CN108642121A - 一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法及其应用 - Google Patents

一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及筛选抗人巨细胞病毒(HCMV)药物的方法及其应用，其特征在于利用HCMV可诱导人胚肺成纤维细胞内线粒体含量增加，其含量增加与HCMV的扩增具有显著的相关性，通过测定线粒体含量变化，计算药物对HCMV诱导的线粒体增量抑制率，可以有效的反映药物的抗HCMV作用，具有操作简便、检测灵活、反应灵敏和结果准确的特点。

Description

一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法及其应用。
背景技术
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)属疱疹病毒β亚科，在人群中感染普遍，尤其是免疫力低下的老年人、孕妇和新生儿，同时也是造成出生缺陷的重要因素。HCMV感染会导致神经系统、肝脏、呼吸系统及血液系统等损伤，严重时甚至危及生命(RevMed Virol,2010,20:311-326)。数据显示我国是HCMV感染的高发地区，儿童血清抗HCMV阳性率为83.2％-87.2％，成人则高达95％(国际检验医学杂志,2010,31:1131-1133)。因此，对巨细胞病毒感染者进行积极有效的治疗，是提高出生人口素质和提高免疫力低下老年人生活质量的重要手段。
目前对于HCMV感染的治疗，仍缺少安全有效的抗HCMV感染的理想药物。尽管有一些临床用的核苷类抗病毒药物，如丙氧鸟苷、更昔洛韦和西多福韦等，以及其他类如膦甲酸等，有一定的临床疗效，但往往停药后HCMV又潜伏地回升，并且具有严重的不良反应，如骨髓抑制、肾毒性和引起电解质紊乱等，因此大大限制了其临床应用(微生物学免疫学进展,2015,43:64-68)。另外，HCMV疫苗的研发也没有实质性的进展，仍停留在研发阶段，未在临床上应用。因此，寻找新的安全有效的抗HCMV药物仍是一个研究热点。
HCMV具有严格的寄生性，在体外培养中一般只在二倍体成纤维细胞上生长。传统的测定药物抗HCMV作用的主要手段有:(1)细胞病变(CPE)程度判定，主要通过肉眼进行显微镜的观察，每天记录细胞病变情况，需观察5-10天；(2)空斑计数试验，病毒扩增后引起空斑，进行染色，然后通过显微镜观察计数空斑形成的数目；(3)病毒滴度测定，结果准确，但操作非常繁琐；(4)病毒DNA复制及转录产物测定。这些指标可以用于检测单个或少数药物的抗HCMV活性，但对于用于筛选抗HCMV药物的存在不足：(1)人工操作过多(如通过显微镜观察)，评价细胞病变时主观差异性大，空斑计数误差也较大，缺乏客观定量数据，而且需要及时观察，观察时间有局限性；(2)对于空斑形成试验和病毒滴度测定，必须要等到HCMV复制到中晚期之后才能检测，周期长，操作繁琐；(3)直接测定病毒DNA拷贝数和转录产物结果精确，但操作步骤较多，检测成本也较高，可以用于抗HCMV活性的验证，但不适用于药物的筛选。另外，有研究者构建了一种HCMV-TOWNE-GFP重组巨细胞病毒，可以通过检测绿色荧光蛋白的表达来判断药物的抗HCMV作用(专利公开号：CN101319202A)，但在实际操作过程中，存在以下问题：1)检测结果客观性不足，绿色荧光蛋白的表达是通过肉眼判断其荧光强度，没有仪器给出的定量数据；2)需要活细胞状态下检测，必须及时观察，检测时间有局限性，且检测结果随细胞状态变化出现差异；3)需要配备倒置荧光显微镜。因此，目前仍缺少一种灵活、可靠、高效和快速的抗HCMV药物筛选方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗巨细胞病毒(HCMV)药物筛选方法，其主要测定指标是药物对HCMV诱导的线粒体增量抑制率，这是一种可以检测HCMV复制早期存在显著变化，并与病毒复制有着密切联系的指标，检测操作相对简单。其原理是基于HCMV诱导的人成纤维细胞线粒体含量增加与HCMV DNA和相关蛋白表达具有显著相关性，通过采用壬基吖啶橙(NAO)通过流式细胞仪进行测定线粒体相对含量，进而计算线粒体增量抑制率，可以有效反映药物的抗HCMV作用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
1、细胞和病毒的培养：用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，在37℃、5％CO2条件下传代培养人胚肺二倍体成纤维细胞。将人巨细胞病毒Towne株接种于上述细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存。
2、HCMV接种及药物干预：采用30PD的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38，用10％FBS的培养基按2×104/cm2接种至培养皿中，24h后更换0.2％FBS的培养基继续培养48h，通过此种血清饥饿的方法，细胞此时G0/G1同步化，更有利于HCMV的侵染。之后进行HCMV病毒(Towne病毒株)的接种，接种量为0.01MOI(感染复数)。设立加灭活HCMV的对照组(MOCK)，只加HCMV组(HCMV)和待测药物试验组(HCMV+TEST)，待测药物于HCMV接种前2小时加入到培养基中，于HCMV接种后指定时间进行相关检测。
3、测定HCMV侵染后WI-38细胞线粒体数量：线粒体内膜心磷脂(CL)是一种线粒体的特异性成分，荧光探针壬基吖啶橙(NAO)能够特异性地与CL结合，进而应用流式细胞术方法检测细胞内线粒体数量的变化，是一个检测线粒体数量的有效指标。方法如下：上述HCMV侵染的WI-38细胞经胰酶消化收集后，加入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞吹打成单个细胞，300g离心5分钟，PBS洗两遍，用约500μl的PBS重悬细胞，加入5ml预冷的70％乙醇，4℃固定过夜。检测前PBS洗两遍，沉淀细胞重悬于1ml的PBS中，加入终浓度为10μM的NAO染色液，常温避光染色10min，PBS洗涤两次，细胞经300目尼龙网过滤后，流式细胞仪测定FL1荧光强度(λex 494nm，λem 519nm)，每管计数5000-10000个细胞，采用CELL Quest Pro进行数据分析。NAO荧光强度与线粒体数量成正比。该方法的优点：目前，通过流式细胞仪的5×8或者8×12的进样模块，可以一次性自动检测40管或者96管样本，大大减少了人工操作。另外，用于检测线粒体含量的样本是70％乙醇固定后的细胞，可在4℃或者-20℃至少保存1个月而检测结果依然稳定，在检测时间上比活细胞样本更为灵活。
4线粒体增量抑制率的计算
设对照组(MOCK，加失活HCMV)，单独HCMV组及HCMV+检测药物组(TEST)，以流式细胞仪测得的NAO荧光强度(FL1)，按下述公式计算，线粒体增量抑制率＝[1-(试验组-对照组)/(HCMV组-对照组)]*100％。以50％线粒体增量抑制率表示半数抑制浓度(IC50)<1mg/ml者为抗HCMV潜在活性药物。
5治疗指数(TI)的计算
对于上述获得的潜在阳性药物，采用MTT法检测其细胞毒活性，计算半数中毒浓度(TD50)，进而计算治疗指数(TI)＝TD50/IC50，取TI>10为候选物，进行抗HCMV活性的进一步验证。药物的细胞毒活性采用MTT法检测，方法如下：成纤维细胞以每孔3000个接种于96孔培养板中，培养24小时后加入含抑制HCMV DNA复制活性对应浓度的药物，每一浓度设6个平行孔，并设有不加药物的空白对照组和无细胞的溶解对照组。培养3天后,每孔加入20μlMTT(5mg/ml，用无血清的DMEM培养液配制)，37℃、5％CO2条件下培养4h，小心洗净孔内液体，每孔加150μl DMSO,在摇床上轻轻振荡10min,使结晶物充分溶解，而后于570nm处测定光吸收度(OD)。细胞存活率％＝(加药细胞OD-本底OD)/(对照细胞OD-本底OD)×100％。每检测点取3个平行孔的平均值，绘制抑制曲线，计算TD50值。
6、药物抗HCMV活性的验证
(1)Western Blot检测HCMV相关分子表达
采用细胞刮刀收集细胞，采用RIPA裂解液裂解细胞后，收集蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，制作上样缓冲液。应用相应抗体，采用Western Blot法测定HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白UL44等。Image J分析辉度值，进行半定量分析。
(2)qPCR测定HCMV DNA拷贝数
收获细胞，采用Qiagen Mini-DNA Kit提取基因组DNA。取10ng总DNA，按照iQ SYBRGreen Supermix kit(Bio-Rad)试剂盒说明进行，所用引物为：上游5′-TCTGCCAGGACATCTTTCTC-3′和下游5′GTGACCAAGGCCACGACGTT-3′。扩增条件：95℃5min，(95℃5sec+60℃30sec)X 40循环。
本发明具有如下优点：1)反应灵敏，检测周期短，在HCMV接种后的第二天，即显示出稳定的线粒体数量的增加，而此时细胞尚未出现形态变化，较传统方法需要接种后5-7天才能出现形态变化，其检测时间跨度显著缩短；2)操作简便，测试简单，可进行高通量筛选，通过流式细胞仪的5×8或者8×12的进样模块，可以一次性自动检测40管或者96管样本；3)样本容易保存，收集的样本经70％乙醇固定后可于-20°保存1月结果依旧稳定，避免了活细胞检测需立即检测的麻烦，检测时间灵活。
本发明提供的抗HCMV药物筛选方法，为寻找抗HCMV新药物或者发现已有药物的抗HCMV新活性提供了一条新途径，尤其是为从中药中寻找新的活性物质提供了有效手段，将大大促进HCMV药物研发的进展。
附图说明
图1是本发明的实施例1结果示意图
其中：纵坐标—相对线粒体含量(HCMV组FL1荧光强度/对照组FL1荧光强度*100％)横坐标—MOI 0.01的HCMV接种后天数(d.p.i)；
图2是本发明的实施例2结果示意图
其中：纵坐标—线粒体相对含量(设定MOCK为100％)
横坐标—A-对照组(MOCK)
B-HCMV(MOI 0.01)接种3天后
C-C-RES(10μM)+HCMV接种3天后
D-RES(20μM)+HCMV接种3天后；
图3是本发明的实施例3结果示意图(Western Blot)
其中：1-对照组(MOCK)
2-HCMV(MOI 0.01)接种4小时后
3-HCMV(MOI 0.01)接种24小时后
4-HCMV(MOI 0.01)接种48小时后
5-HCMV(MOI 0.01)接种72小时后
6-RES(20μM)+HCMV接种4小时后
7-RES(20μM)+HCMV接种24小时后
8-RES(20μM)+HCMV接种48小时后
9-RES(20μM)+HCMV接种72小时后；
图4是本发明的实施例3结果示意图(Q-PCR)
其中：纵坐标—HCMV DNA拷贝数
横坐标—MOI 0.01的HCMV接种后天数(d.p.i)
具体实施方式
本发明所涉及的WI-38细胞和人巨细胞病毒(HCMV)Towne株来自于美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)。
实施例1：HCMV侵染WI-38细胞诱导线粒体含量增加，具体操作步骤如下：
(1)细胞培养和HCMV接种方法
采用30PD的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38，用10％FBS的培养基按2×104/cm2接种至培养皿中，24小时后更换0.2％FBS的培养基继续培养48小时，通过此种血清饥饿的方法，细胞此时G0/G1同步化，更有利于HCMV的侵染。之后进行HCMV病毒(Towne病毒株)的接种，接种量为0.01MOI(感染复数)，继续培养至指定时间进行相关检测。
(2)测定HCMV侵染后WI-38细胞线粒体数量
线粒体内膜心磷脂(CL)是一种线粒体的特异性成分，荧光探针壬基吖啶橙(NAO)能够特异性地与CL结合，进而应用流式细胞术方法检测细胞内线粒体数量的变化，是一个检测线粒体数量的有效指标。方法如下：上述HCMV侵染的WI-38细胞经胰酶消化收集后，加入预冷的PBS缓冲液将细胞吹打成单个细胞，300g离心5分钟，PBS洗两遍，用约500μl的PBS重悬细胞，加入5ml预冷的70％乙醇，4℃固定过夜。检测前PBS洗两遍，沉淀细胞重悬于1ml的PBS中，加入终浓度为10μM的NAO染色液，常温避光染色10min，PBS洗涤两次，细胞经300目尼龙网过滤后，流式细胞仪测定NAO荧光强度(λex 494nm，λem 519nm)，每管计数5000-10000个细胞，采用CELL QuestPro进行数据分析。NAO荧光强度与线粒体数量成正比。0.01MOI的HCMV可以时间依赖的上调WI-38细胞中的线粒体含量(图1)，在接种后的2天、3天、4天和5天后分别上调至对照组(设为100％)的121.5％±3.9％、139.3％±6.4％、189.02％±16.9％和224.1±11.2％。
实施例2：白藜芦醇抑制HCMV侵染后WI-38细胞内线粒体含量的增加
白藜芦醇(RES)是文献报道具有抗HCMV活性的一种药物(Antiviral Res.2004,63:85-95)，在本实施例中作为抗HCMV的阳性药物，其报道的抑制HCMV常用浓度为20μM。细胞培养和HCMV接种方法同实施例1所述，设立不加HCMV的对照组(MOCK)，只加HCMV组(HCMV)和白藜芦醇试验组(HCMV+RES)，白藜芦醇10μM或20μM于HCMV接种前2小时加入到培养基中，于HCMV接种后3天(3d.p.i.)收集细胞，用于检测WI-38细胞内线粒体含量，检测方法同实施例1所述。结果见图2，HCMV诱导的线粒体含量增加可以被白藜芦醇(RES)显著抑制，表明在本实验体系中白藜芦醇具有良好的潜在抗HCMV活性。按照公式：线粒体增量抑制率＝[1-(试验组-对照组)/(HCMV组-对照组)]*100％计算，10μM、20μM白藜芦醇的线粒体增量抑制率分别为78.28％±3.72％和89.58％±2.27％，因此其IC50<10μM，与文献报道相符(Antiviral Res.2004,63:85-95)。
实施例3：白藜芦醇显著抑制HCMV相关蛋白表达和DNA复制
MTT检测表明，白藜芦醇对WI-38细胞的半数中毒浓度(TD50)约为100μM，因此其治疗指数(TI)＝TD50/IC50>10，表明其在本实验体系中具有良好的潜在抗HCMV活性。为进一步确认白藜芦醇(RES)在本实验体系中的抗HCMV作用，我们检测了白藜芦醇对HCMV立即早期蛋白(IE)的表达以及DNA扩增的抑制作用。细胞培养和HCMV接种方法同实施例1所述，设立不加HCMV的对照组(MOCK)，只加HCMV组(HCMV)和白藜芦醇试验组(HCMV+RES)，白藜芦醇20μM于HCMV接种前2小时加入到培养基中，于HCMV接种后不同时间点收集细胞，进行Western Blot检测HCMV的IE蛋白表达以及qPCR检测HCMV DNA拷贝数。
(1)WesternBlot检测HCMV相关分子表达
细胞经细胞刮刀收集，采用RIPA裂解液裂解细胞后，收集蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，制备分析样品。应用相应抗体，采用Western Blot法测定HCMV立即早期蛋白IE。实验结果见图3，HCMV的IE蛋白表达(86kd，72kd，38kd)可以被20μM白藜芦醇(RES)显著抑制，证明了白藜芦醇在本实验体系中的抗HCMV作用，通过image J软件分析条带的光密度值后进行计算，RES在HCMV接种后72小时对IE蛋白表达的抑制率为95.89％±0.56％，与白藜芦醇对HCMV诱导的线粒体增量抑制率非常接近，进一步确认了本方法的有效性。
(2)qPCR测定HCMV DNA拷贝数
细胞培养至指定时间，采用Qiagen Mini-DNA Kit提取基因组DNA。取10ng总DNA，按照iQ SYBR Green Supermix kit(Bio-Rad)试剂盒说明进行，所用引物为：上游5′-TCTGCCAGGACATCTTTCTC-3′和下游5′GTGACCAAGGCCACGACGTT-3′。扩增条件：95℃5min，(95℃5sec+60℃30sec)×40循环。实验结果见图4，HCMV的DNA扩增可以被白藜芦醇(RES)显著抑制，证明了RES在本实验体系中的抗HCMV作用。按照公式：药物的HCMV DNA抑制率＝[1-(试验组对照组)/(HCMV组-对照组)]*100％，经计算20μM白藜芦醇的HCMV DNA扩增抑制率在接种后4天和7天分别为88.28％和93.73％，与白藜芦醇对HCMV诱导的线粒体增量抑制率一致。该结果进一步确认了白藜芦醇在本实验体系中的抗HCMV活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种筛选抗人巨细胞病毒(HCMV)药物的方法，其特征在于其主要测定指标是药物对HCMV诱导的线粒体增加的抑制作用，通过计算药物对HCMV诱导的线粒体增量抑制率，反映药物的抗HCMV作用。
2.如权利要求1所述的一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法，其特征在于采用0.01MOI的HCMV Towne株侵染28PD-35PD的WI-38细胞，采用壬基吖啶橙(NAO)染色后通过流式细胞仪进行测定线粒体含量，进而计算线粒体增量抑制率判断药物的抗HCMV作用。
3.如权利要求1所述的一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)细胞和病毒的培养：用10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO2条件下传代培养人胚肺二倍体成纤维细胞，将人巨细胞病毒Towne株接种于上述细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存；
2)HCMV接种及药物干预：采用30PD的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38，用10％FBS的培养基按2×104/cm2接种至培养皿中，24小时后更换0.2％FBS的培养基继续培养48小时，之后进行HCMV病毒的接种，接种量为0.01MOI，设立加灭活HCMV的对照组，只加HCMV组和待测药物试验组，待测药物于HCMV接种前2小时加入到培养基中，于HCMV接种后指定时间进行相关检测；
3)测定HCMV侵染后WI-38细胞线粒体数量：上述HCMV侵染的WI-38细胞经胰酶消化收集后，加入预冷的PBS缓冲液将细胞吹打成单个细胞，300g离心5分钟，PBS洗两遍，用500μl的PBS重悬细胞，加入5ml预冷的70％乙醇，4℃固定过夜，检测前PBS洗两遍，沉淀细胞重悬于1ml的PBS中，加入终浓度为10μM的NAO染色液，常温避光染色10min，PBS洗涤两次，细胞经300目尼龙网过滤后，流式细胞仪测定NAO荧光强度，每管计数5000-10000个细胞，采用CELLQuest Pro进行数据分析，NAO荧光强度与线粒体数量成正比；
4)线粒体增量抑制率的计算：
设对照组，单独HCMV组及HCMV+检测药物组，以流式细胞仪测得的NAO荧光强度，按下述公式计算，线粒体增量抑制率＝[1-(试验组-对照组)/(HCMV组-对照组)]*100％，以50％线粒体增量抑制率表示半数抑制浓度IC50<1mg/ml者为抗HCMV潜在活性药物；
5)治疗指数TI的计算：
对于上述获得的潜在阳性药物，采用MTT法检测其细胞毒活性，计算半数中毒浓度TD50，进而计算治疗指数TI＝TD50/IC50，取TI>10为候选物，进行抗HCMV活性的进一步验证，药物的细胞毒活性采用MTT法检测，方法如下：成纤维细胞以每孔3000个接种于96孔培养板中，培养24小时后加入含抑制HCMV DNA复制活性对应浓度的药物，每一浓度设6个平行孔，并设有不加药物的空白对照组和无细胞的溶解对照组，培养3d后,每孔加入20μl MTT，37℃、5％CO2条件下培养4小时，小心洗净孔内液体，每孔加150μl DMSO，在摇床上轻轻振荡10min,使结晶物充分溶解，而后于570nm处测定光吸收度，细胞存活率％＝(加药细胞OD-本底OD)/(对照细胞OD-本底OD)×100％，每检测点取3个平行孔的平均值，绘制抑制曲线，计算TD50值；
6)药物抗HCMV活性的验证：
(a)WesternBlot检测HCMV相关分子表达：
采用细胞刮刀收集细胞，采用RIPA裂解液裂解细胞后，收集蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，制作上样缓冲液，应用相应抗体，采用Western Blot法测定HCMV立即早期蛋白IE1/2等，Image J分析辉度值，进行半定量分析。
(b)qPCR测定HCMV DNA拷贝数：
收获细胞，采用Qiagen Mini-DNAKit提取基因组DNA，取10ng总DNA，按照iQ SYBRGreen Supermix kit试剂盒说明进行，所用引物为：上游5′-TCTGCCAGGACATCTTTCTC-3′和下游5′GTGACCAAGGCCACGACGTT-3′，扩增条件：95℃5min，(95℃5sec+60℃30sec)X 40循环，qPCR仪：CFX96C1000Touch Real-Time PCR System Detector。
4.如权利要求1至3中任意一项所述方法在药物筛选中的应用。
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