CN113957171A - 一种组织半数感染法染色测定伪狂犬病毒滴度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组织半数感染法染色测定伪狂犬病毒滴度的方法，所述方法以非洲绿猴肾成纤维细胞即CV‑1细胞作为检测伪狂犬病毒即PrV病毒的指示细胞，采用组织半数感染法对伪狂犬病毒进行滴定，再结合结晶紫染色法判断细胞病变效应，最终计算得出病毒的滴度。本发明提供的测定方法利用组织半数感染法结合结晶紫染色法来判断细胞病变效应，能够简单直观的观察到细胞情况，有效降低实验人员镜下观察的主观性影响，同时本方法稳定性良好，不同时间和不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性好。

Description

一种组织半数感染法染色测定伪狂犬病毒滴度的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种组织半数感染法染色测定伪狂犬病毒滴度的方法。
背景技术
生物制品指微生物、细胞、动物或人源组织和体液等生物材料经基因工程、细胞工程、蛋白质工程等生物技术制备而得的产品。随着生物医药产业的不断发展，对生物制品的安全性与有效性的要求也随之增高。生物制品在生产制备过程中，存在被病毒污染的风险，从而对患者的生命健康造成潜在隐患或严重损害，并且还会造成巨大的经济损失。为了避免生物制品污染事件的发生，美国药监局(FDA)、欧洲药监局(EMA)以及国际人用药品技术要求协调委员会(ICH Q5A)的指导原则指出，病毒清除/灭活是生物药品研发过程的必需过程，需要通过添加指示病毒来评估纯化工艺各个步骤的清除/灭活病毒的能力，衡量病毒清除/灭活的效果，以确保不会出现病毒污染，保证药品安全。
典型的指示病毒应包括单链和双链的RNA及DNA、脂包膜和非脂包膜、强和弱抵抗力、大和小颗粒。伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PrV)是一种常用的指示病毒，属于疱疹病毒科水痘病毒属，是大小为120-200nm的球形DNA病毒，猪是其自然宿主。PrV具有中等的理化抗性，因具脂包膜，所以对脂溶剂如乙醇、丙酮、乙醚等敏感。PrV可在MDBK、Vero、PK-15、SK6等细胞中增殖，其中最适用的是兔肾和猪肾细胞，包含原代及传代细胞。
病毒的定量测定方法主要有噬斑法、组织半数感染量终点滴定法(TCID50)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光定量PCR法等。噬斑法与组织半数感染量终点滴定法(TCID50)测量病毒的感染滴度；酶联免疫吸附测定(ELISA)与荧光定量PCR法等测量的是病毒的物理滴度。由于并非所有的病毒均具有感染性，因此物理滴度实际上高于病毒的感染性滴度(ChinJ Pharm Anal 2020,40(1))。
在病毒清除/灭活验证研究中，病毒的感染水平必不可少，感染滴度为重要参考。目前，在利用噬斑法对病毒滴度进行测定时，读板过程中实验人员的主观性较强，容易影响实验的结果，因此需要采取有效手段以减少主观因素对检测结果的影响，开发出一种能够测定PrV病毒滴度的方法，以适用于病毒清除/灭活研究，同时还应保证：PrV病毒在指示细胞上易感性强，能够产生明显的细胞病变效应，能够明显地区分病变细胞与正常细胞；在适当的病毒滴度范围内，病毒的滴度与稀释倍数应呈良好的线性关系；测定结果应具有稳定性，不同时间、不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性要好，检测灵敏度要高；该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，都符合相关法规要求。
本发明利用TCID50结合结晶紫染色法测定有感染活力的PrV病毒，染色简单直观，与TCID50法相结合，可有效降低人员镜下观察主观性影响，同时，结晶紫染料在噬斑实验中应用成熟，可快速染色，并且着色效果好，因此本发明提供的方法能够适用于病毒清除/灭活研究的需要。
通过对中英文专利的检索，暂未发现明确地应用TCID50测定PrV病毒滴度的专利。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种组织半数感染法染色测定伪狂犬病毒滴度的方法，所述方法以非洲绿猴肾成纤维细胞即CV-1细胞作为检测伪狂犬病毒即PrV病毒的指示细胞，采用组织半数感染法对伪狂犬病毒进行滴定，再结合结晶紫染色法判断细胞病变效应，最终计算得出病毒的滴度，包括以下步骤：
1)将CV-1细胞接种于含细胞培养基的细胞培养孔板中，至细胞汇合度为70-100％；
2)对PrV病毒进行稀释，将经稀释的多个不同稀释度的PrV病毒分别加入至含CV-1细胞的培养孔内，再将接种了PrV病毒的所述细胞培养孔板转移入细胞培养箱中，培养3天；
3)CV-1细胞出现明显的细胞病变效应后终止培养，在每孔细胞中加入固定液对CV-1细胞进行固定，固定结束后除去固定液；
4)加入染色液对CV-1细胞进行染色，染色结束后，清洗并晾干细胞培养孔板，读取每个稀释度下出现细胞病变效应的细胞孔数，根据Spearman-Kaerber法计算PrV病毒的滴度。
具体地，步骤1)中，所述细胞培养孔板上的每个培养孔接种4×104个细胞。
具体地，步骤2)中，所述对PrV病毒进行稀释是指对PrV病毒进行连续稀释，所述连续稀释的倍数为10倍、3.2倍、2.5倍中的一种。
具体地，步骤2)中，所述细胞培养孔板上的每个培养孔中加入相同体积的接种量，每个稀释度下的PrV病毒液做8个复孔。
具体地，步骤1)中，所述细胞培养孔板中的细胞在接种PrV病毒前的培养天数均不得超过2天，在步骤2)中，接种PrV病毒前需要用新鲜培养基对细胞培养孔板中的细胞培养基进行替换。
具体地，所述细胞培养基为MEM培养基，所述细胞培养基的胎牛血清含量为10％，所述新鲜培养基为MEM培养基，所述新鲜培养基的胎牛血清含量为2％。
具体地，步骤2)中，接种PrV病毒后进行培养时，采用封口膜封闭所述细胞培养孔板。
具体地，步骤2)中，稀释PrV病毒采用的稀释液为使用HEPES缓冲的EMEM培养基，所述HEPES的浓度为0.25mol/L。
具体地，步骤3)中，所述固定液为甲醛固定液，所述固定是指在细胞培养孔板的每个培养孔中均加入甲醛固定液，使得甲醛固定液覆盖细胞培养孔，固定的时间不少于30分钟。
具体地，步骤4)中，所述染色液为浓度为0.5％的结晶紫溶液，染色时间为5分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.指示细胞CV-1被PrV病毒感染后，CV-1细胞在显微镜下显示出明显的CPE，结晶紫染色后呈现显著区别于未感染细胞的染色形态，相对于显微镜观察，染色更有助于统一判断标准，减少人员主观因素带来的误差；
2.通过控制变量，验证PrV感染CV-1细胞的组织半数感染法测定的稳定性与可重复性，结果表明，在不同时间、不同操作人员的情况下，用该方法测定的PrV病毒滴度没有显著差异，绘制的标准曲线具有良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强；
3.本方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，符合相关法规要求，说明该方法能够应用于病毒清除/灭活验证研究中伪狂犬病毒滴度的测定；
4.本方法详细描述了以CV-1细胞作为指示细胞，PrV病毒的组织半数感染法染色测定病毒滴度的方法，为其他需要用于病毒清除/灭活验证研究的机构提供了良好的参考依据，同时也为PrV其他亚型的病毒滴度测定提供可借鉴的实验方法。
附图说明
图1是本发明典型的PrV病毒组织半数感染法细胞图；
图2是本发明实施例二中CV-1细胞组织半数感染法测定PrV病毒滴度的线性关系；
图3是本发明实施例三中同一操作人员在不同时间下采用本方法测定PrV病毒滴度的线性关系；
图4本发明实施例四中不同操作人员采用本方法测定PrV病毒滴度的线性关系。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中所使用的材料、仪器和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所使用的技术手段，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一组织半数感染法染色测定PrV病毒滴度具体实施方法
首先，将PrV病毒解冻后，经超声和过滤处理后，根据实际情况做10倍系列稀释，病毒稀释液选用添加HEPES作为缓冲液的EMEM培养基，其中HEPES的浓度为0.25mol/L；
其次，在细胞培养96孔板中加入MEM培养基，MEM培养基的胎牛血清含量为10％，将CV-1细胞接种于细胞培养96孔板中，每个细胞孔内接种约4×104个细胞，在37℃，5％CO2培养条件下进行细胞培养，至第二天观察细胞，至细胞汇合度为70-100％可进行后续操作，接种CV-1细胞的数目可以在合理范围内调整，使细胞汇合度在两天内达到70-100％即可进行后续操作；
再次，使用制备好的不同稀释度的PrV病毒去感染CV-1细胞：吸去细胞培养基，加入50μLCV-1病毒液后,加入新鲜培养基200μL至每个细胞孔，新鲜培养基为MEM培养基，其中胎牛血清含量为2％，每个稀释度病毒液做8个复孔，将接种病毒的细胞板立即转移入细胞培养箱中，培养3天；
最后，待细胞出现明显的细胞病变效应后，终止培养，在每孔细胞中加入适量甲醛固定液，使其充分覆盖细胞培养孔，多聚甲醛能够将细胞板底部的细胞固定，作用时间应不少于30分钟，随后轻轻去除固定液，在细胞中加入适量0.5％结晶紫溶液对细胞进行染色，染色5分钟后，弃去结晶紫溶液，用清水洗净细胞。
在通风橱中晾干细胞培养96孔板，并在白光透射仪下观察记录出现CPE的细胞孔，记录阳性比例后，计算病毒滴度。图1为本发明典型的PrV组织半数感染法实例图片。
实施例二PrV组织半数感染法的线性及范围
按照实施例一的操作流程，两个实验操作人员共进行了3个Run实验，每个Run进行6个样品的独立系列稀释，每个样品做3个重复，每个系列稀释包含8个不同的稀释因子，并计算各个稀释系列的病毒滴度，包括绘制标准曲线、计算线性相关系数和定病毒检测范围，标准曲线和线性相关系数结果见图2。
由图2可知，在所测的病毒滴度范围内，3个Run独立的系列稀释的标准曲线具有良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强。
实施例三同一操作人员在不同时间进行PrV病毒感染CV-1细胞实验的比较
按照实施例一的操作流程，实验操作者Operator1分别在第一天和第二天进行PrV病毒的滴度测定实验Run1和Run3，每个Run包含6个样品的实验，每个样品做三个重复，样品系列稀释后，每个稀释度做8个复孔实验，结果如图3所示。
由图3可知，不同的两个时间点下，PrV病毒感染CV-1细胞，在不同的稀释因子下，均呈现出良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强。
实施例四不同实验操作者的比较
按照实施例一的操作流程，两位实验操作者Operator 1和Operator 2同时分别独立进行实验，Run1和Run2，每个Run包含6个样品的实验，每个样品做三个重复，样品系列稀释后，每个稀释度做8个复孔实验，结果如图4所示。
由图4可知，Operator 1和Operator 2无显著差别，两个操作人员在不同的稀释因子下均呈现出良好的线性关系。
实施例五PrV病毒滴度的统计分析
按照实施例一的操作流程，两位实验操作人员Operator 1和Operator 2参与实验，共进行了18组独立的系列稀释实验，实验操作者Operator 1完成12组独立系列稀释实验，实验操作者Operator 2完成6组独立系列稀释实验，对此18组实验结果进行统计分析，具体包括：准确度、线性、测定范围、定量限、重复性和中间精密度等数据，结果如下表所示：
分析参数 统计参数，单位 数值
准确度 ％ 97％-104％
线性 Coefficient of Determination，R<sup>2</sup> 0.95
范围 TCID<sub>50</sub>/mL 11.2
定量限 TCID<sub>50</sub>/mL 7.5
重复性 95％置信区间(Log<sub>10</sub> titer) 0.09
中间精密度 95％置信区间(Log<sub>10</sub> titer) 0.14
以上结果表明，以CV-1细胞为指示细胞用TCID50 Assay染色测定PrV病毒滴度的方法，PrV病毒在指示细胞CV-1上易感性强，能够产生明显的细胞病变效应，能够明显地区分病变细胞与正常细胞，且在适当的病毒滴度范围内，PrV病毒的滴度与稀释倍数应呈良好的线性关系；此外，不同时间、不同的操作者均不会影响实验结果，表明该方法稳定性高，可重复性好，检测灵敏度高，且该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，都符合FDA，ICH和USP相关GLP法规要求，能够用于病毒清除/灭活验证研究中。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种组织半数感染法染色测定伪狂犬病毒滴度的方法，其特征在于，所述方法以非洲绿猴肾成纤维细胞即CV-1细胞作为检测伪狂犬病毒即PrV病毒的指示细胞，采用组织半数感染法对伪狂犬病毒进行滴定，再结合结晶紫染色法判断细胞病变效应，最终计算得出PrV病毒的滴度，包括以下步骤：
1)将CV-1细胞接种于含细胞培养基的细胞培养孔板中，至细胞汇合度为70-100％；
2)对PrV病毒进行稀释，将经稀释的多个不同稀释度的PrV病毒分别加入至含CV-1细胞的培养孔内，再将接种了PrV病毒的所述细胞培养孔板转移入细胞培养箱中，培养3天；
3)CV-1细胞出现明显的细胞病变效应后终止培养，在每孔细胞中加入固定液对CV-1细胞进行固定，固定结束后除去固定液；
4)加入染色液对CV-1细胞进行染色，染色结束后，清洗并晾干细胞培养孔板，读取每个稀释度下出现细胞病变效应的细胞孔数，根据Spearman-Kaerber法计算PrV病毒的滴度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述细胞培养孔板上的每个培养孔接种4×104个细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述对PrV病毒进行稀释是指对PrV病毒进行连续稀释，所述连续稀释的倍数为10倍、3.2倍、2.5倍中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述细胞培养孔板上的每个培养孔中加入相同体积的接种量，每个稀释度下的PrV病毒液做8个复孔。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述细胞培养孔板中的细胞在接种PrV病毒前的培养天数均不得超过2天，在步骤2)中，接种PrV病毒前需要用新鲜培养基对细胞培养孔板中的细胞培养基进行替换。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基为MEM培养基，所述细胞培养基的胎牛血清含量为10％，所述新鲜培养基为MEM培养基，所述新鲜培养基的胎牛血清含量为2％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，接种PrV病毒后进行培养时，采用封口膜封闭所述细胞培养孔板。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，稀释PrV病毒采用的稀释液为使用HEPES作为缓冲液的EMEM培养基，所述HEPES的浓度为0.25mol/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述固定液为甲醛固定液，所述固定是指在细胞培养孔板的每个培养孔中均加入甲醛固定液，使得甲醛固定液覆盖细胞培养孔，固定的时间不少于30分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述染色液为浓度为0.5％的结晶紫溶液，染色时间为5分钟。
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