KR101553109B1 - 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 또는 항종양 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정제봉독의 항바이러스 및 항종양 효과에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 정제봉독은 자궁경부암을 유발시키는 것으로 알려진 HPV를 억제하며, 이로 인해 발생한 종양의 성장을 억제하므로 항 HPV 조성물 또는 항종양 조성물로 유용하게 사용될 수 있다..

Description

정제봉독을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 또는 항종양 조성물{Antivirus or antitumor composition containing purified bee venom}

본 발명은 정제봉독의 HPV에 대한 항바이러스 효과 및 HPV에 의해 유발되는 종양에 대한 항종양 효과에 관한 것이다.

봉독(Bee Venom, 蜂毒)은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액으로서, 비중이 1.3, pH가 5.2, 쓴맛이 있고, 약한 방향성이 있다. 실온에서 증발시키면 약 30%의 건조물이 남으며 그 성분은 복잡하다. 봉독의 성분은 75%가 단백질이며, 그 주요 성분으로는 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 인, 알라닌, 발린, 아르기닌, 트립토판, 메티오닌 및 히스티딘 등 다양한 물질이 함유되어 있다. 상기 봉독은 지금까지 류머티즘성 관절염을 조절하고 항암, 항염증(anti-inflammatory) 및 항통각(antinociceptive)의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다. 봉독의 효능은 옛날부터 많이 알려져 왔다. 기원전 4세기경 히포크라테스가 사용했다는 기록이 있으며, 꿀벌의 뱃속에 있는 액은 사람에게 좋은 약으로 소개되고 있다. 우리나라에도 옛날부터 민간요법의 일종으로 벌침을 치료에 응용해 왔다. 봉독은 벌이 가진 독을 말하는 것으로 인체에 무해한 성분을 추출해내어 통증부위나 침을 놓는 경혈자리에 주입하여 인체의 면역력을 강화시켜 염증이나 이물질에 대해 스스로 이겨낼 수 있게끔 만드는 치료요법으로 사용되고 있다. 봉독의 주성분은 단백질의 일종인 멜리틴(melittin), 아파민(apamin), 아돌라핀(adolapin) 및 비반 세포 과립 감소 펩티드(mast cell degranulation peptide; MCD-peptide) 등으로 구성되어 있다. 봉독은 일단 몸속으로 들어가면 대사 작용을 활발히 하고, 면역작용을 극대화시켜 외부로부터 침입한 세균을 이겨낸다. 그러나 봉독의 주 약리작용인 면역기능의 활성화에 대한 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않고 있다. 전통적으로 봉독을 가장 많이 응용해온 질환은 관절염, 결체조직과 기타 염증, 동통성 질환이다. 류마티스염, 급만성 관절염, 경추, 요추간판 탈충증, 척추관협착증, 섬유근통, 산후풍, 오십견, 만성염증등에 응용이 활발하다. 특히, 봉독의 항염 작용은 iNOS와 COX-2의 발현뿐만 아니라 TNF-a, NF-B의 활성을 억제하고, 프로스타글라딘E2(prostagladin E2)의 생성을 억제한다는 연구결과들이 다수 보고되고 있다. 최근 서구에서는 다발성 경화증에 봉약침을 응용하려는 시도가 이어지고 있는데, 치료 후 몸이 가벼워지고 근육의 운동성이 좋아졌다는 사례들이 있다. 브라질에서는 천식에 봉약침을 사용하교 있고, 중국에서는 근골격 질환 등의 치료에 사용되고 있다.

사람 파필로마바이러스(HPV; Human Papillomavirus)는 생식기 감염의 주요 원인이며 또한 피부나 구강의 경구 감염으로 인한 악성 종양의 발병 원인이다(Zhebe et al., 1997; Chrisofos et al., 2004). HPV로 인한 생식기 감염은 전 세계적으로 남성과 여성 모두에게 가장 흔하게 나타나는 성 접촉에 의한 질병이며, 최근 가장 빈번하게 나타나는 바이러스성 질병이기도 하다(Ho et al., 1998; Jung et al., 2004). 자궁경부에서 발견되는 암세포의 발생은 대부분이 HPV에 의한 것으로 120 여종 이상의 유전형이 알려져 있다. 이렇게 많은 종의 HPV는 발생시키는 종양의 위험도에 따라 고위험군(High-risk group), 중간위험군(intermediate-risk group), 저위험군(low-risk group)의 3가지로 분류되는데, 이 중에서 특히 고위험 HPV16, 18, 31 유전형의 경우 자궁경부암 및 종양형성 과정과 가장 높은 연관성이 있음이 보고되어지고 있다 (zur Hausen., 1996; Koutsky et. al., 1997; Munoz et. al., 2002; Scheurer et al., 2005). HPV는 파포바바이러스(papovavirus)로 분류되는 작고 외피가 없는 (non-enveloped) 바이러스로, 숙주세포 감염과 세포 주기에 관련하는 두 가지 종류의 단백질을 가진다. 한 종류는 숙주세포 감염 초기에 활동하는 단백질 종류이고, 다른 하나는 숙주세포 감염 말기에 바이러스의 세포 주기를 조절하는 단백질들이다. 이 중 초기에 활동하는 E6 단백질은 바이러스 유전물의 복제와 숙주세포에서의 종양형성에 중요한 역할을 하는 단백질이다. 기본적으로 HPV 감염은 상피세포(epithelial cell)의 손상에 의해 시작된다. 상피세포의 기저층이 손상되면 HPV의 유전물질은 복제주기를 시작하는데 이 주기는 숙주세포의 물질과 HPV 유전체(genome)에 위치한 long control region (LCR)의 상호작용에 의해 시작된다. 이러한 상호작용은 HPV의 E6 및 E7 단백질 유전자의 복제를 주도한다. 이들 단백질은 종양단백질(oncoprotein)로서, 숙주세포의 종양억제유전자(tumor suppressor gene)인 p53 또는 pRb를 비활성화(inactivation) 또는 분해를 통해 숙주세포의 성장인자 조절경로를 교란시키거나 숙주세포 환경을 바이러스유전물질 복제에 유리하도록 조절시킴으로써 종양단백질로서의 기능을 수행한다(Jung et al., 2004). 현재까지 고위험 HPV 유전형으로 분류된 HPV16, 18이 숙주의 감염세포내에 삽입되어 종양을 일으키며, 이 과정에 E6 발암단백질이 숙주발암억제인자인 p53과 상호작용함으로서 자궁경부암화가 유발되고 (Kiyono et al., 1998; zur Hausen., 1999; Furumoto et al., 2002), hTERT (human telomerase reverse transcriptase) 와 함께 사람 상피세포의 불멸화(immortalize)에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Munger & Howley, 2002).

한편, 국내 고위험 여성군의 감염율 및 변이주에 대한 연구를 통해 국내 고위험 여성군의 HPV 감염율이 47%이고, 이들 집단에서 HPV16 유전형이 35%로 가장 높은 비율을 차지하였으며 (Choi et al. 2003), 발암유전자인 E6의 염기서열을 분석한 결과 68%가 변이주로 관찰되었다 (Choi et al., 2007). 많은 역학적 연구자료들에 따르면 HPV16 변이주는 바이러스의 지속감염과 그에 따른 자궁이형성증과정에 영향을 미치는 것으로 알려졌으나 (Berumen et al., 2001, del Refugio Gonzales-Losa et al., 2004; Grodzki et al., 2006; Hildesheim et al., 2001; Lee et al., 2008; Londesborough et al., 1996; Picconi et al., 2003; Sathish et al., 2005; Sichero et al., 2007; Villa et al., 2000; Xi et al., 1995, 1997, 2006) 국내외적으로 이러한 변이주들에 의한 자궁경부암화 기작 연구는 미비한 상태이다. Charkrabarti et al. (2004) 에 의한 HPV16 E6 L83V에 대한 연구결과 미토겐 활성 단백질 키나아제(MAPK; Mitogen-Activated Protein Kinase) 발현을 활성화시킴으로 표준주와는 다른 자궁경부암화를 유도함을 보고한 것이 유일하였으나, 현재 많은 연구진들에 의해 활발한 연구가 이루어지고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 자궁경부암의 주 원인인 HPV에 대해 억제 효과를 나타내는 물질로 정제봉독을 발견하였으며, 정제봉독이 고위험성 HPV인 HPV16 및 HPV18에 대해 항바이러스 효과를 가지고 HPV에 의해 유발된 종양에 대해 항종양 효과를 가지는 것을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV에 의해 유발된 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) HPV에 의해 유발된 종양의 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV에 의해 유발된 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방용 식품 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) HPV에 의해 유발된 종양의 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 정제봉독은 HPV에 감염된 세포에서 유전자 및 단백질 수준에서 항바이러스 및 항종양 효과를 나타냈으며, 동물에서 HPV 감염에 의해 생성된 종양의 성장을 억제하는 효과를 나타내었으므로, 항 HPV 조성물 또는 HPV에 유발되는 종양의 치료용 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 15일령 서양종 꿀벌독과 동양종 꿀벌독의 단백질을 확인한 도이다.
도 2는 15일령 동양종 꿀벌독과 서양종 꿀벌독의을 액체 크로마토그래피로 분석한 도이다.
도 3은 서양종 꿀벌독의 일령에 따른 봉독의 성분을 비교한 도이다.
도 4는 정제 전 봉독과 정제 후 봉독을 현미경을 통해 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 정제봉독의 세포독성을 확인한 도이다.
도 6은 HPV의 E6 및 E7의 발현을 확인한 젤 사진이다;
C33A: HPV 비감염 대조군 세포주;
CASKI: HPV16에 감염된 세포주;
Hela: HPV18에 감염된 세포주; 및
GAPDH: 로딩 컨드롤.
도 7A는 HPV16에 감염된 Caski 세포에서 본 발명의 정제봉독에 의한 E6, E7 및 L1의 발현 변화를 확인한 그래프이다;
위: 정제봉독 5 ㎍/ml를 처리한 Caski 세포에서의 정제봉독 처리 직후, 처리 12시간 뒤, 처리 24시간 뒤의 E6, E7 및 L1의 발현량; 및
아래: 정제봉독 10 ㎍/ml를 처리한 Caski 세포에서의 정제봉독 처리 직후, 처리 12시간 뒤, 처리 24시간 뒤의 E6, E7 및 L1의 발현량.
도 7B는 HPV18에 감염된 Hela 세포에서 본 발명의 정제봉독에 의한 E6, E7 및 L1의 발현 변화를 확인한 그래프이다;
위: 정제봉독 5 ㎍/ml를 처리한 Hela 세포에서의 정제봉독 처리 직후, 처리 12시간 뒤 E6, E7 및 L1의 발현량; 및
아래: 정제봉독 10 ㎍/ml를 처리한 Hela 세포에서의 정제봉독 처리 직후, 처리 12시간 뒤의 E6, E7 및 L1의 발현량.
도 8은 본 발명의 정제봉독에 의한 E6 및 E7 단백질의 발현량을 확인한 도이다;
C33A: HPV 비감염 대조군 세포주;
0: 봉독 처리 직후;
12: 봉독 처리 12시간 후;
24: 봉독 처리 24시간 후; 및
Beta-Actin: 로딩 컨트롤.
도 9는 정제봉독에 의한 C33A, Caski 및 Hela 세포주의 세포 주기 변화를 확인한 도이다;
untreated: 정제봉독을 처리 안한 경우.
도 10은 HPV로 종양을 발생시킨 동물 모델에서 정제봉독에 의한 항종양 및 항바이러스 효과를 확인한 도이다;
A: 정제봉독을 종양에 주사한 뒤의 HPV16의 E6 및 E7 유전자의 발현량;
B: 정제봉독을 종양에 주사한 뒤의 HPV16의 E6 및 E7 단백질의 발현량;
C: 정제봉독 또는 PBS의 주사 후 종양의 성장 속도 그래프.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "봉독"은 꿀벌로부터 분리한 독을 말하며 "꿀벌독"과 혼용하여 기재하였다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 종양 관련 질환 또는 HPV 바이러스 감염의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 혈종양 관련 질환 또는 HPV 바이러스 감염의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

본 발명은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 HPV는 고위험성인 HPV16 또는 HPV18인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 정제봉독은 HPV의 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 억제시킴으로써 항바이러스 효과를 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV에 의해 유발된 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 HPV는 고위험성인 HPV16 또는 HPV18인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 HPV에 의해 유발된 종양은 자궁경부암, 두경부암, 편도암 및 방광암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 자궁경부암이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 정제봉독은 HPV의 발암 유전자의 발현을 억제시킴으로써 HPV에 의해 유발되는 암의 발생 또는 생장을 억제시키는 것이 바람직하며, 상기 발암 유전자는 E6 또는 E7인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용한 봉독은 서양종 벌꿀 이탈리안계통(Apis mellifera liguria)의 꿀벌로부터 분리한 봉독으로, 꿀벌의 종류는 일반적으로 서양종꿀벌(Apis mellifera), 동양종꿀벌(Apis cerana), 인도최대종(Apis dorsata), 인도최소종(Apis florea)의 4개의 종이 알려져 있다.

봉독은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액으로서, 생봉독, 건조봉독, 봉독추출물 및 정제봉독을 포함하는 것이다. 봉독에는 멜리틴(Melittin), 아파민(Apamin), 비만세포 과립감소 펩티드(MCD-Peptide, Mast Cell Degranulation Peptide, Op), 단백효소 억제제(Protease Inhibitor), 세카르핀(Secarpin), 터치아핀(Tertiapin), 프로카민(Procamine) 등 다양한 펩타이드를 함유하고 있는 것으로 알려져있다. 생봉독은 건조 또는 정제과정을 거치지 않은 것으로서 비중이 1.1 내지 1.3이고, 산도(pH)가 5.2 내지 5.5 범위이며, 70~80중량%는 단백질 또는 펩타이드로 이루어진다. 봉독 추출물은 당 업계에 공지된 다양한 추출방법을 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 이러한 저급알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜을 추출용매로 하여 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는 봉독을 물로 현탁하고, 에틸 아세테이트를 용매로 수회 추출하여 분리된 수층을 다시 부탄올(butanol)로 추출하며, 각 층을 감압 농축하여 얻는 것이다. 정제봉독은 상술한 추출용매에 의한 추출물 이외에 통상적인 정제 과정을 거쳐 얻거나, 다양한 추출방법 및 정제방법을 이용하여 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 대한민국 등록 특허 제10-0758814에 기재된 봉독 정제방법을 통해 얻을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 정제봉독을 포함하는 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19thed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 봉독 정제물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태, 바람직하게는 현탁제, 동결건조제제, 비수성 주사제, 또는 수성 주사용액의 형태, 보다 더 바람직하게는 멸균 주사용액제제로 제형화하여 사용될 수 있으며, 봉독 정제물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 당업계에서 통상적으로 사용하는 용제, 용해보조제, 완충제, 등장화제, 안정제, 항산화제, 무통화제, 현탁화제 등을 사용하여 조제가능하며, 상기 용제, 첨가제 및 희석제로는 멸균증류수, 생리식염수, pH 조절제, 알부민, 염화나트륨, 만니톨, 링겔주사액, 포도당 등을 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 개체에 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용), 경구 투여하거나 피하 주입 또는 피부를 통한 국소 투여(경피 투여) 또는 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피내, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사를 통할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 ~ 100 mg/kg(체중)이 바람직하고, 0.01 ~ 10 mg/kg(체중)이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 그러나, 가장 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 봉독으로부터 분리된 봉독 정제물은 1일 8 마이크로그램 내지 5 밀리그램, 바람직하게는 8 마이크로그램 내지 2 밀리그램, 보다 바람직하게는 16 마이크로그램 내지 1 밀리그램의 투여량으로, 바람직하기로는 주사제, 보다 더 바람직하기로는 근육내 주사법으로 투여하는 것이 바람직할 것이다. 투여 회수는 1일 1회, 1일 수회, 2일 내지 1주일간 1회 등으로 투여가능하나, 그 투여횟수에는 그 제한이 없다. 상기 투여량, 투여횟수 및 투여방법은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 조성물은 염증성 피부 질환 또는 알러지성 피부 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 봉독을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 코팅제 또는 필터충진제의 제조에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방용 식품 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) HPV에 의해 유발된 종양의 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 본 발명의 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로서 상기 봉독을 포함하는 조성물 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 식품보조첨가제를 추가로 첨가할 수도 있는바 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품보조첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명은 봉독을 포함하는 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로 제공될 수도 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물에는 pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 점안제 또는 접안제 및 피하주사제로 제조하여 이를 생체에 접종할 수 있고, 점안제나 주사제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 대한민국 등록 특허 제10-0758814에 기재된 봉독 정제방법을 통해 정제한 정제봉독에 의해 HPV16 또는 HPV18에 감염된 세포주에서 발암 유전자인 E6 및 E7의 발현이 유전자 수준, 전사수준 및 단백질 수준에서 억제되는 것을 확인하였으며, 바이러스의 감염 및 전파에 중요한 캡시드 단백질인 L1을 암호화하는 유전자 또한 억제하는 것을 확인하였다. 또한, HPV에 감염된 세포로 종양이 형성된 동물에서도 정제봉독이 종양의 성장을 억제하였으며, 발암 유전자인 E6 및 E7의 발현을 억제하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 정제봉독은 HPV에 대하여 항바이러스 효과를 가지며, HPV에 의해 유발된 종양을 억제하는 효과를 가지므로, HPV에 의한 감염 및 이로 인해 발생한 자궁경부암과 같은 종양의 치료에 이용할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예 및 제조예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 봉독 정제 및 성분 확인

<1-1> 꿀벌의 품종에 따른 봉독의 단백질 구성 비교

본 발명자들은 서양종 꿀벌인 이탈리안 계통 일벌 중 15일령 이상 된 꿀벌의 봉독을 대한민국 등록특허 10-0758814에 기재된 봉독 정제 방법을 통해 정제한 뒤, 같은 일령의 동양종 꿀벌독 봉독과 단백질 성분을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 비교하였다.

그 결과, 도 1에서와 같이 두 종의 꿀벌에서 정제한 봉독의 단백질 구성이 전혀 다름을 확인하였다.

또한, 액체 크로마토그래피를 이용하여 15일령 동양종 꿀벌에서 채취한 봉독과 본 발명의 15일령 서양종 꿀벌에서 채취한 봉독을 비교하였다.

그 결과, 두 봉독의 성분이 상이함을 확인하였다 (도 2).

따라서 봉독은 벌의 종류에 따라 그 성분의 차이를 보이는 것을 알 수 있었다.

<1-2> 꿀벌의 일령에 따른 봉독의 단백질 구성 비교

본 발명자들은 서양종 꿀벌인 이탈리안 계통 일벌의 일령 별 봉독의 성분을 확인하였다.

그 결과, 일령에 따라 봉독의 성분이 상이하였다. 따라서, 동일한 벌이라도 일령에 따라 성분의 차이가 발생함을 알 수 있었다 (도 3).

<1-3> 정제 봉독

본 발명자들은 성분의 변화없이 봉독을 규격화하기 위하여 15일령 서양종 꿀벌(일벌)의 봉독을 대한민국 등록특허 10-0758814에 기재된 봉독 정제 방법을 통해 정제하였다.

구체적으로, 15일령 이상의 서양종 일벌의 봉독만을 대한민국 등록특허 10-0579899에 기재된 봉독채집장치를 이용하여 채집하였으며, 대한민국 등록특허 10-0758814에 기재된 봉독 정제 방법으로 당류(sugars)와 휘발성물질(volatile compounds)를 제거하고 정제된 봉독의 성분을 확인하였으며 (표 1), 이를 전자현미경(SEM, S-2460N, Hitachi, Japan)으로 확인하였다 (도 4).

Class of Molecules	Component	% of Dry Venom
Enzymes	Phospolipase A2	10 ~ 12
	Hyaluronidase	1 ~ 3
	Acid phosphomonoesterase
	Lysophopholipase
	a -glucosidase
Other Proteins and	Melittin	45 ~ 65
Peptides	Apamine	1 ~ 3
	Mast Cell Degranulating Peptide (MCD)	1 ~ 2
	Secapin	0.5 ~ 2.0
	Procamine	1 ~ 2
	Adolapin
	Protease inhibitor
	Tertiapin *	0.1
	Small peptides (with less than 5 amino acids)	13 ~ 15
Physiologically Active	Histamine	0.5 ~ 2.0
Amines	Dopamine	0.2 ~ 1.0
	Noradrenaline	0.1 ~ 0.5
Amino Acids	t -aminobutyric acid	0.5
	a -amino acids	1.0
Phospholipids		5

< 실시예 2> HPV 감염 세포에서의 정제봉독의 세포 독성 평가

본 발명자들은 등록특허 제10-0758814에 따라 정제한 봉독을 이용하여 HPV에 감염된 세포주에서의 세포 생존 및 IC50를 확인하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다.

구체적으로, HPV18 감염 세포주인 Hela, HPV16 감염주인 Caski 및 비감염 세포주인 C33A를 96 웰 세포배앙 플레이트에 1×10⁴ cells / well로 분주하여 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 및 10% FBS를 첨가한 RPMI 1640 배지에서 37 ℃ 및 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양 후 웰에 정제봉독(bee venom, BV)을 15, 10, 5, 2.5 및 1 ㎍/ml의 농도로 각각 처리하였다. 정제봉독 처리 후 12, 24 및 48 시간째에 MTT 시약 4 mg/ml를 각 웰에 20 ㎕씩 넣고 37 ℃에서 4시간 동안 반응시켜 염색하였다. 염색 후 상등액을 제거하고 DMSO 200 ㎕로 녹여 560 nm에서 OD 값을 측정하였다.

그 결과, 정제봉독 처리 12시간 째에는 C33A, Caski, Hela 세포주 모두 BV 10 ㎍/ml에서 IC50 값을 보였으나, 24시간 째에 HPV 비감염 세포주인 C33A는 IC50 값이 14 ㎍/ml로 다시 상승한 반면, HPV 감염세포주인 Caski (HPV16 감염)에서는 5 ㎍/ml로 낮아졌으며 Hela (HPV18 감염)에서는 변화가 없었다 (도 5).

따라서, BV가 HPV가 감염된 암 세포주에서 더 효과가 좋다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3> HPV 감염 세포주에서의 정제봉독의 유전자 발현 억제 효과

<3-1> HPV16 또는 HPV18 의 발암유전자 및 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자의 전사 확인

본 발명자들은 정제봉독이 HPV16 또는 HPV18의 발암유전자(oncogene)인 E6 및 E7과 캡시드 단백질을 암호화하는 L1 유전자의 발현에 미치는 영향을 전사 수준(Transcription level)에서 확인하기 위해 RT-PCR(reverse transcriptional PCR)을 수행하였다.

구체적으로, HPV16으로 감염된 Hela 및 HPV18로 감염된 Caski 세포주에 각각의 IC50 농도로 BV를 처리한 후 12 및 24 시간 뒤에 세포를 수거하였다. 수거한 세포를 Trizol을 이용하여 RNA를 획득하였다. RNA의 농도는 나노드랍(nanodrop) (Thermo scientific, USA)으로 측정하고 1 내지 2 ㎍의 RNA를 primescript reagent kit (#RR037A TaKaRa)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA, HPV16 또는 HPV18의 E6, E7 및 L1 유전자에 대한 각각의 프라이머 (표 2)를 이용하여 첫 PCR은 95℃에서 1분간, 53℃에서 2분간, 72℃에서 1분간 시행하고 전체 30 cycle로 시행하였다.두 번째 PCR은 95℃에서 30초간, 61℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 시행하였고 전체 30cycle로 시행하였다. PCR이 끝난 DNA 용액을 아가로오스젤에 전기영동하여 확인하였다.

그 결과, 10 ㎍/ml의 농도로 BV를 처리한 HPV16으로 감염된 암세포주인 Caski에서 E6, E7 모두 각각 12시간 24시간째 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, HPV18으로 감염된 암세포주인 Hela에서 E6가 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 서열 (5' → 3')
1	HPV16 E6 F	ATGCACCAAAAGAGAACTGC
2	HPV16 E6 R	TTACAGCTGGGTTTCTCTAC
3	HPV16 E7 F	GCAACCAGAGCAACTGATCTCTAC
4	HPV16 E7 R	GGTCTTCCAAAGTACGAATGTCTACG
5	HPV18 E6 F	CAACACGGCGACCCTA
6	HPV18 E6 R	TCGGTTGCAGCACGAA
7	HPV18 E7 F	TGCATGGACCTAAGGCAA
8	HPV18 E7 R	GCTGGGATGCACACCA
9	HPV L1 F(MY09)	CGTCCMARRGGAWACTGATC
10	HPV L1 R(MY11)	GCMCAGGGWCATAAYAATGG

<3-2> HPV16 또는 HPV18 의 발암유전자 및 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 억제 확인

본 발명자들은 본 발명의 정제봉독의 HPV16 또는 HPV18의 발암유전자(oncogene)인 E6 및 E7과 캡시드 단백질을 암호화하는 L1 유전자의 발현을 억제하는 정도를 real-time PCR(Q-PCR)을 통해 정량적으로 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에서와 같이 HPV16으로 감염된 Hela 및 HPV18로 감염된 Caski 세포주에 각각의 IC50 농도로 BV를 처리한 후 12시간 뒤에 세포를 수거하였다. 수거한 세포를 Trizol을 이용하여 RNA를 획득하였다. RNA의 농도는 나노드랍(nanodrop)으로 측정하고 1 내지 2 ㎍의 RNA를 primescript reagent kit (#RR037A TaKaRa)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA, HPV16 또는 HPV18의 E6, E7 및 L1 유전자에 대한 각각의 프라이머 (표 2) 및 SYBR Prenix ExTaq(2X) (#RR041A TaKaRa)를 LightCycler 480II (Roche)을 이용하여 표 2의 조건으로 real time PCR을 수행하였다.

그 결과, HPV16으로 감염된 암세포주 Caski에서 5 ㎍/ml의 농도로 BV를 처리한 경우, E6 및 E7의 발현량이 처리하지 않았을 때보다 60 내지 80% 수준으로 감소하였으며, L1의 발현량은 12시간째 15% 수준으로 감소하였다가 24시간째 다시 회복하는 경향을 나타냈다. 또한, BV를 10 ㎍/ml로 처리한 경우, E6 및 E7의 발현량이 30 내지 50% 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, L1 역시 50 내지 60% 수준으로 발현량이 감소하는 것을 확인하였다 (도 7A). 또한, HPV18으로 감염된 암세포주 Hela에서 5 ㎍/ml의 농도로 BV를 처리한 경우, E6, E7 및 L1 모두 발현량이 감소하였으며, 10 ㎍/ml의 농도로 BV를 처리한 경우에 세 유전자의 발현량이 모두 각각 60% 정도로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다 (도 7B).

따라서, BV가 HPV16 및 18의 발암 유전자인 E6 및 E7과 바이러스 기전에 관여하는 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자인 L1의 발현을 억제하므로 BV가 항암 기전뿐만 아니라 HPV의 항바이러스 기전에도 관여한다는 것을 알 수 있다.

< 실시예 4> HPV 감염 세포주에서의 정제봉독의 단백질 발현 억제 효과

본 발명자들은 정제봉독이 HPV16 또는 HPV18에 감염된 세포에서의 E6 및 E7 단백질의 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다.

구체적으로, Hela, Caski 및 C33A 세포주에 각각의 IC50 농도로 BV를 처리한 후 12 및 24 시간 후에 세포를 수거하였다. 수거한 세포를 RIPA 버퍼로 파쇄하여 단백질을 획득하였다. 단백질의 농도를 브래드포드 방법으로 측정하고 30 내지 50 ㎍의 단백질을 이용하여 SDS-아크릴아마이드 젤을 이용하여 전기영동한 뒤, 이를 PVDF 막(membrane)에 옮겨서 각각의 항체(antibody) (HPV16/18 E6: sc-460, HPV16 E7: sc-6981 및 HPV18 E7: sc-1590)를 이용하여 발현량을 비교하였다.

그 결과, 상기 <실시예 3>의 RT-PCR 또는 Q-PCR의 결과와 동일한 양상으로 정제봉독에 의해 E6 및 E7 단백질 발현량이 현저하게 감소하는 결과를 관찰할 수 있었다 (도 8).

< 실시예 5> 정제봉독에 의한 HPV 감염 세포주의 세포주기 변화 검증

본 발명자들은 HPV 감염 세포주와 비감염 세포주의 정제봉독에 의한 세포주기 변화를 확인하였다.

구체적으로, HPV 감염 세포주 Caski (HPV16 감염) 및 Hela (HPV18 감염)와 비감염 세포주 C33A 각각의 IC50 농도로 BV를 처리한 후 12, 24 및 48시간 후에 배양액과 세포를 모두 수거하였다. 수거한 세포를 PBS로 1회 세척한 후 70% 에탄올에 고정시켜 4 ℃에서 3 내지 5일간 정치시켰다. 각각의 세포를 500 ㎕의 PI staining sol. (PI/Rnase staining buffer, #550825 BD)으로 염색한 뒤 FACS 분석을 수행하였다.

그 결과, HPV 비감염 암세포인 C33A에서는 12시간 이후부터 세포사멸 세포를 나타내는 subG1 (apoptosis cells) 주기가 증가하는 것을 확인할 수 있었으나 48시간에서는 다시 세포주기가 회복되는 것을 확인할 수 있었다 (도 9). 이는 C33A의 IC50 값이 24시간째에 15 ㎍/ml이기 때문에 10 ㎍/ml 농도에서 죽지 않은 C33A 세포가 다시 살아났기 때문이라 판단된다. 또한, HPV16으로 감염된 암세포주인 Caski에서는 BV를 처리한 후 12시간째부터 G2/M 주기 정지(phase arrest)가 관찰되었으며, 48시간째에는 모든 세포주가 subG1 주기로 관찰됨을 확인할 수 있었다 (도 9). 이를 통해 BV가 HPV16의 E6 뿐만 아니라 세포주기도 조절하는 E7 또한 저해한 것임을 알 수 있었다. 아울러, HPV18으로 감염된 암세포주인 Hela에서는 24시간째부터 subG1 주기가 증가하기 시작하여 48시간째에는 모두 subG1 주기로만 관찰되었으며 (도 9), 이러한 결과는 BV가 p53을 저해하는 HPV18의 E6를 감소시킴으로써 p53이 증가하여 암세포주 Hela의 세포사멸을 유도하기 때문으로 유추된다.

< 실시예 6> 동물에서의 정제봉독의 항종양 및 항바이러스 효과

본 발명자들은 본 발명의 정제봉독의 항종양 효과를 동물에서 확인하였다.

구체적으로, HPV16의 E6 및 E7을 발현하고 있는 TC-1 세포주 5×10⁵ cells/100 ㎕ (혈청 및 항생제 없는 DMEM에서 배양)를 이용하여 C57/BL6 마우스의 복부피하에 종양을 형성시켰다. 종양의 부피가 150 내지 200 mm³ 정도 되었을 때 BV 및 PBS (대조군)를 1 mg/kg의 양으로 종양에 직접 (intra-tumor injection) 주사하였다. 매일 1회씩 3일째까지 동량으로 BV를 주사한 후 종양의 크기를 12일까지 매일 측정하였다. 마우스는 BV 처리 군 및 대조군 (PBS) 각각 4마리씩 사용하였다. 또한, 주사 13일 후에 BV 처리군, 대조군(PBS) 마우스를 희생시켜 각각의 종양을 척출한 뒤 (2마리) 상기 <실시예 2> 및 <실시예 3>의 방법으로 RNA 및 단백질을 획득한 후 real-time PCR 및 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 대조군 (PBS)에 비하여 BV을 주사한 처리군의 종양의 성장 속도가 현저히 감소하여 13일째에는 크기가 대조군의 35% 수준인 것을 확인할 수 있었다 (도 10C). 또한, 주사 13일 후 마우스의 종양을 적출하여 Q-PCR로 E6 및 E7의 전사 수준 (mRNA)의 차이를 확인한 결과, 대조군에 비하여 BV를 처리한 종양에서 E6 및 E7의 발현량이 각각 20% 및 10%로 현저히 감소되어 있음을 확인할 수 있었다 (도 10A). 아울러, 웨스턴 블롯으로 E6 및 E7의 단백질 발현량을 확인한 결과에서도 E6 및E7의 발현이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다 (도 10B).

따라서, 동물실험 결과가 in vitro 결과에서 확인한 결과와 동일한 것을 알 수 있었으며, 발암 유전자인 HPV16의 E6 및 E7의 발현을 mRNA 및 단백질 수준에서 저해함으로써 HPV 바이러스에 의해 발생된 종양의 성장을 저해하는 것으로 결론내릴 수 있다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

본 발명의 정제봉독 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

본 발명의 정제봉독 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 정제봉독 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

본 발명의 정제봉독 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

본 발명의 정제봉독 50 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<1-6> 질 세정제 조제

본 발명의 정제봉독 20.0 mg

코코글루코시드(코코넛유 유래 계면활성제) 15.0 g

코코암포아세테이트나트륨(코코넛유 유래 계면활성제) 5.0 g

에데트산나트륨 100.0 mg

정제수 79.88 g

상기 원료를 칭량하여 조제 용기에 넣은 다음 액 온도를 80 ℃로 가온하면서, 교반하여 완전 용해시켰다. 완전 용해되면 액 온도를 40 ℃로 냉각한 다음, 진공 탈포하여 100 g의 질 세정제를 제조하였다.

<1-7> 겔제의 제조

본 발명의 정제봉독 2.5 mg

에데트산나트륨 50.0 mg

글리시리진산칼륨 50.0 mg

부틸렌글리콜 3.0 g

포비돈 K30 1.0 g

카보머 300.0 mg

트리에탄올아민 400.0 mg

정제수 95.19875 g

상기 원료를 칭량한 다음 조제 용기에 넣고 액 온도를 80 ℃ 가온 교반하면서 완전 용해하고, 40 ℃ 냉각한 다음 진공 탈포하여 100 g의 겔제를 제조하였다.

<1-8> 좌제의 제조

본 발명의 정제봉독 5.0 mg

폴리에틸렌글리콜 1500 49.995 g

폴리에틸렌글리콜 4000 50.0 g

상기 원료를 칭량한 다음 조제 용기에 넣고 액 온도를 80 ℃ 가온 교반하면서 완전 용해하고, 40 ℃ 냉각한 다음 진공 탈포하여 100 g의 좌제를 제조하였다.

<1-9> 에어로졸제의 제조

본 발명의 정제봉독 5.0 mg

부틸렌글리콜 3.5 g

에탄올 3.0 g

글리세린 0.5 g

피이지-60하이드로제네이트카스터오일 0.3 g

구연산 20.0 mg

구연산나트륨 80.0 mg

에데트산나트륨 50.0 mg

글리시리진산암모늄 10.0 mg

글리시리진산이칼륨 50.0 mg

정제수 92.485 g

상기 원료를 칭량한 다음 조제 용기에 넣고 액 온도를 80℃ 가온 교반 하면서 완전 용해하고, 40 ℃ 냉각한 다음 진공 탈포하여 100 g의 액을 제조한 후 압력용기에 충전한 다음 질소가스를 충전하고 밀봉하여 에어로졸제를 제조하였다.

< 제조예 2> 식품의 제조

<2-1> 밀가루 식품의 제조

본 발명의 정제봉독 0.01~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.

<2-2> 스프 및 육즙( gravies )의 제조

본 발명의 정제봉독 0.01~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 정제봉독 1 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<2-4> 유제품( dairy products )의 제조

본 발명의 정제봉독 1~5 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-5> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 정제봉독 분말을 준비하였다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 본 발명의 정제봉독 분말를 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

본 발명의 정제봉독(3 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

< 제조예 3> 음료의 제조

<3-1> 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(94.5%)과 같은 부재료와 본 발명의 정제봉독(0.5 %)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.

<3-2> 야채 주스의 제조

본 발명의 정제봉독 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.

<3-3> 과일 주스의 제조

본 발명의 정제봉독 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.

<110> republic of Korea <120> Antivirus or antitumor composition containing purified bee venom <130> p130310 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E6 F primer <400> 1 atgcaccaaa agagaactgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E6 R primer <400> 2 ttacagctgg gtttctctac 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E7 F primer <400> 3 gcaaccagag caactgatct ctac 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E7 R primer <400> 4 ggtcttccaa agtacgaatg tctacg 26 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV18 E6 F primer <400> 5 caacacggcg acccta 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV18 E6 R primer <400> 6 tcggttgcag cacgaa 16 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV18 E7 F primer <400> 7 tgcatggacc taaggcaa 18 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV18 E7 R primer <400> 8 gctgggatgc acacca 16 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV L1 F(MY09) primer <400> 9 cgtccmarrg gawactgatc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV L1 R(MY11) primer <400> 10 gcmcagggwc ataayaatgg 20

Claims (10)

1. 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 HPV는 HPV16 또는 HPV18인 것을 특징으로 하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 정제봉독은 HPV의 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
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9. 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 HPV(Human Papillomavirus) 감염 예방용 식품 조성물.
   
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