KR101170965B1 - 금은화 추출물을 포함하는 돼지유행성설사병 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항바이러스 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 금은화 추출물을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 (PED, Porcine Epidemic Diarrhea) 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV, Porcine Epidemic Diarrhea Virus)에 대한 항-바이러스가 효과가 뛰어나므로, 상기 바이러스의 감염으로 유발되는 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 사료 첨가제로 활용될 수 있다.

돼지유행성설사병, PEDV, 금은화, 항바이러스

Description

금은화 추출물을 포함하는 돼지유행성설사병 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for prevention or treating Porcine Epidemic Diarrhea containing extract of Lonicerae Flos}

본 발명은 금은화 추출물을 포함하는, 돼지 유행성 설사병 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

돼지 유행성 설사병 (Porcine Epidemic Disease, PED)은 TGE (Transmissible Gastroenteritidis) 등과 함께 동절기 양돈장에 큰 피해를 입히는 바이러스성 질환으로 코로나바이러스과에 분류되어 있다. 육성, 비육돈에게 까지 설사를 유발시킬 수 있으며 어린 자돈에 발생시 높은 폐사율이 문제가 될 수 있다. 특히 아시아 지역에서의 피해가 두드러지는데 가까운 일본에서는 1996년 겨울 9개현, 18개 농장의 56,256두의 포유자돈중 39,509 마리가 폐사하여 70%의 폐사율을 보이는 등, 자돈피해가 큰 질병이다. Corona virus 속에는 송아지 코로나바이러스(Calf coronavirus), 돼지 TGE (Transmissible Gastroenteritidis) virus, 돼지 혈구응집 성 뇌척수염바이러스 (Hemagglutinating encephalomyelitis virus), 고양이 감염성 복막염바이러스 (feline infectious peritonitis virus), 개코로나바이러스(Canine coronavirus), 조류 전염성 기관지염바이러스 (avian infectious bronchitis virus), 마우스 간염 바이러스 (murine hepatitis virus) 및 사람에서의 SARS (Severe Acute Respiratory syndrome) virus 등이 코로나 바이러스 속에 속한다.

PEDV의 최초 보고지는 유럽으로 1978년 영국과 벨기에에서 최초로 보고되었으며 국내에서는 1993년 공식적으로 처음 발생이 보고된 이후 계절에 관계없이 연중 발생하고 있다. 근래에는 PED가 TGE 보다 월등히 많은 발생을 보이고 있어 양돈농가에 경제적인 피해를 유발하고 있다. 이와 같은 설사병을 예방하기 위해 지금까지 생백신을 분만 전 모돈에 접종하여 형성된 항체를 초유를 통해 포유자돈에 전달하는 수동면역을 주로 실시해오고 있다. 국내백신 생산 회사에서도 PED 생백신을 생산 판매하고 있으며, 국외백신으로는 일본의 PED 생백신 및 PEDㅇTGE 혼합 생백신이 수입되고 있다.

그러나, 생백신인 경우 특히, PEDV에 대한 야외농장들에서 예방효능에 대한 불신감이 높아 예방접종 미실시로 인하여 매년 자돈의 설사 발생율이 증가하고 있는 추세에 있다. 이에 따라, 상기 질병들을 효율적으로 예방또는 치료하기 위한 효율적인 제제의 개발이 절실히 필요한 상황이다.

이에 본 발명자들은 돼지유행성설사병의 원인체인 PEDV에 의한 설사 및 소장 손상을 감소시키는 천연물 유래 치료제를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 금은화 추출물에 의한 CPE 형성 억제, 바이러스 억제 효과, 분변 상태 개선, 바이러스 접 종 후 운동성, 사료 섭취율 등에서 유의성 있는 결과를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 돼지의 유행성 설사병 바이러스에 대한 항-바이러스 효과를 실효적으로 높일 수 있으면서, 농가에 효율적으로 대량 공급할 수 있는 돼지 유행성 설사병 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 돼지유행성설사병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 금은화 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다. 더욱 더 구체적으로는, 금은화 추출물을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)로 인한 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 PEDV로 인한 질환은 돼지 유해성 설사병 (PED)을 포함하며, 사람을 포함한 포유동물에 발생하는 것으로 포함한다.

상기 금은화는 인동과의 인동덩굴(Lonicera japonica Thunberg) 또는 그 변종의 꽃봉오리를 일컫는 약초로서, 냄새가 특이하고, 단 맛이 나며, 성질은 차다. 상기 금은화는 항균, 항염증, 해열, 백혈구 탐식, 중추신경 흥분, 혈청 콜레스테롤 강하, 궤양 예방 등의 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

본 발명에서는 금은화를 이산화탄소와 물을 용매로 하여 통상적인 방법으로 초임계 추출하여 금은화 추출물을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에서는 상기 금은화를 에탄올 및 메탄올 등의 극성용매 또는 그들과 정제수의 혼합용액에서 가열 추출할 수도 있으며, 감압 농축 등 다양한 방법으로 금은화 추출물을 얻을 수 있다. 바람직하게는, 열수, 메탄올 등을 사용하여 금은화 추출물을 수득할 수 있다. 보다 바람직하게는 본 발명의 금은화 추출물은 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

상기 금은화 추출물의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 기대하는 항바이러스 효과를 치료용 조성물에 유효하게 발휘시키기 위해서는 조성물 총 중량에 대해서 0.1 내지 50 중량%로 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 금은화 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 투여 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 금은화 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 금은화 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 금은화 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능 한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 금은화 추출물의 바람직한 투여량은 환자 또는 환축의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 금은화 추출물은 0.0001 내지 1,000㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 금은화 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 금은화 추출물을 유효성분으로 함유하는 돼지 유행성 설사바이러스 (PEDV)로 인한 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 사료첨가제는 분말제, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 상태로 제조될 수 있다.

또한, 돼지 유행성 설사 바이러스로 인한 질환의 예방 효과를 목적으로 사료 에 첨가될 수 있다. 이 때, 상기 사료 중의 상기 추출물의 양은 전체 사료 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 PEDV에 대한 증식 억제 효과가 있는 금은화 추출물을 유효성분으로 포함함으로써, 돼지의 유행성 설사병 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 실효적으로 높일 수 있으며, 또한 농가에 돼지 유행성 설사병 치료용 조성물을 효율적으로 대량 공급할 수 있는 효과가 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하도록 한다. 하지만, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1: 금은화 추출물의 제조

건조된 금은화를 63.43g 칭량하여 생수 (화이트, 무학산청샘물(주), 경남산청군 심장면 덕교리 800) 1L 를 넣고 1시간 침적시킨 후, 대웅약탕기(DWP-5000M)를 이용하여 100℃에서 3시간 끓인 후 100메시(mesh)에 걸러 탕액(100 ml)을 추출하였다. 본 시험물질을 20배 희석하여 본 실험에 사용하였다.

실시예 2: 바이러스 및 세포주

본 실시예에서 사용한 바이러스는 PEDV의 백신주인 KPEDV-9 strain, sm98 strain을 사용하였으며, 배양에 사용한 세포는 서울대학교 세포주은행에서 구입한 vero-cell를 사용하고, alpha minimum essential medium (alpha-MEM)에서 배양하였다.

실시예 3: 한약재의 농도 결정

한약재를 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 미리 5x10^4/well로 분주해 놓은 96well 세포에 crude water extract를 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 및 0.05 ㎎/ml 농도로 물(H₂O)에 희석하여 세포배양액에 첨가하고, 96시간까지 배양하여 세포가 괴사되는지를 확인하였다. 이 후 세포가 괴사되지 않은 plate well의 배양액을 취하여 세포독성 검사 키트(cytotoxicity assay kit)를 이용하여 세포독성을 측정하였다.

실시예 4: 바이러스 접종

25cm²의 세포배양 플라스크(cell culture flask)에 VERO-CELL을 1X10⁶ cell/flask로 분주하여 monolayer가 되었을 때 바이러스액 (KPEDV-9)을 MOI(multiplicity of infection )=0.01를 첨가한 뒤 5% CO₂, 37 ℃ incubator에서 1 시간 동안 감염시킨 뒤 배양액을 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline )로 세척 후 신선한 배지를 첨가하였다. 이때 농도가 결정된 한약재를 희석배수에 맞게 첨가하여 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 및 96시간까지 도립현미경을 통해 세포 응집이 깨지는 세포변성효과(cytopathic effects, CPE)가 나타나는지 여부를 관찰하였으며, 시간별로 배양액 120㎕를 수확하여-80 ℃에 보관하였다.

실시예 5: One step Growth curve 작성

세포를 6-well plate를 준비하여 1x10⁶ cell/well의 농도로 분주하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 monolayer 되었을 때 바이러스 접종 전 plate의 배양배지를 버리고 1ml씩 새로운 배지를 첨가하였다. 그리고 이전 한약재 첨가하여 CPE 를 관찰하면서 시간별로 수확하여 보관하였던 바이러스 배양액을 10진 희석으로 10^-6 까지 희석하여 100 ㎕씩 접종한 후 37 ℃ 배양기에서 1시간 동안 바이러스가 세포에 흡착되게 배양하였다.

Agarplaque LE-agarose를 증류수에 1.5%로 만들어 microwave에서 녹인 후 45 ℃ water-bath에서 정치시키고 alpha-MEM과 섞어서 최종적으로 0.5%의 agarose가 되도록 하였다. Plate에서 배지를 완전히 제거한 후 앞에서 준비한 agarose gel을 감염세포위에 overlay 한 뒤 굳으면 37 ℃ 배양기에서 4-5일 동안 배양하였다. 이 후 현미경으로 plaque가 형성되었는지를 일단 확인하고, 7% formalin으로 고정 시킨 후 agarose를 떼어내고, crystal violet 으로 염색 후 물로 씻어낸다.

그리고 잘 말린 후 plaque-reading을 하였다. 배양시간에 따른 한약재가 첨가된 바이러스의 역가를 알기 위해 증식곡선을 작성하였다.

<실험예>

실험예1: 금은화 추출물이 PEDV 생장 곡선 (growth curve)에 미치는 영향 평가

바이러스 농도 (MOI=0.1)에 따라 접종 후 한약재를 첨가하여 시간별로 바이러스 수확하여 정량-PCR로 역가 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 대조군의 경우 시간이 지나면서 PEDV 역가가 증가하였으나 (A), 금은화 추출물을 첨가한 세포에서 수확한 바이러스는 시간이 지나도 음성으로 나타났다(B).

다음으로, 금은화 추출물의 효과를 재검증하기 위하여 바이러스 농도를 MOI=0.01 로 하여 시간별로 바이러스 수확하여 정량-PCR로 역가 측정하였다. 그 결과 도 2와 같은 결과를 얻었다. 즉, 도 2에 의하면, 대조군의 경우 시간이 지나면서 PEDV 바이러스 역가가 증가하였으나(A), 금은화 추출물(B) 을 첨가한 세포에서는 PEDV 바이러스 역가가 48시간이 경과하여도 음성으로 나옴을 확인할 수 있었다.

또한, 바이러스를 농도별로 접종한 후 시간별로 나오는 바이러스 증식속도를 측정하였으며, 측정방법은 플라크 검정(Plaque assay)으로 실행했다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 금은화가 첨가된 실험군 (PED+124)의 바이러스 역가가 대조군 (PED)과 대비하였을 때 현저히 적게 나오는 것을 확인할 수 있었다.

실험예2: 플라크 모양 또는 크기에 미치는 영향 평가 - 플라크 검정

플라크 검정(plaque assay)을 통해 플라크의 모양 또는 크기에 미치는 영향을 평가하였다. 플라크(Plaque)는 감염성이 있는 바이러스가 세포에 감염되어 형성되는 것으로 플라크 검정(plaque assay) 결과는 직접적으로 바이러스 particle의 갯수를 측정할 수 있는 방법이다. 플라크 검정은 상기 실시예 5에 나타난 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 여기서 plaque의 모양 또는 크기를 평가하는 이유는 금은화 추출물에 의해 바이러스 역가가 낮아지면서 바이러스 변이로 인해 plaque의 모양 또는 크기가 작게 혹은 눈에 보이지 않게 형성될 수도 있어, 이를 알아보기 위해 비교하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군(A)과 비교했을 때 금은화 추출물을 첨가하였을 때(B)도 플라크(plaque)의 모양 또는 크기에는 큰 변화가 없었다. 즉, 플라크의 형태학적인 변화는 없었으며, 금은화 추출물 첨가군(B)에서 감염성 바이러스의 갯수가 10 내지 43배 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조). 따라서, 금은화 추출물이 PEDV에 대해 억제효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 금은화 추출물이 PEDV 세포배양에서 CPE에 미치는 영향 평가

25cm²의 세포배양 플라스크(cell culture flask)에 VERO-CELL을 1X10⁶ cell/flask로 분주하여 monolayer 되었을 때 바이러스액 (KPEDV-9)을 MOI(multiplicity of infection )=0.01를 첨가한 뒤 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 1시간 동안 감염시킨 뒤 배양액을 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline)로 세척 후 배지를 첨가하였다. 이후 금은화 추출물을 첨가하고 시간별로 CPE를 평가하였다.

그 결과, 도 5는 PEDV 바이러스 감염 후 48시간 및 72시간일 때의 세포의 CPE 형성 여부를 광학현미경으로 200배 확대하여 확인 한 것이다. 도 5의 (A)에 의하면, 본 발명에 따른 실시예의 금은화 추출물을 혼합하지 않은 대조군에서 시간이 경과할수록 CPE 형성이 증가하였으며, 결국 72시간이 경과하였을 때는 PEDV 바이러스에 감염된 세포가 모두 괴사함을 확인할 수 있었다. 반면에, 도 5의 (B)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 금은화 추출물을 첨가한 세포에서는 바이러스 접종 후 48시간 경과 시 상기 대조군(A)에 비해 CPE가 늦게 형성되며 약하게 보이기 시작하였으며, 바이러스 접종 후 72시간이 경과한 시점에서는 CPE가 보이긴 하지만, 여전히 생존하고 있는 세포가 존재함을 확인할 수 있었다.

이상에 설명한 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기의 상세한 설명보다 는 후술할 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

도 1은 금은화 추출물의 항 PEDV 효능을 Growth curve로 확인하기 위하여, MOI=0.1의 바이러스 농도로 접종한 후 금은화 추출물을 첨가하여 시간별로 바이러스를 수확하여 정량-PCR로 바이러스 역가를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 금은화 추출물의 항 PEDV 효능을 Growth curve로 확인하기 위하여, MOI=0.01의 바이러스 농도로 접종한 후 금은화 추출물을 첨가하여 시간별로 바이러스를 수확하여 정량-PCR로 바이러스 역가를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 바이러스를 농도별로 접종한 후 시간별로 나오는 바이러스 증식속도를 측정한 값을 플라크 검정(plauqe assay)으로 역가 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 4는 플라크 검정(plauqe assay) 결과를 나타낸 것으로서, (A)는 PEDV만 존재하는 대조군을, (B)는 본 발명에 따른 실시예의 금은화 추출물을 첨가한 것을 나타낸 것이다.

도 5는 금은화 추출물의 항 PEDV 효능을 확인하기 위해, CPE 형성여부를 광학현미경으로 확인한 사진으로서, 48시간 경과 및 72시간 경과 후의 양상을 나타낸 것이다.

Claims (7)

1. 금은화 추출물을 포함하는 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)로 인한 돼지 질환에 대한 항바이러스제.
2. 제1항에 있어서, 상기 금은화 추출물은 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 항바이러스제.
3. 제1항의 항바이러스제를 포함하는 돼지 사료 첨가제.
4. 제 3항에 있어서, 분말제, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 돼지 사료첨가제.
5. 제1항에 있어서, 상기 금은화 추출물은 그 함량이 0.1 내지 50 중량% 인 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
6. 제1항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사바이러스로 인한 질환은 돼지 유행성 설사병 (PED)인 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
7. 삭제

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