CN110075117A - 肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途 - Google Patents

肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110075117A
CN110075117A CN201910362688.0A CN201910362688A CN110075117A CN 110075117 A CN110075117 A CN 110075117A CN 201910362688 A CN201910362688 A CN 201910362688A CN 110075117 A CN110075117 A CN 110075117A
Authority
CN
China
Prior art keywords
grass carp
heparin sodium
carp reovirus
reovirus infection
inhibiting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910362688.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110075117B (zh
Inventor
吕利群
孙皓
王浩
万偲佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Maritime University
Shanghai Ocean University
Original Assignee
Shanghai Maritime University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Maritime University filed Critical Shanghai Maritime University
Priority to CN201910362688.0A priority Critical patent/CN110075117B/zh
Publication of CN110075117A publication Critical patent/CN110075117A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110075117B publication Critical patent/CN110075117B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途，属于水产养殖抗病毒药物技术领域。抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物包括肝素钠作为活性成分，还包括水产养殖药物的辅料或载体；其中，肝素钠的使用剂量不低于100μg/mL，其通过替代细胞表面硫酸乙酰肝素分子作用竞争性抑制病毒感染细胞实现。解决目前水产养殖领域中草鱼呼肠孤病毒感染导致草鱼养殖发病死亡率高、但无理想治疗方法的问题，对草鱼呼肠孤病毒感染抑制作用强，作为草鱼呼肠孤病毒的抗病毒药物或治疗草鱼出血病的药物安全性高、应用前景广。

Description

肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途
技术领域
本发明属于水产养殖抗病毒药物技术领域，涉及肝素钠作为水产养殖抗病毒感染药物的新用途，具体涉及肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途。
背景技术
目前，我国草鱼养殖量约占总养殖量的20％，每年因病害造成的减产占年度草鱼总养殖量的30％以上。在草鱼病原中，以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)危害最大，其感染导致的草鱼出血病具有高传染性、高致死性，导致大规模减产，一直以来视为我国淡水养殖中最为突出的问题之一。草鱼呼肠孤病毒粒子呈二十面体对称，具有双层衣壳，无囊膜，基因组由11条双链RNA组成，草鱼呼肠孤病毒感染可引起草鱼各器官、组织出现不同程度充血、出血现象，发病死亡率高达80％以上。而目前对于草鱼呼肠孤病毒感染尚无理想的治疗方法，主要以预防工作为主。
肝素钠一直以来作为抗凝血药物被广泛使用(姬胜利,张天民.1996(5)：216-219.)。然而近年来，随着多种病毒性疾病的爆发，有许多研究人员发现肝素钠拥有部分抗病毒感染的作用，目前研究发现肝素钠可以抑制HIV(Katzenstein D.1991,29(4)：676-9.)、寨卡病毒(Ghezzi S,Cooper L,Rubio A,et al.2017,140(Complete)：13-17.)、单纯疱疹病毒(Nahmias,AndréJ,Kibrick S.1964,87(5)：1060.)等感染，但很少有其对水产动物病毒抑制的相关研究。
发明内容
针对目前水产养殖领域中草鱼呼肠孤病毒感染导致草鱼养殖发病死亡率高、但无理想治疗方法的问题，本发明的目的在于提供肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途。
进一步，所述肝素钠通过替代细胞表面硫酸乙酰肝素分子作用竞争性抑制病毒感染细胞实现。由于多数病毒可以通过细胞表面的硫酸乙酰肝素分子结合细胞，上述技术方案中肝素钠可以通过替代细胞表面硫酸乙酰肝素分子的作用来竞争性的抑制病毒感染细胞。
进一步，所述抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物包括肝素钠作为活性成分，还包括水产养殖药物的辅料或载体。
更进一步，所述肝素钠的使用剂量不低于100μg/mL。在某一优选实施方案中，当所述肝素钠的使用剂量为100μg/mL时即可显著减少病毒增殖；当所述肝素钠的使用剂量在10mg/ml以上时基本可以抑制病毒感染细胞。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现商品肝素钠可用于抗凝血之外，还能够抑制草鱼呼肠孤病毒感染，且抑制作用强，作为草鱼呼肠孤病毒的抗病毒药物或治疗草鱼出血病的药物，比其他药物安全性高、应用前景广。
附图说明
图1为不同浓度肝素钠对CIK细胞中草鱼GCRV JX01病毒感染的抑制效果；其中，NC为正常CIK细胞对照组；30mg/mL为培养基中添加30mg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；20mg/mL为培养基中添加20mg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；10mg/mL为培养基中添加10mg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；1mg/mL为培养基中添加1mg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；100μg/mL为培养基中添加100μg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；10μg/mL为培养基中添加10μg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；0μg/mL为培养基中未添加肝素钠且加有GCRV JX01病毒组。
图2是Western blot检测草鱼GCRV JX01病毒在不同浓度肝素钠的CIK细胞内增殖情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
通过以下试验验证肝素钠对草鱼呼肠孤病毒感染的抑制作用，具体步骤为：
步骤a：细胞复苏及病毒感染
液氮中取出冻存的CIK细胞，于37℃水浴至细胞全部溶解后，800r/min离心10min，迅速转移至无菌超净台内，弃去冻存液，将细胞转移至密封培养瓶内，并加入新鲜无菌M199培养液(10％胎牛血清)，放置于28℃培养箱中进行培养。参照贴壁细胞培养方法培养CIK至2-3代后，将CIK细胞铺满至12孔板，使用不同浓度的商品肝素钠(sangon Biotech)处理CIK细胞1h后，去掉培养液，使用无菌PBS洗三遍，加入GCRV JX01株病毒感染CIK细胞，在病毒吸附细胞1h后，去掉培养液上清中未吸附的病毒粒子，无菌PBS洗三遍，分别加入与原浓度相同的肝素钠培养液，28℃培养24h后，分别收集上清与细胞样品。
步骤b：Western blot检测病毒在细胞内增殖情况
(1)使用2×loading buffer裂解细胞样品，100℃水浴加热10min，12000rpm离心10min后，取上清上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳条件为120V，30min；80V，60min。
(2)将电泳后的蛋白样品转至PVDF膜后，使用5％脱脂牛奶室温孵育封闭2h，再分别4℃孵育VP7抗体(1：4000)和内参GAPDH抗体(1：4000)过夜，使用PBST缓冲液洗5次，每次5min；使用HRP标记的鼠抗(Goat Anti-mouse IgG HRP：2.5％脱脂牛奶＝1：4000)作为二抗室温孵育2h，PBST洗11次，每次5min。
(3)加入ECL化学发光液处理1min，暗室压片曝光，扫描拍照。
步骤c：上清RNA提取
(1)使用RNA提取试剂盒，取感染病毒细胞上清样品0.22μM过滤，200μL转移至新离心管中，加入20μL Proteininase K混匀。
(2)加入20μL Carrierl RNA，上下颠倒15s混匀。
(3)56℃孵育15min。
(4)加入250μL无水乙醇震荡15s混匀，室温孵育5min。
(5)将前一步混匀溶液转移至吸附柱中，8000rpm离心1min，弃废液。
(6)加入500μL GD溶液，8000rpm离心1min，弃废液。
(7)加入600μL PW溶液，室温放置2min，8000rpm离心1min，弃废液；重复该步骤两次。
(8)加入500μL无水乙醇溶液，8000rpm离心1min，弃废液；再将吸附柱12000rpm离心3min。
(9)室温下干燥3min，悬空滴加适量洗脱液于吸附膜上，5min后12000rpm离心1min，收集RNA样品，测出RNA浓度，进行后续逆转录和Real-time PCR方法。
步骤d：逆转录
(1)反应液配置于冰上进行，反应体系10μL，如下：
(2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却。
(3)配置下列反应液，反应体系为20μL：
(4)缓慢混匀，按下列条件进行反转录反应：
30℃ 10min
42℃ 60min
95℃ 5min
冰上冷却。
步骤e：Real-time PCR方法
(1)Real-time引物如下：
GCRV JX01-F：5’-CAAGACCATTCAAGACTC-3’
GCRV JX01-R：5’-TCACTCACTTCGACTAAT-3’
(2)Real-time PCR按照以下配比进行反应体系配制，反应体系为25μL：
(3)PCR扩增程序如下：
(4)定量PCR程序结束后，整理数据利用SPSS软件分析其显著性差异。
参见图1和2，图1中不同浓度肝素钠对CIK细胞中草鱼GCRV JX01病毒感染的抑制效果。NC为正常CIK细胞对照组；30mg/mL为培养基中添加30mg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；20mg/mL为培养基中添加20mg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；10mg/mL为培养基中添加10mg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；1mg/mL为培养基中添加1mg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；100μg/mL为培养基中添加100μg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；10μg/mL为培养基中添加10μg/mL肝素钠与GCRV JX01病毒组；0μg/mL为培养基中未添加肝素钠且加有GCRVJX01病毒组；结果可见培养基中添加有肝素钠的CIK细胞相对于未添加肝素钠的CIK细胞未出现或出现了较少的CPE现象，表明肝素钠对于草鱼GCRV JX01病毒的感染具有一定抑制作用。
图2是Western blot检测草鱼GCRV JX01病毒在不同浓度肝素钠的CIK细胞内增殖情况。Western blot结果显示，随着CIK细胞培养基中肝素钠添加的浓度升高，GCRV JX01病毒外衣壳蛋白VP7被检测到越少，说明肝素钠使得GCRV JX01病毒复制的数量得到控制，抑制病毒扩增。

Claims (4)

1.肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝素钠通过替代细胞表面硫酸乙酰肝素分子作用竞争性抑制病毒感染细胞实现。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物包括肝素钠作为活性成分，还包括水产养殖药物的辅料或载体。
4.根据权利要求1或3所述的用途，其特征在于，所述肝素钠的使用剂量不低于100μg/mL。
CN201910362688.0A 2019-04-30 2019-04-30 肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途 Active CN110075117B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910362688.0A CN110075117B (zh) 2019-04-30 2019-04-30 肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910362688.0A CN110075117B (zh) 2019-04-30 2019-04-30 肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110075117A true CN110075117A (zh) 2019-08-02
CN110075117B CN110075117B (zh) 2021-10-08

Family

ID=67418147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910362688.0A Active CN110075117B (zh) 2019-04-30 2019-04-30 肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110075117B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115040537A (zh) * 2022-06-22 2022-09-13 中国科学院水生生物研究所 锰离子在防治水生病毒感染中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102908342A (zh) * 2012-11-20 2013-02-06 上海海洋大学 一种用于防治草鱼出血病的药物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102908342A (zh) * 2012-11-20 2013-02-06 上海海洋大学 一种用于防治草鱼出血病的药物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHE C. COLPITTS等: "A Small Molecule Inhibits Virion Attachment to Heparan Sulfate- or Sialic Acid-Containing Glycans", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
MASANORI BABA等: "Sulfated Polysaccharides Are Potent and Selective Inhibitors of Various Enveloped Viruses, Including Herpes Simplex Virus, Cytomegalovirus, Vesicular Stomatitis Virus, and Human Immunodeficiency Virus", 《ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY》 *
郭帅等: "草鱼呼肠孤病毒的致病机制及抗病毒新对策", 《渔业现代化》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115040537A (zh) * 2022-06-22 2022-09-13 中国科学院水生生物研究所 锰离子在防治水生病毒感染中的应用
CN115040537B (zh) * 2022-06-22 2023-09-01 中国科学院水生生物研究所 锰离子在防治水生病毒感染中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110075117B (zh) 2021-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4087712B2 (ja) 細胞培養物からウイルスを抽出する方法
Bucknall et al. Studies with human coronaviruses II. Some properties of strains 229E and OC43
Singer et al. Respiratory diseases in cyclophosphamide-treated mice II. Decreased virulence of PR8 influenza virus
CN113082049B (zh) 碘化钾或含有碘化钾的组合物在制备用于治疗非洲猪瘟的药物中的新用途
Kiyotani et al. Immediate protection of mice from lethal wild-type Sendai virus (HVJ) infections by a temperature-sensitive mutant, HVJpi, possessing homologous interfering capacity
CN110075117A (zh) 肝素钠作为抑制草鱼呼肠孤病毒感染药物的用途
CN102443571B (zh) 一株鸡源h9n2禽流感病毒毒株及其应用
Thacore et al. Rescue of vesicular stomatitis virus from interferon-induced resistance by superinfection with vaccinia virus: I. Rescue in cell cultures from different species
Wang et al. The dynamics of Chinese variant porcine epidemic diarrhea virus production in Vero cells and intestines of 2-day old piglets
Holland et al. Attempts to detect homologous autointerference in vivo with influenza virus and vesicular stomatitis virus
Wecker et al. Genomic masking produced by double-infection of HeLa cells with heterotypic polioviruses
McKimm-Breschkin et al. Conditions required for induction of interferon by rotaviruses and for their sensitivity to its action
Gauntt et al. Host factors regulating viral clearance
Yamazi et al. Inhibition of poliovirus by effect of a methylthiopyrimidine derivative
Chen et al. Delayed protein shut down and cytopathic changes lead to high yields of infectious pancreatic necrosis virus cultured in Asian Grouper cells
Liebhaber et al. STUDIES OF A MYXOVIRUS RECOVERED FROM PATIENTS WITH INFECTIOUS HEPATITIS: I. ISOLATION AND CHARACTERIZATION
Tonew et al. Replication and persistence of coxsackieviruses B3 in human fibroblasts
Jackson et al. Viruses causing common respiratory infections in man. II. Enteroviruses and paramyxoviruses
Amin et al. Viral sepsis
Ohta et al. Activation of chicken alternative complement pathway by fowlpox virus-infected cells
Taylor et al. Analysis of a plaque assay method for purified poliovirus MEF-1
Gobara et al. Properties of Virus Isolated from an Epidemic of Hand‐Foot‐and‐Mouth Disease in 1973 in the City of Matsue: Comparison with Coxsackievirus Group A Type 16 Prototype
JP7397079B2 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス薬の調製におけるトランスフェリン、トランスフェリン受容体及びそれらの抗体の応用
Koga et al. CD8+ T-lymphocytes infiltrate the myocardium in fulminant herpes virus myocarditis
Davis et al. Susceptibility of the Vero line of African green monkey kidney cells to human enteroviruses

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant