CN101319202A - HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HCMV－Towne－GFP重组巨细胞病毒，其制备方法为：用脂质体转染法将US9－US10位点之间插入有绿色荧光蛋白基因的PHM673质粒插入到人类巨细胞病毒基因组中，方法操作简便，结果客观可靠；本发明还公开了该重组病毒的应用：可以应用于筛选抗巨细胞病毒药物中，通过检测绿色荧光蛋白的表达来判断药物的作用，具有灵敏、快速、准确、有效的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒及其制备方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是在自然界普遍存在的一种疱疹病毒，是严重威胁新生儿健康的主要致畸病毒之一。由于近年来免疫抑制患者如骨髓移植、器官移植、艾滋病人的增多，巨细胞病毒感染日益受到重视。目前用于治疗HCMV感染的有效药物不多，而且常用的药物存在口服用药生物效价低，药效差，具有一定的毒性以及耐药毒株的问题。
随着医药基础理论的不断前进，基因工程技术的不断发展，新的抗病毒药不断出现。新的抗病毒药物的不断开发，自然需要快速有效的药物筛选方法。细胞病变效应法(CytopathicEffect，CPE法)是测定病毒生存情况的有效方法，常被用作药物抗病毒活性的体外检测模型，该方法结果是肯定的，但实验周期长，操作复杂。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒，将绿色荧光蛋白基因插入到病毒基因组中，在进行抗巨细胞病毒的药物筛选时，可以通过检测绿色荧光蛋白的表达来判断药物的作用，具有操作简便、结果客观可靠、快速有效等优点。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒，包括人类巨细胞病毒基因组和US9-US10位点之间插入有绿色荧光蛋白基因的PHM673质粒。
所述的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)细胞和病毒的培养：用含10％小牛血清的1640培养液，在37℃、5％CO2孵箱中传代培养人胚肺细胞；将人巨细胞病毒Towne标准毒株接种于上述人胚肺细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存；
(2)质粒的转化：用PHM673质粒转化感受态大肠杆菌细胞，得到转化子；然后进行质粒的中量抽提，在紫外分光光度计上测量获得的产物的DNA含量，并进行电泳鉴定质粒，然后进行质粒的纯化，获得纯化的PHM673质粒；
(3)病毒重组：①脂质体转染及转化克隆重组病毒的获得：脂质体转染24小时后去掉培养液，将0.2ml HCMV-Towne标准毒株加入细胞培养孔，32～35℃吸附1小时，增加培养基的体积至2ml，在5％CO2、37℃孵箱中孵育24小时；换用含G418(200ug/ml)的选择培养基继续培养，以后每隔3天换一次选择培养基，用反复冻融法收集病毒液，-80℃或液氮保存；②重组病毒空斑的纯化：接种人胚肺细胞在12孔板中，用上述病毒液感染人胚肺细胞，37℃、5％CO2孵育8～12天，荧光倒置显微镜观察，将荧光阳性孔挑出，即为转染成功的重组病毒，转移至新的人胚肺细胞中增殖。
所述的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒在抗巨细胞病毒药物筛选中的应用：在进行抗巨细胞病毒的药物筛选时，用本发明的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒感染宿主细胞，然后在药物的作用下培养繁殖，检测绿色荧光蛋白的表达，即代表病毒的表达情况，以此来判断药物的作用，具有灵敏、快速、准确、有效的特点。
本发明利用分子生物学方法，构建了表达绿色荧光蛋白的巨细胞病毒，可应用于抗巨细胞病毒的药物筛选，通过检测绿色荧光蛋白的表达来判断药物的作用，具有方法操作简便，结果客观可靠等优点，这也为药物的常规应用和试验研究开辟了一条新的途径，并可进一步用于巨细胞病毒发病机制和致畸机制的研究。
附图说明
图1为PHM673质粒的模式图；
图2为PHM673质粒的电泳图；
其中，I为λ-HindIII Marker，II1-II5为5个不同的转化子提取质粒后的电泳结果；II为PHM673质粒DNA用NheI酶切后的的电泳结果；
图3为HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒感染HELF后第3、5、7、9、11天的感染状态图；
其中，(A)为第3天，(B)为第5天，(C)为第7天，(D)为第9天(E)为第11天；
图4为野生型HCMV与重组HCMV-GFP通过PCR扩增后电泳鉴定结果图；
其中，A、B为重组病毒扩增产物，C为野生型病毒扩增产物，D为Marker15000；
图5为HCMV-Towne与HCMV-Towne-GFP子代病毒滴度的比较；
图6为实施例2中随药物浓度变化荧光蛋白表达量的变化图；其中，从左到右代表药物浓度逐渐变小。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1：制备HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒，步骤如下：
(1)细胞和病毒的培养：用含10％小牛血清的1640培养液，在37℃，5％CO2孵箱中传代培养人胚肺细胞；将人巨细胞病毒Towne标准毒株接种于上述人胚肺细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存。
(2)质粒的转化：先用大肠杆菌DH5α制备感受态细胞，然后用PHM673质粒转化感受态大肠杆菌细胞，得到转化子；然后进行质粒的中量抽提，在紫外分光光度计上测量获得的产物的DNA含量，并进行电泳鉴定质粒(如图2所示)，然后进行质粒的纯化，获得纯化的PHM673质粒。
(3)病毒重组：①脂质体转染及转化克隆重组病毒的获得：脂质体转染24小时后去掉培养液，将0.2ml HCMV-Towne标准毒株加入细胞培养孔，32～35℃吸附1小时，增加培养基的体积至2ml，在5％CO2、37℃孵箱中孵育24小时；换用含G418(200ug/ml)的选择培养基继续培养，以后每隔3天换一次选择培养基，用反复冻融法收集病毒液，-80℃或液氮保存；②重组病毒空斑的纯化：接种人胚肺细胞在12孔板中，用上述病毒液感染人胚肺细胞，37℃、5％CO2孵育8～12天，荧光倒置显微镜观察，将荧光阳性孔挑出，即为转染成功的重组病毒，转移至新的人胚肺细胞中增殖，结果如图3所示。
(4)进一步鉴定：先提取病毒DNA，然后对病毒DNA进行PCR扩增，反应条件：94℃，预变性10分钟，94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸3分30秒，反应进行30个循环，最后延伸20分钟，终止反应；对PCR反应产物进行电泳鉴定，结果如图4所示，重组病毒于3500kb处、标准株于312kb处出现扩增条带，与预期结果相符。
(5)HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒的复制能力及感染活性的检测：用空斑法检测病毒的滴度，比较巨细胞病毒标准株与重组病毒株复制的特点；用Reed-Muench法分别测定巨细胞病毒Towne标准株与重组巨细胞病毒Towne-GFP株的TCID50，比较巨细胞病毒标准株与重组病毒株的感染活性。结果如图5所示：与HCMV标准株相比，重组病毒的复制能力和致细胞病变的能力没有统计学差异。
其中，人巨细胞病毒Towne标准株(参考文献：人巨细胞病毒UL131A，UL130，UL128基因在先天感染患儿临床株中的变异，武汉大学学报)由湖南师范大学生命科学学院陈则教授馈赠，大肠杆菌DH5α购自上海杰美基因医药有限公司、人胚肺成纤维细胞(Human embryoniclung fibroblast，HELF)购自中国科学院细胞库，绿色荧光蛋白表达的重组质粒PHM673质粒(构建过程请参考文献：Recombinant Green Fluorescent Protein-Expressing Human Cytomegalovirusas a Tool for Screening Antiviral Agents，ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPYJune 2000，p.1588-1597)由德国Erlangen-Nürnberg大学临床与分子病毒学研究所ManfredMarschall博士馈赠，US9-US10位点之间含有绿色荧光蛋白基因，如图1所示。RPMI 1640细胞培养基为GIBCO BRL公司产品；新生牛血清、胎牛血清为杭州四季青公司产品；转染试剂脂质体2000(LipofectamineTM 2000)、G418和无血清培养基Opti-MEM均为Invitrogen公司产品；限制性内切酶Nhe I和PCR扩增试剂盒购自宝生物工程有限公司；质粒小量中提试剂盒购自北京天为时代，质粒纯化试剂盒购自安徽优晶，病毒DNA小量抽提试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品，含LATaq酶，2×GC Buffer，dNTPs；DNAMarker：λDNAHindIII为上海生工生物技术公司产品；更昔洛韦粉针剂50mg/支，购自湖北科益药业股份有限公司，用时加入1ml生理盐水溶解，配制成50mg/ml溶液。
实施例2：HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒在抗病毒药物筛选中的应用：步骤如下：(以抗病毒常用药物更昔洛韦为例)
(1)细胞和病毒的培养：人胚肺细胞(HELF)用含10％小牛血清的1640培养液，37℃，5％CO2孵箱中传代培养；HCMV-Towne-GFP重组病毒接种于HELF细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存。
(2)更昔洛韦细胞毒性测定：取更昔洛韦(50mg/ml)0.1ml，用含2％小牛血清的1640培养液进行对比稀释(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128)，将各稀释度的药液接种于已制备好的HELF细胞，每孔200μl，每一稀释度重复4孔，正常细胞对照组以培养液替代药液，继续培养48h。观察药物对细胞贴壁及生长情况的影响，以细胞病变为指标，计算药物对HELF细胞的半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。
(3)绿色荧光检测：将HELF细胞接种于96孔板，加入HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒液，20μl/孔，吸附1小时，每个稀释度设4个复孔。1小时后加入更昔洛韦液(以最大无毒浓度为起点进行对比稀释)，20μl/孔，作用1小时。1640培养液补至200μl，37℃，5％CO2孵箱培养。3天后，即可在荧光倒置显微镜下直接观察绿色荧光的表达量，并检测荧光强度，如图6所示，在荧光倒置显微镜下观察到：随着药物浓度的降低，重组病毒所表现的荧光逐渐增强。
(4)对更昔洛韦药效的评价：根据以上结果检测病毒的抑制率，最小有效浓度，治疗指数等。
经检测更昔洛韦的TD50为200μg/ml，TD0为100μg/ml，最小有效浓度(MTC)为12.5μg/ml，治疗指数(TI)为8。
Claims (3)
1.一种HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒，其特征在于：包括人类巨细胞病毒基因组和US9-US10位点之间插入有绿色荧光蛋白基因的PHM673质粒。
2.根据权利要求1所述的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)细胞和病毒的培养：用含10％小牛血清的1640培养液，在37℃，5％CO2孵箱中传代培养人胚肺细胞；将人巨细胞病毒Towne标准毒株接种于上述人胚肺细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存；
(2)质粒的转化：用PHM673质粒转化感受态大肠杆菌细胞，得到转化；然后进行质粒的中量抽提，在紫外分光光度计上测量获得的产物的DNA含量，并进行电泳鉴定质粒，然后进行质粒的纯化，获得纯化的PHM673质粒；
(3)病毒重组：①脂质体转染及转化克隆重组病毒的获得：脂质体转染24小时后去掉培养液，将0.2ml HCMV-Towne标准毒株加入细胞培养孔，32～35℃吸附1小时，增加培养基的体积至2ml，在5％CO2、37℃孵箱中孵育24小时；换用含200ug/ml G418的选择培养基继续培养，以后每隔3天换一次选择培养基，用反复冻融法收集病毒液，-80℃或液氮保存；②重组病毒空斑的纯化：接种人胚肺细胞在12孔板中，用上述病毒液感染人胚肺细胞，37℃、5％CO2孵育8～12天，荧光倒置显微镜观察，将荧光阳性孔挑出，即为转染成功的重组病毒，转移至新的人胚肺细胞中增殖。
3.根据权利要求1所述的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒在抗巨细胞病毒药物筛选中的应用。
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