CN111035631B - 乳酸钙在制备防治鲤春病毒血症病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了乳酸钙在制备防治鲤春病毒血症病毒（SVCV）感染的药物中的应用，通过实验动物感染模型证实乳酸钙可以对斑马鱼SVCV感染起到治疗作用，结合病毒增殖与qPCR实验发现乳酸钙处理后病毒相关基因的表达量明显下降，因此乳酸钙可以作为防治SVCV的药物，具有使用剂量低、安全、无毒副作用。

Description

乳酸钙在制备防治鲤春病毒血症病毒感染的药物中的应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及乳酸钙的医药用途，其可用于制备预防和治疗鲤春病毒血症病毒感染引起的水产动物疾病。
背景技术
钙是生物体必需的元素。无论在生物的肌肉、神经、体液还是骨骼中，均有与Ca2+结合的蛋白质。钙参与新陈代谢，是神经传递、肌肉收缩、血液凝结、激素释放等过程中所必需的元素，同时也是骨骼的主要组成成分，其重要性可见一斑。
钙元素在生物体中通常以钙离子形式存在，并以这种形式参与多种生物学过程，其中，在抵御外界刺激方面，一般地，外来抗原激活T细胞受体，会启动钙离子介导的信号通路，促使免疫细胞的分化和生长。当病毒、细菌等侵入机体时，钙离子首先发出预警信号，随后钙离子又发出入侵者的特性信号，免疫系统随之组织相应的免疫细胞，捕获和吞噬抗原。钙离子在机体免疫过程中发挥举足轻重的作用，但目前尚未见到将钙离子化合物应用于预防和治疗水生动物病毒病的报道。
鲤春病毒血症病毒(SVCV)是一种能够引起鲤科鱼类急性传染性病毒病——鲤春病毒血症(SVC)的病原，一旦爆发会造成巨大的经济损失。SVCV属于弹状病毒科的水疱病毒属，其基因组为单股负链RNA，主要编码5种结构蛋白，分别为核蛋白(Nucleoprotein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基质蛋白(Matrix protein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)和RNA聚合酶蛋白(RNA polymerase，L)。
SVC被国际兽医局(OIE)列为必须申报的疾病，在我国《中华人民共和国进境动物一，二类传染病寄生虫病名录》中被列为二类动物疫病。因此，深入研究病原SVCV对疾病的监测、预防、疫苗、诊断试剂的研制都具有重要的意义。目前对水产动物病毒病的防治手段还不够成熟，SVCV病毒疫苗、治疗药物的研究尚处于起步阶段，亟待有效快速的预防治疗手段有效控制病毒爆发。
发明内容
本发明的目的在于提供乳酸钙在预防和治疗鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染中的应用，乳酸钙可有效抑制SVCV增殖，实验动物存活率模型证实乳酸钙对SVCV感染起到治疗作用，因此乳酸钙可用于制备预防或治疗鲤春病毒血症病毒感染的药物。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
乳酸钙在预防或治疗鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染中的应用：
鱼类EPC细胞感染SVCV后加入不同浓度的乳酸钙处理48h，在显微镜下观察细胞病变效应并检测上清的病毒滴度，结果表明，与对照组相比乳酸钙从20mM开始发挥抗病毒效应，并且引起病毒滴度明显下降。
已感染SVCV的斑马鱼注射乳酸钙后，因病毒感染造成的死亡率显著降低，其中乳酸钙浓度为0.3mg/g时对斑马鱼感染SVCV的治疗效果最佳。进一步检测鱼体中病毒相关基因的表达情况，发现乳酸钙处理之后，鱼体肝脏中病毒相关基因(包括g，l，m，n，p)的表达量明显下降。
本发明的实施例采用的斑马鱼是目前世界上公认的模式鱼类，其属于鲤科鱼类，因鲤科鱼遗传背景接近，基因同源率高，因此通过斑马鱼感染SVCV建立的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知乳酸钙适用于鲤科鱼类感染SVCV病毒的预防。
乳酸钙作为预防或治疗鲤春病毒血症病毒(SVCV)的药物，可以制成注射剂或口服剂，使用剂量低，成分单一，对鱼体没有毒副作用，没有药物残留的风险。
附图说明
图1为乳酸钙处理鱼类细胞能够增强细胞的抗SVCV能力。A为不同化合物处理已感染SVCV细胞后的病变效应，B为不同浓度的乳酸钙处理已感染SVCV细胞后的病变效应，C为病毒滴度。
图2为鱼类细胞感染病毒后再用乳酸钙处理，检测病毒的相关基因在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。
图3为乳酸钙处理未感染或者感染病毒的鱼类细胞，检测内源性和外源性p53蛋白的表达情况。
图4为乳酸钙处理未感染或者感染病毒的鱼类细胞，检测p53蛋白的泛素化修饰情况。
图5为已感染SVCV的鱼体注射乳酸钙后的生长存活率曲线。
图6为乳酸钙对斑马鱼中SVCV相关基因表达的影响，图中g代表糖蛋白，l代表RNA聚合酶，m代表基质蛋白，n代表核蛋白，p代表磷蛋白。
具体实施方式
实施例1：乳酸钙增强细胞抵抗SVCV感染的功能测定
1、鱼类细胞(EPC)按每孔1×105的数目接种到细胞培养板24孔板中培养过夜后，每孔加入1μl SVCV(MOI＝1)，同时分别加入40mM CaLa/CuCl2/FeCl2/MgCl2/MnCl2/ZnCl2处理细胞24h，在显微镜下观察细胞病变效应出现的情况，用PFA固定细胞并用结晶紫染色，发现与对照组相比，感染SVCV组出现明显的细胞病变效应，而加入了乳酸钙处理之后，出现死细胞的比例明显减少(图1A)，这说明乳酸钙处理细胞能够明显增强细胞的抗病毒能力。为了进一步确认这一结果，EPC细胞感染SVCV后加入不同浓度的乳酸钙处理细胞48h，在显微镜下观察细胞病变效应出现的情况(图1B)，收集上清用TCID50方法检测病毒滴度情况(图1C)，同时用PFA固定细胞并用结晶紫染色，发现与对照组相比，乳酸钙从20mM开始发挥抗病毒效应，并且引起病毒滴度明显下降。
2、鱼类细胞(EPC)按每孔5×105的数目接种到细胞培养板6孔板中培养过夜后，每孔加入1μl SVCV(MOI＝1)，同时加入40mM CaLa处理24h，收集细胞通过qPCR、免疫荧光、Western Blot检测细胞内病毒基因的表达情况，结果如下：(1)转录水平(图2A)，提取RNA，制取cDNA模板，然后进行qPCR检测病毒相关基因在转录水平的表达量变化。结果表明：乳酸钙处理之后能够显著抑制病毒相关基因的表达。(2)蛋白水平(图2B-2D)，免疫荧光和Western Blot检测病毒相关基因在蛋白水平的表达量的变化。结果表明：乳酸钙处理之后，细胞内N蛋白和P蛋白的荧光信号明显减弱，N和P蛋白的表达显著减少。
实施例2：乳酸钙处理感染SVCV的鱼类细胞后细胞凋亡因子p53的表达情况
发明人之前的研究工作表明SVCV感染细胞与p53的表达密切相关，为检测乳酸钙处理后内源性和外源性p53的表达水平，将ZFL细胞或EPC细胞接种于6孔板中培养24h，其中EPC细胞中转染2μgpCMV-Myc或Myc-p53，然后用不同浓度的乳酸钙(20，40mM)处理24h，收集细胞通过Western Blot检测细胞中p53蛋白的表达情况(图3A和3B)，内源p53使用p53抗体检测，外源p53使用Myc标签抗体检测，结果表明：乳酸钙处理之后，内源或者外源的p53蛋白表达均明显增加并有剂量依赖效应。另外，为检测SVCV感染后使用乳酸钙处理对内源与外源p53表达水平的影响，将ZFL细胞接种于6孔板中培养24h，用于检测内源p53表达的细胞先用不同浓度的乳酸钙(20，40mM)处理24h后，再感染SVCV(MOI＝1)24h，而用于检测外源p53的EPC细胞先转染(2μgpCMV-Myc或Myc-p53)24h后，用不同浓度的乳酸钙(20，40mM)处理24h，再感染SVCV(MOI＝1)24h，收集细胞通过Western Blot检测细胞中p53蛋白的表达情况(图3C和3D)，结果显示：SVCV感染抑制内源或者外源性p53的表达，乳酸钙处理后可显著恢复其表达。
实施例3：乳酸钙处理感染SVCV的鱼类细胞后p53蛋白的泛素化修饰情况
1、泛素化作为一种可逆的蛋白修饰主要参与调控目标蛋白的稳定、活性和定位等等。而乳酸钙处理细胞能够促进p53的表达，于是检测乳酸钙处理是否影响p53的泛素化修饰。首先将EPC细胞接种于10cm2细胞培养皿中培养过夜，转染5μg Myc-p53和1μg HA-Ub。24h后，分别用20、40mM乳酸钙处理18h，然后用MG132处理6h。收集细胞进行泛素化实验和Western Blot分析(图4A)。结果表明乳酸钙处理细胞能够促进p53的泛素化修饰，并有剂量依赖效应。
2、发明人之前的研究工作表明SVCV感染细胞能够抑制p53的泛素化修饰，因此推测SVCV感染引起的p53的泛素化减少是否能够被乳酸钙处理恢复。首先验证SVCV感染能够抑制p53的泛素化修饰。将EPC细胞接种于10cm2细胞培养皿中培养过夜，转染5μg Myc-p53和1μg HA-Ub 24h，然后感染不同滴度的SVCV(MOI＝10，1，0.1)18h，然后用MG132处理6h，收集细胞进行泛素化实验和Western Blot分析(图4B)。结果表明SVCV感染能够明显抑制p53的泛素化修饰。接下来用乳酸钙处理这一过程，收集细胞进行泛素化实验和Western Blot分析(图4C)。结果表明SVCV引起的p53泛素化减少能够被乳酸钙处理恢复。
3、目前研究比较多的泛素化修饰是K48位和K63位的多聚泛素化修饰，其中K48位的多聚泛素化修饰主要起到降解的作用和调控目标蛋白的稳定性，K63位的多聚泛素化修饰主要起到信号转导、DNA修复的功能和调控蛋白的活性。因此，需进一步检测乳酸钙处理引起的p53泛素化修饰增加属于哪种修饰。EPC细胞中共转染5μg Myc-p53，1μg HA-Ub，或HA-Ub-K48O或HA-Ub-K63O，24h后用40mM乳酸钙处理18h，然后用MG132处理6h。收集细胞进行泛素化实验和Western blot实验(图4D)。结果表明乳酸钙处理能够引起p53的K63位的泛素化修饰增加。
4、接下来确定乳酸钙处理恢复SVCV引起的泛素化减少是属于哪种修饰。首先确定SVCV引起的p53泛素化修饰减少属于哪种修饰。EPC细胞中共转染5μg Myc-p53，1μg HA-Ub，或HA-Ub-K48O或HA-Ub-K63O，24h后感染SVCV(MOI＝1)18h，然后用MG132处理6h，收集细胞进行泛素化实验和Western blot实验(图4E)。结果表明SVCV感染能够引起p53的K63位的泛素化修饰减少。接下来用乳酸钙处理这一过程，收集细胞进行泛素化实验和Western Blot分析(图4F)。结果表明SVCV引起的p53的K63位的泛素化减少能够被乳酸钙处理恢复。
实施例4：乳酸钙对感染SVCV斑马鱼的治疗效果
1、在35cm×23.5cm×36cm的水族箱中进行，每天换水并保持水温在28℃左右。1g左右的健康斑马鱼通过腹腔注射SVCV病毒悬液建立人工感染模型，对照组腹腔注射20μlPBS，实验组使用病毒悬液稀释乳酸钙溶液至不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4mg/g)，同时注射感染20μl/尾。每组使用斑马鱼20尾，感染后每天记录死亡情况，一直统计到7d，最终用Mantel-Cox分析鱼体存活率(图5)。该结果表明，斑马鱼感染SVCV后其存活率仅为45％，注射0.3mg/g的乳酸钙其存活率可以提高到75％，对斑马鱼感染SVCV的治疗效果最佳。
2、进一步检测感染SVCV之后的鱼体用0.3mg/g乳酸钙处理，鱼体中病毒相关基因的表达情况。1g左右的健康斑马鱼腹腔注射20μl PBS或0.3mg/g乳酸钙和SVCV混合液，每组斑马鱼20尾，感染1d后，用MS-222麻醉(浓度0.1mg/ml)，解剖取肝脏样品通过qPCR检测病毒相关基因的表达情况(图6)，结果表明：0.3mg/g乳酸钙处理之后，鱼体肝脏中病毒相关基因(包括g，l，m，n，p)的表达量明显下降。

Claims (2)

1.乳酸钙在制备防治鲤春病毒血症病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，乳酸钙的使用浓度为0.3mg/g。
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