KR20200071444A

KR20200071444A - 봉독을 함유하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수

Info

Publication number: KR20200071444A
Application number: KR1020180159184A
Authority: KR
Inventors: 한상미; 우순옥; 김세건; 장혜리; 최홍민; 문효정
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2020-06-19
Also published as: KR102169044B1

Abstract

본 발명은 봉독을 함유하는 동물 음용수에 관한 것으로서, 상기 봉독이 포함된 조성물이 H9N2 바이러스의 활성을 억제하는 효과가 우수하여 조류 인플루엔자를 예방 또는 개선할 수 있는 동물 음용수 또는 상기 동물 음용수에 비타민 C, 비타민 E, 벌꿀, 화분 추출물, 로얄젤리 및 수용성 프로폴리스가 첨가된 동물용 복합제제로 용이하게 사용될 수 있다.

Description

봉독을 함유하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수 {Animal drink comprising bee venom for prevention or improving avian influenza}

본 발명은 봉독을 함유하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수에 관한 것으로서, 자세하게는 H9N2 바이러스의 활성을 억제시키는 효과가 있는 서양종꿀벌의 정제봉독을 함유하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 '오르소믹소'과에 속하는 RNA 바이러스(Orthomyxovirus)로서 A, B, C형으로 분류된다. A형은 사람에게 주로 감염이 확인되며 B, C형에 비하여 돼지, 기타 포유류 및 다양한 야생조류에서 감염이 확인되고 있는 바이러스이다. 최근, 전 세계적으로 문제가 되고 있는 조류 인플루엔자(Avian influenza), 돼지 인플루엔자(Swine influenza) 및 신종플루(Novel flu) 등은 모두 A형 바이러스에 속한다.

인플루엔자 바이러스의 표면에는 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니데이즈(neuraminidase, NA)라는 두 가지 단백질이 존재하는데, HA는 16종이 있고 NA는 9종이 있으므로 16×9=144 종류의 인플루엔자 바이러스가 발생할 수 있다. 조류에서의 인플루엔자 감염은 주로 H5형이나 H7형 및 H9형에 관련되며, 3종류의 헤마글루티닌(H1, H2, H3)과 2가지 형태의 뉴라미니데이즈(N1과 N2)만이 인간에서 인플루엔자 감염을 일으키므로 원칙적으로 인간은 조류 인플루엔자에 감염되지 않았다. 그러나 최근에는 조류의 인플루엔자 바이러스가 유전자 재조합 과정을 거치지 않고 직접 사람에게 전파된 예도 발생하고 있다.

조류 인플루엔자는 닭과 오리, 칠면조 등 가금류를 접촉하는 것 이외에도 야생조류와 우리나라에 온 철새들을 통해서 빠르게 전파된다. 조류 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자가 발생한 동남아로부터 주기적으로 유입되어 전파되며 특히 봄철 황사를 통해 중국으로부터도 전염이 가능하다. 세계적으로 문제가 되고 있는 동물의 바이러스 질환인 조류 인플루엔자는 국내에서 1996년 이후 발생해 매년 직접적인 피해가 발생하고 있으며, 아시아를 비롯한 여러 국가에서도 조류 인플루엔자의 발생으로 양계산업의 경제적 손실이 막대한 실정이다.

바이러스의 감염 및 증식과정을 살펴보면 바이러스는 세포에 감염 후 세포내에서 새로운 바이러스를 만들고 다른 세포로 전파되기 위하여 세포 외부에 존재하는 시알릭산(siliac acid)을 바이러스가 만든 뉴라미니데이즈를 이용하여 절단하는 것이 필요하다. 조류 인플루엔자의 치료제로서 가장 잘 알려져 있는 것은 타미플루인데, 타미플루와 같은 치료약에 대해서도 내성이 있는 바이러스가 보고되어 있어 신규 치료제에 대한 개발이 시급하다. 내성 조류 인플루엔자 바이러스는 보통 타미플루가 결합하는 타미플루의 수용체 단백질의 아미노산을 변화시키는 3개의 유전적 변이(Arg292Lys, Asn274Ser, His294Tyr)를 통해 발생하는 것으로 알려져 있다. 3개의 유전적 변이 중 타미플루 내성 조류 인플루엔자 바이러스의 변종으로 가장 많이 발현하는 294의 His가 Tyr으로 변화한 바이러스의 경우는 타미플루의 소수성 잔기(hydrophobic residue)가 타미플루 수용체에 결합하지 못하게 변이된 경우이다. 따라서 이러한 바이러스의 등장은 인간이 새로운 바이러스 치료제를 지속적으로 개발하여야 하는 당위성을 제공한다.

일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위해 기존 약제를 실험적으로 변형시키는 것보다는 전통 의학에서 사용되고 있는 천연물 약제들로부터 새로운 활성성분을 찾는 것이 여러가지 면에서 장점이 많다. 특히 이러한 활성 성분들은 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 약물들에 의한 독성 염려가 적다. 이러한 사실은 타미플루도 출발물질은 중국의 토착식물인 '스타아니스' 열매를 주원료로 개발한 것에서 확인할 수 있다.

꿀벌의 종류는 일반적으로 서양종꿀벌(Apis mellifera), 동양종꿀벌(Apis cerana), 인도최대종(Apis dorsata), 인도최소종(Apis florea) 등 4개의 종이 알려져 있다. 이 중 현재 우리나라에는 서양종꿀벌과 동양종 꿀벌이 서식하고 있다. 특히 동양종꿀벌은 고려시대부터 사육되기 시작하였으며, 민간과 한방에서 봉침요법으로 사용되어져 왔다. 그러나 서양종꿀벌은 이탈리안 계통 일벌로서 조선시대 고종황제시기에 독일인 선교사에 의해 1892년경에 우리나라에 도입되어 사육되고 있다. 봉독은 벌의 독낭에 들어있는 것으로, 약 40여 가지의 물질로 이루어져 있으며 기원전부터 인체의 질병치료에 이용되어 왔다. 봉독은 벌의 종류에 따라 그 성분에 차이를 보이며, 동일한 벌이라도 일령에 따라 성분의 차이가 발생한다. 현재 봉독 성분에 따른 작용과 기전, 봉독의 과민성과 독성, 면역요법 및 관절염, 단순포진, 다발성 경화증, 종양 등의 질병 치료 등에 대한 연구가 보고되고 있으며 특히 항균작용과 세포 손상개선효과를 갖고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 이러한 정제봉독이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 정제봉독이 조류 인플루엔자의 활성을 억제하는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성할 수 있었다.

대한민국 등록특허 제10-1553109호 (발명의 명칭 : 정제봉독을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 또는 항종양 조성물, 출원인 : 대한민국(농촌진흥청장), 등록일 : 2015년09월08일) 대한민국 등록특허 제10-1596344호 (발명의 명칭 : 정제봉독을 이용한 동물의 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료용 조성물, 출원인 : 주식회사 청진바이오텍, 등록일 : 2016년02월16일)

본 발명의 목적은 봉독을 함유하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수를 제공하는 데에 있다.

본 발명은 봉독을 함유하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수에 관한 것이다.

상기 봉독은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.) 일벌의 독낭에서 분리한 정제봉독일 수 있다. 이 때, 상기 일벌은 15일령 이상의 일벌인 것이 바람직하다.

상기 동물 음용수 내의 봉독 농도는 1~32 ㎍/㎖(0.001~0.32㎎/㎖)인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 상기 동물 음용수에 NaCl, 비타민 C, 비타민 E, 벌꿀, 화분 추출물, 로얄젤리 및 수용성 프로폴리스가 첨가된 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 복합제제를 제공한다.

상기 화분 추출물은 벌이 채취한 생화분을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출한 것일 수 있다.

상기 수용성 프로폴리스는 프로폴리스 용액 1㎖당 꿀 5~20g이 혼합된 것일 수 있는데, 상기 프로폴리스 용액으로, 프로폴리스 원괴를 50~90%(v/v)의 에탄올 수용액에 녹여 얻은 것을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 봉독은 정제봉독으로서, 채집하는 과정은 통상의 양잠농가에서 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 특히, 봉독 외의 이물질인 당류와 휘발성물질을 제거하여 얻은 정제봉독인 것으로서, 자세하게는 상기 정제봉독은 서양종꿀벌의 15일령 이상 일벌의 독낭에서 봉독채집장치를 이용하여 분리한 봉독에서 봉독 외의 이물질인 당류와 휘발성물질을 제거하여 얻은 것일 수 있다.

본 발명의 봉독을 함유하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수 또는 이를 함유하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 복합제제에 있어서, 봉독이 1~32 ㎍/㎖(0.001~0.32㎎/㎖)로 포함될 수 있다. 또한, 동물 음용수에 NaCl, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 벌꿀, 화분 추출물, 로얄젤리 및 수용성 프로폴리스가 첨가될 때, NaCl 5~15 ㎎/㎖, 비타민 C 0.01~0.03 ㎎/㎖, 비타민 D 0.01~0.03 ㎎/㎖, 비타민 E 0.01~0.03 ㎎/㎖, 벌꿀 0.2~0.8 ㎎/㎖, 화분 추출물 0.01~0.5 ㎎/㎖, 로얄젤리 0.1~0.5 ㎎/㎖ 및 수용성 프로폴리스 0.1~0.8 ㎕/㎖가 포함되도록 제조하는 것이 바람직하다. 각 성분의 함량은 동물 음용수의 상태를 안정화하는 것으로서, 각 성분 함량이 이와 같은 범위를 벗어날 때 동물 음용수의 제조 직후에 나타나는 것과 같은 항바이러스 효능이 장기간 동일하게 유지되지 않을 수 있어 좋지 않다.

본 발명에서 사용하는 화분 추출물은 벌이 채취한 생화분(꽃화분)을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출한 것으로서, 상기 기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 화분 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 화분 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 화분 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 로얄젤리는 꿀벌 중 일벌이 유충을 기르는 시기에만 타선(唾腺)이 포육선(哺育腺)으로 발달하여 분비되는 유상물질로, 일벌의 유충에게 4일간만 먹이고 주로 여왕벌을 기르기 위하여 저장된다.

본 발명에서 사용하는 수용성 프로폴리스는 프로폴리스 용액과 꿀이 혼합된 것으로서, 프로폴리스 용액 1㎖당 꿀 5~20g이 혼합된 것을 사용할 수 있다. 이 때 꿀은 유화제로 기능하는데, 상기 꿀의 함량이 상기 프로폴리스 1㎖당 5g 미만일 경우에는 꿀의 함량이 너무 낮아 유화제로서의 역할을 하지 못하여 수지 상태의 프로폴리스가 혼합되지 못하거나 항균력도 낮을 수 있다. 또한 상기 꿀의 함량이 상기 프로폴리스 1㎖당 20g을 초과할 경우에는 더 상승된 효과를 나타내지 못하며 오히려 과도한 꿀의 함량으로 인해 용해성이 낮아질 수 있다. 상기 꿀은 프로폴리스 용액의 유화제로서 사용될 수 있다. 프로폴리스 용액은 물과 혼합시, 물에 잘 용해되지 않고 용기의 벽면에 묻어나거나 덩어리가 질 수 있다. 그러나, 꿀이 혼합됨으로써 상기 꿀이 유화제의 역할을 하여, 수용성이 증가되어 안정화된 수용액 상태를 유지하는 프로폴리스를 제공할 수 있다.

상기 프로폴리스 용액은, 프로폴리스 원괴를 50~90%(v/v)의 에탄올 수용액에 녹여 얻은 것일 수 있다. 이 때, 50%(v/v) 미만의 에탄올 수용액을 사용한다면, 프로폴리스 원괴의 용해도가 떨어져 프로폴리스 용액을 제조하기에 적합하지 않을 수 있다. 90%(v/v)초과 농도의 에탄올 수용액이나 에탄올 용액을 사용할 경우에는 프로폴리스 용액과 꿀을 혼합할 때 꿀이 유화제로서의 기능을 하는 것을 방해할 수 있다.

또한 상기 프로폴리스 용액은, 프로폴리스 원괴 1kg 당, 50~90%(v/v)의 에탄올 수용액 2~5ℓ에 녹여 얻은 것일 수 있다. 상기 50~90%(v/v)의 에탄올 수용액이 2ℓ 미만이 되면 프로폴리스 용액과 꿀과의 혼합이 잘 되지 않고 꿀이 유화제로서의 기능을 잘 하지 못할 수 있다. 상기 50~90%(v/v)의 에탄올 수용액이 5ℓ를 초과하여도 항바이러스 기능이 잘 나타나지 않을 수 있다.

이에, 상기 수용성 프로폴리스는, 프로폴리스 원괴를 1kg 당 50~90%(v/v)의 에탄올 수용액 2~5ℓ에 녹이는 제1단계; 프로폴리스 원괴를 녹인 용액에서 에탄올을 제거하여 프로폴리스 용액을 얻는 제2단계; 및, 상기 프로폴리스 용액 1㎖당 유화제로서 꿀 5~20g을 혼합하는 제3단계;를 포함하는 방법을 통해 제조될 수 있다.

본 발명은 봉독을 함유하는 동물 음용수에 관한 것으로서, 상기 봉독이 포함된 조성물이 H9N2 바이러스의 활성을 억제하는 효과가 우수하여 조류 인플루엔자를 예방 또는 개선할 수 있는 동물 음용수 또는 상기 동물 음용수에 비타민 C, 비타민 E, 벌꿀, 화분 추출물, 로얄젤리 및 수용성 프로폴리스가 첨가된 동물용 복합제제로 용이하게 사용될 수 있다. 대한민국 등록특허 제10-1553109호와 대한민국 등록특허 제10-1596344호에 봉독이 자궁경부암이나 뉴캐슬병 등의 원인이 되는 바이러스의 억제 효과가 있음이 개시되어 있지만, 아직까지 봉독의 조류 인플루엔자에 대한 항바이러스 효과는 개시된 바 없다.

도 1은 봉독채집장치를 이용하여 봉독을 채집하는 과정을 나타내는 사진이다.
도 2는 꿀벌의 일령별로 독낭을 액체크로마토그래피 분석하여 봉독 성분의 분포를 확인한 크로마토그램 결과이다.
도 3은 꿀벌의 일령에 따른 독낭을 액체크로마토그래피 분석하여 독낭 내의 봉독 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 15일령 이상된 일벌에서 채집한 정제봉독봉독의 정제 전(도 4의 좌측) 및 정제 후(도 4의 우측) 사진(도 4의 상단)과 이를 전자현미경으로 관찰한 사진(도 4의 하단)을 나타낸다.
도 5는 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)를 이용하여 정제봉독 내에 봉독의 표준물질인 아파민, 포스포리파아제 A2, 아돌라핀, 히알루니다아제 및 멜리틴이 존제하는지 확인한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 6은 정제봉독의 항바이러스 효과를 EID₅₀(Egg Infectious Dose)로 산출하여 나타낸 결과값의 그래프이다(1~3차 평균 log EID₅₀/㎖).
도 7은 정제봉독의 항바이러스 효과를 EID₅₀(Egg Infectious Dose)로 산출하여 나타낸 결과값을 대조군과 대비하여 나타낸 그래프이다(1~3차 평균 log EID₅₀/㎖reduction).

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 정제봉독의 제조>

서양종꿀벌(Apis meliffera L.)을 봉독채집장치를 이용하여 봉독을 채집하되, 성충이 된 시간이 1시간 이내인 일벌, 3~8일령인 일벌, 9~14일령인 일벌, 15일령 이상된 일벌에서 각각 봉독을 별도로 채집하였고, 봉독의 간이정제방법을 통해 당류와 휘발성물질을 제거함으로써 순수한 수용성을 갖는 정제 봉독 건조물을 제조하였다. 도 1에는 이와 같은 봉독채집장치를 이용한 봉독 채집과정이 개시되어 있다.

한편, 각 일령별 꿀벌의 독낭 내의 봉독 함량을 확인한 바, 도 2 및 도 3에 개시된 것처럼, 15일령 이상된 일벌의 독낭에서 순수한 봉독의 함유량이 가장 높았이다. 따라서 본 발명에서는 15일령 이상된 일벌에서 채집된 정제봉독을 실험에 사용하기로 하였다. 이렇게 얻은 정제봉독 분말은 2~8℃에서 빛이 차단되도록 알루미늄 호일로 포장하여 보관하였다.

<실시예 2. 정제봉독의 성분 확인을 위한 초고성능액체크로마토그래피 분석>

15일령 이상된 일벌에서 채집한 정제봉독 40 ㎎을 3차 증류수 10 ㎖에 녹여 PTFE 0.2 μm필터로 여과하였고, 아파민, 멜리틴, 포스포리파아제 A2, 아돌라핀, 히알루니다아제 표준품을 동일하게 3차 증류수에 녹여 2 ㎎/㎖로 만들어 시험봉독과 동일한 필터를 사용하여 여과하여 준비하였다. 봉독 성분 분석은 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)하여 확인하였으며, 분석기기는 Waters 회사의 I class 모델을 사용하였고, Advanced materials technology사의 Halo peptide ES-C18(입자크기: 2.7 μm, 내경: 4.6mm, 길이: 10 cm) 컬럼을 장착하였다. 이동상으로는, A용액: 20 mM 트리플루오르아세트산(TFA)의 아세토나이트릴(MeCN) 용액과, B용액: 20 mM 트리플루오르아세트산(TFA)의 수용액을 혼합한 혼합용액을 이용하였다. 상기 혼합용액은 이동시간이 3분 미만일 때는 A용액이 10 부피% 이상 31 부피% 미만, 이동시간이 3분 이상에서 5분 미만일 때는 A용액이 31 부피% 이상 40 부피% 미만, 이동시간이 5분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 40 부피% 이상에서 45 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하였다. 이동상의 흐름속도는 1.5 ㎖/min이고, 시료 주입량은 4 ㎕이며 자외부 흡광광도계 파장은 220 nm로 설정하였으며 분석시 컬럼의 온도는 50℃로 조절하였다. 검출한계는 ICH 가이드라인(International Conference on Harmonisation guideline)에 따라 산출하였다. 상기 조건은 다시 하기 표 1에 자세하게 나타내었다.

기 기	Waters I class
컬 럼	Halo ES-18 (4.6 x 100 mm, 2.7 μm)
컬럼온도	50℃
흐름속도	1.5 ㎖/min
주 입 량	4 ㎕
검출파장	220 nm
이 동 상	(A) 20 mM TFA/MeCN, (B) 20 mM TFA/H₂O (A) 0-3 min:10-31부피%/ 3-5 min:31-40부피%/ 5-10 min:40-45부피%

이렇게 분석한 정제봉독 수용액의 분석결과는 표준품 용액과의 피크 비교를 통해 도 5에 나타내었으며, 상기 정제봉독 수용액 내의 아파민, 멜리틴, 포스포리파아제 A2, 아돌라핀, 히알루니다아제 함량은 하기 표 2에 나타내었다.

성분	함량(%)
아파민	2.3
멜리틴	63.6
포스포리파아제 A2	11.5
히알루니다아제	1.9
아돌라핀	0.9

<실시예 3. 시료의 준비>

실시예 3-1. 종란 및 계혈(Chicken blood)의 준비

7일령 SPF 종란(Chicken embryo)을 구입(경기도 화성, 성민축산)하여 실험 전까지 부화기(38℃)내 보관하고, 9일째 생존상태의 것만 바이러스 배양용으로 사용하였다(실험 도중 죽은 종란은 냉장보관 또는 접종 자체가 원인이 된 것이며, 검란용 라이트를 사용하여 생존상태를 확인함). 10%(v/v) 닭 날개에서 채취한 Chicken blood는 PBS(Phosphate Buffer Solution, Gibco, USA)를 이용하여 0.5%(v/v) 용액이 되도록 희석하였다(희석된 용액은 1주일 동안 사용가능함).

실시예 3-2. 인플루엔자 바이러스의 준비

실험에 사용한 조류 인플루엔자 바이러스는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 A/chicken/Korea/MS96/96(H9N2)을 사용하였다(건국대학교 분양). 이것을 9일령 종란의 요막강 내의 요막액(allantoic fluid)에 0.2ml씩 접종(5개, 1㎖ syringe)하고, 38℃에서 2일간 배양하였다(배양 도중 죽은 종란은 폐기함). 2일간의 배양 후, 11일령이 된 종란의 온도를 4℃로 낮춘 후 요막액을 수집하여 3,000rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액만을 채취하였다. 채취된 상층액을 1.1㎖ 씩 분주 후 사용 전까지 -40℃에 보관하였다. 실험직전에는 -40℃ 보관 중인 바이러스 배양액을 상온에서 녹인 후, PBS(Phosphate Buffer Solution, Gibco, USA)를 이용하여 10^-1~10^-8 EID₅₀/㎖으로 10배씩 연속 희석 후 사용하였다.

실시예 3-3. 정제봉독 수용액의 준비

실시예 1에서 얻은 정제봉독 분말을 2차 증류수(D.W) 50ml를 이용해 녹인 후 3,000rpm 10min 원심분리 후 0.2um syringe filter(Coring, German)를 이용하여 불순물을 제거한 후, 실험 직전에 2차 증류수(D.W; Distilled water)를 이용하여 농도별로 희석하여 수용액 상태로 제조하였다(봉독 농도 : 32, 16, 8, 4, 2, 1㎍/㎖).

<실시예 4. 항바이러스 활성 억제 효과 확인>

각 희석배수별 바이러스(10^-1~10^-8 EID₅₀/㎖) 500㎕와 농도별 봉독 500㎕씩을 혼합하여 시료를 준비하였다. 음성 대조군(negative control)은 희석배수별 바이러스 500㎕와 PBS 500㎕를 혼합하였고, 양성 대조군(positive control)은 조류 인플루엔자 감소효력이 증명된 소독제(유효성분 : 이염화이소시아뉼산나트륨[NaDCC 0.01%])와 바이러스 혼합하여 사용하였다. 모든 실험은 [농림축산검역본부 고시 제2016-29호, '16.3.9.]의 소독제 효력시험지침에 따라 표준조건 하에서 진행하였다. ※ 소독제는 제조회사의 권장희석배수에 맞추어 희석 후 사용함.

각 시료를 주사기(1㎖, Korea Vaccine, Korea)를 이용하여 0.1㎖씩 9일령 종란의 요막강 내 요막액에 접종하였다.

접종된 종란은 1회 실험당 240 eggs[바이러스 희석배수(8set) × 봉독 희석배수(6set) × 접종 종란(5set)]를 사용하였고, 대조군 그룹(control group)에 30 eggs를 사용하였고, 본 실험조건을 3번 반복하여, 총 810 eggs(270 eggs × 3)를 사용하였다. 접종된 종란은 38℃ 배양기 내에서 48시간 보관하였고, 도중에 죽은 종란(냉장보관사 또는 접종사 원인)은 폐기하였다.

이렇게 48시간 보관 된 종란 내에서 요막액을 1㎖ 씩 회수하여 micro haemagglutination(HA) test를 수행하였다.

이를 위해 96well U-type cell culture plate(SPL, Korea)에 각 종란에서 얻은 요막액 50㎕와 0.5% chicken blood 50㎕를 반응하게 하여 35~40분 후 응집 유무 관찰을 통해 감염 여부 확인하였다. 응집이 일어난 것은 적혈구가 well 전체에 골고루 퍼져있고 응집이 일어나지 않은 것은 혈구가 가운데로 모여 단추 모양 (⊙)을 이루고 있다. 최종 결과 판정은 plate를 45ㅀ 기울여서 흐르는 것을 기준으로 판정한다. 응집결과는 EID₅₀(Egg Infectious Dose)로 산출하여 나타내었고, Reed and Muench mathematical technique를 이용하여 계산하였으며, 산출된 EID₅₀값은 log₁₀변환 후 표시하였다.

이에 대한 실험결과의 평균값을 하기의 표 3에 나타내었고 이를 도 6에 그래프로서 표시하였다. 표 3과 도 6의 기준값은 log EID₅₀/㎖이다.

표 4는 표 3의 값을 음성대조군(N.C)에 대한 값으로 환산하여 나타낸 것으로 이에 대한 값도 역시 도 7에 그래프로서 표시하였다. 표 4와 도 7의 기준값은 log EID₅₀/㎖ reduction이다.

조건	1st	2nd	3rd	평균
음성대조군(N.C)	6.33	6.33	6.50	6.39
양성대조군(P.C)	1.89	2.31	2.00	2.07
32㎍/㎖	3.73	2.46	2.49	2.89
16㎍/㎖	3.28	2.55	2.67	2.83
8㎍/㎖	4.00	3.00	3.00	3.33
4㎍/㎖	3.84	2.19	2.31	2.78
2㎍/㎖	3.81	2.00	2.80	2.87
1㎍/㎖	2.55	2.57	4.29	3.14

조건	1st	2nd	3rd	평균
양성대조군(P.C)	4.44	4.02	4.50	4.32
32㎍/㎖	2.60	3.87	4.01	3.49
16㎍/㎖	3.05	3.78	3.83	3.55
8㎍/㎖	2.33	3.33	3.50	3.05
4㎍/㎖	2.49	4.14	4.19	3.61
2㎍/㎖	2.52	4.33	3.70	3.52
1㎍/㎖	3.78	3.76	2.21	3.25

표 3과 도 6, 표 4와 도 7의 결과를 참고하여, 봉독이 농도 의존적으로 조류 인플루엔자의 활성을 현저하게 억제함을 알 수 있다.

<실시예 5. 바이러스 감염 억제 효과 확인>

실시예 1의 정제봉독 분말을 생리식염수(NaCl 9 ㎎/㎖)를 이용하여 2㎍/㎖의 농도로 희석하여 바이러스 감염 억제용 음용수로 제조하였다.

바이러스 감염 실험을 위해서는 3주령 SPF 병아리 70수를 표 5와 같이 구분하여 공격접종군과 접촉감염군을 동거 사육하였고, 사육 기간 중 봉독이 포함된 음용수를 2일 간격으로 새로 공급하였다.

그룹	구분	두수	봉독	H9N2 접종
G1	공격 접종군	5	+	+
G2	접촉 감염군	10	+	-
G3	공격 접종군	5	-	+
G4	접촉 감염군	10	-	-
G5	비접종 대조군	10	-	-

표 5와 같이 봉독 투여 7일 후 H9N2 10⁶ EID₅₀/100 ㅅl를 비강으로 감염시킨 뒤 2일 간격으로 구강 및 총배설강을 면봉으로 채취한 후 real-time RT-PCR을 이용하여 바이러스 배출 여부 및 배출량을 측정하였다. 이 때 바이러스의 RNA 추출을 위해서는 Viral gene-spin RNA/DNA extraction kit를 사용하였고, PCR을 위한 프라이머 및 프루브는 다음에 개시된 것을 사용하였다. real-time RT-PCR Master Mixture는 표 6의 조성물 제조 조건으로 혼합한 것을 사용하였고, real-time RT-PCR의 조건은 표 7에 나타내었다.

forward : 5'-AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3'

reverse : 5'-TGCAAAAACATCTTCAAGTCTCTG-3'

probe sequence : 5'-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-3'

시약	용량(㎕)
Forward primer	1
Reverse primer	1
Probe	1
QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix	25
QuantiTect RT enzyme	0.5
RNA	5
DW	16.2
Total reaction	50

Stage 1 cDNA syntheseis		Stage 2 PCR reation (40 cycles)
Temp(℃)	Time(min)	Temp(℃)	Time(sec)
50	30	94	10
95	15	55	30
		72	10

real-time RT-PCR 결과, 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 정제 봉독을 투여한 접촉감염군과 양성대조군 접촉감염군의 구강에서 일자별 인플루엔자 바이러스 검출을 확인한 결과 바이러스 공격접종 후 11일째에 양성대조군 접촉감염군에서 인플루엔자 바이러스 재분리양성율 100%에 비하여 정제봉독을 투여한 접촉감염군이 인플루엔자 바이러스 재분리 양성율 60%로 감소하여 전염이 억제되는 것으로 확인된다. 또한 공격접종 후 정제 봉독을 투여한 접촉감염군과 양성대조군 접촉감염군의 총배설강에서 일자별 인플루엔자 바이러스 검출을 확인한 결과, 바이러스 공격접종 후 11일째에 양성대조군 접촉감염군에서 인플루엔자 바이러스 재분리양성율 100%에 비하여 정제봉독을 투여한 접촉감염군이 인플루엔자 바이러스 재분리 양성율 70%로 감소하여 바이러스의 전염이 억제되는 것으로 확인된다.

조류인플루엔자 감염군과 동거사육 시 정제 봉독처리에 의한 바이러스 감염율(%)

	조류인플루엔자 감염군과 동거사육 기간
	1일	3일	5일	7일	9일	11일
구강 내 검출(봉독처리)	0% 감염율	100% 감염율	100% 감염율	100% 감염율	90% 감염율	60% 감염율
구강 내 검출(무 처리)	0% 감염율	60% 감염율	100% 감염율	100% 감염율	100% 감염율	100% 감염율
총 배설강 내 검출(봉독처리)	0% 감염율	20% 감염율	80% 감염율	100% 감염율	80% 감염율	70% 감염율
총 배설강 내 검출(무 처리)	0% 감염율	20% 감염율	70% 감염율	100% 감염율	100% 감염율	100% 감염율

<실시예 6. 봉독을 함유하는 동물 음용수의 안정적 제형화 방법 확인>

고형 생태에서의 정제봉독 성분은 매우 안정화 되어 있으나, 분말 또는 고체 형태의 정제봉독을 물 또는 생리식염수에 녹여 사용할 경우 유효성분의 변화없이 안정적으로 유지되어야 할 필요가 있다. 한편, 봉독이 액체에 용해된 상태에서는 낮은 농도에서의 안정성이 매우 낮은 것으로 본 발명의 연구자들이 기존 연구를 통해 확인된 바 있다.

따라서, 수용액 상태의 정제봉독이 음용수 상태로 성상의 변화없이 보존될 수 있는 음용수 제형을 제조하였고, 이렇게 제조된 음용수 내의 표준물질인 멜리틴의 농도가 시간별로 변화하는지 확인하였다.

실시예 6-1. 음용수의 제형화

먼저, 봉독이 함유된 동물 음용수의 안정적인 제형화를 위해 비타민 C, 비타민 E, 벌꿀, 화분 추출물, 로얄젤리 및 수용성 프로폴리스를 준비하였다. 로얄젤리와 아카시아꿀은 양봉농가에서 구입하였고, 비타민 C와 비타민 E는 의약용 원료를 구입하였다.

화분 추출물은 꿀벌이 채취한 생화분 1kg을 10ℓ의 70%(v/v) 에탄올 수용액에 넣고 50℃에서 10시간 동안 반응한 후 10000rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 액상을 감압증류하여 제조하였다.

수용성 프로폴리스의 제조를 위해서는 다음의 과정을 수행하였다. 먼저, 프로폴리스 원괴 1kg을 3.5L의 80%(v/v) 에탄올 수용액에 용해시켜 프로폴리스 용액을 준비하였다. 상기 프로폴리스 용액을 필터하여 36ㅀbrix의 프로폴리스 용액을 제조하였다. 상기 프로폴리스 용액 25 내지 100㎖에 아카시아꿀 500g을 넣고 혼합하여, 수용성 프로폴리스를 제조하였다. 상기 프로폴리스 용액과 꿀은 혼합 후, 100rpm 이하로 일정한 속도의 기계적 교반을 30분간 수행하였다.

이렇게 준비된 원료를 이용하여 하기 표 9와 같이 각 원료를 혼합하고 필터를 이용하여 멸균함으로써 음용수 제형을 제조하였다.

음용수 제조 조건	봉독 (㎎/㎖)	NaCl (㎎/㎖)	비타민 C (㎎/㎖)	비타민 D (㎎/㎖)	비타민 E (㎎/㎖)	벌꿀 (㎎/㎖)	화분 추출물 (㎎/㎖)	로얄 젤리 (㎎/㎖)	수용성 프로 폴리스 (㎕/㎖)
제조예 1-1	0.016	9.000	0.030	0.010	0.010	0.50	0.200	0.300	0.300
제조예 1-2	0.032	9.000	0.014	0.030	0.030	0.26	0.100	0.100	0.800
제조예 1-3	0.010	9.000	0.030	0.010	0.030	0.24	0.046	0.500	0.500
제조예 1-4	0.001	8.510	0.010	0.030	0.010	0.80	0.405	0.500	0.100
비교 제조예 1-1	0.032	10.334	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
비교 제조예 1-2	0.016	10.050	0.100	0.100	0.100	0.000	0.000	0.000	0.000
비교 제조예 1-3	0.010	6.890	0.000	0.000	0.000	1.100	1.100	1.100	0.166
비교 제조예 1-4	0.001	9.535	0.030	0.000	0.000	0.500	0.000	0.300	0.000

실시예 6-2. 음용수의 보존에 따른 안정화 상태 확인

표 9와 같이 각 원료를 혼합하여 제조한 음용수 제형이 습도 70% 조건의 25℃와 40℃에서 3개월간 상태가 그대로 유지되는지를 표 10에 나타내었고, 봉독 성분이 안정적으로 유지되는지에 대해서는 멜리틴의 함량을 UPLC를 이용하여 측정하여 표 11에 나타내었다.

먼저 표 10에 제형상의 형태 변화를 확인하여 나타내었는데, 표 10의 결과를 참고하면, 제조예 1의 음용수 제형만이 25℃ 뿐만 아니라 40℃ 보관 상태에서도 안정적임을 확인할 수 있다.

음용수 제형	25℃ 보관된 상태에서의 음용수 상태	40℃ 보관된 상태에서의 음용수 상태
제조예 1-1	균질	균질
제조예 1-2	균질	균질
제조예 1-3	균질	균질
제조예 1-4	균질	균질
비교제조예 1-1	균질	부유물질 생성
비교제조예 1-2	균질	부유물질 생성
비교제조예 1-3	균질	부유물질 생성
비교제조예 1-4	균질	부유물질 생성

다음으로, 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)를 이용하여 각 음용수 제형 내의 멜리틴 성분을 확인하였는데, 분석기기로는 Waters 회사의 I class 모델을 사용하였으며, Advanced materials technology사의 Halo peptide ES-C18(입자크기: 2.7 μm, 내경: 4.6mm, 길이: 10 cm) 컬럼을 장착하였다. 이동상으로는, A용액: 20 mM 트리플루오르아세트산(TFA)의 아세토나이트릴(MeCN) 용액과, B용액: 20 mM 트리플루오르아세트산(TFA)의 수용액을 혼합한 혼합용액을 이용하였다. 상기 혼합용액은 이동시간이 3분 미만일 때는 A용액이 10 부피% 이상 31 부피% 미만, 이동시간이 3분 이상에서 5분 미만일 때는 A용액이 31 부피% 이상 40 부피% 미만, 이동시간이 5분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 40 부피% 이상에서 45 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하였다. 이동상의 흐름속도는 1.5 ㎖/min이고, 시료 주입량은 4 ㎕이며 자외부 흡광광도계 파장은 220 nm로 설정하였으며 분석시 컬럼의 온도는 50 ℃로 조절하였다. 검출한계는 ICH 가이드라인(International Conference on Harmonisation guideline)에 따라 산출하였다. 상기 조건은 다시 하기 표 11에 자세하게 나타내었다.

이 조건으로 본 발명에서 제조된 동물 음용수 내의 멜리틴 함량을 확인하였는데, 각 음용수의 제조직후의 멜리틴 함량을 100%라 할 때, 음용수 제조 3개월간 보존된 것의 멜리틴 함량이 하기 표 12와 같이 확인되었다.

음용수 제형	25℃ 보관된 상태에서의 멜리틴 함량 (%)	40℃ 보관된 상태에서의 멜리틴 함량 (%)
제조예 1-1	99	90
제조예 1-2	97	92
제조예 1-3	99	94
제조예 1-4	98	94
비교제조예 1-1	68	25
비교제조예 1-2	76	36
비교제조예 1-3	75	43
비교제조예 1-4	78	41

표 12의 결과를 통해, 오직 제조예 1 제형의 동물 음용수만이 봉독 성분이 분해되지 않고 온전히 보존됨을 확인할 수 있다.

Claims

봉독을 함유하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수.
제1항에 있어서,
봉독은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.) 일벌의 독낭에서 분리한 정제봉독인 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수.
제2항에 있어서,
상기 일벌은 15일령 이상의 일벌인 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수.
제1항에 있어서,
상기 동물 음용수 내의 봉독 농도는 1~32 ㎍/㎖인 것을 특징으로 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 동물 음용수.
제1항의 동물 음용수에 NaCl, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 벌꿀, 화분 추출물, 로얄젤리 및 수용성 프로폴리스가 첨가된 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 복합제제.
제5항에 있어서,
상기 화분 추출물은 벌이 채취한 생화분을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 복합제제.
제5항에 있어서,
상기 수용성 프로폴리스는 프로폴리스 용액 1㎖당 꿀 5~20g이 혼합된 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 복합제제.
제7항에 있어서,
상기 프로폴리스 용액은, 프로폴리스 원괴를 50~90%(v/v)의 에탄올 수용액에 녹여 얻은 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자의 예방 또는 개선용 복합제제.