CN115025117B - 镁离子在防治水生病毒感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了镁离子（Mg2+）在防治水生病毒感染中的应用，细胞系感染模型的建立显示，氯化镁（MgCl2）能够对草鱼呼肠孤病毒（GCRV）和鲤春病毒血症病毒（SVCV）感染起到显著地保护作用，结合qPCR实验结果发现MgCl2处理后病毒相关基因转录及表达被显著抑制。因此，含有镁离子的化合物能够作为防治水生病毒感染（尤其是GCRV和SVCV）的药物或添加剂，并具有使用剂量低，保护效果佳的优点。

Description

镁离子在防治水生病毒感染中的应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及镁离子的用途，含有镁离子的化合物可用于制备预防或治疗水生病毒(尤其是GCRV或SVCV)感染的药物或添加剂。
背景技术
镁离子是维持神经、肌肉和心脏功能的重要离子之一。镁离子的生理功能主要包括：(一)通过抑制突触的乙酰胆碱释放，阻止神经系统及肌肉的信号传导，具有镇静作用；(二)作用于周围血管系统，使血管扩张，起到降低血压的作用；(三)作为多种酶的催化剂参与到物质代谢和能量代谢过程中，如磷酸酶、磷酸化酶、胆碱酯酶、羧化酶、激酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等等；(四)作为重要组分存在于体内，如分布于骨骼和牙齿中，组成磷酸镁盐，或在血浆中以游离镁离子形态存在，参与多种生理活动。目前，镁离子在抗病毒过程中扮演的角色尚不清楚，尚未有报道将镁离子应用于水生动物病毒性疾病防治。
鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)属弹状病毒科，水疱病毒属，是一种单股负义链RNA病毒。SVCV引起的鲤春病毒血症(SVC)是一种具高传染性、高致死性的水产疾病，能够造成巨大的经济损失。目前关于SVCV的研究较为丰富，药物研究较多，但仍然缺乏行之有效的防治手段，尚无商品化的特效药。预防方面，SVCV的疫苗开发目前尚处于探索阶段，尚未研发出保护率、成本、接种方式三项均满足规模化生产，能够实现市场投放的疫苗。因此，在当前的研究背景下，寻找高效安全的药物仍是SVCV防治的首选。
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)，属呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属。GCRV引起的草鱼出血病是危害草鱼养殖产业的主要病毒性疾病。目前，针对GCRV的防治方式主要聚焦于疫苗研究。随着基因工程疫苗研制的发展，以亚单位疫苗和核酸疫苗为代表的各类草鱼出血病疫苗相继出现。但是疫苗的大规模生产应用仍然受到制约，主要是因为疫苗专一性强的特性使其无法应用于易变异的病毒。基于此，找寻具有良好抗病毒效果的抗GCRV药物相比于使用疫苗具有显著的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供镁离子在防治水生病毒感染中的应用，镁离子能够显著抑制鱼类离体培养细胞中病毒相关基因(SVCV相关基因g、l、n、p及GCRV相关基因S6、S9)的转录，抗病毒实验证实镁离子对于SVCV与GCRV病毒感染起到保护作用，含有镁离子的化合物能够用于制备防治水生病毒(尤其是SVCV与GCRV)感染的药物或添加剂。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
镁离子在防治水生病毒感染中的应用：在本发明的具体实施例中，感染SVCV的EPC细胞系或感染GCRV的CIK细胞系在加入20mM MgCl2处理后，病毒造成的细胞病变效应被显著抑制。进一步检测细胞中病毒相关基因扩增情况显示，MgCl2处理之后，EPC和CIK细胞中病毒相关基因(SVCV相关基因g、l、n、p及GCRV相关基因S6、S9)的表达被显著抑制，EPC细胞中SVCV病毒的N、P、G蛋白表达水平显著降低。
本发明实施例中选取的两种鱼类细胞系分别是来源于SVCV和GCRV重要宿主的细胞系，因此通过建立两种细胞感染病毒的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知镁离子适用于水生病毒(尤其是SVCV或GCRV)的病毒防治。
含有镁离子的化合物作为预防或治疗SVCV或GCRV病毒感染的药物或添加剂，药物可以以注射剂或口服剂形式使用，具有给药剂量低，成分单一，防治效果佳的优点。
附图说明
图1为MgCl2对SVCV与GCRV 873感染细胞的影响。
图2为MgCl2对细胞中SVCV与GCRV 873病毒基因转录水平的影响。
图3为MgCl2对细胞中SVCV病毒蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
实施例1：MgCl2对SVCV与GCRV 873感染细胞的影响
抗病毒实验用于检测SVCV与GRCV病毒在细胞中的滴度。在24孔细胞培养板及96孔细胞培养板中进行。CIK细胞用于检测GCRV病毒滴度，EPC细胞用于检测SVCV病毒滴度。取生长状态良好的细胞传代接入24孔板，28℃培养过夜；接种MOI＝10的SVCV于EPC细胞或接种MOI＝1的GCRV于CIK细胞，同时加入20mM MgCl2处理；接种后继续培养72h，将贴壁细胞使用4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜，次日对染色完成的细胞进行拍照，观察病变效应。结果如图1所示，20mM MgCl2处理后的感染病毒细胞中，细胞病变显著减少。
实施例2：MgCl2对SVCV与GCRV 873病毒基因转录的影响
检测感染SVCV或GCRV 873之后的细胞用20mM MgCl2处理后，细胞中病毒相关基因的转录水平。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法及病毒滴度接种病毒并进行药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，用TRIzol(Invitrogen)裂解细胞沉淀后提取细胞总RNA，由GoScript逆转录试剂盒(Promega)逆转录得到cDNA。通过qPCR检测病毒相关基因的转录水平，包括GCRV 873相关基因S6、S9，SVCV相关基因g、ln和p，相关方法参照文献[1]。结果表明：20mM MgCl2处理后，细胞中SVCV病毒相关基因(包括g，l，n，p)及GCRV 873相关基因(包括S6、S9)的转录水平显著下降。
实施例3：MgCl2对SVCV病毒增殖的影响
检测感染SVCV之后的细胞用20mM MgCl2处理后，细胞中病毒相关基因的表达情况。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，PBS润洗一遍后放入-80℃冰箱保存；向冰冻保存的细胞沉淀中加入适量RIPA弱裂解液，置于4℃裂解1小时，使细胞充分裂解；吸取细胞裂解物至新的1.5mL离心管中，样品加入1/4体积的5×SDS Sample Buffer，涡旋混匀，100℃沸水浴10min，置于冰上备用。使用Western Blot实验检测MgCl2处理后SVCV蛋白表达水平(核蛋白N、磷酸化蛋白P、糖蛋白G)，相关方法参照文献[2]。实验结果表明，20mM MgCl2处理后，细胞中SVCV病毒的N、P、G蛋白表达水平显著降低(图3)。
参考文献
[1]ZHOU X Y,LU L F,LI Z C,et al.Temperature effects on SVCVpropagation and the related IFN response in zebrafish[J].Aquaculture,2021,533.
[2]LU L F,ZHANG C,LI Z C,et al.A novel role of Zebrafish TMEM33 innegative regulation of interferon production by two distinct mechanisms[J].PLoS Pathog,2021,17(2):e1009317.

Claims (1)

1.MgCl2在制备防治草鱼呼肠孤病毒的药物或添加剂中的应用。
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