CN109394738A - 白皮杉醇在防治人巨细胞病毒感染中的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了白皮杉醇在制备防治人巨细胞病毒感染的药物中的新用途，实验表明，白皮杉醇单独处理对HCMV体外宿主细胞—人胚肺二倍体成纤维细胞WI‑38在0‑20μM没有表现出明显的毒性，白皮杉醇在10‑20μM能够抑制HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白UL44在WI‑38中的表达，在10‑20μM能够抑制HCMV的扩增；白皮杉醇通过抑制HCMV诱导的宿主细胞衰老发挥抗HCMV活性，具体机制是抑制HCMV诱导的p16^INK4a高表达以及活性氧自由基水平的升高，进而发挥抗HCMV的作用。

Description

白皮杉醇在防治人巨细胞病毒感染中的新用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体是一种白皮杉醇在防治人巨细胞病毒感染中的新用途。

背景技术

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)属疱疹病毒β亚科，在人群中感染普遍，且感染后往往终身带毒。巨细胞病毒感染患者容易导致神经系统、肝脏、呼吸系统及血液系统等损伤，严重时甚至危及生命(Rev Med Virol,2010,20:311-326)。流行病学数据表明，在大多数发达国家，大约50％的成年人口有既往感染HCMV的血清学史；在发展中国家，HCMV感染在大龄儿童和成年人群中甚至高达90％-100％。我国是HCMV感染的高发地区，儿童血清抗HCMV阳性率为83.2％-87.2％，成人则高达95％(国际检验医学杂志,2010,31:1131-1133)。因此，对巨细胞病毒感染者进行积极有效的治疗，是提高出生人口素质和提高免疫力低下老年人生活质量的重要手段。

目前对于HCMV感染的治疗，主要仍是应用丙氧鸟苷、更昔洛韦、膦甲酸等抗病毒西药，有一定的临床疗效，但并不能解决根本问题，往往停药后病毒又潜伏地回升，且具有明显的不良反应，如骨髓抑制、肾毒性和引起电解质紊乱等，因此大大限制了其临床应用(微生物学免疫学进展,2015,43:64-68)。另外，虽然近年来HCMV疫苗的研发有所进展，但仍未在临床上应用。因此，目前仍缺少安全有效的抗HCMV感染的理想药物。

研究表明，HCMV具有严格的寄生性，在体外培养中一般只在二倍体成纤维细胞中生长，人胚肺二倍体成纤维WI-38细胞是其体外宿主细胞之一，该细胞同时也常用于细胞衰老的研究，一般认为≤30PD为年轻细胞；≥55PD为复制性衰老细胞。目前，常用的实验室HCMV病毒株是Towne和AD169，这些HCMV病毒株致病能力大大减弱，但保留了良好的侵袭能力，专门用于科学研究。HCMV基因的表达呈现出一定的时序性，即表达可分为立即早期(IE)、早期和晚期。其中，IE基因对病毒其它基因以及宿主细胞的某些基因的表达和调控方面有着重要的作用，其中最主要的是IE2和IE1，尤其是IE2在HCMV诱导的细胞衰老中起重要作用，HCMV可以通过诱导IE2和IE1诱导成纤维细胞衰老相关分子p16^INK4a高表达，p16^INK4a是诱导细胞衰老最重要的分子之一(JVirol,2002,76:12135-12148)。进一步的研究表明，p16^INK4a的高表达促进了HCMV的侵染和复制(Virology,2006,349:79-86)。同时，HCMV侵染会引起宿主细胞内活性氧自由基(ReactiveOxygen Species，ROS)水平急剧升高，ROS水平的升高反过来促进HCMV的吸附、进入和复制，是加速HCMV侵染的一种机制，也是诱导细胞衰老的一个重要因素(Viruses.2015,7:2816-2833.)。

白皮杉醇是一种二苯乙烯类天然小分子化合物，主要存在于葡萄、大黄和甘蔗中，已经报道该物质具有显著的抗氧化、保护心脑血管、抗恶性肿瘤以及调节代谢等生物活性。但是本发明所涉及的白皮杉醇通过抑制HMCV诱导的p16^INK4a和活性氧自由基(ROS)升高而引起的细胞衰老进而发挥抗HCMV作用，尚未见报道。

本发明的目的是提供白皮杉醇在防治人巨细胞病毒感染中的新用途，其机制是通过抑制人巨细胞病毒诱导的细胞衰老而发挥作用，具体是抑制HCMV立即早期蛋白IE1/2的表达，进而抑制HCMV诱导的p16^INK4a高表达以及活性氧自由基水平的升高。

发明内容

本发明采用商品化的白皮杉醇，进行了系列生物实验研究，为开拓白皮杉醇防治人巨细胞病毒感染的新用途提供了依据。

本发明提供了白皮杉醇在制备防治人巨细胞病毒感染药物中的新用途。

所述的白皮杉醇是通过抑制人巨细胞病毒诱导的细胞衰老而发挥作用，具体机制是抑制HCMV立即早期蛋白IE1/2的表达，进而抑制HCMV诱导的p16^INK4a高表达以及活性氧自由基水平的升高。

所述的白皮杉醇形式包括其盐的形式以及药学上可接受的载体结合的形式。

所述的防治人巨细胞病毒感染的药物的制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。

生物学实验研究结果表明：

1.白皮杉醇单独处理对HCMV宿主细胞—人胚肺二倍体成纤维细WI-38在0-20μM没有表现出明显的毒性。

2.白皮杉醇具有良好的抗HCMV的作用，表现为10-20μM白皮杉醇能够显著抑制HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白UL44在WI-38中的表达；同时抑制HCMV的复制，使其DNA拷贝数在WI-38中显著下降，20μM白皮杉醇对HCMV DNA的抑制率超过95％；并显著改善HCMV诱导的宿主细胞裂解样病变。

3.白皮杉醇可以通过抑制HCMV诱导的WI-38细胞衰老发挥抗HCMV活性，表现为HCMV诱导的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性和活性氧自由基(ROS)水平的升高可以被白皮杉醇抑制；同时HCMV诱导的衰老相关分子p16^INK4a的表达上调可以被白皮杉醇抑制，在20μM可以将其逆转至对照组水平。

本发明的优点和积极效果在于，通过系统生物学实验发现并证明，白皮杉醇在没有明显细胞毒活性的剂量下具有显著的抗HCMV的作用，其机制是通过抑制HCMV诱导的WI-38细胞衰老发挥抗HCMV活性，表现为HCMV诱导的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性和活性氧自由基(ROS)水平的升高可以被白皮杉醇抑制；分子水平上，HCMV诱导的衰老相关分子p16^INK4a的表达上调可以被白皮杉醇抑制。有望将其开发为防治HCMV的药物。

附图说明

图1：MTT法测定白皮杉醇对WI-38细胞活力的影响

其中：纵坐标—细胞活力(设对照组为100％)

横坐标：

1-对照组(control)

2-白皮杉醇(5μM)处理3天

3-白皮杉醇(10μM)处理3天

4-白皮杉醇(20μM)处理3天

图2：白皮杉醇对HCMV侵染人胚肺成纤维细胞WI-38后细胞病变的影响

其中：1-对照组(control)，不加HCMV

2-HCMV(MOI 0.01)接种7天后(7dpi)

3-白皮杉醇(20μM)+HCMV接种7天后

图3：WesternBlot法测定白皮杉醇对HCMV特征性蛋白IE1/2和UL44的影响(β-actin为内参)

其中：1-对照组(control)，不加HCMV

2-HCMV(MOI 0.01)接种3天后(3dpi)

3-白皮杉醇(5μM)+HCMV接种3天后

4-白皮杉醇(10μM)+HCMV接种3天后

5-白皮杉醇(20μM)+HCMV接种3天后

图4：Q-PCR法测定白皮杉醇对HCMV DNA扩增的影响

其中：纵坐标—HCMV DNA拷贝数

横坐标：

1-对照组(control)，不加HCMV

2-HCMV(MOI 0.01)接种5天后(6dpi)

3-白皮杉醇(5μM)+HCMV接种5天后

4-白皮杉醇(10μM)+HCMV接种5天后

5-白皮杉醇(20μM)+HCMV接种5天后

*P<0.0001，与HCMV组比较

图5：白皮杉醇对HCMV诱导的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色的影响(A：SA-β-Gal染色图片；B：SA-β-Gal染色阳性率)

其中：1-对照组

2-单独HCMV接种后3天(3dpi)

3-白皮杉醇(20μM)+HCMV接种3天后(3dpi)

*P<0.001，与对照组比较；#与P<0.01与HCMV组比较

图6：白皮杉醇对HCMV诱导的衰老相关分子p16^INK4a蛋白表达的影响(A：WesternBlot图片；B：p16^INK4a相对蛋白表达水平)

其中：1-对照组(control)，不加HCMV

2-HCMV(MOI 0.01)接种3天后(3dpi)

3-白皮杉醇(5μM)+HCMV接种3天后

4-白皮杉醇(10μM)+HCMV接种3天后

5-白皮杉醇(20μM)+HCMV接种3天后

*P<0.001与对照组比较；#P<0.01与HCMV组比较；##P<0.001与HCMV组比较

图7：白皮杉醇对HCMV接种后对WI-38细胞内活性氧自由基(ROS)水平的影响

其中：纵坐标—细胞内ROS水平(设对照组为100％)

横坐标：

1-对照组(control)，不加HCMV

2-单独HCMV(MOI 0.01)接种3天后(3dpi)

3-白皮杉醇(20μM)+HCMV接种3天后

*P<0.01与对照组比较；#P<0.01与HCMV组比较。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明所涉及的化合物白皮杉醇来自于Sigma-Aldrich Co.LLC.公司。所用的WI-38细胞和人巨细胞病毒(HCMV)Towne株来自于美国模式培养物集存库(American typeculture collection,ATCC)。

实施例1：药物的细胞毒性通过MTT法检测细胞活力进行，方法如下：成纤维细胞以每孔3000个接种于96孔培养板中，培养24h后加入不同浓度的药物，每一浓度设6个平行孔，并设有不加药物的空白对照组和无细胞的溶解对照组。培养3d后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml，用无血清的DMEM培养液配制)，37℃、5％CO₂条件下培养4h，小心吸净孔内液体，每孔加150μlDMSO，在摇床上轻轻振荡10min，使结晶物充分溶解，而后于570nm处测定光吸收度，计算相对细胞活力，以不加药物的空白组细胞活力为100％。实验结果见图1。

实施例2：HCMV接种及白皮杉醇处理

HCMV具有严格的寄生性，在体外培养中一般只在二倍体成纤维细胞上生长。采用28-35PD的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38(来自美国ATCC)，用10％FBS的培养基按2×10⁴/cm²接种至培养皿中，24小时后更换0.2％FBS的培养基继续培养48小时，通过此种血清饥饿的方法，细胞此时G0/G1同步化，更有利于HCMV的侵染。之后进行HCMV病毒(Towne病毒株)的接种，接种量为0.01MOI(感染复数)，继续培养至指定时间进行相关检测。进行抗HCMV药物活性检测时，提前2小时将一定浓度的药物加至培养基中，而后接种HCMV，进而观察细胞形态学变化(图2)以及病毒基因表达和DNA扩增等的变化。

实施例3：Western Blot检测HCMV相关蛋白和衰老相关分子的表达

采用人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38，按2×10⁴/cm²接种至培养皿中，24h后更换0.2％FBS的培养基继续培养48h后进行HCMV病毒(Towne病毒株)的接种，接种量为0.01MOI(感染复数)。在接种HCMV前2h加入一定浓度的药物，继续培养至指定时间后采用细胞刮刀收集细胞，采用RIPA裂解液裂解细胞后，收集蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，制备分析样品。应用相应抗体，采用WesternBlot法测定HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白UL44以及衰老相关分子p16^INK4a的蛋白表达水平。实验结果见图3和图6。

实施例4：qPCR测定HCMV DNA拷贝数

采用人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38，按2×10⁴/cm²接种至培养皿中，24h后更换0.2％FBS的培养基继续培养48h后进行HCMV病毒(Towne病毒株)的接种。在接种HCMV前2h加入一定浓度的药物，继续培养至指定时间后，收获细胞，采用QiagenMini-DNA Kit提取基因组DNA。取10ng总DNA，按照iQ SYBR Green Supermix kit(Bio-Rad)试剂盒说明进行，所用引物为：上游5′-TCTGCCAGGACATCTTTCTC-3′和下游5′GTGACCAAGGCCACGACGTT-3′。扩增条件：95℃5min，(95℃5sec+60℃30sec)×40循环。qPCR仪：CFX96C1000Touch Real-Time PCRSystemDetector(Bio-Rad)。实验结果见图3。

实施例5：衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色

按照商品化试剂盒说明书进行，主要步骤为：HCMV的接种及药物处理同上述，在进行染色前，去除上清，细胞用PBS洗2遍，之后用4℃预冷的2％甲醛/0.2％戊二醛固定10min，以PBS洗3遍，采用新配制的SA-β-gal染液于37℃(无CO2)温育12～16h，于显微镜下(放大倍数100×)拍照并计算阳性(蓝绿色为衰老的细胞)细胞所占百分比。实验结果见图5。

实施例6：流式细胞术测定细胞内活性氧自由基(ROS)水平

HCMV接种及药物处理同实施例2，检测前，弃掉培养基，用预冷的PBS清洗后，加入10μM的荧光探针H₂DCFDA(2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯)染色液(用含1M HEPES的PBS配制，置于37℃、5％CO₂培养箱孵育30min。弃去细胞染色液，用PBS清洗2遍，加入0.25％胰酶消化片刻，而后加入1ml的PBS将细胞吹打成单个，1000rpm离心5分钟收集细胞，再用1ml的PBS重悬细胞，流式细胞仪采集样品和数据(激发光488nm)。H₂DCFDA荧光强度与ROS水平正相关。实验结果见图7。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.白皮杉醇在制备防治人巨细胞病毒感染药物中的新用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的白皮杉醇是通过抑制人巨细胞病毒诱导的细胞衰老而发挥作用，具体机制是抑制HCMV立即早期蛋白IE1/2的表达，进而抑制HCMV诱导的p16^INK4a高表达以及活性氧自由基水平的升高。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的白皮杉醇形式包括其盐的形式以及药学上可接受的载体结合的形式。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的防治人巨细胞病毒感染的药物的制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。