CN116115610B - 一种小分子抑制剂bci121在鱼类抗病毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小分子抑制剂BCI121在制备预防或治疗鱼类病毒感染的药物或饲料添加剂的用途，通过对斑马鱼幼鱼进行SVCV病毒的攻毒实验发现，BCI121可以明显激活抗病毒相关基因（ifn1，ifn2，mxb，mxc，lta，pkz，rigi）的表达，显著提高斑马鱼受SVCV病毒感染后的存活率，BCI121可以用于制备抗病毒（尤其是鲤春病毒血症病毒）的药物或饲料添加剂。

Description

一种小分子抑制剂BCI121在鱼类抗病毒中的应用

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种小分子抑制剂BCI121在鱼类抗病毒中的应用。

背景技术

随着养殖规模和养殖密度的不断扩大，发生鱼类病毒病的几率也逐渐加大，已经成为制约水产养殖业健康发展的瓶颈因素之一。鱼类病毒病的病原体微小、在宿主细胞内复制、潜伏期长，导致病毒病症状复杂多变、传染性强、死亡率高、难以防控，严重危害鱼类的养殖，易造成巨大的经济损失。因此，开展鱼类免疫抗病的基础研究及研制新型抗病药物已经成为当务之急。

目前，鱼类病毒病的主要防治方法有：

1)免疫预防。由于病毒病目前尚无较好的治疗办法，因而免疫接种就成为预防病毒病暴发、控制病毒病蔓延的主要手段。

2)药物防治。关于鱼类抗病毒药物的开发十分有限，目前广泛采用的是一种有机碘制剂(PVP)，常用于鱼卵的消毒。

3)优化养殖条件。严格执行检疫制度，对养殖工具定期消毒，合理的换水增氧，加强日常管理，提高鱼体自身免疫力。

然而，鱼类疫苗研发进展缓慢，且效果不显著，接种工作费时费力，难以实现大规模实施；病毒病原微小，感染动物后便在宿主细胞内复制，抗生素对病毒几乎不起作用，而化学药物在灭活病毒前就可能对宿主细胞产生损害。因此小分子抑制剂因其结构简单，具有合成相对容易，可口服，易储存与运输，组织渗透性好，能部分通过血脑屏障且没有免疫原性的优势。

鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus，简称SVCV)是一种能够引起鲤科鱼类急性传染病——鲤春病毒血症(SVC)的病原，一旦爆发会造成巨大的经济损失。SVCV具有囊膜，属于弹状病毒科水泡性病毒属。SVCV病毒基因组为线性单股不分段的负链RNA，长11019个核苷酸，主要包含5个基因，分别编码核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、糖蛋白G和RNA聚合酶L。鲤春病毒血症病毒SVCV主要在鲤科鱼类养殖中广泛传播，主要症状为体内出血，腹膜炎及腹水。目前，对于鱼类感染SVCV的预防及治疗手段十分有限，尚无商品化疫苗。

BCI121是组蛋白赖氨酸甲基转移酶SMYD3的小分子抑制剂，已有研究报道BCI121可显著抑制癌细胞的生长，但在抗病毒方面没有研究。BCI121其分子量为340.22，分子式为C₁₄H₁₈BrN₃O₂，分子结构式如图1所示。

发明内容

本发明的目的在于提供小分子抑制剂BCI121在制备预防或治疗鱼类病毒(尤其是鲤春病毒血症病毒)感染的药物或饲料添加剂的用途。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明通过细胞生化实验证明，小分子抑制剂BCI121浓度为10μM、50μM、100μM、200μM时，在斑马鱼肝脏组织上皮细胞ZFL中进行48h处理后，检测细胞凋亡情况，发现小分子抑制剂BCI121对ZFL细胞无明显毒性，且经过鲤春病毒血症病毒SVCV感染ZFL细胞24h后检测抗病毒相关基因(ifn1，lta)的表达情况，发现小分子抑制剂BCI121可以显著增强ZFL细胞的抗病毒能力。

另外，本发明通过斑马鱼活体实验发现，在BCI121的浓度为200μM时，作用48h后对斑马鱼幼鱼同样无明显毒性，且能够有效增强斑马鱼抗病毒相关基因(ifn1，ifn2，mxb，mxc，lta，pkz，rigi)的表达，显著增强斑马鱼抗病毒能力，同时提高感染鲤春病毒血症病毒SVCV的斑马鱼的存活率，因此，BCI121可用于制备预防或治疗鱼类病毒(尤其是鲤春病毒血症病毒)感染的药物或饲料添加剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次发现BCI121是一种具有抗鲤春病毒血症病毒SVCV活性的小分子抑制剂，通过对斑马鱼幼鱼进行SVCV病毒的攻毒实验发现，BCI121可以明显激活抗病毒相关基因(ifn1，ifn2，mxb，mxc，lta，pkz，rigi)的表达，显著提高斑马鱼受病毒感染后的存活率，BCI121可以用于制备抗病毒药物或饲料添加剂。

附图说明

图1为小分子抑制剂BCI121的结构式。

图2为不同浓度BCI121处理后斑马鱼ZFL细胞凋亡的检测结果。

图3为感染SVCV病毒的斑马鱼ZFL细胞在不同浓度BCI121处理后抗病毒相关基因的表达情况。

图4为不同浓度BCI121对斑马鱼毒性的影响。

图5为BCI121增强斑马鱼抗SVCV病毒的能力。

图6为BCI121对SVCV病毒感染后斑马鱼存活率的影响。

图7为感染SVCV病毒的斑马鱼在不同浓度BCI121处理后的抗病毒相关基因的表达水平。

具体实施方式

下列实施例涉及到的材料和试剂，实验条件和方法如下：

一、材料和试剂

材料：BCI121(购于selleck，CAS：432529-82-3)，溶剂DMSO(购于selleck)；

试剂：细胞凋亡试剂盒(购于BD)，F12培养基(购于BI)，胰蛋白酶(购于BI)，FBS(购于BI)；

细胞株及病毒：斑马鱼肝组织上皮细胞ZFL，鲤春病毒血症病毒SVCV；

斑马鱼：AB品系斑马鱼来自国家斑马鱼资源中心。

二、方法及步骤

ZFL细胞培养：将长满的ZFL细胞用胰酶消化后，转移至新的10cm细胞培养皿中，用含10％ FBS的F12培养基培养。细胞在细胞培养箱中培养，恒温28℃，5％ CO₂。

BCI121储液配制：将购得的25mg BCI121粉末溶于367.4μl DMSO中，配得200mM的BCI121储液。

实施例1BCI121对ZFL细胞的毒性实验

将10cm细胞培养皿中的状态良好的ZFL细胞，去除原有培养基，加入2ml胰酶对细胞进行消化，消化3-5min，期间在显微镜下观察细胞形态，待细胞收缩变圆、部分脱落后，加入3ml F12培养基终止消化，将细胞吹打均匀，吸取10μl细胞悬液至细胞计数板上，进行细胞计数，计算细胞密度；按照2×10⁵个细胞/孔的细胞密度，将细胞接种于六孔板中，每孔培养基最终体积为2ml，将六孔板置于28℃、5％CO₂培养箱中静置培养16-24h。之后向每个孔中分别加入0.1μl、0.5μl、1μl、2μl BCI121储液，使工作浓度分别为10μM、50μM、100μM、200μM，并向另一孔中加入2μl DMSO作为空白对照，排除DMSO对细胞状态的影响。将六孔板置于28℃、5％CO₂培养箱中静置培养48h后，使用细胞凋亡检测试剂盒，验证小分子抑制剂BCI121对ZFL细胞的毒性及生长状态的影响，实验结果如图2所示。

实验结果表明，当小分子抑制剂BCI121工作浓度为10μM、50μM、100μM时，作用48h后，BCI121对ZFL细胞均没有明显细胞毒性，对ZFL细胞的生长状态均没有显著影响。

实施例2BCI121处理后ZFL细胞抗病毒相关基因的表达检测

将10cm细胞培养皿中的状态良好的ZFL细胞，去除原有培养基，加入2ml胰酶对细胞进行消化，消化3-5min，期间在显微镜下观察细胞形态，待细胞收缩变圆、部分脱落后，加入3ml F12培养基终止消化，将细胞吹打均匀，吸取10μl细胞悬液至细胞计数板上，进行细胞计数，计算细胞密度；按照2×10⁵个细胞/孔的细胞密度，将细胞接种于六孔板中，每孔培养基最终体积为2ml，将六孔板置于28℃、5％CO₂培养箱中静置培养16-24h。之后向每个孔中分别加入0.1μl、0.5μl、1μl、2μl BCI121储液，使工作浓度分别为10μM、50μM、100μM、200μM，并向另一孔中加入1μl DMSO作为空白对照，排除DMSO对细胞状态的影响。将六孔板置于28℃、5％CO₂培养箱中静置培养24h后，向每个孔中加入100μl SVCV病毒(～5.0×10⁷TCID₅₀/ml)，将六孔板置于28℃、5％CO₂培养箱中静置培养24h后，使用Trizol法提取细胞的总RNA，利用反转录试剂盒获得cDNA，根据SYBR Green qPCR mix说明书要求，进行实时荧光定量PCR，从而检测抗病毒相关基因(ifn1，lta，引物见表1)的表达情况。

表1

实验结果如图3所示，小分子抑制剂BCI121随着工作浓度的提高，抗病毒相关基因ifn1、lta的表达也梯度增强，这表明BCI121可显著增强ZFL细胞的抗病毒相关基因(ifn1，lta)的表达。

实施例3BCI121对斑马鱼的毒性实验

利用AB品系斑马鱼成鱼进行交配，获得足够数量的三天龄的斑马鱼幼鱼，将三天龄的斑马鱼幼鱼按照30条为一组随机分为5组，分别使用6cm培养皿培养。分别向每组鱼中加入4ml培养水，之后向空白对照组(BCI121 0μM)中加入1ml含有5μl DMSO的培养水，向BCI121工作浓度为10μM组中加入1ml含有0.25μl BCI121储液的培养水，向BCI121工作浓度为50μM组中加入1ml含有1.25μl BCI121储液的培养水，向BCI121工作浓度为100μM组中加入1ml含有2.5μl BCI121储液的培养水，向BCI121工作浓度为200μM组中加入1ml含有5μlBCI121储液的培养水。将斑马鱼幼鱼置于28℃恒温培养箱中，48h后显微镜下观察斑马鱼状态并拍照记录，如图4所示。

根据显微镜拍照结果表明，小分子抑制剂BCI121在浓度为10μM、50μM、100μM、200μM时，均对斑马鱼幼鱼的生命活动及生存状态没有影响，说明BCI121对斑马鱼幼鱼无毒性。

实施例4BCI121增强斑马鱼抗病毒能力

利用AB品系斑马鱼成鱼进行交配，获得足够数量的三天龄的斑马鱼幼鱼，将三天龄的斑马鱼幼鱼按照30条为一组随机分为2组，分别使用6cm培养皿培养。分别向每组鱼中加入2ml培养水，之后向空白对照组(DMSO组)中加入1ml含有5μl DMSO的培养水，向实验组BCI121组中加入1ml含有5μl BCI121储液的培养水，之后向每组中加入2ml SVCV病毒(～1.0×10⁸TCID₅₀/ml)。将斑马鱼幼鱼置于28℃恒温培养箱中，每隔5h后观察斑马鱼幼鱼状态并统计死亡数量，病毒感染24h后显微镜拍照记录，如图5所示，红色箭头表示死亡的斑马鱼幼鱼。利用graphpad prism软件统计斑马鱼存活情况。

根据显微镜拍照结果表明，小分子抑制剂BCI121在工作浓度为200μM时，在SVCV病毒感染24h后，对照组DMSO组斑马鱼死亡数量明显多于实验组BCI121组，这说明BCI121可以增强斑马鱼抗SVCV病毒的能力。同时，图6死亡曲线表明，对照组斑马鱼在SVCV病毒感染30h后全部死亡，而BCI121处理后的斑马鱼此时存活率仍在90％以上，这说明BCI121可以显著提高斑马鱼受SVCV病毒感染后的存活率。

实施例5BCI121增强斑马鱼抗病毒相关基因的表达

利用AB品系斑马鱼成鱼进行交配，获得足够数量的三天龄的斑马鱼幼鱼，将三天龄的斑马鱼幼鱼按照30条为一组随机分为3组，分别使用6cm培养皿培养。向无刺激组(即-SVCV)中加入5ml培养水；向另外两组分别加入2ml培养水，之后向对照组(DMSO组)中加入1ml含有5μl DMSO的培养水，向实验组BCI121组中加入1ml含有5μl BCI121储液的培养水，此时BCI121终浓度为200μM，之后向这两个刺激组中分别加入2ml SVCV病毒(～1.0×10⁸TCID₅₀/ml)。将斑马鱼幼鱼置于28℃恒温培养箱中培养24h。之后将培养水去掉，将斑马鱼收集于1.5ml离心管中，利用Trizol法提取斑马鱼RNA，之后使用反转录试剂盒获得cDNA，根据SYBR Green qPCR mix说明书要求，进行实时荧光定量PCR，从而检测斑马鱼抗病毒相关基因(ifn1，ifn2，mxb，mxc，lta，pkz，rigi，引物见表1)的表达情况。

实验结果如图7所示，病毒SVCV可明显激活抗病毒相关基因(ifn1，ifn2，mxb，mxc，lta，pkz，rigi)的表达，同时，BCI121可显著增强抗病毒基因的表达水平。

Claims (2)

1.BCI121在制备用于预防或者治疗鲤春病毒血症病毒感染的药物或饲料添加剂中的应用，其特征在于，所述BCI121的结构式为

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，BCI121的使用浓度为200μM。