JP4087712B2 - 細胞培養物からウイルスを抽出する方法 - Google Patents
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Description
ウイルスにより引き起こされる膨大な数の疾患に起因して、ウイルス学は、集中的に研究されている分野である。ワクチンを生成するために、または研究室での研究のための感染性ウイルスを提供するために、ウイルスタンパク質を単離しそして精製する目的で、ウイルスを効果的に生成することが常に必要とされてきた。ウイルス治療の新たな開発は、感染性ウイルスの効果的な産生の必要性を、さらに最近、必要としている。
本発明は、細胞の培養物からウイルスを抽出する方法に関する。ウイルスは、伝統的に、複数回の凍結−解凍、引き続き、密度勾配による精製および超遠心分離によって細胞から抽出される。本発明において、本発明者らは、界面活性剤を用いて細胞の培養物からウイルスを抽出し、そして得られた収率は、凍結−溶解によって得られたものよりも高かった。さらに、この抽出工程は、周囲温度以上で実施され得る。特に、抽出は、25℃または37℃のような都合のよい温度で行われ得、それにも関わらず高いウイルス力価を与える。
(a)ウイルスに感染している細胞の培養物を提供する工程;
(b)培養物に界面活性剤を加えることによって細胞からウイルスを抽出する工程;および
(c)ウイルスを回収する工程。
本発明は、細胞培養物からウイルスを抽出する方法に関する。従来の冷凍−解凍技術の代わりに、本発明者らは、簡便に実施され得る迅速かつ単純な方法を開発した。
本明細書中に使用される場合、「ウイルス感染」とは、細胞へのウイルスの侵入および続く細胞中でのそのウイルスの複製をいう。
パーセンテージ」とは、ある集団における、細胞変性効果を示さない細胞のパーセンテージである。
レオウイルスは、本発明を詳述するためのモデル系として用いられる。しかし、本発明が他のウイルス(特に、他の非エンベロープウイルス)にも同様に適用され得ることが企図される。
が、このウイルスを精製するために用いられ得る。例えば、細胞細片は、ろ過によって除去され得る。ろ過の流速を増加させるために、より大きい孔径を用いた前ろ過の後に、より小さな孔径を用いた少なくとも1回のろ過工程を行う段階ろ過が、実施され得る。フィルターの孔径および型は、このウイルスおよび細胞の性質に依存し、そして当業者によって決定され得る。例えば、HEK293/SF細胞を用いたレオウイルス産生のためには、8μMまたは5μMの孔径のプレフィルターが用いられ得、その後3μMのフィルター、そして最後に0.8μMのフィルターが用いられ得る。
本発明に従い調製されたウイルス組成物もまた、提供される。これらの組成物は、ウイルス性タンパク質の単離および特徴づけか、ワクチン産生においてか、もしくはこの組成物が感染性ウイルスを含む場合、ウイルスストックとしてか、または臨床での投与において用いられ得る。
TCID50=組織培養感染用量50
μM=マイクロモル濃度
mM=ミリモル濃度
M=モル濃度
ml=ミリリットル
μl=マイクロリットル
mg=ミリグラム
μg=マイクログラム
g/L=1リットルあたりのグラム数
rpm=1分間あたりの回転数
FBS=ウシ胎仔血清
DTT=ジチオスレイトール
NP−40=Nonidet P−40(オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)
SDS=ドデシル硫酸ナトリウム
PBS=リン酸緩衝化生理食塩水
β−ME=β−メルカプトエタノール
MOIまたはm.o.i.=感染効率
PFU=プラーク形成単位
hr=時間
℃=摂氏温度
(一般的方法)
(細胞およびウイルス)
ヒト腎臓胚293(HEK293)細胞、ベロ(アフリカミドリザル腎臓)細胞、およびマウス繊維芽細胞L−929細胞を、製造業者BioReliance Corporation(Rockville,Maryland)から入手した。HEK293細胞を、10%熱不活化ウマ血清および90%の以下の混合物:2mMのL−グルタミンおよび1.5g/Lの重炭酸ナトリウムを含むように調整されたEarle平衡化塩溶液を有するEagle最小基本培地、0.1mMの非必須アミノ酸、ならびに1.0mMのピルビン酸ナトリウム、を含有する培養培地中で増殖させた。マウスL−929細胞およびVero細胞を、10%FBSおよび90%の以下の混合物:2mMのL−グルタミンおよび1.5g/Lの重炭酸ナトリウムを含むように調整されたEarle平衡化塩溶液を有するEagle最小基本培地、0.1mMの非必須アミノ酸、ならびに1.0mMのピルビン酸ナトリウム、を含有する培養培地中で増殖させた。
コンフルエントな単一層のHEK293細胞、Vero細胞、およびL−929細胞を、24ウェルプレート中で増殖させ、そして公知の感染効率でレオウィルスを感染させた。37℃で1時間インキュベートした後、温めた培地で単一層を洗浄し、次いでその培養培地中でインキュベートした。感染後の種々の時点で、NP−40およびデオキシコール酸ナトリウムの混合物を、最終濃度がそれぞれ1%および0.5%となるように、感染した単一層上の培地に直接添加した。次いで溶解物を回収し、そしてL−929細胞でのプラーク滴定法によりウィルスの収量を決定し、そしてLog10TCID50/mlとして表した。
293/SF細胞を、106/mlまで増殖させ、そしてレオウイルスで感染させた。培地の色が赤から橙色に変化するまで、または細胞の生存度が生細胞の計測によって証明される場合に所望のレベルまで低下するまで、培養物を増殖させた。細胞変性効果を示さない細胞について顕微鏡下で、生細胞の計測を実行した。細胞変性効果は、細胞の外観が膨張および顆粒状になること、ならびに細胞の凝集塊が別々に分離することによって示される。生細胞の計測をまた、当該分野において通常用いられるような生存株によって実行し得る。
所望の細胞生存レベルを達成した場合、この細胞を、遠心分離でペレット化し、そして10mM Tris(pH7.4)、250mM NaClおよび0.1% Triton X−100中に再懸濁した。次いで、この細胞を凍結融解によって溶解し、そして細胞を混合および溶解するために周期的にボルテックスをしつつ氷上で20〜40分間維持した。懸濁物を、10分間のボルテックスによって、等容量の予め氷冷されたFreon(登録商標)(1,1,2−トリクロロ−1,1,2−トリフルオロ−エタン)で抽出し、続いて、4℃で10分間2500rpmで遠心分離して異なる相を分離した。水相(上相)を除去し、そして上記のように2回再抽出し、そしてこのウイルスを、4℃で1時間25,000rpmで超遠心分離することによってペレット化した。
(レオウイルスの生成のための最適な細胞株の決定)
感染の結果として生成されたレオウイルスの量において感受性細胞株の間に差異が存在するか否かを決定するために、レオウイルス感受性を示す多数の異なる細胞株を、生成されたレオウイルスの相対量についてアッセイした。生物学的因子の生成について種々の監督機関によって認められている細胞株が、特に興味深い。従って、HEK293細胞、Vero細胞、およびL−929細胞を、レオウイルスに曝露し、そしてレオウイルスを生成する能力を比較した。
(最終的なウイルス生成に対する開始感染効率の効果)
開始感染効率が、最終的なウイルスの産出量を決定するか否かを決定するために、HEK293細胞を、1〜0.1の間の開始感染効率(m.o.i.)の範囲で感染させた。表2に示される本発明者らの結果は、開始m.o.i.と最終的なウイルス生成との間に確かに関連があることを示す。1未満の開始m.o.i.が、レオウイルスの大量製造のために最適である。
(ウイルス抽出手順の評価)
初めに、本発明者らは、材料および方法の節に記載されるように、ウイルス粒子を抽出および精製する従来の方法に従った。手短には、細胞を、凍結融解によって崩壊させ、そしてFreonによって3回抽出した。次いで、ウイルス粒子を、CsCl勾配および超遠心分離で精製した。しかし、このプロトコルは、大量のウイルスを生成するためには、あまりにも単調で時間がかかった。故に、本発明者らは、大量の懸濁培養のための回収条件を最適化するために、以下に記載されるようないくつかの他の抽出方法を試験した。
Claims (20)
- 細胞の培養物からウイルスを生成する方法であって、該方法は以下の工程:
(a)ウイルスによって感染されている細胞の培養物を提供する工程;
(b)該細胞の培養物に界面活性剤を加え、そしてインキュベートすることによって、該細胞の培養物からウイルスを抽出する工程;および
(c)ウイルスを回収する工程、
を包含し、ここで、該ウイルスは哺乳動物レオウイルスであり、そして該界面活性剤は、Triton(登録商標) X−100、Tween(登録商標)20、Nonidet(登録商標) P−40およびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選択される、方法。 - 前記界面活性剤が、Triton(登録商標) X−100、Tween(登録商標)20およびNonidet(登録商標) P−40からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、Triton(登録商標) X−100である、請求項2に記載の方法。
- 前記Triton(登録商標) X−100の最終濃度が1%である、請求項3に記載の方法。
- 前記工程(b)のインキュベーションが、10℃〜30℃の間の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(b)のインキュベーションが、25℃で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(b)のインキュベーションが、37℃で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記培養物を、前記工程(b)において前記界面活性剤とともに60分またはそれ未満イ
ンキュベートする、請求項1に記載の方法。 - 前記培養物を、前記工程(b)において前記界面活性剤とともに30分またはそれ未満インキュベートする、請求項8に記載の方法。
- 前記培養物を、前記工程(b)において前記界面活性剤とともに10分間インキュベートする、請求項9に記載の方法。
- 前記哺乳動物レオウイルスが、ヒトレオウイルスである、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトレオウイルスが、血清3型ウイルスである、請求項11に記載の方法。
- 前記血清3型レオウイルスが、Dearing株である、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト胚腎293(HEK293)細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記HEK293細胞が、懸濁液中で培養される、請求項14に記載の方法。
- 前記工程(c)が、濾過によって破壊された細胞を除去する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 濾過の後に、濃縮の工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- 感染性哺乳動物レオウイルスを生成する方法であって、該方法は以下の工程:
(a)哺乳動物レオウイルスに感染しているHEK293細胞の培養物を提供する工程;
(b)該HEK293細胞の培養物にTriton(登録商標) X−100を加え、そして25℃〜37℃で、10分間インキュベートすることによって、該HEK293細胞の培養物から該ウイルスを抽出する工程;および
(c)該哺乳動物レオウイルスを回収する工程、
を包含する、方法。 - 前記工程(c)が、濾過によって破壊された細胞を除去する工程および濾液を濃縮する工程を包含する、請求項18に記載の方法。
- 前記工程(b)のインキュベーションが、10℃〜37℃の間の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
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