KR101656791B1

KR101656791B1 - 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물

Info

Publication number: KR101656791B1
Application number: KR1020160061598A
Authority: KR
Inventors: 이우철; 손화섭; 허담
Original assignee: 이우철; 손화섭; 허담
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2016-05-19
Publication date: 2016-09-12
Also published as: WO2017200192A1

Abstract

본 발명은 밀의 배아 건조 분말, 쌀의 배아 건조 분말, 청경채 건조 분말, 진피 건조 분말, 귤잎 건조 분말 및 채밀이 완료된 벌집 건조 분말의 혼합물 또는 이 분말의 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하고 배양하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물을 제공한다. 이와 같은 본 발명에 따른 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물은 각기 개별 성분이 충분히 사료로도 사용될 수 있는 우수한 천연물로 구성이 되어 있어 독성, 부작용이 전혀 없으면서, 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV) 또는 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV)을 포함하는 코로나 바이러스, 구제역 바이러스, 조류독감 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 등에 우수한 활성을 보이는 매우 유용한 조성물이다.

Description

항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물{Composition of feed additives having anti-virus activity}

본 발명은 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 코로나바이러스(corona virus), 구제역 바이러스, 조류 독감 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV), 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV) 등에 대한 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다.

코로나바이러스(corona virus)는 코로나비리데(Coronaviridae) 과에 속하는 바이러스로 코로나바이러스 감염으로 인한 질병은 매우 다양하다. 코로나바이러스는 포유류와 조류에서 호흡기질환, 소화기 질환, 간질환, 뇌질환 등을 일으키는 RNA 바이러스로서(Thomas M. et al. irology, 279(2): 371-374; Wege et al. (1982) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 99: 165-200) 사람에게는 거의 감염되지 않고 주로 개, 돼지, 소 등의 동물에 감염되는 바이러스로 인식되어 왔다.

사람에게 감염될 때에도 호흡기 증상을 유발하는 여러 바이러스 가운데 하나로 단순한 감기를 유발하거나(Baker SC. Pediatric Infect. Dis J. (2004) 23(11):1049-1050) 어린이의 설사 등 장질환을 일으키는 경우가 있었지만 위험성이 높지 않았다.

그러다 2003년 3월 중순 처음으로 발생해 세계적으로 774명이 넘는 사망자와 9,000여 명의 환자를 발생시킨 중증급성호흡기중후군(severe acute respiratory syndrome; SARS)의 원인병원체가 신종(변종) 코로나바이러스인 것으로 알려지면서 주목받기 시작하였다.

코로나바이러스는 축산업에서도 심각한 경제적 손실을 유발하는데 다른 코로나 바이러스의 일종인 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV)는 매우 전염성이 높은 바이러스성 질병으로 위장관 소화기계통에 침입하여 구토, 설사로 인한 탈수와 고열을 일으키며 치사율도 높아서 상당한 경제적 손실을 유발하는 바이러스이다(Duarte M, Laude H (1994) Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhea virus. J Gen Virol. 75 (Pt 5) : 1195-200).

돼지에서 높은 치사율을 나타내는 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV)도 코로나바이러스에 속하며 이외에도 생쥐 코로나바이러스는 간염을, 쥐 코로나바이러스는 중증 호흡기질환을, 소 코로나바이러스는 신경질환을 유발하는 등 여러 동물에서 다양한 질환을 유발한다(Brian DA, Baric RS Curr. Top. Microbiol. Immunol. (2005). 287: 1-30).

이에, 바이러스 감염을 방지하기 위한 백신개발연구가 진행되고 있으나 아직 효율성이 떨어지는 실정이다[Alonso S, Sola I, Teifke JP, Reimann I, Izeta A, Balasch M, Plana-Duran J, Moormann RJ, Enjuanes L (2002) In vitro and in vivo expression of foreign genes by transmissible gastroenteritis coronavirus-derived minigenomes. J Gen Virol.83(Pt 3) : 567-79].

바이러스 감염을 치료하기 위한 약물로 다음과 같은 항바이러스제들이 널리 사용되고 있다: 리바비린(Ribavirin)은 C형 간염(Foster 24004. Semin Liver Dis. 24(suppl.2):97-104), SARS, 에볼라 바이러스(Ebola virus) 감염 치료에 이용되고있으며(Gunther 등 2004. Antiviral Res. 63:209-215), 아시클로비르(acyclovir)는 허피즈 바이러스(herpesvirus) 치료에 이용되고 있고(Dewhurst 2004. Herpes 11:105A-111A), 이지도싸이미딘(azido thymidine)은 AIDS의 치료에 이용되고 있으며(Coovadia 2004, N Eng J Med 351:289-292), 글리시리진(glycyrrhizin)은 SARS 치료에 이용되고 있는 약제이다(Chen 등 2004, J. Clin. Virol.:69-75).

상기 항바이러스제들은 이들 약물에 대한 바이러스의 내성 및 부작용으로 지속적인 사용에 문제가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 독성과 부작용이 적고, 효과가 뛰어난 천연물 소재의 코로나바이러스에 특이적인 항바이러스제의 개발은 미흡한 상태이다.

천연물 중에서 식물의 경우, 여러 질병에 대한 치료수단으로 오랫동안 사용되어 왔고(Seeff LB, Lindsay KL, Bacon BR, Kresina TF, Hoofnagle JH (2001) Complementary and alternative medicine in chronic liver disease. Hepatology, 34(3) : 595-603; Langmead L, Rampton DS (2001) Herbal treatment in gastrointestinal and liver disease―benefits and dangers. Aliment Pharmacol Ther. 15(9) : 1239-52) 일부 식물의 경우, 항바이러스 활성이 있음이 보고되었으나(Kinghorn AD (1994) The discovery of drugs from higher plants. Biotechnology, 26: 81-108; Patrick L (1999) Hepatitis C: epidemiology and review of complementary/alternative medicine treatments. Altern Med Rev. 4(4) : 220-38), 식물 추출물이 기존의 항바이러스제보다 효능이 뛰어나지 않아 바이러스 감염 치료에 적용되는 사례는 아직까지 없었다.

또한, 최근 들어 가축전염병인 구제역, 조류독감, 돼지독감과 같은 전염성이 강하고 치명적인 바이러스 유발 전염병이 사회적인 문제를 야기하고 있다. 구제역 바이러스는 가축에게 매우 중요한 질병으로 국제수역사무국(Office International des disease)에서 A급으로 분류하고 있는 질병이며 우리나라에서도 제 1종 가축전염병에 속한다. 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 모든 동물(우제류)이 감염될 수 있으며, 상기 질병은 전염성이 매우 강하며 감염 초기에는 입술, 혀, 잇몸, 코, 발굽 사이 등에 수포가 생기고 체온이 급격히 상승하며 식욕이 저하되는 등의 증상이 나타나다가 급성폐사에 이르게 된다.

또한, 고병원성 조류 인플루엔자 (AI) 역시 국제수역사무국(OIE)에서 A등급으로 그리고 국내에서는 제1종 가축전염병으로 분류하고 있으며, 95% 이상의 높은 치사율을 보인다. 또한, 돼지 인플루엔자(SI)는 인플루엔자 타입 A형(H1N1 혹은 H3N2형이 유행)으로 국내에서는 아직 제2종 가축전염병에 속하지만, 인간과의 교차 감염이 확인되어 멕시코에서는 이미 많은 사망자가 나오는 등 많은 우려를 자아내고 있다.

이와 같이 각종 바이러스에 따른 질병 발생으로 인한 직접적인 피해뿐만 아니라 발생국은 비 발생국에 동물 및 축산물을 수출하지 못하는 등의 국제적인 제재를 당하는 등 경제적으로 큰 피해를 입게 된다.

최근 우리나라에서도 구제역, 조류독감 등으로 인한 대대적인 가축의 도살처분 작업이 이루어졌으며 이에 따른 침출수 오염 등의 많은 부작용을 유발하고 있다. 이와 같은 노력과 병행하여 이들 바이러스들이 타지역으로 전파되는 것을 막기 위한 노력의 일환으로 많은 비용과 인력을 투입하여 도로에서 출입하는 모든 차량에 대한 방역작업을 수행하고 있다. 하지만, 이러한 노력에도 최근 국내 구제역 사태에서 밝혀졌듯이 현재의 방역체계로는 바이러스의 전파를 효과적으로 차단하지 못하는 허점을 노출한 바 있다.

지금까지 구제역 내지 조류독감바이러스에 대한 방역제 내지 예방, 치료제에 대한 많은 연구가 이루어진 바 있으나, 대개는 동물의 인체에 유해한 경우가 많을 뿐만 아니라 그 효과 역시 불분명한 경우가 많아 안전하게 사용할 수 있으면서 방역 내지 예방 효과가 우수한 사료첨가제의 개발이 시급한 실정이다.

1. 대한민국 특허 등록 제10-0597711호 2. 대한민국 특허 등록 제10-1170965호

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 천연물, 특히 식물의 추출물을 이용하여 항바이러스 활성이 뛰어나면 독성 및 부작용이 없어 가축의 사료 첨가제로 사용하기 적합한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

밀의 배아 건조 분말, 쌀의 배아 건조 분말, 청경채 건조 분말, 진피 건조 분말, 귤잎 건조 분말 및 채밀이 완료된 벌집 건조 분말의 혼합물을 열수 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위한 다른 실시예로서, 본 발명은

밀의 배아 건조 분말, 쌀의 배아 건조 분말, 청경채 건조 분말, 진피 건조 분말, 귤잎 건조 분말 및 채밀이 완료된 벌집 건조 분말의 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하고 배양한 후 배양물을 열수 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물에 있어서,

상기 밀의 배아 건조 분말, 쌀의 배아 건조 분말, 청경채 건조 분말, 진피 건조 분말, 귤잎 건조 분말 및 채밀이 완료된 벌집 건조 분말의 중량 비율이 동일 비율인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물에 있어서, 상기 항바이러스 활성이 코로나 바이러스, 구제역 바이러스, 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 대하여 활성을 보이며, 상기 코로나 바이러스가 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV) 또는 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV), 인플루엔자 바이러스가 조류독감 바이러스일 수 있다.

상기한 바와 같은 본 발명에 따른 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물은 각기 개별 성분이 충분히 사료로도 사용될 수 있는 우수한 천연물로 구성이 되어 있어 독성, 부작용이 전혀 없으면서, 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV) 또는 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV)을 포함하는 코로나 바이러스, 구제역 바이러스, 조류독감 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 등에 우수한 활성을 보이는 매우 유용한 조성물이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 본 발명에 따른 추출물의 제조

건조한 밀의 배아, 쌀의 배아, 청경채, 진피, 귤잎, 채밀이 완료된 한봉 벌집을 각각 1kg씩 분쇄기에 넣고 입자의 크기가 30메시(mesh) 이하가 되도록 분쇄하여 건조 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 분말의 무게에 3배에 해당하는 증류수를 가하여 100℃에서 3시간 동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 감압 농축하여 600g의 추출물을 수득하였다.

실시예 2. 본 발명에 따른 추출물의 제조

건조한 밀의 배아, 쌀의 배아, 청경채, 진피, 귤잎, 채밀이 완료된 벌집을 각각 1kg씩 분쇄기에 넣고 입자의 크기가 30메시(mesh) 이하가 되도록 분쇄하여 건조 분말을 수득한 후, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하고 배양을 한 후에 이 배양물의 분말의 무게에 3배에 해당하는 증류수를 가하여 100℃에서 3시간 동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 감압 농축하여 600g의 추출물을 수득하였다.

시험예 1: 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV )

1. 실험준비

PEDV 백신 미 접종 모체 출산, 최근 바이러스성 설사증이 발생하지 않은 곳에서 출생 1주령의 돼지를 구입하여 사용하였다. 질병이 없고 외관상 건강한 돼지로 군 구성 시 체중 평균이 유사하게 분류하였고 먹이는 신생자돈용 분유를 급여하였다. 또한, PED바이러스 배양은 PEDV를 베로 세포(Vero cell)로 배양하여 10⁵TCID₅₀/㎖의 역가로 3㎖씩을 하기 표 1에서와 같은 시험군 I, II, III 군의 동물들에 경구 접종하였고 II군의 동물에는 DMEM 배지를 3㎖ 경구 접종하였다.

군	처 치		두수
군	PEDV	물질	두수
I	O	용매	3
II	O	실시예 1 500mg	3
III	O	실시예 2 500mg	3

상기 시험군에 대상으로 다음과 같은 실험을 하였다

2. 분변상태 관찰

시험 진행 과정 동안에 매일 분변 상태를 관찰하고 각 개체의 분변점수를 기록하고 각군의 평균 및 표준편차를 구하였다. 분변 점수는 "3; 정상, 2; 연변, 1; 설사, 0; 폐사"로 하였다. PEDV 접종 후 각 군의 분변 점수의 평균 및 표준편차는 표 2와 같았다.

PEDV 접종 후 I 군의 개체들은 심한 설사를 보였다. 반면 PEDV 접종 후 7일째 본 발명에 따른 추출물 투여군인 II 및 III군의 분변 점수는 I 군에 비교하여 유의하게 높았다 (p<0.05). 따라서 본 발명의 추출물은 PEDV에 의한 설사를 경감시켜 주는 것을 확인할 수 있었다.

군	평가 시간
군	1일	2일	3일	4일	5일	6일	7일
I	2.0	1.3	2.0	1.6	1.6	1.3	1.0
II	2.0	1.6	2.0	2.3	2.3	2.3	2.3
III	2.0	1.6	2.0	2.3	2.3	2.3	2.3

3. 병리조직 검사

각 개체들을 안락사한 후 부검하여 소장을 채취하여 절개한 후 10% 포르말린에 고정하고 병리조직 제작을 위한 통상적인 과정을 거쳐 각 조직의 헤마토실린 & 에오신(Hematoxylin & eosin) 염색 슬라이드를 가지고 소장융모의 위축 여부에 대하여 병리조직검사를 수행하였다.

소장융모의 위축 여부는 융모:선와의 비(vili : crypt ratio)를 구하여 비교하였으며 그 결과는 본 발명에 따른 추출물 투여군인 II, III군의 융모:선와의 비는 I 군에 비교하여 유의하게 높았다.

따라서 본 발명의 추출물은 PEDV에 의한 소장 손상을 경감시켜 주는 것을 확인할 수 있었다.

4. 플라크 억제효과 분석실험 (Plaque reduction assay)

4-1. 돼지 유행성 설사바이러스 감염 및 본 발명의 추출물 처리

37℃에서 배양하여 80-90% 융합(confluent)한 베로 세포(Vero cell)를 바이러스배양 배지(MEM, 0.3% tryptose phosphate broth [sigma], 10㎍/㎖ 트립신(trypsin), 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin))로 한 번 씻어준 후, PEDV를 감염시켰다. 이때 실시예 1 및 2의 추출물 200㎍/㎖을 같이 처리하였으며 감염기간 동안 실험군 별로 추출물농도를 유지하도록 하였다.

감염시킨 후 37℃에서 두 시간 동안 매 15분마다 rocking하면서 배양한 후 바이러스 배양 배지를 더 넣어주었다. 10시간이 더 지난 후에 바이러스 배양 배지로 방출된 바이러스를 얻었다.

추출물처리에 의해 바이러스 방출이 감소하였는지를 플라크분석법으로 조사하였다.

4-2. 본 발명의 추출물 처리 후 PEDV 의 플라크분석법

베로 세포(Vero cell)를 24-웰 조직배양용 플레이트에 키워 24시간 후에 70% confluent가 되도록 세포를 접종하여 24시간 배양한 후에 세포를 바이러스 배양 배지로 두 번 씻어준다. 10배씩 희석 (serial dilution)한 PEDV를 각 웰에 200㎕씩 넣어 감염시킨 후 37℃에서 2시간 배양한다. 2시간 후 바이러스를 제거한 후 바이러스 배양 배지로 씻어준다.

각 웰에 바이러스 배양 배지를 500㎕씩 넣어준 후 37℃에서 4시간 더 배양한다. 4시간 후 트립신의 작용을 없애기 위해 4% FBS가 첨가된 바이러스 배양 배지 500㎕를 넣어준다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후에 바이러스 배양 배지를 제거하지 않고 4% 포름알데히드(formaldehyde) 1㎖을 24-웰 조직배양용 플레이트에 넣어준 뒤 1시간 동안 상온에서 고정시킨다. 배지 및 포름알데히드를 제거한 뒤 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 10분 동안 염색한 후 플레이트(plate)를 씻어준 뒤에 건조한 후, 형성된 플라크의 개수를 현미경으로 측정한다.

실시예 1 및 2의 추출물 200㎍/㎖으로 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군의 플라크 수를 세어 비교(PEDV 플라크측정법 : Veterinary Microbiology, 20, pp 131-142, 1989)한 실험결과는 하기 표 3에 나타내었다.

투여군	플라크 형성단위(PFU, plaque forming unit)
PEDV 대조군: no treatment	2.0 X 10⁴
실시예 1: 200㎍/㎖	1.9 X 10³
실시예 2: 200㎍/㎖	2.1 X 10²

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 추출물 투여 시 10배 감소, 실시예 2의 추출물 투여시 100배 감소효과를 나타내어 돼지 유행성 설사바이러스에 대한 강력한 항바이러스 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 2: 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV)

1. 실험준비

TGEV 백신 미 접종 모체 출산, 최근 바이러스성 설사증이 발생하지 않은 곳에서 출생 1주령의 돼지를 구입하여 사용하였다. 질병이 없고 외관상 건강한 돼지로 군 구성 시 체중 평균이 유사하게 분류하였고 먹이는 신생자돈용 분유를 급여하였다. 또한, TGE바이러스 배양은 TGEV를 베로 세포(Vero cell)로 배양하여 10⁵TCID₅₀/㎖의 역가로 3㎖씩을 하기 표 4에서와 같은 시험군 I, II, III 군의 동물들에 경구 접종하였고 II군의 동물에는 DMEM 배지를 3㎖ 경구 접종하였다.

군	처 치		두수
군	TGEV	물질	두수
I	O	용매	3
II	O	실시예 1 500mg	3
III	O	실시예 2 500mg	3

상기 시험군에 대상으로 다음과 같은 실험을 하였다

2. 체중 변화 관찰

각 시험군에 대하여 체중(kg) 변화를 관찰하여 그 결과를 표 5에 나타냈으며, 표 5를 보면 도입시 군간 체중의 평균은 유사하였으나, TGEV 접종 후 I 군의 동물들은 계속하여 체중 감소를 보였으나, 본 발명에 따른 추출물을 처리한 군에서는 체중 변화가 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.

군	평가 시간
군	1일	4일	7일
I	3.6	2.1	2.0
II	3.4	3.1	3.5
III	3.5	3.4	3.6

3. 플라크 억제효과 분석실험 (Plaque reduction assay)

3-1. 돼지 전염성 위장염 바이러스 감염 및 본 발명의 추출물 처리

37℃에서 배양하여 80-90% 융합(confluent)한 베로 세포(Vero cell)를 바이러스 배양 배지(MEM, 0.3% tryptose phosphate broth [sigma], 10㎍/㎖ 트립신(trypsin), 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin))로 한 번 씻어준 후, TGEV를 감염시켰다. 이때 실시예 1 및 2의 추출물 200㎍/㎖을 같이 처리하였으며 감염기간 동안 실험군 별로 추출물농도를 유지하도록 하였다.

추출물처리에 의해 바이러스 방출이 감소되었는지를 플라크분석법으로 조사하였다.

3-2. 본 발명의 추출물 처리 후 PEDV 의 플라크분석법

베로 세포(Vero cell)를 24-웰 조직배양용 플레이트에 키워 24시간 후에 70% confluent가 되도록 세포를 접종하여 24시간 배양한 후에 세포를 바이러스 배양 배지로 두 번 씻어준다. 10배씩 희석 (serial dilution)한 TGEV를 각 웰에 200㎕씩 넣어 감염시킨 후 37℃에서 2시간 배양한다. 2시간 후 바이러스를 제거한 후 바이러스 배양 배지로 씻어준다.

실시예 1 및 2의 추출물 200㎍/㎖으로 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군의 플라크 수를 세어 비교한 실험결과는 하기 표 6에 나타내었다.

투여군	플라크 형성단위(PFU, plaque forming unit)
TGEV 대조군: no treatment	2.0 X 10⁴
실시예 1: 200㎍/㎖	2.1 X 10³
실시예 2: 200㎍/㎖	3.8 X 10²

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 추출물 투여 시 10배 감소, 실시예 2의 추출물 투여시 80배 감소효과를 나타내어 돼지 전염성 위장염 바이러스에 대한 강력한 항바이러스 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 3: H9N2 인플루엔자 바이러스 공격접종 방어활성

1. 시험목적

본 발명의 추출물을 이용한 조류인플루엔자 바이러스(H9N2)에 대한 병아리 생체 내 증식억제 효능시험

2. 시험배경

가. 시료는 실시예 1 및 2의 추출물을 사용한다.

나. 본 시험은 실시예의 추출물을 투여한 SPF 병아리에서 조류인플루엔자 바이러스의 생체 내 증식억제 효능이 있는지 여부를 조사하기 위함이다.

3. 시험방법

가. 공시재료

1) 시험동물: 유정란, 14일령 병아리

2) 시험물질: 실시예 1 및 2의 추출물

3) 시험바이러스: Influenza virus A/HS/K5/01 (H9N2)

나. 처리내용

1) 병아리를 이용한 생체 내 조류인플루엔자 바이러스 증식억제 시험

가) 14일령 병아리에게 시험물질을 3주간 투여 후 조류인플루엔자 바이러스를 비강으로 공격접종

나) 시험물질 투여량 :10mg/kg/day, 20mg/kg/day

다) 바이러스 공격접종 5일 후 기관과 맹장 편도 채취

4. 시험 결과

가. 10일령 부화란의 요막강으로 시험용 바이러스를 10진 희석하여 종란 당 0.1㎖씩 접종하고, 접종란의 폐사여부와 생존란의 요막액에 대한 혈구응집반응을 검사하여 역가를 산출하였으며. 접종 24시간 내에 폐사한 종란은 버렸다.

나. 시험용 Influenza virus A/HS/K5/01 (H9N2)를 PBS로 10진 희석한 후 10일령 SPF 부화란의 요막강에 각각 접종하여 접종란의 폐사여부와 생존란의 요막액 에 대한 혈구응집반응을 검사하여 바이러스 역가를 산출한 결과 10⁸ EID₅₀/㎖로 확인되었다.

다. 시험물질 실시예 1 추출물 투여 SPF 병아리에서 조류인플루엔자 바이러스 증식억제 시험을 실시한 결과 10mg 투여군과 20mg 투여군은 공격접종 대조군에 비하여 기관 및 맹장 편도에서 바이러스 재 분리율이 유의성 있게 저하되었으며, 시험물질 투여량에 비례하여 바이러스 증시 억제 효과가 관찰되었다.

라.　시험물질 실시예 2 추출물 투여 SPF 병아리에서 조류인플루엔자 바이러스 증식억제 시험을 실시한 결과 10mg, 20mg 투여군은 공격접종 대조군에 비하여 기관에서 바이러스 재분리율이 유의성 있게 저하되었으며, 시험물질 투여량에 비례하여 바이러스 증식 억제 효과가 관찰되었다.

마. 이상의 시험 결과 본 발명에 따른 추출물은 SPF병아리에 투여 시 병아리 생체 내에서 조류인플루엔자 바이러스 증식억제 효능이 관찰되어 항 조류인플루엔자 바이러스 효능이 있는 것으로 판단되었으며, 20mg 투여 시까지 병아리 체중과 사료 및 음수 소비량에 변화가 없어 안전성이 확인되었다.

시험예 4: 구제역 바이러스

1. 플라크 억제효과 분석실험 (Plaque reduction assay)

1-1. 구제역 바이러스 감염 및 본 발명의 추출물 처리

37℃에서 배양하여 80-90% 융합(confluent)한 베로 세포(Vero cell)를 바이러스 배양 배지(MEM, 0.3% tryptose phosphate broth [sigma], 10㎍/㎖ 트립신(trypsin), 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin))로 한 번 씻어준 후, 구제역 바이러스를 감염시켰다. 이때 실시예 1 및 2의 추출물 200㎍/㎖을 같이 처리하였으며 감염기간 동안 실험군 별로 추출물농도를 유지하도록 하였다.

1-2. 본 발명의 추출물 처리 후 PEDV 의 플라크분석법

베로 세포(Vero cell)를 24-웰 조직배양용 플레이트에 키워 24시간 후에 70% confluent가 되도록 세포를 접종하여 24시간 배양한 후에 세포를 바이러스 배양 배지로 두 번 씻어준다. 10배씩 희석 (serial dilution)한 구제역 바이러스를 각 웰에 200㎕씩 넣어 감염시킨 후 37℃에서 2시간 배양한다. 2시간 후 바이러스를 제거한 후 바이러스 배양 배지로 씻어준다.

실시예 1 및 2의 추출물 200㎍/㎖으로 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군의 플라크 수를 세어 비교한 실험결과는 하기 표 7에 나타내었다.

투여군	플라크 형성단위(PFU, plaque forming unit)
대조군: no treatment	1.59 X 10⁴
실시예 1: 200㎍/㎖	3.0 X 10³
실시예 2: 200㎍/㎖	3.8 X 10²

상기 표 37에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 추출물 투여 시 5배 감소, 실시예 2의 추출물 투여시 50배 감소효과를 나타내어 구제역 바이러스에 대한 강력한 항바이러스 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 5: 세포 독성평가

1. 세포 독성 평가 실험 방법

가. 세포 배양

melanoma cell line인 B16F10 cell을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 1% antibiotic (Gibco, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Grand Island, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 4일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다.

나. 세포 생존률 측정 ( MTT 분석)

시료가 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다. 대사가 왕성한 살아있는 세포는, 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소작용에 의하여 수용성의 노란색인 3-(4,5-dimethylthiaxo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide를 환원시켜 자주색을 띠는 비수용성 formazan을 형성한다.

B16F10 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 2.0 × 10⁴cells/㎖로 96 well plate에 넣고 18시간 배양 후 각 시료 농도별로 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 MTT 용액 50㎕를 첨가하여 4시간 동안 반응 시켰다. 배양 배지를 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide를 200㎕를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, microplate reader를 사용하여 540nm 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생장률을 평가하였다.

2. 실험 결과

하기 표 8에서 보는 바와 같이 실시예 1 및 2의 추출물 모두 50㎍/㎖와 100 ㎍/㎖에서 세포 독성을 나타내지 않음 확인할 수 있었다.

sample		Cell viability (%)
대조군: No treatment		100
실시예 1 추출물	50㎍/㎖	101.8 ± 0.02
실시예 1 추출물	100㎍/㎖	99.9 ± 0.07
실시예 2 추출물	50㎍/㎖	105.2 ± 0.06
실시예 2 추출물	100㎍/㎖	101.4 ± 0.02

상기한 바와 같은 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명에 따른 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물은 각기 개별 성분이 충분히 사료로도 사용될 수 있는 우수한 천연물로 구성이 되어 있어 독성, 부작용이 전혀 없으면서, 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV) 또는 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV)을 포함하는 코로나 바이러스, 구제역 바이러스, 조류독감 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 등에 우수한 활성을 보이는 매우 유용한 조성물임을 확인할 수 있었다.

Claims

밀의 배아 건조 분말, 쌀의 배아 건조 분말, 청경채 건조 분말, 진피 건조 분말, 귤잎 건조 분말 및 채밀이 완료된 벌집 건조 분말의 혼합물을 열수 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물.
밀의 배아 건조 분말, 쌀의 배아 건조 분말, 청경채 건조 분말, 진피 건조 분말, 귤잎 건조 분말 및 채밀이 완료된 벌집 건조 분말의 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하고 배양한 후 배양물을 열수 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물.
제 1항 또는 2항에 있어서,
상기 밀의 배아 건조 분말, 쌀의 배아 건조 분말, 청경채 건조 분말, 진피 건조 분말, 귤잎 건조 분말 및 채밀이 완료된 벌집 건조 분말의 중량 비율이 동일 비율인 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 항바이러스 활성이 코로나 바이러스, 구제역 바이러스, 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 대하여 활성을 보이는 것을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 코로나 바이러스가 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV) 또는 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV)이며, 인플루엔자 바이러스가 조류독감 바이러스인 것을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 가지는 사료 첨가제 조성물.