KR101596344B1 - 정제봉독을 이용한 동물의 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정제봉독을 이용한 바이러스성 질환의 예방 빛 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 정제봉독의 구성성분인 아파민, 포스포리파아제A₂, 멜리틴을 유효성분으로 하여 바이러스성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 동물의 바이러스성 질환을 예방 및/또는 치료용 조성물의 제조방법은, 봉독 원료를 증류수와 혼합하여 봉독 수용액을 생성하는 제 1 단계와, 생성된 봉독 수용액을 여과지로 여과하여 비 수용성 화분 및 먼지를 포함하는 이물질을 제거하는 제 2 단계와, 이물질이 제거된 봉독 수용액을 필터막으로 여과하여 정제봉독 수용액을 얻는 제 3 단계 및 상기 정제봉독 수용액을 동결 건조하여 정제봉독을 제조하는 제 4 단계를 포함하고, 상기 정제봉독은 2.0 내지 3.0%의 아파민, 11.5 내지 13%의 포스포리파아제A₂, 50 내지 75%의 멜리틴을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

Description

정제봉독을 이용한 동물의 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료용 조성물{Composition for viral disease prophylaxis and/or cure of animal using purified bee venom}

본 발명은 정제봉독을 이용한 바이러스성 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 정제봉독의 구성성분인 아파민, 포스포리파아제A₂, 멜리틴을 유효성분으로 하여 동물의 바이러스성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

봉독(蜂毒)이란 벌이 가지고 있는 독을 일컫는 말로, 주요 성분인 멜리틴, 아파민, MCD-펩티드를 포함하여 단백질효소, 펩티드 아미노산 및 활성 아민 등 40가지 이상의 물질로 구성되어 있다.

봉독은 진통, 소염, 항균작용을 특성을 가지고 있어 예로부터 관절염, 류마티즘 및 피부 질환에 사용되어 왔다. 또한 현대에는 뇌하수체의 호르몬 분비 촉진, 혈액순환 촉진 등의 효능이 알려지면서 다발성 경화증(multiple sclerosis), 라임병(lyme disease), 만성피로증후군(chronic fatigue syndrome) 치료를 위한 대체 치료로서 사용되고 있다.

핵산과 단백질로 이루어져 있는 바이러스는, 바이러스 감염활성을 가지는 핵산을 증식이 가능한 숙주에게 침투시켜 친화성을 지닌 조직의 감염을 통해 바이러스성 질환의 병적 변화를 일으킬 수 있으며, 이러한 바이러스성 질환의 특징은 여러 종류의 바이러스가 유사한 증상을 나타낼 수 있다.

바이러스성 질환의 치료는 대증요법을 중심으로 백신에 의한 예방을 최우선으로 하고, 세균의 2차 감염예방과 치료의 목적으로 항생제를 사용할 수 있으며, 특히, 세포가 바이러스에 감염되면 세포의 변성, 괴사, 염증, 거세포형성 및 봉입체형성 등이 발생할 수 있고, 종양의 원인이 될 수도 있다.

또한, 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus)는 오르토믹스 바이러스과 인플루엔자바이러스속에 속하며 상기도(upper airway)의 점막에 침입하여 호흡기질환을일으키는 바이러스로, 이 바이러스 종류들은 전염성이 매우 크고, 기관지 폐렴, 급성전염병(acute infectious disease) 등을 일으키며, 고이환율, 저폐사율 등의 특징을 갖는다.

인플루엔자 바이러스는 항원 자극의 면역학적 기억이 매우 길고, 동물체 내에서 증식하여 분절 교환이 일어나며, 사람 외에 돼지, 말, 오리 등에서도 분리될 수 있다.

또한, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus)는 수포성 구내염의 병인(病因)이 되는 비분절형의 음성가닥 RNA를 기본형으로 하는 바이러스이며, 랍도바이러스(rhabdovirus)과로 분류되고 있다. 이 바이러스 RNA의 뉴클레오시드 껍질은 나선 대칭형이고, 비리온(virion, 바이러스입자)에는 외막이 있으며, 그 구조는 포탄형이다. 비리온 표면에는 1종류의 바이러스 특이적 단백질(G단백질)이 존재하며, 입자 내부에는 바이러스 특이적 RNA의존성 RNA중합효소가 있다.

또한, 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus)는 Paramixoviridae과 Paramixovirus속의 조류 병원 바이러스로, 이 바이러스의 크기는 지름 150 내지 200nm 정도이며, 피막으로 싸여있고 입자에 RNA중합효소를 가지고 있다.

닭 뉴캐슬병의 병원체로서 전염성이 강하고 기관지염, 폐렴, 설사나 경련, 마비 등을 일으키며 사망률이 높으며, 닭 이외의 다른 조류에서도 치사 병변을 초래하고 사람에게도 결막염을 일으킬 수 있다.

또한, 헤르페스 바이러스(Herpes Simplex Virus)는 바이러스입자가 둥근 모양으로, 피막(envelope) 내부에는 지름 100nm 전후의 정 20면체상의 캡시드가 있다. 유전체는 2중 가닥 DNA이며 그 크기는 예를 들면 단순 헤르페스 바이러스1형은 152,260염기쌍, EB바이러스가 172,282염기쌍, 사이토메가로 바이러스가 229,400염기쌍을 가진다.

헤르페스 바이러스는 숙주의 세포핵에서 증식하고 포일겐반응(Feulgen reaction) 양성의 봉입체를 만들며, 바이러스가 감소하면 포일겐반응 음성, 에오신호성(호산성)의 Cowdry A형 봉입체로 변하는 특징 때문에 A형 핵내봉입체(NITA) 바이러스군이라고도 하였다.

봉독은 항 바이러스의 효능이 있어, 동물의 생체 내에서 면역계를 자극하여 바이러스에 대한 방어력을 증가시킨 뿐 아니라 대상포진 바이러스의 독소 또한 제거할 수 있는 효과가 있다.

정제봉독(Purified Bee Venom, PBV)은 벌로부터 봉독채집장치를 이용하여 채집된 봉독의 자연 상태를 최대한 유지시키기 위하여 자연건조, 수용, 여과, 멸균 및 동결건조 등의 공정을 통해 비 수용성 화분, 먼지 등의 이물질만 제거하고 회수한 결과물이며, 정제봉독과 봉독의 생리활성은 유사한 것으로 알려져 있다.

이와 같이 봉독 또는 정제봉독을 이용한 기술로, 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-1070600호는 봉독으로부터 분리된 봉독 정제물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관하여 제안하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1165510호는 봉독을 유효성분으로 하여 T세포 활성에 관여하는 림프절의 무게 증가를 억제하고 진피 및 표피 두께를 감소시키는 등의 피부 질환 치료용 조성물에 관하여 제안하고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 아파민, 포스포리파아제A₂, 멜리틴을 주요성분으로 하는 정제봉독을 이용하여 동물의 바이러스성 질환을 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 의한 정제봉독을 이용한 동물의 바이러스성 질환의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료용 조성물은, 동물의 바이러스성 질환을 예방 및/또는 치료할 수 있는 아파민, 포스포리파아제A₂ 및 멜리틴을 유효성분으로 하는 정제봉독 조성물을 제안한다.

또한 본 발명에 따른 동물의 바이러스성 질환을 예방 및/또는 치료용 조성물의 제조방법은, 봉독 원료를 증류수와 혼합하여 봉독 수용액을 생성하는 제 1 단계와, 생성된 봉독 수용액을 여과지로 여과하여 비 수용성 화분 및 먼지를 포함하는 이물질을 제거하는 제 2 단계와, 이물질이 제거된 봉독 수용액을 필터막으로 여과하여 정제봉독 수용액을 얻는 제 3 단계 및 상기 정제봉독 수용액을 동결 건조하여 정제봉독을 제조하는 제 4 단계를 포함하고, 상기 정제봉독은 2.0 내지 3.0%의 아파민, 11.5 내지 13%의 포스포리파아제A₂, 50 내지 75%의 멜리틴을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 정제봉독을 이용한 동물의 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료용 조성물에 의하면, 2.0 내지 3.0%의 아파민, 11.5 내지 13%의 포스포리파아제A₂, 50 내지 75%의 멜리틴을 유효성분으로 하는 정제봉독을 이용하여 동물에게서 발생할 수 있는 바이러스에 의한 질환을 예방 및 치료할 수 있는 특징이 있다.

도 1은, 본 발명에 따른 정제봉독을 이용한 동물의 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료용 조성물의 제조방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는, 본 발명의 실시예에 의해 제조된 정제봉독의 성분을 나타내는 도면이다.
도 3은, 본 발명에 의한 정제봉독이 대식세포에서 인플루엔자 바이러스에 작용하는 예방효과를 나타내는 도면이다.
도 4는, 본 발명에 의한 정제봉독이 대식세포에서 수포성 구내염 바이러스에 작용하는 예방효과를 나타내는 도면이다.
도 5는, 본 발명에 의한 정제봉독이 상피세포에서 수포성 구내염 바이러스에 작용하는 예방효과를 나타내는 도면이다.
도 6은, 본 발명에 의한 정제봉독이 대식세포에서 헤르페스 바이러스에 작용하는 예방효과를 나타내는 도면이다.
도 7은, 본 발명에 의한 정제봉독이 상피세포에서 헤르페스 바이러스에 작용하는 예방효과를 나타내는 도면이다.
도 8은, 본 발명에 의한 정제봉독이 대식세포에서 뉴캐슬 바이러스에 작용하는 예방효과를 나타내는 도면이다.
도 9은, 본 발명에 의한 정제봉독이 대식세포에서 사이토카인 및 인터페론의분비를 유도하는 효과를 나타내는 도면이다.
도 10은, 본 발명에 의한 정제봉독이 대식세포에서 수포성 구내염 바이러스에 작용하는 치료효과를 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 하기에서 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기에서 설명하고 있는 것은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 설명에 의하여 한정되는 것은 아니다.

도 1은 채집한 봉독을 정제하여 정제봉독을 제조하는 과정을 나타내는 흐름도이다.

도 1의 흐름에 따라, 벌로부터 채집한 봉독을 정제하여 정제봉독을 제조하는 과정은 우선 채집한 봉독 원료를 증류수와 혼합하여 수용액을 생성한다(S100). 수용액은 벌로부터 채집한 봉독 원료와 증류수를 예를 들어, 1:10 의 중량비로 혼합하여 용해할 수 있다.

이때, 하기의 여과 단계에서 유효성분을 충분히 통과시켜 회수하기 위해 증류수를 적정량으로 맞춰주어야 한다. 증류수의 양이 부족하면 회수율이 감소되고, 증류수의 양이 너무 많으면 다음 과정의 필터와 최종 건조의 효율을 낮아진다.

다음 상기의 생성된 수용액을 여과지로 여과하여 비수용성 화분 및 먼지를 포함하는 이물질을 제거한다(S200). 여과지는 예를 들어 3㎛의 여과지를 이용하여 감압여과를 수행한다.

봉독은 단백질효소, 펩티드, 아미노산과 활성 아민 등 수용성 유효성분으로 구성되며, 상기의 여과 과정에서 비수용성의 화분, 먼지 등의 이물질이 제거된다.

그 다음으로 이물질이 제거된 봉독 수용액을 필터막으로 여과하여 정제봉독 수용액을 얻는다(S300).

필터막을 이용한 여과는 2번의 공정으로 진행될 수 있는데 우선, 예를 들어 0.45㎛의 필터막을 이용하여 미세 이물질 등을 제거하는 가압여과를 수행한다. 그 다음으로 0.2㎛의 필터막을 이용하여 미생물과 세균 등을 제거하는 가압여과를 수행한다.

이후, 이물질 등이 제거된 수용액을 동결건조하여 정제봉독을 제조한다(S400). 상기에서 수득한 정제봉독은 유효성분으로서 아파민 2.0 내지 3.0%, 포스포리파아제A₂ 11.5 내지 13%, 멜리틴 50 내지 75%를 포함하고 있다.

정제봉독의 평가 및 분석

1) 정제봉독의 성분분석

본 발명에 따른 방법으로 제조한 정제봉독의 유효성분의 정량 및 정성분석 위해 각각의 시료를 1.0 mg/mL 농도로 정확히 만들고 HPLC(고속 액체 크로마토그래피)장치와 펩티드 분석 전용 컬럼(150 X 4.6mm 4.0㎛, 90Å, phenomenex^®)을 이용하여 HPLC용 물(0.2% TFA(trifluoroacetic acid) in water)과 acetonitrile(0.22% TFA in ACN(acetonitrile))로 분석하였다.

도 2는 그에 대한 결과로서, 봉독 성분의 표준물의 HPLC 장치와 비교분석하며 아파민과 멜리틴의 피크(peak)는 10.47 min와 22.25 min에서 집중 유출되고, 포스포리파아제A₂의 피크는 16.68 min에 유출되었음을 확인할 수 있다. 표준 규격(standard)의 검정곡선(calibration curve)과 각 성분의 면적을 산출하여 각 성분의 함량을 하기의 식 1을 통하여 계산하고, 표 1을 통하여 나타내었다.

[식 1]

[표 1]

2) 정제봉독의 안전성 평가

본 발명의 방법으로 제조한 정제봉독의 안전성 평가는 미국 FDA-DMF(미국 식품의약국-원료의약품)인증기관에서 지정한 안정성 평가기관의 실험의뢰를 통해 평가 하였고 등록하였다(FDA-DMF 27321). 구체적인 실험은 정제봉독을 0.1mg/ml과 0.2mg/ml 농도에서 다음과 같이 FDA의 GLP(good laboratory practice)기준에 따라 실험하였다.

L929 세포는 MEM (Minimum Essential Medium (Eagles)) 과 EBS(Earles Balanced Salts) 배지 속에서 배양하고 저장시키며, 소 태아 혈청과 항생-항 진균성 용액을 혼합하여 세포에 영양분을 준다. 60mm의 멸균된 tissue culture grade(세포배양용)의 페트리 플레이트에서 융합성의(confluent) 배양세포에 트립신(Trypsin) 처리 후, 계대배양(subculture)을 하여 한 플레이트 당 약 1 x 10⁶cell의 밀도로 세포를 배양한다. 모든 플레이트는 실험에서 약 80%의 융합성의(confluent) 단층을 얻기 위하여 5±1%의 CO₂를 포함하는 37±1℃의 다습한 환경에서 24시간 이상 배양한다.

배양 후, 배양세포의 준포화상태(subconfluency)의 형태학을 현미경을 이용하여 확인한다. 플레이트의 약 80% 정도로 가득찬(80% confluency) 배양세포에서 특성이 일반적이고 건강한 세포를 포함한 배양세포가 실험에 사용되었다.

각 세포단층에서 배지를 조심스럽게 제거하고 1:1로 믹스된 2% w/v purified agar(한천 배양기 배지)와 2x Complete MEM 7ml으로 교체하였다. 덧입힌 agar를 상온에서 15분 이상 굳히고, 실험을 시작하기 전에 0.01% neutral red 염색 액 2-5ml로 세포단층을 염색한다. 최소 15분 동안 염색 후 염색 약을 제거한다.

적당한 농도의 시험물질 약 0.2ml을 적신 멸균된 필터종이(~2.1 cm²)를 agar 표면에 올려놓아 약 10%의 cell agar 층 표면을 둘러싸도록 한다.

대조용 필터종이는 주사용 멸균증류수에 적신 필터 종이로 준비한다. 표준 양성 혹은 음성 대조물질은 라텍스 고무와 USP HDPE 표준시료를 2.1cm²의 크기로 멸균 커팅하여 준비하고 agar 표면에 올린다.

모든 시험은 3번 반복하며 3개의 플레이트도 blank (대조군)로 준비한다. 모든 플레이트는 5±1% CO₂가 포함된 37±1℃ 의 다습한 환경에서 24시간에서 28시간 배양한다.

시험결과는 표 2와 같으며 평가기준은 음성대조군의 값이 0, 양성대조군의 값이 낮아도 3일 경우 세포실험으로 적당하다.

봉독시료의 값이 2 이상이 되지 않을 때 시험물질로서의 조건을 만족할 수 있다. 2 이상의 값이 나타났을 때 독성효과가 있는 것으로 간주한다.

[표 2]

정제봉독의 바이러스에 대한 효능 실험

본 발명의 정제봉독을 이용한 바이러스성 질환의 예방 및 치료에 대한 효능은 동물의 대식세포 및 상피세포에서 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 뉴캐슬 바이러스 및 헤르페스 바이러스 등을 대상으로 실험하였다.

상기의 정제봉독의 효능 실험은 정제봉독의 농도를 달리하여 바이러스-gfp의 대조군과 비교하였다.

1) 바이러스에 대한 예방효과

정제봉독으로 12시간 동안 미리 배양된세포(대식세포 : Raw 264.7; 상피세포 : Human Kidney Cell Line 293T)에 전처리한 후 다시 12시간을 배양시킨다. 그리고 바이러스 복제에 따라서 Green Fluorescence Protein(GFP)을 발현하는 인플루엔자 바이러스(PR8-FGP), 수포성 구내염 바이러스(VSV-GFP), 뉴캐슬 바이러스(NDV-GFP), 헤르페스 바이러스(HSV-GFP)로 감염시킨다. 감염된 세포를 다시 12시간 배양하여 바이러스 증식에 따른 GFP의 발현률을 측정한다. GFP의 발현이 적게 될수록 바이러스 예방의 효과가 높은 것을 나타낸다.

결과는 도 3 내지 도 8에 나타난 바와 같이 정제봉독의 양에 따라서 바이러스 감염 및 증식률을 비교하여 효과를 판단한다. 각 도면은 대식세포 또는 상피세포에서 정제봉독의 양을 달리하여 투여했을 경우 바이러스의 GFP 발현을 정제봉독을 투여하지 않았을 경우와 비교하여 보여준다. 각 도면의 공통적인 특징은 바이러스에 대하여 더 많은 양의 정제봉독을 투여했을 경우 GFP의 발현이 현저하게 줄어든다는 것이다. 이것은 상기 바이러스 감염의 예방효과에 대한 실험에서 본 발명의 정제봉독이 상기 바이러스의 감염과 증식률에 대하여 감소와 억제효과를 현저하게 나타내는 것을 의미한다.

도 3은 정제봉독이 대식세포에서 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 효과를 보여준다.

도 4 및 도 5는 정제봉독이 각각 대식세포와 상피세포에서 수포성 구내염 바이러스의 감염을 예방하는 효과를 보여주는 것으로 대식세포에서 뿐만 아니라 상피세포에서도 현저하게 나타나는 것을 확인할 수 있다.

도 6 및 도 7은 정제봉독이 각각 대식세포와 상피세포에서 헤르페스 바이러스의 감염을 예방하는 효과를 보여준다.

도 8은 정제봉독이 대식세포에서 뉴캐슬 바이러스 감염을 예방하는 효과를 보여준다.

이렇게 정제봉독이 면역세포에 작용하여 다양한 바이러스들에 대해 항 바이러스 효능을 나타내는 것은, 정제봉독의 구성 성분 중 아파민, 포스포리파아제A₂, 멜리틴과 같은 특이 물질이 면역세포를 자극하여 바이러스들의 증식을 억제하도록 유도한 결과이다.

또한 도 9은 정제봉독이 대식세포에서 사이토카인 및 인터페론의 분비를 유도하는 효과를 보여주는 것으로, 시간이 경과함에 따라 염증성 사이토카인(cytokine) 및 인터페론(interferon)의 분비가 유도되는 것을 확인하였고, 사이토카인(cytokine)의 종류인 TNF-α, IL-6 및 interferon-β의 분비도 확인하였다. 그래프에서 확인할 수 있듯이 투여한 정제봉독의 양이 증가할수록 사이토카인 및 인터페론의 분비량이 증가하였다.

상피세포의 경우 면역세포보다 외부의 자극에 반응하는 기전이 미약함에도 불구하고, 정제봉독을 처리하였을 경우 상피세포에서도 다양한 바이러스에 대해 항 바이러스 효능이 나타났다. 이는 정제봉독의 구성 성분 중 아파민, 포스포리파아제A₂, 멜리틴과 같은 특이 물질이 면역세포뿐 아니라 상피세포도 자극하여 바이러스들의 증식을 억제하는 것을 의미한다.

2) 바이러스성 질환의 치료효과

본 발명에 따른 방법으로 제조한 정제봉독의 바이러스에 치료효과는 대식세포 Raw 264.7에 미리 20분간 반응시킨 정제봉독과 수포성 구내염 바이러스(VSV-GFP) 혼합물로 감염시킨다. 그리고 감염세포를 22 내지 24시간 동안 배양 후 바이러스 증식에 따른 GFP의 발현률을 측정하였다.

도 10에 제시된 바와 같이, 투여하는 정제봉독의 양이 증가함에 따라서 VSV의 감염 및 증식률이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (3)

1. 정제봉독을 유효성분으로 포함하는, 뉴캐슬병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 정제봉독이, 정제봉독 총 중량에 대하여 아파민 2.0 내지 3.0 중량%, 포스포리파아제A₂ 11.5 내지 13 중량% 및 멜리틴 50 내지 75 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 정제봉독이
   봉독 원료를 증류수와 혼합하여 봉독 수용액을 생성하는 제 1 단계;
   생성된 봉독 수용액을 여과지로 여과하여 비 수용성 화분 및 먼지를 포함하는 이물질을 제거하는 제 2 단계;
   이물질이 제거된 봉독 수용액을 필터막으로 여과하여 정제봉독 수용액을 얻는 제 3 단계; 및
   상기 정제봉독 수용액을 동결 건조하여 정제봉독을 제조하는 제 4 단계
   를 포함하는 정제봉독의 제조방법에 의하여 제조된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

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