CN106822176B

CN106822176B - 氯化锂抑制口蹄疫病毒的用途

Info

Publication number: CN106822176B
Application number: CN201710146292.3A
Authority: CN
Inventors: 赵付荣; 常惠芸
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-03-13
Filing date: 2017-03-13
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2037-03-13
Also published as: CN106822176A

Abstract

本发明设计一种以氯化锂为有效成分的口蹄疫病毒抑制剂，属于医药领域，其中，氯化锂的作用浓度不高于40mmol/L，在20‑40mmol/L的浓度范围内对口蹄疫病毒的抑制作用最为明显，所述抑制作用发生在口蹄疫病毒感染的复制阶段，更进一步的，所述抑制作用发生在口蹄疫病毒复制的早期阶段。加之，氯化锂成分清楚单一，对口蹄疫病毒感染的效果较为显著，这就为将氯化锂应用于口蹄疫病毒的分子或细胞学研究以及进行药物抗病毒的研究奠定了基础和提供了便利的条件。

Description

氯化锂抑制口蹄疫病毒的用途

技术领域

本发明涉及化学物质在医药领域的用途，具体地涉及一种以氯化锂为有效成分的口蹄疫病毒抑制剂。

背景技术

口蹄疫（Foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdisease virus, FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，能够感染家畜和野生偶蹄动物，包括牛、猪、羊、骆驼和鹿等。自从在世界上所有国家都有口蹄疫容易受到意外或有意的越境传播的报道之后，它的宿主范围广泛和快速传播已经引起国际动物卫生组织的关注。鉴于FMD可造成巨大经济损失和社会影响，世界动物卫生组织（World Organisationfor Animal Health，OIE）和联合国粮农组织（FAO）将其列在A 类动物传染病之首，我国也将其列在一类动物传染病的第一位，充分显示了国内外对FMD的关注程度。它是危害畜牧业健康发展的“头号杀手”，也是影响动物及动物产品国际贸易最重要的疾病。到目前为止，我国针对口蹄疫采取以疫苗免疫为主的综合防控措施已取得了一定的成效。但由于口蹄疫疫苗是一种灭活疫苗，存在诱发免疫的时间端，通常只有四个月左右，以及毒性较大，其导致的过敏反应使畜牧业的损失加大等缺点。另外，口蹄疫病毒是一种具有广泛变异性的病毒，其抗原性也常常随之发生变异。更有研究表明，一个地区的畜群经过有效的口蹄疫疫苗注射后，在1-2月内又会再次流行，这是由于该病毒发生变异导致的。因此，迫切需要研发一种能有效抗口蹄疫病毒的药物，通过综合措施来抑制或控制FMDV的感染。

LiCl是一种常用的精神稳定剂，在人类医学中用来治疗精神紊乱及抑郁已经有近60年的历史。除了稳定情绪的作用外，LiCl还被发现能够用来治疗一些神经紊乱疾病例如阿尔茨海默病综合征。锂盐也被报道对肿瘤细胞存在抑制作用。但LiCl对FMDV是否存在影响，影响机制如何等尚未有报道。

发明内容

针对目前FMDV防治过程中存在的问题，本发明拟提供一种以氯化锂为有效成分的口蹄疫病毒抑制剂。所述抑制剂能在体外有效抑制FMDV的复制，在保证正常细胞活性率的前提下，可将口蹄疫病毒的病毒滴度降低约67%，mRNA表达水平下降约90%。

本发明提供一种口蹄疫病毒抑制剂，所述抑制剂的有效成分为氯化锂；氯化锂的作用浓度不高于40mmol/L。

进一步的，所述氯化锂的作用浓度为20-40mmol/L。

进一步的，氯化锂对口蹄疫病毒的抑制发生在病毒感染的复制阶段。

进一步的，氯化锂对口蹄疫病毒的抑制发生在复制阶段的早期。

进一步的，氯化锂抑制口蹄疫病毒在BHK-21细胞中的复制。

本发明的有益效果：

1、本发明所述口蹄疫病毒抑制剂，以氯化锂为基础，进行口蹄疫病毒感染的抑制，该抑制剂能从体外有效的抑制FMDV的复制和翻译过程，所述的抑制作用发生在口蹄疫病毒感染的复制阶段，更进一步，在早期复制阶段，更确切地说，主要在复制阶段的前12h，在复制阶段的后12h内，氯化锂对病毒没有影响。在口蹄疫病毒感染细胞的过程中，氯化锂对病毒的吸附和穿入能力几乎没有影响，加之，氯化锂成分清楚单一，这就为将氯化锂应用于口蹄疫病毒的分子或细胞学研究以及进行药物抗病毒的研究奠定了基础和提供了便利的条件。

2、本发明所述口蹄疫病毒抑制剂，基于氯化锂能够抑制口蹄疫病毒的复制，提出其在制备抗口蹄疫病毒药物中的应用，当氯化锂浓度不高于40mmol/L时，能够保证正常细胞活性率在90%以上，同时氯化锂浓度为40mmol/L时，相比于阴性对照组，口蹄疫病毒的病毒滴度降低约67%，病毒的mRNA表达水平下降约90%，具有显著的抗病毒作用，将其制备成抗口蹄疫病毒药物，相比于常用的疫苗免疫，制备简单、使用方便、成本较低、作用周期较长。另外，氯化锂对口蹄疫病毒的抑制作用主要发生在病毒的复制阶段，尤以早期的0-12h内最为显著，这就为利用氯化锂相关药物来防治口蹄疫病毒感染奠定了理论基础。

附图说明

图1是不同浓度的LiCl对BHK-21细胞的毒性结果图；

图2是不同浓度的LiCl对FMDV病毒滴度的影响差异图；

图3是不同浓度的LiCl对病毒mRNA表达水平的影响差异图；

图4是病毒吸附阶段不同浓度的LiCl对FMDV病毒滴度的影响差异图；

图5是病毒吸附阶段不同浓度的LiCl对病毒mRNA表达水平的影响差异图；

图6是病毒穿入阶段不同浓度的LiCl对FMDV病毒滴度的影响差异图；

图7是病毒穿入阶段不同浓度的LiCl对病毒mRNA表达水平的影响差异图；

图8是病毒复制阶段不同浓度的LiCl对FMDV病毒滴度的影响差异图；

图9是病毒复制阶段不同浓度的LiCl对病毒mRNA表达水平的影响差异图；

图10是在病毒复制的不同时间段加药对FMDV病毒滴度的影响差异图；

图11是在病毒复制的不同时间段加药对病毒mRNA表达水平的影响差异图。

具体实施方式

本发明通过具体的试验例对本发明做进一步的解释说明。

溶液配制：将氯化锂粉末溶于DMEM细胞培养液中使其终浓度为1 mol/L，然后经0.22μm无菌过滤器过滤除菌，配制成氯化锂原液，备用。

试验例１ LiCl的细胞毒性检测

为了检测LiCl对于正常细胞生长的影响，应用Cell Counting Kit-8（CCK8）试剂盒对LiCl的细胞毒性进行了检测。具体操作步骤如下：将在DMEM细胞培养液上生长良好的BHK-21细胞传至96孔细胞板，待细胞长满单层后，弃掉细胞培养液，用PBS溶液洗3次，然后加入100μL系列浓度（用无血清细胞培养液将LiCl分别稀释成10、20、30、40、60、80和100mmol/L）的药物，将不同浓度的药设立三个重复，同时设立阴性对照（不加入药物）和空白对照（没有细胞只加入培养液），放入37℃温箱中培养48h。在PBS润洗后向每孔中加入100μL含10% CCK8溶液，37℃温箱中继续培养1-4h，用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度值。应用以下公式计算不同浓度药物对细胞的毒性：细胞活性率（%）=[(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)]*100。使得50%细胞产生细胞病变的药物浓度（CC₅₀）通过GraphPad Prism软件计算。

由图1可知，随着氯化锂浓度的不断增加，其对正常细胞的毒性加大。当氯化锂浓度不高于40mmol/L时，细胞活性率在90%以上；当氯化锂浓度高于40mmol/L时，细胞活性迅速下降，在100mmol/L的氯化锂浓度下，细胞活性率只有30%。所以，当利用氯化锂制备抗口蹄疫病毒药物时，其浓度应不高于40mmol/L。

试验例２ LiCl对口蹄疫病毒的抗病毒活性的确定

通过以下协议确定了LiCl对口蹄疫病毒的抗病毒活性通过以下实验进行验证。具体操作步骤如下：将在DMEM细胞培养液上生长良好的BHK-21细胞传至24孔细胞板，待细胞长满单层后，弃掉细胞培养液，用PBS溶液洗3次，每孔接种FMDV（MOI=0.1）同时加入系列浓度的LiCl（分别为10、20、30、40 mmol/L），设立三个重复，同时设未加药物但接种FMDV的对照。37℃培养箱中培养48h。弃去病毒液，用预冷的PBS洗三次以除去游离的病毒，每孔加入400μL培养液，放入-20℃冰箱反复冻融3次，收集病毒液，10000rpm离心10min去除细胞碎片，上清液用于病毒滴度的测定和检测mRNA表达水平情况。

由图2可知，在分别加入0、10、20、30、40mmol/L浓度的氯化锂的情况下，FMDV的病毒滴度呈梯度下降，说明在一定的浓度范围内，氯化锂能够梯度抑制口蹄疫病毒的复制，进一步由图3可知，氯化锂能够梯度抑制口蹄疫病毒mRNA的表达水平。另外，在20-40mmol/L浓度范围内，氯化锂对口蹄疫病毒的病毒滴度和mRNA表达水平抑制显著。

试验例３ FMDV抑制病毒复制阶段的检测

1. 病毒吸附阶段

为检验LiCl是否对病毒吸附BHK-21细胞有影响，将BHK-21细胞传至24孔板中，待细胞长满单层后，弃去培养液，每孔加入200μL的FMDV病毒液（MOI=0.1），然后向每孔中加入不同浓度的LiCl 200μL，使LiCl的终浓度分别为10、20、30和40mmol/L，设立不加入药物的阴性对照，将细胞板放入4℃冰箱作用1h，只允许病毒附着于细胞表面。弃去病毒液，用PBS洗去游离的病毒，每孔加入400μL培养液，放入-20℃冰箱反复冻融3次，收集病毒液，10000rpm离心10min去除细胞碎片，上清液用于病毒滴度的测定和检测mRNA表达水平情况。

由图4和图5可知，在病毒吸附阶段，分别用不同浓度的氯化锂和FMDV病毒液进行处理BHK-21细胞，在4℃冰箱共同作用1h。结果显示无论是何种浓度的LiCl处理细胞，病毒的滴度和mRNA表达水平与未处理组并无明显差异，所以LiCl并不会对FMDV吸附BHK-21细胞产生影响。

2. 病毒穿入阶段

为检验LiCl是否对病毒的穿入BHK-21细胞有影响，将BHK-21细胞传至24孔板中，待细胞长满单层后，弃去培养液，每孔加入200μL的FMDV病毒液（MOI=0.1），将细胞板放入4℃冰箱1h，允许病毒吸附细胞表面，用PBS液去除未结合的病毒后，然后向每孔中加入不同浓度的LiCl 200μL，使LiCl的终浓度分别为10、20、30和40mmol/L，同时设立不加药物的阴性对照，将细胞板放入37℃温箱培养1h，弃去药物，用PBS洗去残留的药物，加入含有2%FBS的维持液，放入37℃温箱继续培养48h，收集上清液进行病毒滴度测定和检测mRNA表达水平情况。

病毒在4℃条件下作用细胞1h，保证病毒已经吸附在细胞表面上，之后加入不同浓度的LiCl并在37℃孵育1h，此条件下病毒发生进入过程，之后去除LiCl，补充新的培养液去除LiCl对于病毒进入后阶段的影响，由图6和图7可知，各药物处理组的病毒滴度和mRNA表达水平与未经药物处理组（0mmol/L）的阴性对照相比没有显著差别，说明病毒不会受LiCl影响，进入细胞的能力没有变化。

3.病毒复制阶段

为分析LiCl是否对FMDV在BHK-21细胞上复制有抑制作用，将BHK-21细胞传至24孔板中，待细胞长满单层后，弃去培养液，每孔加入200μL的FMDV病毒液（MOI=0.1），置于37℃温箱培养1h，保证病毒完成吸附和穿入过程，弃去病毒液，然后向每孔中加入不同浓度的LiCl 200μL，使LiCl的终浓度分别为10、20、30和40mmol/L，同时设立不加药物的阴性对照，放入37℃温箱继续培养48h。病毒的感染情况分别通过病毒滴度和检测mRNA表达水平进行测定。

由图8和图9可知，病毒在37℃条件下作用细胞1h，随后加入不同浓度的药物，在此条件下，病毒已经完成了吸附和进入阶段，而药物也只会作用于病毒的复制阶段。图8所示，病毒滴度随浓度的升高呈梯度下降趋势，尤其在20、30、40mmol/L氯化锂浓度下，病毒滴度下降趋势极显著，说明LiCl能够抑制FMDV在BHK-21细胞上的复制；由图9可知，mRNA表达水平随浓度的升高呈梯度下降趋势，在氯化锂浓度为10mmol/L下，RNA表达水平下降趋势极显著,说明LiCl能够抑制FMDV复制过程中mRNA的合成，即FMDV的翻译过程。

试验例４ FMDV抑制病毒复制阶段时间段的检测

为了分析LiCl对FMDV在BHK-21细胞上复制的哪个时期具有抑制作用，采用了分时间段加药的方式进行研究。将BHK-21细胞传至24孔板中，待细胞长满单层后，弃去培养液，加入每孔加入200μL的FMDV病毒液（MOI=0.1），置于37℃温箱培养1h，保证病毒完成吸附和穿入过程，弃去病毒液，加入2%FBS的细胞培养液，此时记为0h，在时间间隔0-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-24h分别向不同孔中加入LiCl，使药物的终浓度达到40mmol/L，同时设立不加药物的阴性对照，37℃温箱培养至24h后，收集不同组上清液，进行病毒滴度测定和检测mRNA表达水平情况。

通过检测上清液病毒滴度和mRNA表达水平来分析FMDV复制的不同时期的抑制情况，结果如图10和图11所示，在FMDV复制的0-10h内，与阴性对照相比，病毒滴度下降趋势极显著，10-12h内下降趋势显著，12-24h内病毒滴度下降趋势并不明显；进一步的，在FMDV复制的0-10h内，与阴性对照相比，病毒的mRNA表达水平下降趋势极显著，10-12h内下降趋势显著，12-24h内病毒的mRNA表达水平下降趋势并不明显。说明LiCl只是在FMDV复制的早期起作用，而进入病毒复制的后期LiCl不能阻止病毒的复制。

由上述实施例1- 4的细胞水平试验可知，10-40mmol/L浓度的氯化锂能够显著抑制病毒mRNA的表达水平，进一步的抑制病毒的病毒滴度，在不影响正常细胞活性率的前提下，抑制效果显著，相比于阴性对照，病毒的mRNA表达水平下降约90%，病毒的病毒滴度降低约67%。另外，通过对病毒感染细胞的不同阶段进行分别分析可知，病毒的抑制主要发生在复制阶段，进一步对复制阶段的不同时间段进行研究，发现氯化锂对病毒的抑制作用主要发生在早期复制阶段，其中，以早期的0-12h内最为显著，研究上述氯化锂对口蹄疫病毒抑制的反应机理，为将氯化锂应用于口蹄疫病毒的分子生物学研究和利用氯化锂研发抗口蹄疫病毒的药物，开发氯化锂在制备抗口蹄疫病毒药物方面的应用提供了理论前提和条件。

其中，上述各实验组与药物未处理组（0 mmol/L组）的差异性利用GraphPadPrism5软件进行变量分析（ANOVA）。数据按照±标准差（SD）展示。采用t检验分析统计学意义。

本发明所述实施例为说明性的，并不以此限制本发明的保护范围，但以本发明精神为基础的、任何的进一步延伸或改进，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.氯化锂在制备抑制口蹄疫病毒药物中的用途，其中，氯化锂在所述药物中的浓度为20-40 mmol/L。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：氯化锂对口蹄疫病毒的抑制发生在病毒感染的复制阶段。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：氯化锂对口蹄疫病毒的抑制发生在复制阶段的早期。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于：氯化锂抑制口蹄疫病毒在BHK-21细胞中的复制。