KR101633432B1 - 감마 허피스바이러스 감염의 개선 및 치료에 사용하기 위한 아까시나무 추출물의 용도 - Google Patents
감마 허피스바이러스 감염의 개선 및 치료에 사용하기 위한 아까시나무 추출물의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 감마 허피스바이러스 감염의 개선 및 치료에 사용하기 위한 아까시나무 추출물의 용도를 제공한다. 본 발명에 따르면, 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물은 부작용 및 독성 발현율이 적고 생체 친화적이고 약물내성 없이 감마 허피스바이러스 감염 질환을 치료할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 감마 허피스바이러스 감염의 개선 및 치료에 사용하기 위한 아까시나무 추출물의 용도에 관한 것이다.
인체 허피스바이러스 대부분은 국내 70-80% 이상의 높은 감염률을 나타내며, 한 번 감염되면 잠복감염을 형성하고, 숙주에서 잠복감염과 재활성을 반복하여 평생 동안 감염성 유지하는 대표적인 만성바이러스이다(표 1. 인체 만성바이러스의 특징 참조).
| 인체허피스바이러스 | 종류 | 잠복감염 | 주요 질병 | |
| HHV-1 | Herpes simplex virus-1 | 알파 | 신경계 | 단순포진, 뇌염 |
| HHV-2 | Herpes simplex virus-2 | 알파 | 신경계 | 생식기 포진 (STD), 뇌염 |
| HHV-3 | Varicells-Zoster virus | 알파 | 신경계 | 수두, 대상포진 |
| HHV-4 | Epstein-Barr virus | 감마 | B림프계 | 전염성단핵구증, 버킷림프종, 코인두암종, B림프종양, 위암 |
| HHV-5 | Human cytomegalovirus | 베타 | 림프계 | 전염성단핵구증, 선천기형, 망막염, 실명 |
| HHV-6 | Human herpesvirus-6 | 베타 | T림프계 | 돌발진, 뇌수막염, 전염성 단핵구증, 전격성 간염, 비전형적 림프구증식증 |
| HHV-7 | Human herpesvirus-7 | 베타 | T림프계 | |
| HHV-8 | Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus | 감마 | B림프계 | 카포시육종, B림프종양 |
허피스바이러스들은 대표적인 기회감염 (opportunistic infection)으로서 면역기능 저하에 따른 재활성이나 선천감염을 통해 다양한 질병을 유발하고 환자의 면역상태에 따라 치명적인 감염 예후를 나타낸다. VZV(Varicells-Zoster virus)의 예방 생백신을 제외한 나머지 7종의 인체 허피스바이러스에 대해서는 예방 백신이나 치료 백신 모두 없는 실정이다.
장기이식 (organ transplant) 및 조혈모세포 이식 (Hematopoietic Stem Cell Transplant)의 증가, 인체면역결핍바이러스 (HIV-1) 감염 등, 면역 저하에 따른 재활성 허피스바이러스 감염제어가 중요한 이슈가 되고 있다.
또한, 허피스바이러스의 지속감염으로 인한 노년층 인구의 면역 저하(리뷰 논문: Koch et al, Cytomegalovirus infection: a driving force in human T cell immunosenescence, Ann N Y Acad Sci. 2007 1114:23-35)는 최고속으로 고령화 사회에 진입하고 있는 우리나라 실정에서 중요한 보건 사회적 부담으로 작용할 것이다.
한편, 허피스바이러스 가운데 감마허피스바이러스는 림프세포에 잠복 감염되어 종양을 일으킬 수 있으며, 상피세포나 섬유세포에서는 용해성 감염(lytic infection)을 일으키는 것으로 알려져 있다. 감마허피스바이러스에는 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, 이하, 'EBV'라고 함)와 카포시육종 허피스바이러스(Kaposi's sarcoma associated virus, 이하, 'KSHV'라고 함)가 있다.
통상 허피스바이러스는 높은 감염률을 특징으로 하는데, 특히 EBV의 경우 우리나라를 포함한 전세계 인구의 90 % 이상이 혈청 양성반응을 나타낸다. EBV는 잠복감염에 의한 만성 감염시 코인두암종(nasopharyngeal carcinoma, NPC), 위암종(gastric carcinoma, GC), 버킷림프종 (Burkitt's lymphoma BL), 이식후 B 세포 림프종(post-transplant B cell lymphomas, PTBL), 및 호지킨림프종(Hodgkin's disease, HD) 등 다종의 종양들의 형성과 깊은 연관성이 있다 (Roizman, 2007).
KSHV는 가장 최근(1994년)에 발견된 인체 감염 허피스바이러스로서, 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma, KS)과, B 세포 림프종의 일종인 원발성 삼출성 림프종(primary effusion lymphoma: PEL)이나 다중심성 캐슬만병(multicentric Castleman's disease)의 원인 바이러스이다 (Alkan et al, 1997; Huang et al, 1995,; Liberman et al, 1990; Moore et al, 1994).
기존 항허피스바이러스제제는 대부분 바이러스 DNA 중합효소 (DNA pol)을 타겟으로 개발되었다. 그 중, 아실클로버(acyclovir) 및 그 유도체는 허피스바이러스의 티미딘 키나아제(thymidine kinase, 이하, 'TK'라고 함)에 의해서 특이적으로 인산화 된 후 DNA pol에 의해 복제되는 바이러스 게놈으로 끼어들어 DNA 조기 종결(premature termination)을 유도하는 약물로, 개발 후 지난 40여 년 동안 가장 많이 사용되었다. 이 외에 피로인산 유사체(pyrophosphate analogue)와 같은 포스카르네트(forscarnet) 등의 약물이 상용되고 있다.
이들은 알파-허피스바이러스 감염의 치료에는 유효한 반면, 베타나 감마허피스바이러스의 초기감염증 (예: 전염성 단핵구증) 또는 재활성 감염에는 그 임상적인 역가가 제한적이다. 특히, 감마허피스바이러스의 제어에 유용하게 사용될 수 있는 항바이러스제는 존재하지 않아 주로 스테로이드 계열의 약물을 통한 대증요법에 의존하고 있는 실정이다.
또한, 최근 장기이식 및 조혈모세포이식, HIV 감염으로 인한 면역결핍환자의 경우 약물의 독성이 심하게 나타나고, 더 중요하게는 이들 환자에게서 약물내성의 돌연변이 출현이 증가하고 있다 (Danve-Szatanek C et al. Surveillance network for herpes simplex virus resistance to antiviral drugs : 3- year follow - up. J Clin Microbiol. 2004 42(1):242-9.; Limaye AP et al. Emergence of ganciclovir - resistant cytomegalovirus disease among recipients of solid - organ transplants. Lancet 2000; 356:645649; Marfori JE et al. Development of new cytomegalovirus UL97 and DNA polymerase mutations conferring drug resistance after valganciclovir therapy in allogeneic stem cell recipients. J Clin Virol 2007; 38:120-125).
대부분의 약물내성 돌연변이는 TK나 바이러스 DNA pol에 대한 돌연변이로서, 새로운 타겟이나 메카니즘을 가지는 항허피스바이러스제 신약 후보 물질 개발이 매우 시급한 실정이다.
본 발명은 약물독성 및 약물내성은 없으면서 감마 허피스바이러스 감염을 효과적으로 개선 또는 치료할 수 있는 새로운 성분을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이를 위해, 본 발명은 아까시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 감마 허피스바이러스 감염의 개선 또는 치료용 조성물, 치료상 유효량의 아까시나무 추출물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 방법, 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스제의 제조를 위한 아까시나무 추출물의 신규 용도를 제공한다.
본 명세서에서, 아까시나무(black locust tree, Robinia pseudoacacia L.)의 추출물은 당업계에 공지된 통상의 추출방법을 이용하여 제조할 수 있다. 추출에 사용되는 아까시나무의 부위는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 아까시나무의 지상부 및 수피, 예를 들어, 수피, 잎, 화서, 잔가지류 등을 사용할 수 있다. 또한, 추출의 방법으로는 초음파 추출, 초임계유체 추출, 열탕 추출 등의 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 “아까시나무 추출물”은 위와 같은 통상의 추출법을 통해 추출함으로써 얻어진 추출물을 의미하는 것으로, 아까시나무의 구성성분 중 섬유소 등은 추출 및 정제 과정을 통해 걸러지고, 본 발명의 “아까시나무 추출물”은 아까시나무의 미량성분을 주로 포함하고 있다.
본 발명에 있어서 “아까시나무 추출물”은 아까시나무의 미량성분들이 복합적으로 만들어 내는 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스 효능을 이용하는 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출 용매로서 이용하여 아까시나무로부터 추출된 것일 수 있다. 이 때 사용되는 유기용매의 종류나 물과 유기용매의 혼합 비율은 특별히 제한되지 않으며, 통상의 추출 방법에 따라 아까시나무 추출물을 제조할 수 있다.
예를 들어, 상기 유기용매는 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매일 수 있다. 상기 저급 알코올은 탄소수 1 내지 6의 알코올일 수 있다. 예를 들어, 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜 등을 이용할 수 있다. 유기용매는 이 외에도 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide), DMSO(dimethyl sulfoxide) 등의 극성 용매, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF(Tetrahydrofuran) 등의 비극성 용매를 사용할 수도 있다.
한 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 저급 알코올 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 아까시나무의 에탄올 추출물일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 헥산 추출물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 아까시나무 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 본 명세서에서 ?瑾뭐?은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 용매 분획, 실리카 겔 크로마토그라피(silica gel chromatography), prep-HPLC 등의 기술을 이용하여 활성물질이 농축된 특정 분획물을 제조할 수 있다. 또한, 상기 추출물이나 분획물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 아까시나무 추출물에 포함된다.
한 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 유기용매 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 여기에서, 제2의 유기용매는 추출용매로 사용된 첫번째 유기용매와는 상이한 추가의 유기용매를 말한다. 다른 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 저급 알코올 추출물을 제2의 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 에탄올 추출물을 헥산으로 재분획한 분획물일 수 있다. 하기 실시예에서는 인 비트로 실험을 위한 최적의 수율을 얻기 위해 메탄올을 1차적인 추출 용매로 사용하였으나, 메탄올 대신 에탄올을 사용하여도 동일한 효과를 나타낼 것임은 당업자에게 명백하다. 하기 실시예에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 아까시나무 전 추출물을 제2의 유기용매로 분획한 분획물은 매우 우수한 항바이러스 효능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘아까시나무 추출물’은 아까시나무에 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물 또는 이들의 분획물뿐만 아니라 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아까시나무 추출물은 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스 효능을 나타낸다.
아까시나무 추출물은 감마 허피스바이러스, 특히 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV) 또는 카포시육종 허피스바이러스(Kaposi's sarcoma associated virus, KSHV)의 감염의 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에 따른 아까시나무 추출물은 감마 허피스바이러스의 감염에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 개선을 위해 사용될 수 있으며, 이러한 질환으로는 전염성단핵구증, 버킷림프종, 코인두암종, B림프종양, 위암, 카포시육종 및 B림프종양을 포함한다.
아까시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 의약 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 아까시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 감마 허피스바이러스 감염 치료용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 의약 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
또한 본 발명은 치료상 유효량의 아까시나무 추출물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 의약 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 아까시나무 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01 ㎎/kg~200 ㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 아까시나무 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 아까시나무 추출물을 포함하는 감마 허피스바이러스 감염 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 같은 음료류로 제조되는 경우 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물 이외에도 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과접, 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 감마 허피스바이러스 감염의 개선용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강식품에 있어서의 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물의 첨가량은, 대상인 건강식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 과립, 정제 또는 캡슐형태의 식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 음료의 형태일 수 있다.
본 발명에 따르면, 아까시나무 추출물은 부작용 및 독성 발현율이 적고 생체 친화적이고 약물내성 없이 감마 허피스바이러스 감염 질환을 치료할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 아까시나무 추출물 및 그의 분획물들의 마우스 감마 허피스바이러스에 대한 항바이러스 효능을 나타내는 도면이다.
도 2는 아까시나무 에탄올 추출물의 CHCl3 분획물 및 헥산 분획물이 마우스 감마 허피스바이러스의 비리온 생산을 저해하는 효능을 나타내는 도면이다.
도 3은 아까시나무 추출물 및 그의 분획물들의 MHV-68에 대한 항바이러스 효능을 보여주는 플라그 어세이의 결과이다.
도 4는 아까시나무 추출물의 EBV에 대한 바이러스 유전자 발현 억제를 분석한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 아까시나무 추출물의 EBV에 대한 바이러스 유전자 발현 억제를 정량분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 아까시나무 추출물의 KSHV에 대한 항바이러스 작용을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 아까시나무 에탄올 추출물의 CHCl3 분획물 및 헥산 분획물이 마우스 감마 허피스바이러스의 비리온 생산을 저해하는 효능을 나타내는 도면이다.
도 3은 아까시나무 추출물 및 그의 분획물들의 MHV-68에 대한 항바이러스 효능을 보여주는 플라그 어세이의 결과이다.
도 4는 아까시나무 추출물의 EBV에 대한 바이러스 유전자 발현 억제를 분석한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 아까시나무 추출물의 EBV에 대한 바이러스 유전자 발현 억제를 정량분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 아까시나무 추출물의 KSHV에 대한 항바이러스 작용을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
제조예
: 아까시나무 추출물 및 그의
분획물의
제조
아까시나무 (Robinia pseudoacacia L.; black locust tree)의 수피 부위를 건조기(40℃)에서 48시간 건조 후 세절하였다. 추출 방법으로는 초음파법을 이용하였다. 추출 용매는 80% 메탄올을 사용하였으며, 용매의 량은 시료 100g 당 용매 1L 을 첨가하였다. 추출 시간은 시료당 1회 90분씩, 총 3회 수행하였으며, 초음파 Frequency는 42kHz 였다. 시료의 추출 수율은 7.28%(136.214/1,872gⅹ100) 을 나타내었다. 유기용매를 모두 증발시킨 아까시나무 추출물을 2차 증류수로 현탁한 후 극성이 낮은 순에서 높은 순으로 hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH의 용매를 이용하여 분획을 실시하였으며, 남은 유기용매 및 증류수 건조를 위하여 동결건조(-120℃)처리하였다. 전처리가 완료된 분획량은 hexane층, 11.65g, CHCl3층 14.03g, EtOAc층 9.92g, BuOH층 53.5g을 나타내었다.
실험예
1. 마우스
감마허피스바이러스
,
MHV
-68/EGFP에 대한 항바이러스 효능
실험군을 상기 제조예를 통해 얻어진 시료의 종류에 따라 하기 5 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다.
실험군 1(아1): 메탄올 추출물(Total MeOH 추출물) 처리군
실험군 2(아2): 메탄올 추출물의 BuOH 분획물 처리군
실험군 3(아 3): 메탄올 추출물의 CHCl3 분획물 처리군
실험군 4(아4): 메탄올 추출물의 EtOAc 분획물 처리군
실험군 5(아 5): 메탄올 추출물의 헥산 분획물 처리군
마우스 감마 허피스바이러스인 MHV-68을 이용한 플라그 에세이(plaque assay)를 통해 아까시나무 추출물 및 그의 분획물의 항바이러스 효능을 시험하였다. 먼저 베로(Vero) 세포주에 아1 내지 아5의 시료들을10, 20, 50 ug/ml의 농도로 3시간 동안 전 처리한 후, MHV-68/EGFP 바이러스를 베로(Vero) 세포주에 MOI=0.1로 1시간 동안 감염시켰다. 바이러스 제거 후, 전처리와 같은 농도로 시료를 첨가한 배지에서 상기 세포를 3일 동안 배양하면서 EGFP의 발현을 형광현미경으로 관찰하였다. 또한, 세포를 수거한 후 바이러스 단백 ORF45 및 M9의 발현을 웨스턴블롯으로 확인하였으며, 감염 3일째의 SPNT를 수거하여 플라그 어세이를 통해 비리온 생산을 검정하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 아2, 아5에서 GFP 발현이 줄어들었으며, 바이러스 단백의 발현이 감소하여 10 ug/ml부터 농도에 의존적으로 항바이러스 효능를 보였다. 아2, 아5의 경우 또한 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 비리온 생산이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예
2. 마우스
감마허피스바이러스
,
MHV
-68에 대한 항바이러스 효능
마우스 감마 허피스바이러스인 MHV-68을 이용한 플라그 에세이(plaque assay)를 통해 보다 정량적으로 아까시나무 전추출물과 그의 분획물들의 항바이러스 효능을 검증하였다. 먼저 베로(Vero) 세포주에 아1 내지 아5의 시료들을10, 20, 50 ug/ml의 농도로 3시간 동안 전 처리한 후, MHV-68 바이러스를 베로(Vero) 세포주에 100 pfu/well로 감염시켰다. 바이러스 제거 후, 전처리와 같은 농도로 시료를 첨가한 배지에서 상기 세포를 5일 동안 배양하고, 형성된 플라그 수를 측정하였다. 그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 저농도 (10, 20, 50 ug/ml)의 시료 처리에서 아3, 아4가 항바이러스 효능을 나타내었으며, 아5가 용량의존적인 항바이러스 효능을 나타냈다.
실험예
2. 인체 감마-1
허피스바이러스
,
EBV
에 대한 항바이러스 효능
마우스 감마허피스바이러스의 모델에서 확인한 아까시나무 추출물의 항바이러스 효과가 유사한 인체 감마허피스바이러스에 대해서도 동일한 효과를 나타내는 지 확인하기 위해, 인간 감마허피스바이러스이고, 감마-1 허피스바이러스인 EBV에 대해 아까시나무 전추출물과 그의 분획물들의 항바이러스 효능을 확인하였다.
EBV가 잠복감염된 B95.8세포주에 시료 (10, 20, 50, 100 ug/ml)를 미리 1시간동안 처리한 후 TPA (20 ng/㎖)로 바이러스 재활성을 유도하였다. 재활성 유도 24시간 후 세포를 수거하여 DMSO 처리한 대조군과 비교하여 아1 내지 R5의 시료가 바이러스 복제에 미치는 영향을 EBV의 대표적인 활성 유전자(lytic gene)인 EA-D의 단백질 발현정도를 확인하는 웨스턴블럿(western blot)을 통해 조사하였다. 그런 다음, 대조군으로 사용된 알파-튜불린의 강도로 EA-D의 단백질의 강도를 나누어 바이러스 단백의 발현량을 정량적으로 분석하였다. 그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 모든 시료 처리군이 100 ug/ml에서 항바이러스 효능을 나타냈으며, 아4, 아5의 경우 탁월한 항바이러스 효능을 나타내었다. 또한, 정량적인 분석 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 처리한 시료농도에 의존적으로 바이러스 단백발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
실험예
3. 인체 감마-2
허피스바이러스
,
KSHV
에 대한 항바이러스 효능
인간 감마허피스바이러스이고, 감마-2 허피스바이러스인 KSHV에 대한 항바이러스 효능을 확인하기 위해, KSHV가 잠복감염된 세포인 BC-3G 세포주에 대해 아까시나무 전추출물과 그의 분획물들의 항바이러스 효능을 확인하였다.
본 실험실에서 확보하고 있는 BC-3G는 PAN 프로모터에 의해 녹색형광단백질(GFP)이 발현되는 유전자를 도입한 세포주로서 RTA가 발현되는 바이러스의 활성 감염(lytic replication)에 의해 GFP를 발현하는 리포터 세포주이다.
BC-3G에 아1 내지 아5의 시료(10, 20, 50, 100 ug/ml)를 처리하고 1시간 후 바이러스의 재활성을 유도하는 물질인 TPA(20ng/㎖)를 처리하였다. 24 시간 후, 유세포분석기 (FACS)로 살아있는 세포 중 재활성에 진입하여 바이러스 복제가 이루어진 세포의 수를 EGFP(+) 세포수로 분석하였으며, 실험은 3회 반복하였다. 그 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 아1,3,4,5는 50ug/ml, 100ug/ml에서 항바이러스 효능을 나타냈으며, 아2는 100ug/ml에서만 항바이러스 효능을 나타내었다.
이상 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 아까시나무 추출물 또는 그의 분획물은 현재로서 뚜렷한 치료제가 존재하지 않는 감마 허피스바이러스 감염의 치료 및 개선을 위해 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
Claims (16)
- 아까시나무의 수피 또는 지상부 추출물을 유효성분으로 포함하는 감마 허피스바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 아까시나무의 추출물은 아까시나무의 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물의 추출물인 감마 허피스바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 유기용매는 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 감마 허피스바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 아까시나무의 추출물은 아까시나무의 수피 또는 지상부의 에탄올 추출물인 감마 허피스바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 수피 또는 지상부의 유기용매 추출물을 추가의 유기용매로 재분획한 분획물인 감마 허피스바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 수피 또는 지상부의 에탄올 추출물을 헥산으로 재분획한 분획물인 감마 허피스바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 감마 허피스바이러스는 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV) 또는 카포시육종 허피스바이러스(Kaposi's sarcoma associated virus, KSHV)인 감마 허피스바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 감마 허피스바이러스 감염으로 인한 전염성단핵구증, 버킷림프종, 코인두암종, B림프종양, 위암, 카포시육종 및 B림프종양으로 이루어진 그룹에서 선택되는 질환의 치료를 위한 것인 감마 허피스바이러스 감염 치료용 의약 조성물.
- 아까시나무의 수피 또는 지상부 추출물을 포함하는 감마 허피스바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물의 추출물인 감마 허피스바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 유기용매는 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 감마 허피스바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 수피 또는 지상부의 에탄올 추출물인 감마 허피스바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 수피 또는 지상부의 유기용매 추출물을 추가의 유기용매로 재분획한 분획물인 감마 허피스바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 아까시나무 추출물은 아까시나무의 수피 또는 지상부의 에탄올 추출물을 헥산으로 재분획한 분획물인 감마 허피스바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
- 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 감마 허피스바이러스는 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV) 또는 카포시육종 허피스바이러스(Kaposi's sarcoma associated virus, KSHV)인 감마 허피스바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
- 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 감마 허피스바이러스 감염으로 인한 전염성단핵구증, 버킷림프종, 코인두암종, B림프종양, 위암, 카포시육종 및 B림프종양으로 이루어진 그룹에서 선택되는 질환의 치료를 위한 것인 감마 허피스바이러스 감염 개선용 식품 조성물.
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