CN112359139A - 利用组织半数感染法染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用组织半数感染法染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法，本发明以PG4细胞作为检测X‑MuLV的指示细胞，用TCID50 assay结合结晶紫染色法准确定量测定X‑MuLV病毒的滴度，步骤有：将病毒进行连续稀释；将不同稀释度的病毒加入细胞孔中；在孔板中的每个孔内加入细胞生长液，转移入细胞培养箱中培养5至7天；终止培养，染色，读取CPE孔数；计算病毒滴度。本发明能够克服空斑测定法操作工序多的缺点，操作起来更加便捷；同时结合细胞染色，可有效避免显微镜观察细胞病变效应时不同人员的主观误差，且具有灵敏度强、背景清晰、稳定性好，可重复性强等优点。

Description

利用组织半数感染法染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的 方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种利用组织半数感染法(TCID50assay)染色测定异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropic murine leukemia virus,X-MuLV)滴度的方法，可以应用于病毒清除/灭活验证研究。
背景技术
近几年，在国家政策支持下，生物健康产业发展迎来机遇。总体而言，中国生物制药产业发展前景看好，未来5-10年内将保持平稳增长的良好发展势头。随着预防治疗性疫苗、基因治疗、免疫细胞治疗、干细胞治疗和细胞再编程诱导多能干细胞(iPS)等前沿领域的发展与突破，生物制药行业将进入新一轮快速发展期。但是，这些生物制品多是源于微生物、细胞、动物或人源组织和体液等生物体，这些起始原材料或辅料潜在的病毒污染毫无疑问将对产品安全性产生关键影响。以最常见的CHO细胞蛋白表达系统为例，CHO细胞常表达内源性逆转录病毒样颗粒，在细胞上清中通常可检测到103～109/mL逆转录病毒样颗粒而且CHO细胞在培养过程中有可能发生外源性病毒污染(N Engl J Med 306:1423；Dev BiolStand 93:21–29)。因此，各国药监机构都要求临床试验前和生产阶段前的申报材料中，必须经过病毒清除/灭活验证研究，以确保不会出现病毒污染，保证患者的用药安全。
病毒清除/灭活验证研究通过添加指示病毒来评估纯化工艺各个步骤的清除/灭活能力，指示病毒用来衡量病毒清除/灭活的效果，美国、欧盟等药监机构官员及病毒学领域的科学家建议，在病毒清除/灭活验证过程中采用的病毒包含以下四种特性：“单链和双链的RNA及DNA、脂包膜和非脂包膜、强和弱抵抗力、大和小颗粒等”。
异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropic murine leukemia virus,X-MuLV)是一种具有包膜的逆转录病毒，基因组为单链RNA，病毒大小80-110nm，CHO细胞中内源性病毒样颗粒以及其他囊膜病毒的模型病毒。
对于病毒的定量测定，常见的方法包括噬斑法、组织半数感染量终点滴定法、酶联免疫法、荧光定量PCR法以及其他光学检测法。
荧光定量PCR法是通过提取样品中的RNA，利用反转录荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测X-MuLV的特异性基因来间接的定量病毒(CN201810720390.8；Naturebiotechnology.1993,11:1042-1046；US81889310A)。但该类方法主要是通过特异性的扩增病毒的保守序列来间接的定量病毒，因为这种方法检测的是病毒的某段序列，其检测结果并不能反映病毒的感染活性。
噬斑法是一种经典的病毒定量方法，利用噬斑测定X-MuLV病毒和其他MuLV病毒的文献均发表于数十年前，相关方法描述较为简单，所用细胞系亦不具备推广价值，因此应用价值较低(Virology.1977,77(2):849-852；Journal of virology.1974,14(1):177-179；Journal of virology.1977,23(2):436-438)。
酶联免疫法的基本原理是抗原抗体反应，首先制备病毒的特异性抗体，并将抗体与酶复合物结合，病毒特异性抗体与病毒抗原发生特异性反应，通过酶催化的显色反应对病毒进行定量。该方法需要制备特异性抗体，价格昂贵，此外，利用此方法测定的病毒包括复制缺陷型病毒，存在高估的可能，无法真实反应病毒的感染活性。
组织半数感染量终点滴定法作为经典的病毒滴度测定方法，一直广为使用，基本方法是：病毒按照倍比稀释或梯度稀释后接种细胞，培养3-8天，在显微镜下观察CPE情况，判定各孔是否感染。该方法需要寻找合适的指示细胞，病毒需要能够感染该细胞，并使细胞出现明显的CPE，操作人员依据经验判断感染与否，因此主观和经验因素对检测结果的影响较大。如何通过有效的手段来减少主观因素对检测结果的影响也是该类方法主要创新方向。目前已有文献报道，利用染料来对细胞进行染色，来减少主观影响。有学者利用噻唑蓝(MTT)—一种检测细胞存活和生长的染料，检测艾滋病毒、流感病毒，但是该方法由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害(Journal ofVirological Methods.1988,20(4):309-321；Journal of Virological Methods.2002,106:71-79)。有学者利用中性红染液改进了用于埃博拉病毒滴度测定的噬斑法和TCID50法。中性红是一种温和的细胞染料，能够对活细胞培养物进行染色，但其着色较浅，染色时间长达数小时且需要避光培养，因此并不适用于商业化应用(Journal of VirologicalMethods.2001,96:107-126)。
通过对中英文专利的检索，暂未发现明确地应用组织半数感染法测定X-MuLV滴度的专利。因此，急需开发出一种适用于病毒清除/灭活研究且行之有效的X-MuLV病毒滴度测定的方法。
本发明期望利用组织半数感染法结合结晶紫染色法准确测定有感染活力的X-MuLV病毒，适用于病毒清除/灭活研究的需要。
针对X-MuLV病毒的定量多采用噬斑计数法、酶联免疫法和定量PCR法来测定病毒的滴度。细胞水平的定量检测，如噬斑测定法(plaque assay)多报道于几十年前，为了克服MuLV病毒的细胞增值问题，多种细胞被用来进行病毒滴度测定，受制于方法上的缺陷，这些方法不宜推广；指示细胞为不常用的细胞株，遗传稳定性无法保障。组织半数感染法作为另一种细胞水平的病毒滴度测定方法同样需要优秀的细胞品系用于X-MuLV病毒的测定，需要满足以下要求：
X-MuLV在指示细胞上易感性强，能够在引起明显的CPE，能够明显的区分病变细胞与正常细胞；在适当的病毒滴度范围内，病毒的滴度与稀释倍数应呈良好的线性关系；测定结果应具有稳定性，不同时间、不同细胞批次、不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性要好，检测灵敏度要高；该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，都符合相关法规要求。
发明内容
本发明公开了一种利用组织半数感染法(TCID50 assay)染色测定异嗜性鼠白血病病毒(X-MuLV)滴度的方法，本发明以猫星形脑胶质细胞(PG4细胞)作为检测X-MuLV的指示细胞，用TCID50 assay结合结晶紫染色法准确定量测定X-MuLV病毒的滴度。本发明能够克服空斑测定法耗时费力，不宜推广以及指示细胞为不常用的细胞株，遗传稳定性无法保障的缺点；同时改进了传统的TCID50 assay，结合细胞染色技术，避免通过显微镜观察主观判定细胞感染与否，有效减少人员间的主观误差，且该方法具有灵敏度强、背景清晰、稳定性好，可重复性强等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种利用组织半数感染法(TCID50 assay)染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法，该方法以PG4作为检测异嗜性鼠白血病病毒X-MuLV的指示细胞，用TCID50 assay对X-MuLV病毒进行滴定并结合结晶紫染色法判断细胞病变，计算病毒的滴度。作为本发明优选的技术方案，该方法包括：
(I)将PG4细胞接种于含细胞培养基的细胞培养孔板中，至细胞汇合度为30％-50％；
(II)将经稀释的多个不同稀释度的X-MuLV病毒分别加入至含PG4细胞的培养孔内；将接种病毒的细胞培养孔板转移入细胞培养箱中，培养5至7天；
(III)细胞出现明显的细胞病变效应(CPE)后终止培养，对细胞进行固定后，加入染色液对细胞进行染色、洗净，晾干细胞培养孔板，并读取每个稀释度出现CPE的孔数，根据Spearman-Kaerber法计算X-MuLV病毒的滴度。
作为本发明优选的技术方案，步骤(I)中，每个培养孔接种1.0×104～1.5×104个细胞。亦可调整接种细胞的数目使病毒接种时培养孔内细胞汇合度达到30％-50％。
作为本发明优选的技术方案，步骤(II)中，对病毒的稀释根据实际情况作10倍或其他合适倍数(常用倍数为3.2倍(0.5log)、2.5倍(0.4log))进行系列稀释。
作为本发明优选的技术方案，步骤(II)中，每个培养孔中加入相同体积的(0.05mL病毒液或其他合适体积)接种量，每个稀释度病毒液做8个复孔。
作为本发明优选的技术方案，步骤(II)中，细胞培养孔板内细胞接种病毒前培养天数不得超过2天，接种前需替换新鲜培养基。
作为本发明优选的技术方案，步骤(II)中，接种病毒后进行培养时，通过封口膜封闭细胞板，避免培养液过度挥发。
作为本发明优选的技术方案，步骤(III)中，细胞染色前，在每个培养孔中加入固定液，覆盖细胞培养孔，放置不少于15分钟，固定细胞板底部细胞。
作为本发明优选的技术方案，步骤(III)中，所述染色液为0.5％结晶紫溶液。
作为本发明优选的技术方案，本发明所涉及到的试剂溶液配方如下：
步骤(I)中，所述细胞培养基为McCoy’s 5A完全培养基；
步骤(II)中，所述稀释液为HEPES buffered EMEM(HEPES终浓度0.25M)；
步骤(II)中，所述新鲜培养基为McCoy’s 5A完全培养基。
所述异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropic murine leukemia virus,X-MuLV)是常用的指示病毒之一。X-MuLV是一种具有包膜的逆转录病毒，基因组为单链RNA，病毒大小80-110nm，是CHO细胞常见的内源性病毒，通常作为鼠源细胞逆转录病毒的模型病毒。
本发明使用了猫星形脑胶质细胞(PG4细胞)作为检测X-MuLV的指示细胞，以下称为PG4细胞(该细胞系遗传背景清晰、细胞性状稳定、可传多代)，用组织半数感染法准确定量测定X-MuLV病毒的滴度，单位为TCID50/mL(TCID50定义为半数组织细胞感染剂量)。X-MuLV病毒感染PG4细胞，PG4细胞因病毒感染产生细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)。这种方法所测定的不是病毒颗粒的数目，而是病毒感染反应的有无，严格来说是一种定性检测法，而病毒感染反应的有或无与病毒颗粒数目之间存在定量关系，且该法灵敏度高，重复性好，所以广泛用于病毒的定量测定。
本发明的有益效果在于：
1.指示细胞PG4被X-MuLV病毒感染后，PG4细胞在显微镜下显示出明显的CPE，结晶紫染色后呈现显著区别于未感染细胞的染色形态，相对于显微镜观察，染色更有助于统一判断标准，减少人员主观因素带来的误差。
2.通过控制变量，验证X-MuLV感染PG4细胞的组织半数感染法测定的稳定性与可重复性，结果表明，在不同时间、不同细胞批次和不同操作人员的情况下，用该方法测定的X-MuLV病毒滴度没有显著差异，绘制的标准曲线具有良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强。
3.本方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，符合相关法规要求，说明该方法能够应用于病毒清除/灭活验证研究中异嗜性鼠白血病病毒滴度的测定。
4.本方法详细描述了以PG4细胞作为指示细胞，X-MuLV病毒的组织半数感染法染色测定病毒滴度的方法，为其他需要用于病毒清除/灭活验证研究的机构提供了良好的参考依据，同时也为MuLV其他亚型的病毒滴度测定提供可借鉴的实验方法。
附图说明
图1是本发明典型的X-MuLV组织半数感染法细胞图。
图2是本发明实施例二中PG4细胞空斑测定X-MuLV病毒滴度的标准曲线。
图3是本发明实施例三中不同时间和隔天进行X-MuLV的组织半数感染法线性关系。
图4是本发明实施例四中X-MuLV病毒感染3个批次PG4细胞的空斑测定线性关系。
图5是本发明实施例五中不同实验操作者的X-MuLV空斑测定的线性关系。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一组织半数感染法染色测定X-MuLV病毒滴度具体实施方法
将X-MuLV病毒解冻后，经超声和过滤处理后用病毒稀释液对病毒进行系列稀释，根据实际情况做3.2倍系列稀释(0.5log)。
将PG4细胞接种于细胞培养96孔板中，每个细胞孔接种1.0×104～1.5×104个细胞，在37℃，5％CO2培养条件下进行细胞培养，至第二天观察细胞，至细胞汇合度为30％-50％可进行后续操作。亦可调整接种细胞的数目，使细胞汇合度在30％-50％左右。
对病毒进行连续3.2倍稀释至3.2-14稀释度，将制备好的不同稀释度的X-MuLV病毒去感染PG4细胞：吸去细胞培养基，加入50μL病毒液后加入新鲜培养基200μL至每个细胞孔，每个稀释度病毒液做8个复孔。将接种病毒的细胞板立即转移入细胞培养箱中，培养6天。
待细胞出现明显的CPE后，终止培养，在每孔细胞中加入适量多聚甲醛固定试剂，使其充分覆盖细胞培养孔。多聚甲醛能够将细胞板底部的细胞固定。作用时间应不少于15分钟，随后轻轻去除固定液，在细胞中加入适量0.5％结晶紫溶液对细胞进行染色。染色3分钟后，弃去结晶紫溶液，用清水洗净细胞。在通风橱中晾干细胞培养96孔板，并在白光透射仪下观察记录出现CPE的细胞孔，记录阳性比例后，计算病毒滴度。图1为本发明典型的X-MuLV组织半数感染法实例图片。
实施例二：X-MuLV组织半数感染法的线性及范围
按照实施例一的操作流程，实验操作人员进行了三组独立的系列稀释，每个系列稀释包含5个不同的稀释因子，并计算各个稀释系列的病毒滴度：绘制标准曲线、计算线性相关系数、确定病毒检测范围，标准曲线和线性相关系数结果见图2。
由图2可知，在所测的病毒滴度范围内，三组独立的系列稀释的标准曲线具有良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强。
实施例三：同一操作人员在不同时间进行X-MuLV病毒感染PG4细胞实验的比较
按照实施例一的操作流程，同一位实验人员分别在同一天的不同时间和隔天进行X-MuLV的滴度测定实验，每次实验做三组重复，每组做八个复孔，实验结果如图3所示。
实验结果：三个时间点的X-MuLV病毒感染PG4细胞，在不同的稀释因子下，均呈现出良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强。
实施例四：X-MuLV病毒感染3个不同批次PG4细胞的比较
按照实施例一的操作流程，同一批次X-MuLV病毒感染3个不同批次的PG4细胞，每个批次细胞做三组重复，每组做八个复孔。实验结果如图4所示。
由图4可知，3批次细胞之间没有显著差异，3批细胞在不同的稀释因子下均呈现出良好的线性关系。
实施例五：不同实验操作者的比较
按照实施例一的操作流程，两位实验操作者Operator 1和Operator 2分别独立进行实验，每个操作者做三组重复，每组做八个复孔实验结果如图5所示。
由图5可知，Operator 1和Operator 2无显著差别，两个操作人员在不同的稀释因子下均呈现出良好的线性关系。
实施例六X-MuLV病毒滴度的统计分析
按照实施例一的操作流程，两位实验操作人员Operator 1和Operator 2参与实验。共进行了十五组独立的系列稀释实验，Operator 1完成九组独立系列稀释实验，Operator 2完成六组独立系列稀释实验，对此十五组实验结果进行统计分析，具体包括：准确度、线性、测定范围、定量限、重复性和中间精密度等数据，结果如下表所示：
分析参数 统计参数，单位 数值
准确度 ％ 97％-104％
线性 Coefficient of Determination，R<sup>2</sup> 0.95
范围 TCID<sub>50</sub>/mL 11.2
定量限 TCID<sub>50</sub>/mL 7.5
重复性 95％置信区间(Log<sub>10</sub> titer) 0.26
中间精密度 95％置信区间(Log<sub>10</sub> titer) 0.24
以上结果表明，以PG4细胞为指示细胞用TCID50 Assay染色测定X-MuLV病毒滴度的方法，符合FDA，ICH和USP相关GLP法规要求，能够用于病毒清除/灭活验证研究中。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种利用组织半数感染法染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法，其特征在于：
所述方法以猫星形脑胶质细胞作为检测X-MuLV的指示细胞，用TCID50 assay对X-MuLV病毒进行滴定并结合结晶紫染色法判断细胞病变，计算病毒的滴度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括：
(I)将PG4细胞接种于含细胞培养基的细胞培养孔板中，至细胞汇合度为30-50％；
(II)将经稀释的多个不同稀释度的X-MuLV病毒加入至含PG4细胞的培养孔内；将接种病毒的细胞培养孔板转移入细胞培养箱中，培养5至7天；
(III)待细胞出现明显的细胞病变效应后终止培养，对细胞进行固定后，加入染色液对细胞进行染色、洗净，晾干细胞培养孔板，并读取每个稀释度出现细胞病变效应的孔数，根据Spearman-Kaerber法计算X-MuLV病毒的滴度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，每个细胞孔接种1.0×104～1.5×104个细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(II)中，对病毒的稀释根据实际情况作10倍、3.2倍、或2.5倍进行系列稀释。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(II)中，每个培养孔中加入相同体积的接种量，每个稀释度病毒液做8个复孔。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(II)中，细胞培养孔板内细胞接种病毒前培养天数不得超过2天，接种前需替换新鲜培养基。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(II)中，接种病毒后进行培养时，通过封口膜封闭细胞板。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(III)中，细胞染色前，向每个培养孔中加入固定液，覆盖细胞培养孔，放置不少于15分钟，固定细胞板底部细胞。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(III)中，所述染色液为0.5％结晶紫溶液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述固定液为甲醛溶液。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述细胞培养基为McCoy’s5A完全培养基；步骤(II)中，稀释X-MuLV病毒用的稀释液为HEPES buffered EMEM；步骤(II)中，所述新鲜培养基是McCoy’s 5A完全培养基。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113957171A (zh) * 2021-10-26 2022-01-21 苏州药明检测检验有限责任公司 一种组织半数感染法染色测定伪狂犬病毒滴度的方法
CN114107557A (zh) * 2021-10-26 2022-03-01 苏州药明检测检验有限责任公司 一种组织半数感染法染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法
CN114107558A (zh) * 2021-10-26 2022-03-01 苏州药明检测检验有限责任公司 一种组织半数感染法染色测定鼠细小病毒滴度的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105420413A (zh) * 2015-12-30 2016-03-23 苏州药明康德检测检验有限责任公司 逆转录病毒检测方法
CN108342368A (zh) * 2018-01-25 2018-07-31 武汉珈创生物技术股份有限公司 一种低pH孵育病毒灭活的验证方法
CN108531662A (zh) * 2018-07-02 2018-09-14 苏州良辰生物医药科技有限公司 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法
CN109669032A (zh) * 2018-12-25 2019-04-23 苏州药明康德检测检验有限责任公司 一种固定细胞的方法及细胞固定试剂

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105420413A (zh) * 2015-12-30 2016-03-23 苏州药明康德检测检验有限责任公司 逆转录病毒检测方法
CN108342368A (zh) * 2018-01-25 2018-07-31 武汉珈创生物技术股份有限公司 一种低pH孵育病毒灭活的验证方法
CN108531662A (zh) * 2018-07-02 2018-09-14 苏州良辰生物医药科技有限公司 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法
CN109669032A (zh) * 2018-12-25 2019-04-23 苏州药明康德检测检验有限责任公司 一种固定细胞的方法及细胞固定试剂

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANWARUZZAMAN M等: "Evaluation of infectivity and reverse transcriptase real-time polymerase chain reaction assays for detection of xenotropic murine leukemia virus used in virus clearance validation", 《BIOLOGICALS》 *
李文淼;张洋;王伟;: "杨梅素体外抗EV71病毒作用的研究" *
胡勇;俞海洋;刘伯玉;赵俊;汤仁树;陈伟;沈杭;梅杨;王明丽;: "两种细胞株检测重组犬α-干扰素效价的比较" *
雷存科;陈中元;张奇亚;: "三种水生动物细胞系对两株蛙病毒敏感性的比较" *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113957171A (zh) * 2021-10-26 2022-01-21 苏州药明检测检验有限责任公司 一种组织半数感染法染色测定伪狂犬病毒滴度的方法
CN114107557A (zh) * 2021-10-26 2022-03-01 苏州药明检测检验有限责任公司 一种组织半数感染法染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法
CN114107558A (zh) * 2021-10-26 2022-03-01 苏州药明检测检验有限责任公司 一种组织半数感染法染色测定鼠细小病毒滴度的方法
CN114107557B (zh) * 2021-10-26 2024-02-06 苏州药明检测检验有限责任公司 一种组织半数感染法染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法
CN114107558B (zh) * 2021-10-26 2024-03-15 苏州药明检测检验有限责任公司 一种组织半数感染法染色测定鼠细小病毒滴度的方法

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