CN111020060A - 一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒（X‑MuLV）滴度的方法，本发明以猫星形脑胶质细胞(PG4细胞)作为检测X‑MuLV的指示细胞，用空斑测定法(plaque assay)准确定量测定X‑MuLV病毒的滴度。包括如下步骤：将病毒稀释；在6孔板中的每个孔内加入细胞生长液；将不同稀释度的病毒加入细胞孔中，转移入细胞培养箱中孵育；加入培养基‑琼脂混合物培养5至6天；终止培养，染色，读取病毒空斑数；计算病毒滴度。本发明能够克服传统空斑测定法操作上耗时费力，并且使用的指示细胞是不常用的细胞株，不易获得等缺点，且具有灵敏度强、背景清晰、稳定性好，可重复性强等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可以应用于病毒清除研究的异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropic murine leukemia virus, X-MuLV)滴度的测定方法。
背景技术
近年来，单克隆抗体（mAb）和其他重组蛋白（RPs）等生物制品已成为生物医药产业中非常重要的一类产品。现代生物制品常以动物细胞作为蛋白表达系统，以保证蛋白产物正确的构象和生物活性。其中最为常用的细胞系为中国仓鼠卵巢细胞系（CHO细胞），CHO细胞或可能含有内源性逆转录病毒或可能在培养过程中污染外源性病毒[参见:1.BartalAH, Feit C, Erlandson R, Hirshaut Y. 1982. The presence of viral particles inhybridoma clones secreting monoclonal antibodies. N Engl J Med 306:1423；2.Garnick RL. 1998. Raw materials as a source of contamination in large scalecell culture. Dev Biol Stand 93:21–29.]。因此各国药监机构要求这类制品在临床实验前和生产阶段前申报材料中纯化工艺必须经过病毒清除/灭活验证，以确保不会出现病毒污染，保证患者的用药安全。
病毒清除/灭活验证通过添加指示病毒来评估纯化工艺各个步骤的清除能力，其中异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropic murine leukemia virus, X-MuLV)是常用的指示病毒之一。X-MuLV是一种具有包膜的逆转录病毒，基因组为单链RNA，病毒大小80–130 nm，是CHO细胞常见的内源性病毒，通常作为鼠源细胞逆转录病毒的模型病毒。
对于X-MuLV病毒的定量测定，有通过提取检测样品的RNA，利用反转录荧光定量PCR（RT-qPCR）法通过检测X-MuLV的特异性基因来定量测定病毒的含量[参见：3.闻洁。一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法，CN201810720390.8，2018.09.14；4.JohnM. Irving, Lucille W. S. Chang, Francisco J. Castillo. A reversetranscriptase-polymerase chain reaction assay for the detection andquantitation of murine retroviruses. Nature biotechnology. 1993, 11: 1042-1046；5.Mikovits Judy A, Lombardi Vincent, Ruscette Sandra, Ruscetti francis,Silverman Robert. Detection of xenotropic murine leukemia virus, US:81889310:A, 2011.06.23.]。但该类方法主要是通过对病毒基因组中保守基因的扩增来测定病毒的含量，因为这种方法检测的是病毒的基因，其检测结果并不能反映病毒的感染活性。空斑法是一种经典的病毒定量方法，利用空斑法测定X-MuLV病毒或者是和它同家族的其他MuLV病毒的文献均发表于40年前，相关方法描述较为简单，所使用的细胞也不是常用的细胞系，因此不具备较高的应用价值[参见：6.Bjórn Andersen. A plaque assay for murineleukemia virus using enzyme-coupled antibodies. Virology. 1977, 77 (2): 849-852；7.Peter J. Fischinger, Charlotte S. Blevins, Shigeko Nomura. Simple,Quantitative Assay for Both Xenotropic Murine Leukemia and Ecotropic FelineLeukemia Viruses. Journal of virology. 1974, 14 (1): 177-179；8.Michiko Koga.Titration of murine leukemia viruses with rat cell line RFL. Journal ofvirology. 1977, 23 (2): 436-438。]。通过对中英文专利的检索，也没发现明确地应用空斑检测法测定X-MuLV滴度的专利。因此急需开发出一种有效的测定X-MuLV病毒滴度的方法，使之适用于病毒清除验证研究。
病毒清除验证是要验证客户生物制品纯化工艺中清除有感染活力的病毒的能力，因此病毒清除验证中需要一种能够准确测定活病毒的量的方法，这样才能准确的评价各个纯化步骤对病毒清除/灭活的效果。本发明即利用空斑染色准确测定有感染活力的X-MuLV病毒，适用于病毒清除验证的需要。
针对X-MuLV病毒的准确定量多采用空斑计数法测定病毒的滴度，传统的空斑测定法(plaque assay)多报道于四十年前，有的测定思路是利用酶联免疫法通过抗原抗体反应间接检测病毒来测定病毒的滴度，有的方法为了克服MuLV病毒无法在细胞上增值，通过M-MSV转化的猫细胞系或者寻找不常见的大鼠成纤维细胞来进行病毒滴度测定，受制于方法上的缺陷，这些方法操作上耗时费力，并且使用的指示细胞也是不常用的细胞株，不易获得，因此需要寻找新的常用细胞系用于X-MuLV病毒的测定，同时还需满足以下要求：X-MuLV应对新的指示细胞具有高度敏感性，能够在引起明显的细胞病变效应，并且能够在指示细胞上产生易于观察的病毒空斑；测定时间段；在一定的病毒滴度范围内，病毒的滴度应与产生的空斑数目应呈良好的线性关系；测定结果应具有稳定性，不同时间、不同细胞批次、不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性要好，检测灵敏度要高；该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，都符合相关法规要求。
发明内容
本发明克服了传统空斑测定法操作上耗时费力，并且使用的指示细胞也是不常用的细胞株，不易获得的技术缺陷，提供了一种以猫星形脑胶质细胞作为检测X-MuLV的指示细胞，用空斑测定法定量测定X-MuLV病毒的滴度的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法，该方法以猫星形脑胶质细胞作为检测异嗜性鼠白血病病毒X-MuLV的指示细胞，用空斑测定法定量测定X-MuLV病毒的滴度。
作为本发明优选的技术方案，该方法包括如下步骤：
（I）.将PG4细胞接种于细胞培养六孔板中，至细胞汇合度为30%，用稀释液对X-MuLV病毒进行稀释，用不同稀释度的X-MuLV病毒去感染PG4细胞，吸去细胞培养基；
（II）.将接种病毒的细胞转移入细胞培养箱中进行孵育，再弃去病毒液，在每个细胞孔中加入培养基-琼脂混合物，培养基-琼脂混合物完全凝固后将细胞培养板转移至细胞培养箱中，培养5至6天；
（III）.细胞出现明显的空斑后终止培养，去除细胞表面的固体琼脂，加入染色液对细胞进行染色，染色5分钟后，洗净细胞，晾干细胞培养六孔板，并读取每孔的病毒空斑数目，根据空斑数目结合稀释倍数计算X-MuLV病毒的滴度。
作为本发明优选的技术方案，步骤（I）中，每个细胞孔接种1×105~1.5×105个细胞，亦可调整接种细胞的数目使病毒接种时孔内细胞汇合度达到30%。
作为本发明优选的技术方案，步骤（I）中，对病毒的稀释根据实际情况作2-10倍进行系列稀释。
作为本发明优选的技术方案，步骤（I）中，每个细胞孔中加入0.5mL病毒液，每个稀释度病毒液做3个复孔。
作为本发明优选的技术方案，步骤（II）中，所述培养基-琼脂混合物为细胞培养基和溶解的琼脂糖按比例混合均匀，并经37℃水浴后制得。
作为本发明优选的技术方案，步骤（II）中，每孔加入2ml培养基-琼脂混合物，并在室温下放置10至30分钟。
作为本发明优选的技术方案，步骤（III）中，去除细胞表面的固体琼脂前，在每个细胞孔中加入固定液，覆盖细胞培养孔，放置不少于一小时，固定细胞板底部细胞。作为本发明优选的技术方案，所述固定液为甲醛溶液。
作为本发明优选的技术方案，步骤（III）中，所述染色液为0.5%结晶紫溶液。
作为本发明优选的技术方案，步骤（I）中，所述细胞培养基为McCoy’ s 5A完全培养基；所述稀释液为HEPES buffered EMEM；步骤（II）中，所述固体培养基是细胞培养基和琼脂混合物。
作为本发明优选的技术方案，所述固体培养基是2×细胞培养基和1%低熔点琼脂糖的混合物。
所述异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropic murine leukemia virus, X-MuLV)是常用的指示病毒之一。X-MuLV是一种具有包膜的逆转录病毒，基因组为单链RNA，病毒大小80–130 nm，是CHO细胞常见的内源性病毒，通常作为鼠源细胞逆转录病毒的模型病毒。
本发明使用了猫星形脑胶质细胞(PG4 (S+L-)细胞) 作为检测X-MuLV的指示细胞，以下称为PG4细胞（该细胞系遗传背景清晰、细胞性状稳定、可传多代），用空斑测定法准确定量测定X-MuLV病毒的滴度，单位为PFU/mL（PFU定义为空斑形成单位）。X-MuLV病毒感染PG4细胞，PG4细胞因病毒感染产生细胞病变效应 (cytopathic effect, CPE)后即可形成明显的病毒空（噬）斑。这种方法能够定量检测有感染活力的X-MuLV病毒，理论上一个有活性的病毒感染一个PG4细胞，病毒复制后以辐射状感染周缘细胞，造成细胞死亡，形成一个病毒空斑即形成一个PFU，根据空斑数目以及对应的稀释度即可得到病毒的滴度。
本发明的有益效果在于：
1．指示细胞PG4被X-MuLV病毒感染后用固体琼脂细胞培养基进行培养，感染后的PG4细胞无论是显微镜下还是肉眼观察均显示出明显的CPE，染色后呈特定的空斑形态。
2. 通过控制变量，验证X-MuLV感染PG4细胞的空斑测定的稳定性与可重复性，结果表明，在不同时间、不同细胞批次和不同操作人员的情况下，用该方法测定的X-MuLV病毒滴度没有显著差异，绘制的标准曲线具有良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强。
3．该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，符合相关法规要求，说明该方法能够应用于病毒清除验证中异嗜性鼠白血病病毒滴度的测定。
4. 该方法详细描述了以PG4细胞作为指示细胞，X-MuLV病毒的空斑测定方法，为其他需要用于病毒清除验证的机构提供了良好的参考依据，同时也为MuLV其他亚型的病毒滴度测定提供可借鉴的实验方法。
5. 本发明能够克服传统空斑测定法操作上耗时费力，并且使用的指示细胞是不常用的细胞株，不易获得等缺点，且具有灵敏度强、背景清晰、稳定性好，可重复性强等优点。
附图说明
图1是本发明实施例1中不同时间和隔天进行X-MuLV的空斑测定标准曲线。
图2是本发明实施例2中X-MuLV病毒感染3个批次PG4细胞的空斑测定标准曲线。
图3是本发明实施例2中对X-MuLV 病毒感染3个批次PG4细胞的空斑测定进行汇总，绘制的标准曲线。
图4是本发明实施例3中不同实验操作者的X-MuLV空斑测定的标准曲线。
图5是本发明实施例4中 PG4细胞空斑测定X-MuLV病毒滴度的标准曲线。共完成5个run：Operator 1 完成3个run和Operator 2完成2个run。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
实施例1：同一操作人员在不同时间进行X-MuLV病毒感染PG4细胞实验的比较
X-MuLV病毒解冻后，经超声和过滤处理后用病毒稀释液对病毒进行系列稀释，根据实际情况做10倍系列稀释。
将PG4细胞接种于细胞培养六孔板中，每个细胞孔接种1105个细胞，在37°C，5%CO2培养条件下进行细胞培养，至第二天观察细胞，至细胞汇合度为30%可进行后续操作。亦可调整接种细胞的数目，使细胞汇合度在30%左右。
对病毒进行连续10倍稀释至10-10稀释度，将制备好的不同稀释度的X-MuLV病毒去感染PG4细胞：吸去细胞培养基，每个细胞孔中加入0.5mL病毒液，每个稀释度病毒液做3个复孔。将接种病毒的细胞板立即转移入细胞培养箱中，进行孵育。期间，每15至30分钟，轻轻晃动细胞板，使病毒液充分覆盖培养孔内所有细胞。同时，将细胞培养基和溶解的琼脂糖按比例混合均匀，放置在37°C水浴中待用。将孵育后的细胞培养六孔板取出，弃去病毒液，在每孔中加入2mL事先准备好的培养基-琼脂混合物，在室温下放置10至30分钟，直至覆盖在细胞表面的培养基-琼脂混合物完全凝固。凝固后将细胞培养板转移至细胞培养箱中，培养5-6天。
待细胞出现明显的空斑后，终止培养，在每孔细胞中加入适量多聚甲醛固定试剂，使其充分覆盖细胞培养孔。多聚甲醛能够从培养基-琼脂糖凝胶的表面往下渗透，将细胞板底部的细胞固定。固定细胞至少一小时，随后轻轻去除细胞表明的固体琼脂，在细胞中加入适量0.5%结晶紫溶液对细胞进行染色。染色5分钟后，弃去结晶紫溶液，用清水洗净细胞。在通风橱中晾干细胞培养六孔板，并在白光透射仪下观察空斑形态：指示细胞PG4被X-MuLV病毒感染后用固体琼脂细胞培养基进行培养，感染后的PG4细胞无论是显微镜下还是肉眼观察均显示出明显的CPE，结晶紫染色后呈特定的空斑形态。读取每孔的病毒空斑数目，计算病毒滴度。
同一位实验人员分别在同一天的不同时间和隔天进行X-MuLV的空斑测定实验，每次实验做三组重复，每组做三个复孔，实验结果如图1所示。实验结果：三个时间点的X-MuLV病毒感染PG4细胞的标准曲线线性关系良好。
实施例2：X-MuLV病毒感染3个不同批次PG4细胞的比较
同一批次X-MuLV病毒感染3个不同批次的PG4细胞，每个批次细胞做三组重复，每组做三个复孔。空斑测定实验结果如图2和图3所示。由图2可知，3批次细胞之间没有显著差异，3条标准曲线的线性关系都很好，具有良好的重复性。图3中3组数据汇总后的标准曲线的线性关系好。
实施例3：不同实验操作者的比较
两位实验操作者Operator 1 和Operator 2 进行实验，每个操作者做三组重复，每组做三个复孔实验结果如图4所示。由图4可知，Operator 1 和Operator 2无显著差别，2条标准曲线重复性好。
实施例4：X-MuLV病毒滴度的统计分析
两位实验操作人员Operator 1 和Operator 2参与实验。共进行五轮实验，Operator 1完成三轮实验，Operator 2完成两轮实验，对此五轮实验结果进行统计分析：绘制标准曲线、计算线性相关系数、确定病毒检测范围同时计算出精密度、检测限等相关数据。标准曲线和线性相关系数结果见图5，其他相关数据：
Linearity：Coefficient of Determination, R2 线性拟合计算得到：0.9984
Range：范围应在可计数的空斑数范围即在1 PFU到TNTC（空斑数过多无法计数）之间
Limit of Quantitation：c=lnp/-v=1.997 PFU/mL
注：p: probability, v: volume of sample，本实验中：p≤0.05，v=1.5 mL（每孔0.5mL，共三个复孔）
Limit of Detection：所检测的最小数量为一个空斑即1 PFU
Precision：不同Run的log10 Titer的平均值、标准偏差以及95%置信度进行统计分析对其精密度进行研究，见下表：
Claims (12)
1.一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法，其特征在于：该方法以猫星形脑胶质细胞PG4细胞作为检测异嗜性鼠白血病病毒X-MuLV的指示细胞，用空斑测定法定量测定X-MuLV病毒的滴度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（I）.将PG4细胞接种于细胞培养六孔板中，至细胞汇合度为30%，用稀释液对X-MuLV病毒进行稀释，用不同稀释度的X-MuLV病毒去感染PG4细胞，吸去细胞培养基；
（II）.将接种病毒的细胞转移入细胞培养箱中进行孵育，再弃去病毒液，在每个细胞孔中加入固体培养基，固体培养基完全凝固后将细胞培养板转移至细胞培养箱中，培养5至6天；
（III）.细胞出现明显的空斑后终止培养，去除细胞表面的固体琼脂，加入染色液对细胞进行染色，染色5分钟后，洗净细胞，晾干细胞培养六孔板，并读取每孔的病毒空斑数目，根据空斑数目结合稀释倍数计算X-MuLV病毒的滴度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（I）中，每个细胞孔接种1×105~1.5×105个细胞，亦可调整接种细胞的数目使病毒接种时孔内细胞汇合度达到30%。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（I）中，对病毒的稀释根据实际情况作2-10倍进行系列稀释。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（I）中，每个细胞孔中加入0.5mL病毒液，每个稀释度病毒液做3个复孔。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（II）中，所述培养基-琼脂混合物为细胞培养基和溶解的琼脂糖按比例混合均匀，并经37℃水浴后制得。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（II）中，每孔加入2ml培养基-琼脂混合物，并在室温下放置10至30分钟。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（III）中，去除细胞表面的固体琼脂前，在每个细胞孔中加入固定液，覆盖细胞培养孔，放置不少于一小时，固定细胞板底部细胞。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（III）中，所述染色液为0.5%结晶紫溶液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述固定液为甲醛溶液。
11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（I）中，所述细胞培养基为McCoy’ s5A完全培养基；所述稀释液为HEPES buffered EMEM；步骤（II）中，所述固体培养基是细胞培养基和琼脂混合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述固体培养基是2×细胞培养基和1%低熔点琼脂糖的混合物。
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