KR20190115861A - 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 수두-대상포진 바이러스 및 e형 간염 바이러스 억제용 약학적 조성물 - Google Patents
갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 수두-대상포진 바이러스 및 e형 간염 바이러스 억제용 약학적 조성물Info
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Abstract
본 발명은 수두-대상포진 바이러스 및 E형 간염 바이러스의 증식 억제 효능을 갖는 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물에 관한 것이다.
본 발명의 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물은 수두-대상포진 바이러스의 복제를 위한 Immediate early(IE) 유전자, Early(E) 유전자, Late(L) 유전자의 발현을 억제하고, 또한 E형 간염 바이러스의 복제를 위한 ORF2 영역의 발현을 억제할 수 있으므로, 상기 추출물 및 분획물은 수두-대상포진 바이러스 또는 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물은 수두-대상포진 바이러스의 복제를 위한 Immediate early(IE) 유전자, Early(E) 유전자, Late(L) 유전자의 발현을 억제하고, 또한 E형 간염 바이러스의 복제를 위한 ORF2 영역의 발현을 억제할 수 있으므로, 상기 추출물 및 분획물은 수두-대상포진 바이러스 또는 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 수두-대상포진 바이러스 및 E형 간염 바이러스의 증식 억제 효능을 갖는 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물에 관한 것이다.
수두-대상포진 바이러스(Varicella-Zoster Virus; VZV)는 인간 병원성 바이러스로 전염성이 매우 높으며 주로 겨울과 봄에 2 내지 8세 소아에서 많이 발병된다. 수두-대상포진 바이러스는 감염시 Immediate early(IE) 유전자, Early(E) 유전자, Late(L) 유전자의 순차적 발현을 통해 바이러스의 DNA를 복제한다. ORF(open reading frame)62에 의해 암호화된 IE62 단백질은 용균(lytic) 작용 관련 유전자의 활성화에 필수적으로, 전사인자들과 결합해 E 유전자들의 발현을 유도한다. E 유전자들은 수두-대상포진 바이러스 복제에 결정적인 역할을 하며, L 유전자들의 발현을 유도해 비리온(virion)을 구성하는 구성요소들의 전사를 촉진한다.
수두-대상포진 바이러스의 1차 감염에 의해 수두가 발생하지만, 상기 바이러스가 신경절에 잠복하여 있다가 재활성화되면 대상포진으로 발생하기도 한다.
수두나 대상포진은 정상인에서는 대개 경과가 양호하지만, 혈액종양질환 환자, 고형장기이식 혹은 조혈모세포이식을 받은 환자, 또는 자가면역질환이나 선천성면역결핍질환 환자들에서 발병할 경우에는 치명적일 수 있다.
수두-대상포진 바이러스에 대한 백신은 1970년대에 일본에서 개발되었고, 국내에서도 1988년 수두 백신이 도입된 이후 2005년부터 국가필수예방접종에 포함되어 접종되고 있다. 수두 백신이 도입된 이후 수두, 대상포진의 발병률과 입원율은 현격하게 감소하였다. 미국에서는 백신 접종률이 증가함에 따라 백신 접종 전에 비해서 수두 발병률은 71-84% 감소하였고, 수두와 연관된 입원율은 75~88% 감소하였다. 또한 50세 이하 연령에서 수두로 인한 사망률이 66% 감소하였으며, 특히 1 내지 4세 소아에서의 사망률이 92% 감소하는 효과가 나타났다.
그러나 국내에서도 수두 백신이 국가필수예방접종에 포함된 이후 80%를 상회하는 높은 백신 접종률을 나타내고 있음에도, 매년 180,000~240,000건의 발병례가 보고되고 있다. 이는 백신을 맞았을 때 수두 백신에 의해 항체가 생성되는 비율이 77~82%로 다른 백신에 비해 낮은 편이기 때문에 백신 접종에도 불구하고 발병하는 경우인 돌파 감염(breakthrough infection)이나 면역력의 감소가 그 원인으로 추정되며, 이는 면역저하 환자나 접종을 받지 못한 경우에서 그 위험성이 더 높다. 이에 수두는 예방뿐만 아니라 치료제의 필요성이 높은 질환이다.
수두-대상포진 바이러스는 헤르페스 바이러스과(Herpesviridae)에 속하는 바이러스로 헤르페스 바이러스과는 물집, 피부 박리, 뇌염, 통증, 감각이상 및 신경계 손상 등 각종 증세를 일으키며, 참조도 1과 같이 몇 가지로 분화되어 있다.
[참조도 1]
헤르페스 바이러스과에 속하는 바이러스들은 하기 표 1과 같이 신장에 감염되고 세포거대화(cytomegalic) 증상을 일으키는 사이토메갈로바이러스(Human Herpes Virus-5; HHV-5), 림프조직에 감염되고 림프구 증식(lymphoproliferative) 현상을 일으키는 엡스타인-바 바이러스(Human Herpes Virus-5; HHV-4) 등과 같이 서로 다른 감염부위 및 생활주기(life cycle)를 갖도록 분화되어 있다. 알파 아과에 속하는 단순 헤르페스 바이러스-1(Herpes simplex virus-1; HSV-1), 단순 헤르페스 바이러스-2(Herpes simplex virus-2; HSV-2)는 표 2에서와 같이 수두-대상포진 바이러스와 유전체 단계에서부터 차이를 갖고 있어 같은 헤르페스 바이러스과라 할지라도 각 바이러스에 맞는 치료제의 개발이 요구된다.
| 명칭 | 아과 (subfamily) |
속 (genus) |
생활사/ 세포병리적 특징 |
감염시 잠복 부위 | |
| HHV-1 | 단순 헤르페스 바이러스-1 (Herpes simplex virus-1) |
Alpha | Simplexvirus | 짧은 생활주기/ 세포용해 |
신경 |
| HHV-2 | 단순 헤르페스 바이러스-2 (Herpes simplex virus-2) |
Alpha | Simplexvirus | 짧은 생활주기/ 세포용해 |
신경 |
| HHV-3 | 수두-대상포진 바이러스 (Varicella-zoster virus) |
Alpha | Varicellovirus | 짧은 생활주기/ 세포용해 |
신경 |
| HHV-4 | 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus) |
Gamma | Lymphocryptovirus | 다양한 생활주기/ 림프구 증식 |
림프 조직 |
| HHV-5 | 거대세포 바이러스 (Cytomegalovirus) | Beta | Cytomegalovirus | 긴 생활주기/ 세포거대화 |
샘(gland), 신장 |
| HHV-6 | 단순 헤르페스 바이러스-6 (Herpes simplex virus-6) |
Beta | Roseolavirus | 긴 생활주기/ 림프구 증식 |
림프 조직 |
| HHV-7 | 단순 헤르페스 바이러스-7 (Herpes simplex virus-7) |
Beta | Roseolavirus | 긴 생활주기/ 림프구 증식 |
림프 조직 |
| HHV-8 | 카포시 육종 유발 바이러스 (Kaposi's sarcoma associated virus) |
Gamma | Rhadinovirus | 다양한 생활주기/ 림프구 증식 |
림프 조직 |
| HSV-1(HHV-1) 및 HSV-2(HHV-2) | VZV(HHV-3) | ||
| genome | 크기 | ~152Kbp | ~125Kbp |
| GC 비율 | 67% | 47% | |
| 단백질 | Immediate Early 단백질 | ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47 | IE4, IE62 및 IE63 |
| 외피 단백질 | UL46-49 | ORF9-12 | |
| 감염시 잠복하는 신경 |
HSV-1: 삼차신경절 (Trigeminal ganglia), HSV-2: 엉치신경절 (Sacral ganglia) |
Sensory ganglia (감각신경절) |
|
현재 수두-대상포진 바이러스 치료용으로는 아시클로버(acyclovir; ACV), 팜시클로버(famciclovir), 발라시클로비르(valacyclovir) 및 포스카르넷(foscarnet)을 포함해 DNA 폴리머레이즈(DNA polymerase)에 작용하는 약물들이 이용된다. 그러나, 상기 항바이러스제는 면역력이 약화된 만성감염 환자들에게 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 상기 항바이러스제에 내성을 갖는 종류가 나타나고 있어 수두-대상포진 바이러스 치료를 위해서는 수두-대상포진 바이러스에 적합하고 상기 부작용을 해소한 치료제의 개발이 요구된다.
E형 간염은 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV)로 오염된 식수에 의해서 경구로 전파되는 대변-구강 루트(fecal-oral route)를 통해 전염되며 그 유병률은 각 나라의 보건위생 및 경제적 수준과 밀접한 연관이 있다. 이러한 이유에서 인도, 네팔, 미얀마, 파키스탄, 중국 등 아시아 국가와 수단, 소말리아 등 아프리카 국가, 그리고 멕시코 등 라틴 아메리카 국가에서 주로 발병하고 있으며, 기타 지역 및 경제적 수준이 상대적으로 높은 국가에서는 산발적으로 보고되고 있다.
E형 간염의 원인이 되는 E형 간염 바이러스는 다른 간염 바이러스와 차별화된 바이러스로 감염시 약 2주간 바이러스 혈증(virus 血症; viremina)을 나타낸다. 또한, 주증상으로 황달 이외에 혈장 빌리루빈 상승, 복통, 식욕부진, 간종대(肝腫大; hepatomegalia), 구토, 발열 등의 증상이 동반된다. E형 간염 바이러스 감염에 의한 증상은 평균적으로 40일간 지속되고, 이후 대부분은 자연 치유되나 일부는 간경변으로 만성화된다. 일반적인 경우 3% 정도의 낮은 치사율을 나타내지만, 임산부나 노약자 등에서는 25 내지 30%까지 그 치사율이 상승한다.
E형 간염 바이러스는 헤페 바이러스과(Hepeviridae)에 속하는 바이러스로 약 7.2kb 길이의 단일 RNA 가닥으로 되어 있으며, 구체적으로는 (+)-센스 가닥 RNA 게놈을 갖는다. E형 간염 바이러스 게놈은 ORF(open reading frame) 1, 2 및 3을 포함하는데 ORF1은 Met(methyltransferase) 도메인, Y 도메인, PCP(papain-like cysteine protease) 도메인, HVR(hypervariable region), Pro(proline-rich region), X-도메인, Hel(helicase) 도메인 및 RdRp(RNA dependent RNA polymerase)의 기능적 도메인을 가진 폴리단백질(polyprotein)인 비-구조적 복제효소(non-structural replicase)를 암호화한다. ORF2와 ORF3의 암호화 영역은 중첩되며 바이시스트로닉 하위-지노믹 RNA(bicistronic sub-genomic RNA)로부터 번역된다. ORF2는 HSPG(heparin sulfate proteoglycan), HSP90(heat-shock protein 90) 및 Grp78(glucose-regulated protein 78)과 같은 세포 단백질에 결합하는 캡시드(capsid) 단백질을 암호화하며, ORF3은 E형 간염 바이러스 비리온(virion)의 방출에 중요한 다기능 인산단백질(multifunctional phosphoprotein)을 암호화한다. ORF3은 TRADD(tumor necrosis factor receptor 1-associated death domain) 단백질을 분해하고 RIP1(receptor interacting protein 1) 단백질의 유비퀴틴화(ubiquitination)를 감소시켜 NF-κB 활성화를 억제함으로써 숙주의 선천적 면역 반응을 억제하는 것으로 보고되었다.
숙주세포 안으로 들어간 E형 간염 바이러스의 바이러스 게놈 RNA는 ORF1의 번역을 위한 mRNA 및 복제를 위한 주형의 역할을 한다. 바이러스 게놈 RNA에서 ORF1 단백질이 번역되고, 가장 큰 ORF1 도메인인 RdRp는 (-)-센스 RNA를 합성한다. (+)-센스 게놈 및 서브 게놈 RNA는 RdRp에 의해 (-)-센스 RNA를 주형으로 사용하여 합성된다. ORF2 및 ORF3은 서브 게놈 RNA로부터 번역되고, 바이러스 게놈 RNA는 비리온 안으로 패키징된다.
현재 E형 간염 바이러스에 유효한 치료제는 없으며, 일반적으로 만성 간염에 대해 리바비린(ribavirin) 및 인터페론 알파(interferon α)를 투여하나, 장기 투여시 다양한 부작용을 나타내는 E형 간염의 치료를 위해서는 E형 간염 바이러스에 적합하고 상기 부작용을 해소한 치료제의 개발이 요구된다.
갯까치수영(Lysimachia mauritiana)은 제주도, 울릉도를 비롯한 남부지역 바닷가 바위지대에 분포하는 쌍떡잎식물로써 어린잎은 식용하고 열매는 관상용으로 쓰인다. 한방에서는 강심제와 이뇨제로 이용되며 고혈압, 당뇨, 변비, 부종 및 타박상 등에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 대한민국 등록특허 제10-1168567호에서는 갯까치수영에 함유된 사포닌(saponin)계열 물질의 항곰팡이 활성을 개시하고 있는 등 갯까치수영의 용도에 대한 다양한 방면으로 활용이 증가하고 있다.
이에 본 발명자들은 갯까치수영 추출물(Lysimachia mauritiana extracts; LME) 또는 이의 분획물이 수두-대상포진 바이러스 및 E형 간염 바이러스의 증식 억제 효능을 갖는 것을 확인하여, 수두-대상포진 바이러스 및 E형 간염 바이러스 치료제에 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 수두-대상포진 바이러스 및 E형 간염 바이러스의 감염으로 인한 질환의 치료 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물은 수두-대상포진 바이러스의 복제를 위한 Immediate early(IE) 유전자, Early(E) 유전자, Late(L) 유전자의 발현을 억제하고, 또한 E형 간염 바이러스의 복제를 위한 ORF2 영역의 발현을 억제할 수 있으므로, 상기 추출물 및 분획물은 수두-대상포진 바이러스 또는 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 갯까치수영 추출물의 수두-대상포진 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
VZV-pOka: 수두-대상포진 바이러스(VZV)의 인공적으로 재조합된 pOka 균주;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군;
BF: 광학현미경이미지(Bright field microscopic image);
FL: 형광현미경이미지(Fluorescence microscopic image); 및
hpi: 감염 후 시간(hours post-infection).
도 2는 갯까치수영 추출물의 농도에 따른 수두-대상포진 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
VZV-YC01: 임상에서 얻은 수두-대상포진 바이러스(VZV) YC01 균주.
도 3은 갯까치수영 추출물의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 4는 갯까치수영 추출물의 수두-대상포진 바이러스 Immediate early(IE) 유전자, Early(E) 유전자 및 Late(L) 유전자 억제 효과를 나타낸 도이다:
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군;
ORF62: Open reading frame 62;
ORF28: Open reading frame 28;
gB: 당단백질 B(glycoprotein B); 및
hpi: 감염 후 시간(hours post-infection).
도 5는 갯까치수영 추출물의 수두-대상포진 바이러스 IE62(Immediate early 62) 단백질 억제 효과를 나타낸 도이다:
VZV-pOka: 인공적으로 재조합된 수두-대상포진 바이러스(VZV) pOka 균주;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군; 및
IE62: Immediate early 62 단백질.
도 6은 갯까치수영 추출물의 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군; 및
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군.
도 7은 갯까치수영 추출물의 농도에 따른 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과 및 세포독성을 나타낸 도이다:
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군.
도 8은 갯까치수영 추출물의 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군;
HEV: E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus);
BF: 광학현미경이미지(Bright field microscopic image); 및
FL: 형광현미경이미지(Fluorescence microscopic image).
도 9는 갯까치수영 추출물의 세포독성을 나타낸 도이다:
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군.
도 10은 갯까치수영 추출물을 유기용매로 분획하는 과정을 나타내는 모식도이다:
EtOH: 에탄올(Ethanol);
CHCl3: 클로로포름(Chloroform);
EtOAc: 에틸아세테이트(Ethyl acetate);
n-BuOH: 부탄올(n-butanol); 및
ddH2O: 재증류수(Double distilled water).
도 11은 갯까치수영 분획물의 수두-대상포진 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
VZV-pOka: 인공적으로 재조합된 수두-대상포진 바이러스(VZV) pOka 균주;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군; 및
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군.
도 12는 갯까치수영 분획물의 세포독성을 나타낸 도이다:
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군;
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군; 및
HFF: 음경 포피 섬유모세포(Human foreskin fibroblast).
도 13은 갯까치수영 분획물의 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
pSHEV3-luciferase replicon: 3형 유전자형의 돼지 E형 간염 바이러스(HEV) 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 레플리콘;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군; 및
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군.
도 14는 갯까치수영 분획물의 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
HEV47832c: 3형 유전자형의 E형 간염 바이러스(HEV) 47832c 균주;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군 ;
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군; 및
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군.
도 15는 갯까치수영 분획물의 세포독성을 나타낸 도이다.
Huh7.5 cell: 인간 간암종 세포주(Human hepatocellular carcinoma cell);
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군; 및
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군.
도 16은 갯까치수영 분획물의 세포독성을 나타낸 도이다.
A549 cell: 인간 폐암종 세포주(Human adenocarcinoma cell);
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군; 및
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군.
VZV-pOka: 수두-대상포진 바이러스(VZV)의 인공적으로 재조합된 pOka 균주;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군;
BF: 광학현미경이미지(Bright field microscopic image);
FL: 형광현미경이미지(Fluorescence microscopic image); 및
hpi: 감염 후 시간(hours post-infection).
도 2는 갯까치수영 추출물의 농도에 따른 수두-대상포진 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
VZV-YC01: 임상에서 얻은 수두-대상포진 바이러스(VZV) YC01 균주.
도 3은 갯까치수영 추출물의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 4는 갯까치수영 추출물의 수두-대상포진 바이러스 Immediate early(IE) 유전자, Early(E) 유전자 및 Late(L) 유전자 억제 효과를 나타낸 도이다:
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군;
ORF62: Open reading frame 62;
ORF28: Open reading frame 28;
gB: 당단백질 B(glycoprotein B); 및
hpi: 감염 후 시간(hours post-infection).
도 5는 갯까치수영 추출물의 수두-대상포진 바이러스 IE62(Immediate early 62) 단백질 억제 효과를 나타낸 도이다:
VZV-pOka: 인공적으로 재조합된 수두-대상포진 바이러스(VZV) pOka 균주;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군; 및
IE62: Immediate early 62 단백질.
도 6은 갯까치수영 추출물의 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군; 및
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군.
도 7은 갯까치수영 추출물의 농도에 따른 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과 및 세포독성을 나타낸 도이다:
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군.
도 8은 갯까치수영 추출물의 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군;
HEV: E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus);
BF: 광학현미경이미지(Bright field microscopic image); 및
FL: 형광현미경이미지(Fluorescence microscopic image).
도 9는 갯까치수영 추출물의 세포독성을 나타낸 도이다:
LME: 갯까치수영 추출물 처리 실험군.
도 10은 갯까치수영 추출물을 유기용매로 분획하는 과정을 나타내는 모식도이다:
EtOH: 에탄올(Ethanol);
CHCl3: 클로로포름(Chloroform);
EtOAc: 에틸아세테이트(Ethyl acetate);
n-BuOH: 부탄올(n-butanol); 및
ddH2O: 재증류수(Double distilled water).
도 11은 갯까치수영 분획물의 수두-대상포진 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
VZV-pOka: 인공적으로 재조합된 수두-대상포진 바이러스(VZV) pOka 균주;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군; 및
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군.
도 12는 갯까치수영 분획물의 세포독성을 나타낸 도이다:
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군;
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군; 및
HFF: 음경 포피 섬유모세포(Human foreskin fibroblast).
도 13은 갯까치수영 분획물의 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
pSHEV3-luciferase replicon: 3형 유전자형의 돼지 E형 간염 바이러스(HEV) 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 레플리콘;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군; 및
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군.
도 14는 갯까치수영 분획물의 E형 간염 바이러스 증식 억제 효과를 나타낸 도이다:
HEV47832c: 3형 유전자형의 E형 간염 바이러스(HEV) 47832c 균주;
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군 ;
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군; 및
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군.
도 15는 갯까치수영 분획물의 세포독성을 나타낸 도이다.
Huh7.5 cell: 인간 간암종 세포주(Human hepatocellular carcinoma cell);
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군; 및
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군.
도 16은 갯까치수영 분획물의 세포독성을 나타낸 도이다.
A549 cell: 인간 폐암종 세포주(Human adenocarcinoma cell);
DMSO: 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 처리 대조군;
LM-total: 갯까치수영 70% 에탄올 추출물 처리 실험군;
LM-EA: 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 실험군;
LM-BuOH: 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물 처리 실험군;
LM-DW: 갯까치수영 추출물의 재증류수 분획물 처리 실험군;
LM-CHCl3: 갯까치수영 추출물의 클로로포름 분획물 처리 실험군; 및
LM-Hx: 갯까치수영 추출물의 헥산 분획물 처리 실험군.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 갯까치수영 추출물은 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:
1) 갯까치수영에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과된 여과물을 감압농축한 후 건조하는 단계.
상기 제조방법에서, 갯까치수영은 갯까치수영의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 껍질 등 모든 부위를 포함할 수 있다.
또한, 상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C2의 저급 알코올 수 있고, 구체적으로, 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 추출용매는 70% 에탄올일 수 있다. 상기 추출용매는 추출에 사용되는 갯까치수영의 중량 1 g당 1.7 ㎖의 양으로 첨가될 수 있다.
상기 추출방법은 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출일 수 있다. 이때, 추출 시간은 72 시간일 수 있다.
한편, 상기 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있고, 구체적으로는 동결건조일 수 있다
상기 분획물은 갯까치수영 추출물은 계속해서 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물로 더 분획될 수 있으며, 본 발명에 따른 갯까치수영의 각 분획물들의 제조에 사용되는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올의 농도 및 양, 진탕 및 분액의 반복 횟수 및 농축의 정도 등은 사용 용도에 따라 용이하게 변경 가능하다.
상기 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환은 수두(Varicella), 대상포진(Herpes Zoster)을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 조성물은 수두-대상포진 바이러스 복제를 위한 Immediate-early(IE) 유전자, Early(E) 유전자 및 Late(L) 유전자의 발현 억제효과를 나타낸다.
상기 수두-대상포진 바이러스의 Immediate-early(IE) 유전자는 ORF62(IE62) 유전자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 수두-대상포진 바이러스의 Early(E) 유전자는 ORF28 유전자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 수두-대상포진 바이러스의 Late(L) 유전자는 glycoprotein B(gB) 유전자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 갯까치수영 추출물은 수두-대상포진 바이러스 DNA 복제 억제 효과를 갖는 것으로 나타났고(도 1 및 도 2), IC50 농도에서 세포독성을 보이지 않았다(도 3). 수두-대상포진 바이러스에 감염된 세포에서 갯까치수영 추출물 처리된 군은 Immediate early 유전자인 ORF62의 전사, Early 유전자인 ORF28의 전사 및 Late 유전자인 gB의 전사가 감소되는 것으로 나타나고(도 4), ORF62의 전사 및 번역을 통해 합성되는 IE62 단백질도 발현이 감소되는 것으로 나타났다(도 5). 또한 상기 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물은 5 ㎍/ml 이하의 농도에서 세포독성 없이 수두-대상포진 바이러스 복제 억제 효과를 나타내었다(도 11 및 도 12).
따라서 상기 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 수두-대상포진 바이러스의 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 갯까치수영 추출물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 10 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물은 상기 서술한 바와 같다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 갯까치수영 추출물은 수두-대상포진 바이러스 DNA 복제 억제 효과를 갖는 것으로 나타났고(도 1 및 도 2), IC50 농도에서 세포독성을 보이지 않았다(도 3). 수두-대상포진 바이러스에 감염된 세포에서 갯까치수영 추출물 처리된 군은 Immediate early 유전자인 ORF62의 전사, Early 유전자인 ORF28의 전사 및 Late 유전자인 gB의 전사가 감소되는 것으로 나타나고(도 4), ORF62의 전사 및 번역을 통해 합성되는 IE62 단백질도 발현이 감소되는 것으로 나타났다(도 5). 또한 상기 갯까치수영 추출물의 부탄올 분획물은 5 ㎍/ml 이하의 농도에서 세포독성 없이 수두-대상포진 바이러스 복제 억제 효과를 나타내었다(도 11 및 도 12).
따라서 상기 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 수두-대상포진 바이러스의 감염으로 인한 질환의 개선용 건강기능식품에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
본 발명은 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 갯까치수영 추출물은 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:
1) 갯까치수영에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과된 여과물을 감압농축한 후 건조하는 단계.
상기 제조방법에서, 갯까치수영은 갯까치수영의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 껍질 등 모든 부위를 포함할 수 있다.
또한, 상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C2의 저급 알코올 수 있고, 구체적으로, 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 추출용매는 70% 에탄올일 수 있다. 상기 추출용매는 추출에 사용되는 갯까치수영의 중량 1 g당 1.7 ㎖의 양으로 첨가될 수 있다.
상기 추출방법은 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출일 수 있다. 이때, 추출 시간은 72 시간일 수 있다.
한편, 상기 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있고, 구체적으로는 동결건조일 수 있다
상기 분획물은 갯까치수영 추출물은 계속해서 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물로 더 분획될 수 있으며, 본 발명에 따른 갯까치수영의 각 분획물들의 제조에 사용되는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올의 농도 및 양, 진탕 및 분액의 반복 횟수 및 농축의 정도 등은 사용 용도에 따라 용이하게 변경 가능하다.
상기 조성물은 E형 간염 바이러스 증식 억제효과를 나타낸다.
상기 조성물은 E형 간염 바이러스 ORF2 유전자 발현 억제효과를 나타낸다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 갯까치수영 추출물은 E형 간염 바이러스 RNA 복제 억제 효과를 갖는 것으로 나타났고(도 6 내지 도 8), IC50 농도에서 세포독성을 보이지 않았다(도 7B). E형 간염 바이러스에 감염된 세포에서 갯까치수영 추출물 처리된 군은 ORF2 캡시드 발현 감소 효과가 나타났다(도 8). 또한 상기 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 10 ㎍/ml 이하의 농도에서 세포독성 없이 수두-대상포진 바이러스 복제 억제 효과를 나타내었다(도 13 내지 도 16).
따라서 상기 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 E형 간염 바이러스의 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 갯까치수영 추출물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 10 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는, E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물은 상기 서술한 바와 같다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 갯까치수영 추출물은 E형 간염 바이러스 RNA 복제 억제 효과를 갖는 것으로 나타났고(도 6 내지 도 8), IC50 농도에서 세포독성을 보이지 않았다(도 7B). E형 간염 바이러스에 감염된 세포에서 갯까치수영 추출물 처리된 군은 ORF2 캡시드 발현 감소 효과가 나타났다(도 8). 또한 상기 갯까치수영 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 10 ㎍/ml 이하의 농도에서 세포독성 없이 수두-대상포진 바이러스 복제 억제 효과를 나타내었다(도 13 내지 도 16).
따라서 상기 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 E형 간염 바이러스의 감염으로 인한 질환의 개선용 건강기능식품에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 갯까치수영 추출물(LME) 및 이의 분획물의 제조
갯까치수영(Lysimachia mauritiana)은 제주도와 거제도에서 수집된 개체를 이용하였으며, 식물표본은 성균관대학교 생명과학과 표본실 및 가천대학교 약학대학 표본실에 보관중이다.
구체적으로, 건조시킨 갯까치수영(3 kg)에 대해 70% 에탄올(EtOH)을 용매로 72 시간 동안 실온에서 70% 에탄올 5 L로 추출한 후, 회전 감압 농축기로 농축, 285 g의 에탄올 추출물을 수득하였다.
상기 추출물을 물(ddH2O)에 재현탁 후 액체분획(liquid-partitioning) 기술을 이용하여 n-헥산(n-Hexane) 분획물 52 g, 클로로포름 (CHCl3) 분획물 17 g, 에틸 아세테이트 (EtOAc) 분획물 15 g, n-부탄올(n-BuOH) 분획물 60 g 및 물 분획물 135 g을 수득하였으며, 동결건조 후 상기 추출물 및 분획물들을 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다(도 10).
실험예 1. 갯까치수영 추출물(LME)의 수두-대상포진 바이러스(VZV) 증식 억제
갯까치수영 추출물이 수두-대상포진 바이러스 복제를 억제할 수 있는지 조사하였다.
미감염 상태의 MRC-5 세포(Korean Cell Line Bank no.10171)를 green fluorescent protein을 발현하는 인공적으로 재조합된 수두-대상포진 바이러스 pOka 균주(충북대학교)로 0.1의 MOI(multiplicity of infection)로 감염시키고, 갯까치수영 추출물을 50 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 후, 0, 24, 48 또는 72 시간째에, 디지털 카메라와 Nikon NIS-Elements 현미경 이미징 소프트웨어가 설치된 니콘 TS100-F 인버티드(inverted) 형광 현미경(Tokyo, Japan)을 사용하여 분석하였다. 또한 처리 후, 0, 24, 48 또는 72 시간째에, 표 3의 ORF62 프라이머를 이용해 quantitative PCR(qPCR)로 VZV-pOka-GFP DNA의 양을 측정하였다. 구체적으로, qPCR은 Accuprep Genomic DNA Extraction kit(Bioneer)를 이용해 total DNA를 분리하였고, StepOnePlus Real-Time PCR system(Applied Biosystem)을 이용, 제조사의 프로토콜에 따라 증폭 및 측정하였다.
그 결과 도 1A에 나타낸바와 같이, 처리 72시간 후 갯까치수영 추출물을 처리한 세포의 형광발현은 DMSO 처리군에 비해 상당히 감소하였다. 또한 도 1B에 나타낸바와 같이, 대조군으로 DMSO를 처리한 경우에 비해, 48 시간 및 72 시간 후 VZV-pOka-GFP DNA가 각각 170000 배 및 280000 배 증폭되었다. 그러나 갯까치수영 추출물을 처리한 세포의 경우, 48 시간 및 72 시간 후 VZV-pOka-GFP DNA 복제가 대조군에 비해 각각 3.8 배 및 4.7 배 감소하였다. 상기 결과는 갯까치수영 추출물이 수두-대상포진 바이러스의 복제를 억제할 수 있음을 제시한다.
| 프라이머명 | 서열 | 서열번호 |
| VZV ORF62 Forward | 5’-TCTTGTCGAGGAGGCTTCTG-3’ | 1 |
| VZV ORF62 Reverse | 5’-TGTGTGTCCACCGGATGAT-3’ | 2 |
| GAPDH Forward | 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’ | 3 |
| GAPDH Reverse | 5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’ | 4 |
실험예 2. 갯까치수영 추출물(LME)의 수두-대상포진 바이러스(VZV) 복제 억제 농도 결정
<2-1> 수두-대상포진 바이러스 복제 억제 활성에 있어 갯까치수영 추출물의 IC
50
결정
수두-대상포진 바이러스 복제 억제 활성에 있어서 갯까치수영 추출물의 IC50(VZV의 증식을 50% 억제하는 농도)을 확인하고자 하였다.
미감염 상태의 MRC-5 세포를 임상에서 얻은 수두-대상포진 바이러스 YC01 균주(충북대학교, VZV-YC01)로 감염시킨 후, 갯까치수영 추출물을 각 5, 10, 25 또는 50 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 후 3 일째에 동일한 농도로 재처리를 하였으며, 6 일째에 플라크의 수를 측정하였다.
그 결과 도 2에 나타낸바와 같이, 갯까치수영 추출물은 농도 의존적으로 플라스크의 수를 감소시켰으며, 특히 25 내지 50 ㎍/ml 농도에서 우수한 항바이러스 활성을 나타내었다. 수두-대상포진 바이러스의 증식을 50% 억제하는 농도(IC50)는 26.09 ㎍/ml로 나타났다.
<2-2> 갯까치수영 추출물의 세포독성
갯까치수영 추출물의 세포독성 유무를 확인하고자 하였다.
MRC-5 세포에 갯까치수영 추출물을 각 0, 5, 10, 25 및 50 ㎍/ml의 농도로 처리하고, 0, 24, 48 또는 72 시간째에 CellTiter-Glo luminescent cell viability assay(Promega)를 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
그 결과 도 3에 나타낸바와 같이, 갯까치수영 추출물로 처리된 경우 처리한 모든 농도에서 처리 당시에(0시간 후) 세포 생존율 감소가 없었으나, 48 시간 및 72 시간 후에는 50 ㎍/ml 갯까치수영 추출물로 처리된 경우 각각 33% 및 39%의 세포 생존율 감소가 나타났다. 그러나 갯까치수영 추출물은 IC50의 농도에서는 유의한 세포독성을 나타내지 않은 바, 이 결과는 갯까치수영 추출물의 수두-대상포진 바이러스 억제 효과가 세포독성에 의한 것이 아님을 제시한다.
실험예 3. 갯까치수영 추출물(LME)에 의한 수두-대상포진 바이러스 Immediate Early(IE) 유전자, Early(E) 유전자 또는 Late(L) 유전자의 억제 발현
갯까치수영 추출물에 의한 항수두-대상포진 바이러스 억제 효과의 분자 기전으로, 수두-대상포진 바이러스의 용해성 복제(lytic replication)에 필요한 Immediate early(IE) 유전자, Early(E) 유전자 또는 Late(L) 유전자의 발현을 조절할 수 있는지 조사하였다.
<3-1> 수두-대상포진 바이러스 Immediate Early(IE) 유전자, Early(E) 유전자 또는 Late(L) 유전자의 mRNA 발현
미감염 상태의 MRC-5 세포를 임상에서 얻은 수두-대상포진 바이러스 YC01(VZV-YC01) 균주로 0.1의 MOI(multiplicity of infection)로 감염시키고, 갯까치수영 추출물을 25 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 후, 0, 24, 48 또는 72 시간째에 수두-대상포진 바이러스의 IE 유전자인 ORF62, E 유전자인 ORF28 및 L 유전자인 gB의 mRNA 발현 정도를 각각 표 4의 프라이머를 이용해 qRT-PCR(quantitative reverse transcription PCR)로 분석하였다. 구체적으로, qRT-PCR을 위한 주형 cDNA는, HiGene™ Total RNA Prep kit(BIOFACT)을 이용하여 total RNA를 분리한 후, QuantiTect reverse transcription kit(Qiagen)를 이용한 역전사 과정을 통해 합성되었다. 상기 과정은 제조사 메뉴얼에 따라 수행하였으며, 합성된 cDNA는 StepOnePlus Real-Time PCR system(Applied Biosystems)에서 증폭 후 정량되었다.
| 프라이머명 | 서열 | 서열번호 |
| VZV ORF62 Forward | 5’-TCTTGTCGAGGAGGCTTCTG-3’ | 1 |
| VZV ORF62 Reverse | 5’-TGTGTGTCCACCGGATGAT-3’ | 2 |
| ORF28(E) Forward | 5’-CGAACACGTTCCCCATCAA-3’ | 5 |
| ORF28(E) Reverse | 5’-CCCGGCTTTGTTAGTTTTGG-3’ | 6 |
| gB(L) Forward | 5’-GATGGTGCATACAGAGAACATTCC-3’ | 7 |
| gB(L) Reverse | 5’-CCGTTAAATGAGGCGTGACTAA-3’ | 8 |
| GAPDH Forward | 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’ | 3 |
| GAPDH Reverse | 5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’ | 4 |
그 결과 도 4에 나타낸바와 같이, 갯까치수영 추출물을 처리하더라도 처리 24 시간 후까지는 수두-대상포진 바이러스 용해성 유전자 발현(lytic gene expression)에 영향이 없으나, 48 시간 및 72시간 후에는 DMSO 처리된 군에 비해서 ORF62, ORF28 및 gB의 전사를 감소시키는 것으로 나타났다.
<3-2> 수두-대상포진 바이러스 Immediate Early(IE) 유전자의 단백질 발현
IE 유전자인 ORF62에 의해 암호화되는 단백질 레벨을 측정하기 위해 웨스턴 블롯(Western blot)을 실시하였다.
미감염 상태의 MRC-5 세포를 인공적으로 재조합된 수두-대상포진 바이러스 pOka 균주(VZV-pOka)로 0.1의 MOI(multiplicity of infection)로 감염시키고, 갯까치수영 추출물을 25 ㎍/ml의 농도로 처리한 후, 72 시간 후 세포를 수득한 후, Kim 등이 2015년에 J Microbiol 53: 732-738에서 이용한 방법을 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 일차 항체로는 VZV IE62(Abcam)와 tubulin(Sigma-Aldrich) 항체를, 이차 항체로는 peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin G(Amersham Biosciences) 항체를 제조사의 프로토콜에 따라 반응시켰다.
그 결과 도 5에 나타낸바와 같이, DMSO 처리된 군에 비해 갯까치수영 추출물 처리된 군에서 IE62 단백질 발현이 감소되는 것으로 나타났다.
상기 결과들은 갯까치수영 추출물이 IE62 단백질의 발현을 저해하고, 수두-대상포진 바이러스 복제를 억제함을 제시한다.
실험예 4. 갯까치수영 분획물의 수두-대상포진 바이러스(VZV) 억제
<4-1> 갯까치수영 분획물의 수두-대상포진 바이러스 복제 억제
상기 실시예 1에서 제조한 갯까치수영 추출물의 분획물이 수두-대상포진 바이러스 복제를 억제할 수 있는지 조사하였다.
미감염 상태의 음경 포피 섬유모세포(human foreskin fibroblast; HFF)를 루시퍼라아제(luciferase)를 발현할 수 있는 인공적으로 재조합된 수두-대상포진 바이러스 pOka 균주(VZV-pOka-luciferase)로 감염시킨 후, 갯까치수영 분획물을 각 5 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 3 일 후, 루시퍼라아제 분석(Promega)을 통해 수두-대상포진 바이러스 복제에 미치는 영향을 분석하였다.
그 결과 도 11에 나타낸바와 같이, 부탄올 분획물이 수두-대상포진 바이러스 복제를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
<4-2> 갯까치수영 분획물의 세포독성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 갯까치수영 추출물의 분획물의 세포독성 유무를 확인하고자 하였다.
HFF 세포에 갯까치수영 분획물을 각 1, 2 또는 5 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 3 일째에 CellTiter-Glo luminescent cell viability assay(Promega)를 이용해 살아 있는 세포를 측정하였다.
그 결과 도 12에 나타낸바와 같이, 5 ㎍/ml 농도의 부탄올 분획물에서 세포독성이 일부 확인되었으나, 5 ㎍/ml 이하의 농도에서 부탄올 분획물은 세포독성 없이 수두-대상포진 바이러스 복제 억제 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실험예 5. 갯까치수영 추출물(LME)의 E형 간염 바이러스(HEV) 복제 억제
갯까치수영 추출물이 E형 간염 바이러스 복제를 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다.
인간 간암종 세포주(Korean Cell Line Bank, Human hepatocellular carcinoma cell; Huh7.5)에 3형 유전자형의 돼지 HEV 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 레플리콘(Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, USA, pSHEV3-luc)을 형질 전환(transfection)시킨 후, 갯까치수영 추출물을 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 3 일째 갯까치수영 추출물 및 DMSO를 동일한 농도로 재처리한 후, 반딧불(firefly) 루시퍼라아제를 발현할 수 있는 플라스미드를 형질전환 정도를 비교하기 위한 대조군으로 하여 레닐라 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 레닐라 루시퍼라아제 활성은 Dual-Luciferase Reporter Assay(Promega)로 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과 도 6에 나타낸바와 같이, DMSO 처리군에서 형질 전환 후 4 일 째의 pSHEV3-luc의 레닐라 루시퍼라아제 활성은 형질 전환 후 1 일 째에 비해 357.2 배 증가하였다. 그러나 형질 전환 3 일 및 4 일째의 레닐라 루시퍼라아제 활성은, 갯까치수영 추출물 처리군에서 DMSO 처리군의 각각 4.7% 및 5.2% 수준으로 매우 낮게 나타났다. 이 결과는 갯까치수영 추출물이 E형 간염 바이러스의 복제를 억제함을 제시한다.
실험예 6. 갯까치수영 추출물(LME)의 E형 간염 바이러스(HEV) 억제 농도 확인
<6-1> E형 간염 바이러스 복제 억제 활성에 있어 갯까치수영 추출물의 IC
50
결정
E형 간염 바이러스 복제 억제 활성에 있어서 갯까치수영 추출물의 IC50(HEV의 증식을 50% 억제하는 농도)을 확인하고자 하였다.
인간 간암종 세포주(Huh7.5)에 3형 유전자형의 돼지 HEV 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 레플리콘(pSHEV3-luc)을 형질 전환(transfection)시키고, 갯까치수영 추출물을 각 0, 1, 2.5, 5 또는 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 형질 전환 후 3 일째에 동일한 농도로 재처리를 하였으며, 재처리한 날로부터 4 일째에 레닐라 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 데이터는 평균±표준 편차(SD)로 나타내었으며 Graphpad Prism 7(Graphpad Software)을 사용하여 중간 억제 농도(half-maximal inhibitory concentration; IC50)를 계산하였다.
그 결과 도 7A에 나타낸바와 같이, pSHEV3-luc 레플리콘의 복제 억제를 위한 갯까치수영 추출물의 IC50 값은 2.141±0.242 ㎍/ml로 나타났다.
<6-2> 갯까치수영 추출물의 세포독성
갯까치수영 추출물의 세포독성 유무를 확인하고자 하였다.
인간 간암종 세포주(Huh7.5)에 갯까치수영 추출물을 각 0, 1, 2.5, 5, 10 또는 20 ㎍/ml의 농도로 처리한 후, 3 일째에 동일한 농도로 재처리하였다. 재처리 후 1, 2, 3, 및 4 일째에 <실험예 2-2>에 기재된 방법과 동일하게 CellTiter-Glo luminescent cell viability assay(Promega)를 수행하였다.
그 결과 도 7B에 나타낸바와 같이, 갯까치수영 추출물은 인간 간암종 세포주(Huh7.5)에 대하여 유의한 세포독성을 나타내지 않았으며, 이 결과는 갯까치수영 추출물의 E형 간염 바이러스 억제 효과가 세포독성에 의한 것이 아님을 제시한다.
실험예 7. 갯까치수영 추출물(LME)의 E형 간염 바이러스(HEV) 증식 억제
<7-1> 갯까치수영 추출물의 E형 간염 바이러스 복제 억제
갯까치수영 추출물이 세포독성을 나타내지 않으면서 pSHEV3-luc의 레닐라 루시퍼라아제 활성을 억제할 수 있음에 기초하여 항E형 간염 바이러스 활성을 qRT-PCR을 통해 분석하였다.
인간 폐암종 세포주(Korean Cell Line Bank, Human adenocarcinoma cell; A549)에 3형 유전자형의 E형 간염 바이러스 47832c 균주(HEV47832c)를 형질 전환시키고, 갯까치수영 추출물을 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 형질 전환 후 1, 3, 7 및 14 일째에 E형 간염 바이러스의 카피 수를 표 5의 ORF2 프라이머를 이용해 <실험예 1>에 기재된 방법과 동일하게 qRT-PCR(quantitative reverse transcription PCR)로 확인하였다.
| 프라이머명 | 서열 | 서열번호 |
| HEV ORF2 Forward | 5’-TATCGGGTTGTCCGAGCTAC-3’ | 9 |
| HEV ORF2 Reverse | 5’-TGCCGGGTTGAACTAGAATC-3’ | 10 |
| GAPDH Forward | 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’ | 3 |
| GAPDH Reverse | 5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’ | 4 |
그 결과 도 8A에 나타낸바와 같이, 형질 전환 후 7 일 및 14 일째의 E형 간염 바이러스 RNA가 각각 4.5 배 및 6.7 배로 증가하였다. 그러나 갯까치수영 추출물을 처리한 세포의 경우, 형질 전환 후 7 일 및 14 일째의 E형 간염 바이러스 RNA가 대조군에 비해 각각 4.4% 및 11.9% 수준으로 감소하였다. 상기 결과는 갯까치수영 추출물이 E형 간염 바이러스의 복제를 억제할 수 있음을 제시한다.
<7-2> 갯까치수영 추출물에 의한 E형 간염 바이러스 유전자의 억제 발현
갯까치수영 추출물에 의한 항E형 간염 바이러스 억제 효과의 분자 기전으로, E형 간염 바이러스 ORF2 캡시드의 발현을 조절할 수 있는지 조사하였다.
인간 폐암종 세포주(A549)에 3형 유전자형의 E형 간염 바이러스(HEV) 47832c 균주(Federal Institute for Risk Assessment, Berlin, Germany, HEV47832c)를 형질 전환시키고, 갯까치수영 추출물을 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 형질 전환 후 14 일째에 세포를 수득한 후, Huang 등이 2005년에 J. Gen. Virol. 86, 2585-2593에서 이용한 방법을 사용하여 면역형광법(immunofluorescence assay)을 수행하였다. 일차 항체로는 마우스-HEV ORF2 항체(MAB8002, Millipore)를, 이차 항체로는 형광 색소(fluorochrome) 결합 항-마우스 IgG(4408, Cell Signaling) 항체를 제조사의 프로토콜에 따라 반응시켜, 디지털 카메라와 Nikon NIS-Elements 현미경 이미징 소프트웨어가 설치된 니콘 TS100-F 인버티드(inverted) 형광 현미경(Tokyo, Japan)을 사용하여 분석하였다.
그 결과 도 8B에 나타낸바와 같이, DMSO 처리된 군에 비해 갯까치수영 추출물 처리된 군에서 ORF2 캡시드의 발현이 감소되는 것으로 나타났다.
<7-3> 갯까치수영 추출물의 세포독성
갯까치수영 추출물의 세포독성 유무를 확인하고자 하였다.
인간 폐암종 세포주(A549)에 갯까치수영 추출물을 각 0, 1, 2.5, 5, 10 또는 20 ㎍/ml의 농도로 처리하고, 3 일째마다 재처리하였다. 1, 3, 7 및 14 일째에 CellTiter-Glo luminescent cell viability assay(Promega)를 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
그 결과 도 9에 나타낸바와 같이, 20 ㎍/ml 농도의 갯까치수영 추출물에서 세포독성이 일부 확인되었으나, 10 ㎍/ml 이하의 농도에서 갯까치수영 추출물은 A549 세포에 대하여 유의한 세포독성을 나타내지 않았다.
상기 결과들은 갯까치수영 추출물에 E형 간염 바이러스 억제 효과가 있는 생물활성 성분이 있음을 제시한다.
실험예 8. 갯까치수영 분획물의 E형 간염 바이러스(HEV) 억제
<8-1> 갯까치수영 분획물의 E형 간염 바이러스 복제 억제
상기 실시예 1에서 제조한 갯까치수영 추출물의 분획물이 E형 간염 바이러스 복제를 억제할 수 있는지 조사하였다.
인간 간암종 세포주(Huh7.5)에 3형 유전자형의 돼지 HEV 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 레플리콘(pSHEV3-luc)을 형질 전환(transfection)시킨 후, 갯까치수영 추출물을 10 ㎍/ml 농도로 처리하였다. 형질 전환 후 4 일째에 Dual-Luciferase Reporter Assay(Promega)를 통해 E형 간염 바이러스 복제에 미치는 영향을 분석하였다.
그 결과 도 13에 나타낸바와 같이, 에틸아세테이트 분획물이 E형 간염 바이러스 복제를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
<8-2> 갯까치수영 분획물의 E형 간염 바이러스 복제 억제
상기 실시예 1에서 제조한 갯까치수영 추출물의 분획물이 E형 간염 바이러스 복제를 억제할 수 있는지 조사하였다.
인간 폐암종 세포주(A549)에 3형 유전자형의 E형 간염 바이러스 47832c 균주(HEV47832c)를 형질 전환시킨 후, 갯까치수영 추출물을 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 형질 전환 후 14 일째의 E형 간염 바이러스 카피 수를 상기 표 5의 ORF2 프라이머를 이용해 qRT-PCR((quantitative reverse transcription PCR)로 확인하였다.
그 결과 도 14에 나타낸바와 같이, 에틸아세테이트 분획물이 E형 간염 바이러스 복제를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
<8-3> 갯까치수영 분획물의 세포독성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 갯까치수영 추출물의 분획물의 세포독성 유무를 확인하고자 하였다.
인간 간암종 세포주(Huh7.5)에 갯까치수영 분획물을 각 0, 1, 2, 5, 또는 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 후 4 일째에 CellTiter-Glo luminescent cell viability assay(Promega)를 이용해 살아 있는 세포를 측정하였다.
그 결과 도 15에 나타낸바와 같이, 10 ㎍/ml 이하의 농도에서 에틸아세테이트 분획물은 세포독성 없이 E형 간염 바이러스 복제 억제 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
<8-4> 갯까치수영 분획물의 세포독성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 갯까치수영 추출물의 분획물의 세포독성 유무를 확인하고자 하였다.
인간 폐암종 세포주(A549) 세포에 갯까치수영 분획물을 각 0, 1, 2, 5, 또는 10 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. 처리 후 7 일째에 CellTiter-Glo luminescent cell viability assay(Promega)를 이용해 살아 있는 세포를 측정하였다.
그 결과 도 16에 나타낸바와 같이, 10 ㎍/ml 이하의 농도에서 에틸아세테이트 분획물은 세포독성 없이 E형 간염 바이러스 복제 억제 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation
<120> Pharmaceutical composition for inhibiting of Varicella-Zoster
Virus and Hepatitis E virus comprising Lysimachia mauritiana
extract or fraction thereof as an active ingredient
<130> 2018P-03-017
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VZV ORF62 Forward
<400> 1
tcttgtcgag gaggcttctg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VZV ORF62 Reverse
<400> 2
tgtgtgtcca ccggatgat 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Forward
<400> 3
catgagaagt atgacaacag cct 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Reverse
<400> 4
agtccttcca cgataccaaa gt 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF28(E) Forward
<400> 5
cgaacacgtt ccccatcaa 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF28(E) Reverse
<400> 6
cccggctttg ttagttttgg 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gB(L) Forward
<400> 7
gatggtgcat acagagaaca ttcc 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gB(L) Reverse
<400> 8
ccgttaaatg aggcgtgact aa 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HEV ORF2 Forward
<400> 9
tatcgggttg tccgagctac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HEV ORF2 Reverse
<400> 10
tgccgggttg aactagaatc 20
Claims (11)
- 갯까치수영(Lysimachia mauritiana) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 수두-대상포진 바이러스(Varicella-Zoster Virus; VZV) 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 갯까치수영의 잎, 줄기 또는 뿌리 추출물인 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 분획물은 갯까치수영 추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환은 수두(Varicella) 또는 대상포진(Herpes Zoster)인 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환의 개선용 건강기능식품.
- 갯까치수영(Lysimachia mauritiana) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus; HEV) 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 상기 추출물은 갯까치수영의 잎, 줄기 또는 뿌리 추출물인 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 상기 분획물은 갯까치수영 추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 갯까치수영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 E형 간염 바이러스 감염으로 인한 질환의 개선용 건강기능식품.
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