CN115040537B - 锰离子在防治水生病毒感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了锰离子（Mn2+）在防治水生病毒感染中的应用，细胞系感染模型的建立显示，氯化锰（MnCl2）能够对草鱼呼肠孤病毒（GCRV）和鲤春病毒血症病毒（SVCV）感染起到显著地保护作用，结合qPCR实验结果发现MnCl2处理后病毒相关基因转录及表达被显著抑制。因此，含有锰离子的化合物能够作为防治水生病毒（尤其是GCRV和SVCV）的药物或添加剂，并具有使用剂量低，保护效果佳的优点。

Description

锰离子在防治水生病毒感染中的应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及锰离子的用途，含有锰离子的化合物可用于制备预防和治疗水生病毒(尤其是GCRV和SVCV)感染的药物或添加剂。
背景技术
锰，作为重要的微量元素，在人体的多种生理过程中发挥重要作用，包括： (一)参与活化软骨素合成的酶系统，促进骨骼的正常生长发育；(二)通过促进人体内胆固醇的合成，激活体内的多糖聚合酶和半乳糖转移酶维持正常的糖代谢和脂肪代谢；(三)维持正常的脑功能；(四)通过催化超氧歧化酶实现抗氧化功能。除此之外，锰在预防癌症，预防贫血，增强免疫功能等方面也被报道发挥重要作用。
在抗病毒免疫方面，cGAS-STING通路是保守的先天性抗病毒免疫信号通路。研究人员发现锰离子(Mn2+)在激活cGAS-STING通路中具有重要作用：响应于DNA病毒感染，细胞线粒体、高尔基体等贮锰细胞器中的Mn2+释放到胞质及胞外。胞质中升高的Mn2+浓度对cGAS-STING通路具有双重激活作用。目前，锰离子在抗病毒方面的功能被初步探索，但是尚未有防治水生动物病毒性疾病过程中使用锰离子的前例。
鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)属弹状病毒科，水疱病毒属，是一种单股负义链RNA病毒。SVCV引起的鲤春病毒血症(SVC) 是一种具高传染性、高致死性的水产疾病，能够造成鲤科鱼类大量死亡，形成巨大的经济损失。目前关于SVCV的研究较为丰富，药物研究较多，但仍然缺乏行之有效的防治手段，尚无商品化的特效药。预防方面，SVCV的疫苗开发目前尚处于探索阶段，尚未研发出保护率、成本、接种方式三项均满足规模化生产，能够实现市场投放的疫苗。因此，在当前的研究背景下，寻找高效安全的药物作为SVCV的防治手段仍是首选。
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)，属呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属，是一种分节段的双链RNA病毒。GCRV引起的草鱼出血病是危害草鱼养殖产业的主要病毒性疾病。目前，针对GCRV的防治方式主要聚焦于疫苗研究。随着基因工程疫苗研制的发展，以亚单位疫苗和核酸疫苗为代表的各类草鱼出血病疫苗相继出现。但是疫苗的大规模生产应用仍然受到制约，主要是因为疫苗专一性强的特性使其无法应用于易于变异的病毒。基于此，找寻具有良好抗病毒效果的抗GCRV药物在给药方式、针对不同毒株维持抗病毒效果等方面相比于鱼用疫苗具有显著的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供锰离子在防治水生病毒感染中的应用，锰离子能够显著抑制鱼类离体培养细胞中病毒相关基因(SVCV相关基因，包括g、l、n、p， GCRV相关基因，包括S6、S9)的转录，抗病毒实验证实锰离子对于SVCV与 GCRV病毒感染起到保护作用，含有锰离子的化合物能够用于制备防治水生病毒 (尤其是SVCV与GCRV)感染的药物或添加剂。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
锰离子在防治水生病毒感染中的应用：在本发明的具体实施例中，感染 SVCV的EPC细胞系或感染GCRV的CIK细胞系在加入20mM MnCl2处理后，病毒造成的细胞病变效应被显著抑制。进一步检测细胞中病毒相关基因扩增情况显示，MnCl2处理之后，EPC和CIK细胞中病毒相关基因(SVCV相关基因，包括g、l、n、p，GCRV相关基因，包括S6、S9)的表达量被显著抑制，EPC 细胞中SVCV的N、P、G蛋白表达水平显著降低。
本发明实施例中选取的两种鱼类细胞系分别是来源于SVCV和GCRV重要宿主的细胞系，因此通过建立两种细胞感染病毒的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知锰离子适用于水生病毒(尤其是SVCV或GCRV)的病毒防治。
含有锰离子的化合物作为预防或治疗SVCV或GCRV病毒感染的药物或添加剂，药物可以以注射剂或口服剂形式使用，具有给药剂量低，成分单一，防治效果佳的优点。
附图说明
图1为MnCl2对SVCV与GCRV 873感染细胞的影响。
图2为MnCl2对细胞中SVCV与GCRV 873病毒基因转录水平的影响。
图3为MnCl2对细胞中SVCV病毒蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
实施例1：MnCl2对SVCV与GCRV 873感染细胞的影响
抗病毒实验用于检测SVCV与GRCV在细胞中的滴度。在24孔细胞培养板及96孔细胞培养板中进行。CIK细胞用于检测GCRV病毒滴度，EPC细胞用于检测SVCV病毒滴度。取生长状态良好的细胞传代接入24孔板，28℃培养过夜；接种MOI＝10的SVCV于EPC细胞或接种MOI＝1的GCRV于CIK细胞，同时加入20mM MnCl2处理；接种后继续培养72h，将贴壁细胞使用4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜，次日对染色完成的细胞进行拍照，观察病变效应。结果如图1所示，20mM MnCl2处理后的感染病毒细胞中，细胞病变效应显著减少。
实施例2：MnCl2对SVCV与GCRV 873病毒基因转录的影响
检测感染SVCV或GCRV 873之后的细胞用20mM MnCl2处理后，细胞中病毒相关基因的转录水平。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，用TRIzol(Invitrogen)裂解细胞沉淀后提取细胞总RNA，由 GoScript逆转录试剂盒(Promega)逆转录得到cDNA。通过qPCR检测病毒相关基因的转录水平，包括GCRV 873相关基因S6、S9，SVCV相关基因g、l、n 和p，相关方法参照文献[1]。结果表明：20mM MnCl2处理后，细胞中SVCV病毒相关基因(包括g，l，n，p)与GCRV 873相关基因(包括S6，S9)的转录水平显著下降。
实施例3：MnCl2对SVCV增殖的影响
检测感染SVCV之后的细胞用20mM MnCl2处理后，细胞中病毒相关基因的表达情况。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基， PBS润洗一遍后放入-80℃冰箱保存；向冰冻保存的细胞沉淀中加入适量RIPA 弱裂解液，置于4℃裂解1小时，使细胞充分裂解；吸取细胞裂解物至新的1.5mL 离心管中，样品加入1/4体积的5×SDS Sample Buffer，涡旋混匀，100℃沸水浴 10min，置于冰上备用。使用Western Blot实验检测MnCl2处理后SVCV蛋白表达水平(核蛋白N、磷酸化蛋白P、糖蛋白G)，相关方法参照文献[2]。实验结果表明，20mMMnCl2处理后，细胞中SVCV病毒的N、P、G蛋白表达水平显著降低(图3)。
参考文献
[1]ZHOU X Y,LU L F,LI Z C,et al.Temperature effects on SVCVpropagation and the related IFN response in zebrafish[J].Aquaculture,2021,533.
[2]LU L F,ZHANG C,LI Z C,et al.A novel role of Zebrafish TMEM33 innegative regulation of interferon production by two distinct mechanisms[J].PLoS Pathog, 2021,17(2):e1009317。

Claims (1)

1.氯化锰在制备防治草鱼呼肠孤病毒的药物或添加剂中的应用。
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草鱼呼肠孤病毒及其免疫防治研究进展;肖波;;鲁东大学学报(自然科学版)(第01期);全文 *

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