EA018438B1

EA018438B1 - Добавка к культуральной среде для производства вируса

Info

Publication number: EA018438B1
Application number: EA200900526A
Authority: EA
Inventors: Элизабет Рётль; Андрей Егоров
Original assignee: Авир Грин Хилз Байотекнолоджи Рисерч Дивелопмент Трейд Аг
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2007-10-11
Publication date: 2013-08-30
Also published as: EP2087104B1; CN101568639B; ES2403098T3; EP1911836A1; EP2087104A1; KR101485441B1; CN101568639A; PL2087104T3; WO2008043805A1; AU2007306324C1; CA2665603C; AU2007306324A1; US20100003221A1; KR20090064584A; CN103232976A; JP2011502466A; EA200900526A1; CA2665603A1; JP5298377B2; US8288145B2

Abstract

Изобретение раскрывает применение амфотерицина В в качестве добавки в культуральную среду для стимуляции роста вируса и способ культивирования вируса в присутствии амфотерицина В. Предложенный способ применим как для ДНК-, так и для РНК-содержащих вирусов. Амфотерицин В используется в концентрации между 0,5 нг/мл и 5 мкг/мл, при этом увеличение вирусного роста составляет 0,1 log 10 - 2,5 log 10.

Description

Данное изобретение обеспечивает применение амфотерицина В в качестве добавки к культуральной среде для размножения вируса. Дополнительно описывается способ культивирования вируса в присутствии амфотерицина В и способ идентификации вируса.

В настоящее время многие вирусные вакцины, за исключением гриппозной, производят с применением первично-трипсинизированных клеток, например клеток из почек обезьян и почек кроликов и хомяков (см., например, \УО 9738094). Первичные диплоидные клеточные культуры имеют определенные преимущества, такие как легкое приготовление с применением простой среды и бычьей сыворотки и чувствительность к широкому диапазону множества вирусов. Однако первичные диплоидные клетки имеют недостатки, такие как комбинация с различными случайными агентами, вариабельное качество и чувствительность и трудность получения подходящей ткани для культивирования (например, почек обезьяны).

Напротив, преимуществами применения стабильных клеточных линий являются сохранение ими природных антигенных характеристик инфекционного вируса, стандартизация, высокая восприимчивость к вариантам одного и того же вируса и способность к выращиванию в виде большой массы клеток с применением систем ферментёров с микроносителями или суспензиями.

Однако эти преимущества сами по себе делают такие клеточные линии пригодными для применения в производстве вакцин. Μίζπιΐιί. еб., Упа1 Уаеетек, ^йеу-Ыкк, Νο\ν Уотк (1990), рр. 39-67. Например, вирус гриппа А, выделенный и перевиваемый исключительно на культурах клеток млекопитающих, как было найдено, в некоторых случаях сохраняет большинство своих исходных антигенных характеристик, что является чертой, обеспечивающей большие преимущества при производстве вакцины (Вотаиоуа 1. е! а1., У1то1оду, 2003, 307(1):90-7; Вотаиоуа 1. е! а1., Уник Век. 2004, 103:187-93).

Однако первичные диплоидные культуры клеток млекопитающих представляют трудности в качестве системы клетки-хозяина при производстве вакцины. Это обусловлено такими проблемами, как контаминация клеточной культуры случайными агентами, вариабельное количество клеток в клеточной культуре, различная чувствительность клеток к вариантам одного и того же вируса, низкие титры вируса и высокая стоимость и трудность получения и подготовки таких клеточных культур.

Далее, как сообщалось, среди анализированных стабильных клеточных линий только МОСК клетки (Мадин Дарби линия клеток почки собаки) поддерживают потенциально достаточный рост и выделение вирусов (Ргапк е! а1., 1. С1ш. М1етоЬ. 10:3236 (1979); Зейерейик & Кок, 1. У1го1. Мебюбк 42:241-250 (1993)).

Две других стабильных клеточных линии - клеток почек африканских зеленых мартышек (Уего) и почек детенышей хомяков (ВК-21) - охарактеризованы, утверждены и сертифицированы Всемирной организацией здравоохранения (\УНО) для производства вакцин для человека. Однако клетки Уего, несмотря на сертификацию, ранее были признаны нестабильными для крупномасштабного производства вакцин из вируса гриппа человека. Например, рост гриппа В на клетках Уего был значительно ограничен по сравнению с клетками МОСК (№-1катига е! а1., 1. Оеи. У1го1. 56:199-202 (1981)). Кроме того, попытки применения клеток Уего для оценки чувствительности к римантадину вируса гриппа А человека Η1Ν1 и Η3Ν2 дали сомнительные результаты из-за низких титров вируса, вырабатывающегося в этих клетках, по сравнению с клетками МОСК (Оотуакоуа Е.А. е! а1., 1. У1го1., 1996, 70:5519-24).

Таким образом, эти и другие исследования указывают, что вирус гриппа ранее плохо воспроизводился в клетках Уего, что делает его непригодным для крупномасштабного производства вакцины (Эепйбоуа е! а1., Уорг. У1гоко1 (Викяаи) 346-352 (1979); Ьаи & ЗейоШккек, Упо1оду 212:225-231 (1995)).

Кауетт КУ. и \УеЬк1ег В.О. (1. У1го1., 1995, 69(4):2700-3) описывают необходимость повторного добавления трипсина в культуральную среду для клеток Уего, инфицированных вирусом гриппа, для восстановления полицикличного типа роста штаммов вируса гриппа А. Тем не менее, необходимое повторное добавление трипсина является достаточно трудоемким и занимает много времени, поскольку трипсин нужно добавлять на различных стадиях культивирования (см. также Оотуакоуа Е.А. е! а1., 1. 1иРее!. ϋΐ8., 1995, 172:250-3).

Члены семейства ДНК-вирусов содержат геномы с двойной цепью. Семейство парвовирусов является единственным исключением. Большинство ДНК-геномов являются не просто линейными молекулами. Например, геномы паповавирусов являются ковалентно закрытыми двухцепочечными кольцами, а геномы гепаднавирусов являются двусторонними кольцами, в которых одна цепь содержит однонитевой разрыв, а другая содержит двухнитевой разрыв. Концы двухцепочечного генома поксвирусов ковалентно соединены, в то время как геномы герпесвирусов содержат терминальные и внутренние дупликации.

ДНК-вирусы классифицируются на следующие семейства: Ратуоушбае, Рароуаушбае, Абеиоушбае, Нерабиаушбае, Нетрекушбае, Шбоушбае, Ваеио1оушбае и Рохушбае.

Двухцепочечные РНК-вирусы классифицируются на две группы: Веоушбае и Впиаушбае.

Семейства вирусов, содержащих покрытую оболочкой одноцепочечную РНК из отрицательносмыслового генома, классифицируются на группы, имеющие несегментированные геномы (Рагатухоушбае, ВйаЬбоушбае, Рйоушбае и вирус болезни Борна, Тодаушбае) или имеющие сегментированные геномы (Оййотухоушбае, Вииуаутбае и Атеиаушбае). Семейство Оййотухоушбае включает вирусы гриппа типов А, В и С, а также вирусы Тогото и Дхори и вирус инфекционной анемии лосося.

- 1 018438

Вирионы гриппа состоят из внутренней рибонуклеопротеиновой сердцевины (геликального нуклеокапсида), содержащей одноцепочечный РНК-геном, и внешней липопротеиновой оболочки, выстланной внутри матриксным белком (М1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из восьми молекул (семи для гриппа С) из линейной, с отрицательной полярностью, одноцепочечной РНК, кодирующей десять полипептидов, включая РНК-зависимые РНК полимеразные белки (РВ2, РВ 1 и РА) и нуклеопротеин (ΝΡ), образующий нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (М1, М2); два поверхностных гликопротеина, выступающих из содержащей липиды оболочки: гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (ΝΑ); неструктурный белок (N81) и ядерный экспортный белок (ΝΕΡ).

Транскрипция и репликация генома осуществляется в ядре, а сборка проходит посредством почкования на плазматической мембране. Вирусы могут пересортировывать гены при смешанных инфекциях. Вирус гриппа абсорбируется посредством НА на сиалилолигосахаридах гликопротеинов и гликолипидов клеточной мембраны. После эндоцитоза вириона происходят конформационные изменения в молекуле НА в клеточной эндосоме, облегчающие слияние мембраны, таким образом запуская декапсидацию. Нуклеокапсид мигрирует к ядру, где вирусная мРНК транскрибируется. Вирусная мРНК транскрибируется с помощью уникального механизма, при котором вирусная эндонуклеаза расщепляет закрытый 5'конец клеточной гетерологичной мРНК, которая служит в качестве праймера для транскрипции шаблонов вирусной РНК вирусной транскриптазой. Транскрипты заканчиваются на участках 15-22 основания от конца их шаблонов, где олиго (И) последовательности действуют как сигналы для добавления поли(А) участков. Из восьми молекул вирусной РНК, произведенных таким образом, шесть являются полицистронными транскриптами, которые транслируются непосредственно в белки, представляющие НА, ΝΑ, ΝΡ и вирусные полимеразные белки, РВ2, РВ 1 и РА. Два других транскрипта подвергаются сплайсингу, где каждый дает две мРНК, которые транслируются в различные рамки считывания для выработки М1, М2, N81 и ΝΕΡ. Другими словами, восемь вирусных РНК сегментов кодируют одиннадцать белков: девять структурных и неструктурный, и недавно идентифицированный ΡΒ1-Ρ2 белок.

Учитывая трудности производства большого количества вирусных частиц. необходимых, главным образом, для профилактического и лечебного применения, задачей данного изобретения является обеспечение новых способов культивирования и добавок, способных увеличить выход и качество вируса, размножаемого в стабильных клеточных линиях.

Проблему решают путем применения амфотерицина В в качестве культуральной добавки для размножения вируса.

В соответствии с предшествующим уровнем техники известно, что амфотерицин В демонстрирует противогрибковые свойства и широко применяется для лечения и профилактики грибковых инфекций у животных и человека. Помимо уже известных свойств амфотерицина В авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что амфотерицин В можно также применять для культивирования и размножения вирусных частиц, которые часто трудно культивировать, и которые требуются в больших количествах для различных целей, таких как профилактическое, лечебное и промышленное применение. Амфотерицин В метиловый эфир, производное амфотерицина В, как было описано, повышает инфицирующую способность РНК вируса энцефаломиокардита и ДНК вируса 8У40 (Вогйеи Е. е! а1., 1. деи.У1го1., 1979, 42, 297-303; Вогйеи Е. е! а1., АгсЫуек οί Упо1о§у, 1981, 69, 161-165), но до сих пор в предшествующем уровне техники нет указаний или свидетельств его применения с целью культивирования вирусов.

При использовании амфотерицина В в соответствии с данным изобретением можно увеличить рост вируса, что может также привести к увеличению инфицирующей способности вирусных частиц даже при низкой множественности заражения.

В соответствии с данным изобретением вирусы, которые можно успешно культивировать, являются ДНК- или РНК-вирусами, предпочтительно РНК-вирусами, более предпочтительно относящимися к семействам Опйотухоушйае, Рюогиаушйае и Рагатухоушйае. Даже более предпочтительно вирусами являются вирус гриппа А, вирус гриппа В, вирус гриппа С, риновирус и вирус парагриппа и их производные, или аналоги, или фрагменты. Альтернативно, вирусы кори, свинки, краснухи и бешенства также могут быть подходящими системами для культивирования в соответствии с данным изобретением.

В альтернативном воплощении культивированные вирусы могут содержать модификации в нескольких структурных и неструктурных генах, предпочтительно модификации в генах N81 и/или РВ1. Модификациями могут быть делеции, замены или вставки по крайней мере одной нуклеиновой кислоты. Альтернативно, вирусами, культивируемыми в среде, содержащей амфотерицин В, могут быть также онколитические вирусы. Вирусные производные, аналоги или фрагменты могут, например, быть любой вирусной частицей, которая все ещё может применяться с целью вакцинирования или демонстрировать онколитические свойства. Вирусы обычно культивируют с применением инфицированных вирусами клеток, которые, как было показано, могут применяться с целью размножения вирусных частиц. Изобретение также обеспечивает способ инфицирования клеток для культивирования вируса с применением амфотерицина В, включающий следующие этапы:

a) клетки инфицируют по крайней мере одной инфекционной вирусной частицей;

b) амфотерицин В добавляют в инокулят и/или культуральную среду вместе с трипсином;

c) инкубация в подходящих условиях, сопровождающаяся

- 2 018438

б) сбором полученного вируса и дополнительно

е) очисткой и/или определением характеристик вирусов.

Удивительно, что было показано, что применение добавки или смеси добавок в соответствии с данным изобретением может увеличивать рост вируса по крайней мере в 0,1 1од 10, предпочтительно по крайней мере в 0,5 1од 10, предпочтительно в 1 1од 10, более предпочтительно по крайней мере в 2 1од 10, даже более предпочтительно по крайней мере в 2,5 1од 10, даже более предпочтительно по крайней мере 5 1од 10.

Дополнительно данное изобретение можно также применять для выделения или титрования вирусных частиц. Это особенно важно, поскольку инфицирование клеток для культивирования вируса часто требует высоких количеств вируса из-за отсутствия достаточного процента заражения и неэффективных механизмов репликации. Количество вируса может быть значительно снижено путем добавления по крайней мере одного амфотерицина В незадолго до, или одновременно, или вскоре после процесса инфицирования.

Описание чертежей

Фиг. 1 показывает влияние амфотерицина В на рост вируса гриппа.

Субконфлюэнтный монослой клеток Уего имел различную множественность заражения (ΜΟΙ) (0,001, 0,0001 и 0,00001). Среда для роста вируса содержала 5 мкг/мл трипсина и 0 или 250 нг/мл амфотерицина В. Для каждого значения ΜΟΙ вирус (с амфотерицином В или без) собирали, когда цитопатический эффект или резкое увеличение скорости роста вируса достигали от 50 до 95%. Для всех вирусов, инкубированных в присутствии амфотерицина В, цитопатический эффект и, следовательно, вирусный титр развивался быстрее, чем у тех, что были выращены без амфотерицина В. Сравнивали титры ТСГО50.

Фиг. 1а показывает влияние на штамм Η1Ν1.

Фиг. 1Ь показывает влияние на штамм Η3Ν2.

Фиг. 1с показывает влияние на штамм гриппа В.

Фиг. 2 показывает результаты титрования в присутствии и при отсутствии амфотерицина В.

a) Вирус гриппа В/Вена/32/2006 (А/Малайзия/2506/2004-подобный) титровали в реакции розеткообразования в присутствии (левая колонка) и при отсутствии (правая колонка) амфотерицина В. Выращивание вируса в присутствии амфотерицина В привело приблизительно к 2,5 2,5 1од увеличению выхода вируса.

b) (А/Новая Каледония/20/99(НШ1)-подобный ΔΝ81 вирус серийно разводили и титровали параллельно в присутствии и при отсутствии 250 нг/мл амфотерицина В путем анализа ТСГО50. Спустя 3 суток инкубации при 37°С в ячейках оценивали цитопатический эффект и подсчитывали титры.

Фиг. 3 показывает исследования с увеличением дозы амфотерицина В.

Субконфлюэнтный монослой клеток Уего инфицировали вирусом А/Вена/28/2006 (А/Висконсин/67/2005-подобным) (Η3Ν2) с множественностью заражения 0,001. После инфицирования в среду для выращивания добавляли различные концентрации амфотерицина В (0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 и 1000 нг/мл соответственно). Вирус собирали спустя 48 ч и титровали с помощью анализа ТСГО50 в присутствии амфотерицина В. Применение концентраций в диапазоне от 250 до 500 нг/мл приводило к наивысшему титру вируса.

Амфотерицин В в соответствии с данным изобретением можно в целом разделить на триены, тетрены, пентены, гексены и гептены по числу конъюгированных двойных связей, которыми они обладают, и в соответствии с наличием или отсутствием связанного посредством гликозида углевода. Для обзора см. НатШои-МШег 1.М.Т., Вае1егю1. Яе\зе\\ъ. 1973, 37, 166-196.

Амфотерицин может быть произведен путем культивирования организма, такого как §Тгер1отуее8 иобокик, и экстрагирован из культуры. Амфотерицин В является, по существу, макроциклическим лактоном с высокой молекулярной массой, обладающим хромофором из 7 конъюгированных двойных связей. В дополнение к большому лактонному ядру амфотерицин В имеет другие характеристические группы, включающие аминосахар. Производные или аналоги могут быть любого вида, обеспечивающего характеристики, необходимые для применения в качестве культивационной добавки для культивирования вирусов. Например, это может быть Ν-ацетилирование, Ν-сукцинилирование, этерификация или комплексообразование с СаС1₂. Например, это может быть метиловый эфир амфотерицина В или липосомальная формула, содержащая амфотерицин В.

В соответствии с альтернативным воплощением смеси амфотерицина В с его производными или различные смеси производных амфотерицина В также могут применяться в качестве добавки для культивирования вирусов и в способах по данному изобретению.

В соответствии с изобретением амфотерицин В применяют в концентрации, достаточной для стимуляции культивирования вирусов. Предпочтительно концентрация составляет между 0,5 нг/мл и 5 мкг/мл, предпочтительно между 0,5 нг/мл и 2,5 мкг/мл, предпочтительно между 10 и 900 нг/мл, более предпочтительно между 100 и 500 нг/мл, более предпочтительно между 200 и 400 нг/мл.

В соответствии с данным изобретением амфотерицин В может применяться для культивирования любого ДНК- или РНК-вируса.

- 3 018438

В предпочтительном воплощении вирусом является РНК-вирус. Семейства вирусов, содержащих покрытую оболочкой одноцепочечную РНК из их отрицательно-смыслового генома, классифицируют на три группы, имеющие несегментированные геномы (Рататухоушбае, КБаЬбоушбае, Рйоутбае и вирус болезни Борна) или имеющие сегментированные геномы (ОйБотухоушбае, Вццуаушбае и Лтеиаушбае). Семейство Ойботухоуитбае включает вирусы гриппа типов А, В и С, а также вирусы Тогото и Дхори и вирус инфекционной анемии лосося.

Геном Ойботухоуитбае состоит из шести-восьми одноцепочечных молекул РНК с отрицательной полярностью (комплементарно мРНК). Вирионы гриппа состоят из внутренней рибонуклеопротеиновой сердцевины (геликального нуклеокапсида), содержащей одноцепочечный РНК-геном, и внешней липопротеиновой оболочки, выстланной внутри матриксным белком (М1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из восьми молекул (семи для гриппа С) из линейной, с отрицательной полярностью, одноцепочечной РНК, кодирующей десять полипептидов, включая РНК-зависимые РНК полимеразные белки (РВ2, РВ1 и РА) и нуклеопротеин (ΝΡ), образующий нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (М1, М2); два поверхностных гликопротеина, выступающих из содержащей липиды оболочки: гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (ΝΑ); неструктурный белок (N81) и ядерный экспортный белок (ΝΕΡ).

Например, вирусы, применяемые для размножения или любых способов, как описано здесь, с применением амфотерицина В в качестве добавок к культуре, могут быть вирусами гриппа, респираторным синцитиальным вирусом (К.8У), вирусом болезни Ньюкасл (ΝΏν), вирусом везикулярного стоматита (У8У), риновирусом и вирусом парагриппа (Ρίν), вирусом кори, свинки, вирусом краснухи и вирусом бешенства.

Вирусы, применяемые в изобретении, могут быть выбраны из природных штаммов, вариантов и мутантов; мутировавшими вирусами (например, созданными путем воздействия мутагенов, повторных пассажей и/или пассажей у непермиссивного хозяина); реассортантов (в случае сегментированных вирусных геномов); и/или генно-инженерных вирусов (например, с применением методик обратной генетики).

Предпочтительно вирус, культивированный при добавлении амфотерицина В, выбран из группы, включающей вирус гриппа А, гриппа В или гриппа С.

В соответствии с данным изобретением вирусы могут содержать модификации в геноме, ведущие к экспрессии и выработке производных или аналогов вирусов. В альтернативном воплощении модификация может быть в пределах гена N81 и/или гена РВ1. Это может приводить к выработке вируса, содержащего полностью удаленный или иначе модифицированный Ν81 белок и/или полностью удаленный или модифицированный РВ1-Р2 белок или модифицированный РВ2 белок, экспрессированный из РВ1 фрагмента генома. Модификации в гене N81 могут быть делениями, вставками или замещениями. Примеры таких модифицированных РНК вирусов раскрыты в \УО 99/64068 и \УО 99/64571, включенных здесь в ссылку, где модификации в гене N81 ведут к выработке РНК вируса с фенотипом антагониста интерферона, ответственным за аттенуацию.

Функция РВ1-Р2 была подробно описана Сбеп XV. е! а1., №11 Меб. 2001, 12:1306-12. Модификации РВ1-Р2 белка, как было показано, вносят вклад в вирусный патогенез у мышей, что описано 2атапп Ό. е! а1, 1. νΐΐΌ1., 2006, 80, 7976-7983.

Альтернативно вирус также может быть онколитическим вирусом. Главной чертой, типичной для онколитических вирусов, является их условно реплицирующийся генотип, позволяющий им расти в злокачественных клетках, но не в нормальной ткани. В предпочтительном воплощении изобретения это может быть онколитический вирус гриппа А, имеющий модификацию в гене N81, который не растет в 1Р№ компетентной системе, но эффективно реплицируется в системах, не способных экспрессировать функциональный интерферон.

Клетки, используемые для культивирования вирусов с применением культуральной среды с добавлением амфотерицина В, могут быть любыми клетками, которые могут расти ίη νίΙΐΌ на синтетической среде и могут применяться для размножения вирусов. В объеме данного изобретения термин клетки означает культивирование отдельных клеток, тканей, органов, клеток насекомых, клеток птиц, клеток млекопитающих, гибридомных клеток, первичных клеток, стабильных клеточных линий, и/или генноинженерных клеток, таких как рекомбинантные клетки, экспрессирующие вирус. Это могут быть, например, В8С-1 клетки (эпителиальные клетки почки африканской зеленой мартышки), ЬЬС-МК клетки (эпителиальные клетки почки обезьяны резус), θν-1 клетки (линия клеток самца африканской зеленой мартышки), СНО клетки (линия клеток яичников китайского хомячка), СО8 клетки (линия фибробластоподобных клеток почки африканской зеленой мартышки), мышиные клетки, клетки человека, НеЬа клетки (линия клеток человека), 293 клетки (эмбриональные клетки почки человеческого происхождения), Vе^о клетки (эпителиальные клетки почки африканской зеленой мартышки), МЭВК клетки (Мадин Дарби линия клеток почки быка), МОСК клетки (Мадин Дарби линия клеток почки собаки), МЭОК клеток (линия клеток почки овцы), СКРК клетки (эпителиальные клетки почки кошки), КАР клетки (линия клеток увеальной меланомы), ТСМК клетки (эпителиальные клетки почки мыши), ЬЬС-РК клетки (эпителиальные клетки почки свиньи), РК15 клетки (линия эпителиальных клеток почки свиньи), ν1-38 клетки

- 4 018438 (линия фибробластов легких человека), МКС-5 клетки (фибробласты легких человека), Т-ЕЬУ клетки (линия эпителиальных клеток дрозофилы), ВНК клетки (линия фибробластов почки хомяка), 8Р2/0 клетки (линия лимфобластов селезенки мыши), №0 (линия клеток миеломы), РегСб (клетки сетчатки человека), клетки яйца с развивающимся эмбрионом или их производные, клетки куриного яйца с развивающимся эмбрионом или их производные. Предпочтительно клеточной линией является клеточная линия УЕК0.

Культуральной средой, используемой для производства вирусов, может быть любая среда, известная в предшествующем уровне техники, применяемая для культивирования вирусов. Предпочтительно средой является синтетическая среда. Это могут быть, например, основные среды, такие как модифицированная среда Игла МЕМ, минимальная эссенциальная среда МЕМ, Дульбекко модифицированная среда Игла Ό-МЕМ, Э-МЕМ-Р12 среда, среда Вильямса Е, КРМ1 среда и их аналоги и производные. Это также могут быть специальные среды для культивирования клеток и выращивания вирусов, такие как УР-8ЕМ, ОрйРго™ 8ЕМ, А1М V® среда, 110 8ЕМ4МедаУ1г™, ЕХ-СЕЬЬ™ V его 8ЕМ, ЕР18ЕКР, РгоУего, любые 293 или СНО среды и их аналоги и производные. В среды могут добавляться любые добавки, известные в предшествующем уровне техники, применяющиеся для культивирования клеток и вирусов, такие как, например, фракции сыворотки животных или их аналоги, аминокислоты, факторы роста, гормоны, буферы, микроэлементы, трипсин, пируват натрия, витамины, Ь-глутамин и биологические буферы. Предпочтительной средой является ОрйРКО™ 8ЕМ с добавлением Ь-глутамина и трипсина.

В частности, амфотерицин В также может применяться для повышения эффективности процента заражения. Для увеличения заражения клеток клетки контактируют одновременно с вирусными частицами и амфотерицином В. Альтернативно клетки могут быть предварительно обработаны амфотерицином В незадолго до, одновременно или вскоре после добавления вирусных частиц к клеткам. Предпочтительный диапазон времени составляет, таким образом, около 1 ч до или после инфицирования, более предпочтительно около 0,5 ч до или после инфицирования.

Из предшествующего уровня техники хорошо известно, что высокий уровень множественности заражения (МО1) приводит к производству высокого количества дефектных вирусных частиц, демонстрирующих снижение или отсутствие инфективности. Таким образом, по экономическим и научным причинам является благоприятным обеспечение средств применения низкой (МО1 0,001), или даже лучше очень низкой МО1 (МО1 от 0,0001 до 0,00001), или даже более низкой МО1 для инфицирования клеток.

Применение добавки или смеси добавок в соответствии с данным изобретением может увеличивать вирусный рост по крайней мере на 0,1 1од 10, по крайней мере на 0,5 1од 10, предпочтительно по крайней мере на 1 1од 10, более предпочтительно по крайней мере на 2 1од 10, даже более предпочтительно по крайней мере на 2,5 1од 10, даже более предпочтительно по крайней мере на 5 1од 10.

Данное изобретение также обеспечивает средства ускорения и увеличения качества и чувствительности стандартных ТСГО50, ТСГО50-основанных анализов или реакции розеткообразования. В соответствии с применением амфотерицина В для культивирования вируса рост вируса ускоряется, и таким образом анализы могут быть проведены раньше, и может быть достигнут более точный результат титрования в более ранний момент времени.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ выделения вируса из клинических образцов, в котором клетки, например клетки Vе^о, инфицируют вирусными частицами из респираторного тракта пациента в присутствии амфотерицина В, инкубируют инфицированные клетки в подходящих условиях для стимуляции роста вируса в присутствии амфотерицина В и изолируют и характеризуют вирус.

Программы надзора над вирусом гриппа требуют эффективных систем для выделения вирусов гриппа из клинических образцов. Обычно эта процедура включает инфицирование куриных яиц с развивающимся эмбрионом или МОСК клеток материалом, взятым из смывов с носоглотки. Эффективность процедуры варьирует от года к году в зависимости от типа вируса и клеточного субстрата. Известно, что выделение на яйцах, а иногда на МОСК может приводить к генерации вариант вируса, отличающихся от реальных вирусов, циркулирующих в популяции человека. Было показано, что клетки Vе^о могут быть лучшим субстратом для выделения вируса гриппа и определения его характеристик, поскольку свойства полученных из Vе^о вирусов наиболее близко отражают природу вирусов человека (Кошаиоуа 1., е1 а1. 2003). В то же время, к сожалению, чувствительность клеточной линии Vе^о для выделения вируса ниже, чем у МОСК клеток.

В соответствии с изобретением амфотерицин В улучшает выделение вируса гриппа из клинических образцов на клетках Vе^о. Применение способа в соответствии с изобретением может обеспечить повышение процентов случаев положительного выделения, так как вирус очень трудно выделить повторно из клинических образцов на клетках Vе^о.

Вышеизложенное описание становится более понятным при ссылке на следующие примеры. Такие примеры являются, однако, просто представлением способов осуществления одного или более воплощений данного изобретения и не могут считаться ограничивающими объем изобретения.

- 5 018438

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1.

Целью данного изобретения является определение влияния амфотерицина В на различные вирусы гриппа при снижении множественности заражения. Три выбранных вируса отражают циркулирующие в настоящее время подтипы Η1Ν1, Η3Ν2 и В, а также рекомендованные ВОЗ для сезонной вакцины 2006/07 в северном полушарии (1Шр://\у\у\УЛУ1ю.1п1/с5г/бЬеа5е/тПиеп/а/уасстегесо1П1пепба1юп51/еп/).

Субконфлюэнтный монослой клеток Уего без сыворотки инфицировали со снижением множественности заражения 0,001, 0,0001 или 0,00001. Использовали два образцовых вируса типа А, А/Новая Каледония/20/99/ΗΙΝΙ) и А/Вена/28/2006(Н3№) (А/Висконсин/67/2005-подобный), а также один кандидат вируса В, В/Вена/32/2006 (В/Малайзия/2506/2004-подобный). В питательную среду, добавляемую после инфицирования, вносили 5 мкг/мл трипсин, а также 0 или 250 нг/мл амфотерицина В соответственно. Собирали надосадочную жидкость от всех клеток, инфицированных с одной и той же множественностью заражения (0 и 250 нг/мл амфотерицина В), когда наблюдался цитопатический эффект 50% и более при быстрорастущем вирусе. Титры вируса определяли с помощью ТСГО50 анализа.

Как показано на фиг. 1а, 1Ь и 1с, для всех трех анализируемых вирусов отмечалось положительное влияние амфотерицина В на вирусную репликацию. Для вируса А/Новая Каледония/20/99(НШ1) наблюдалось влияние амфотерицина В на рост вируса. В присутствии амфотерицина В титры были в диапазоне от 8Е+05 до 2Е+07 ТСГО50/мл со сниженной ΜΟΙ (множественностью заражения), при самой низкой ΜΟΙ было получено на 1 1од меньше вируса, когда не добавляли амфотерицин В. В случае А/Новая Каледония/20/99 наименьшая ΜΟΙ 0,00001 кажется наиболее оптимальной с точки зрения вирусного роста и влияния амфотерицина В.

Вирус А/Вена/28/2006 (Η3Ν2) подтвердил результаты вируса Η1Ν1, показав даже большую чувствительность к влиянию вещества. При всех трех анализируемых ΜΟΙ наивысший титр вируса был получен минимум на 1 1од меньше, чем при выращивании в присутствии амфотерицина В и сборе в тот же самый момент времени.

Даже более поразительный эффект субстанции наблюдался для вируса В/Вена/32/2006 (В/Малайзия/2506/2004-подобного). Титры, измеренные для вируса, выращенного в присутствии амфотерицина В, находились в диапазоне от 1Е+07 (ΜΟΙ 0,001) до 1Е+06 (ΜΟΙ 0,00001) ТСГО50/мл. Напротив, когда амфотерицин не добавляли, вирус плохо реплицировался, что приводило к титрам ниже 3Е+05 ТСГО50/мл, при наименьшей ΜΟΙ совсем не было получено вируса. По сравнению с вирусами А вирус В показал наибольшую чувствительность к веществу. Это можно отчасти объяснить тем фактом, что он был адаптирован к росту на клетках Уето без сыворотки в присутствии амфотерицина В.

В целом можно сделать вывод, что имеется ясное влияние амфотерицина В на вирусный рост всех трех обсужденных выше вирусных подтипов.

Материалы и методы.

Клетки и вирусы.

Клетки Уего культивировали в бессывороточных условиях, применяли среду ΟρΙίΡΐΌ™ 8ΕΜ с добавлением 4 мМ Ь-глутамина. Клетки культивировали путем пассажа каждые 2-3 дня в отношении 1:3 1:4. Использовали питательную среду 8ΕΜ с добавлением 4 мМ Ь-глутамина.

А/Новая Каледония/20/99 получали от ΝΙΒ8ί.’. продукт номер 03/208, и пассировали 3 раза на ΜΟί,’Κ клетки. Адаптацию к росту на клетках Уего без сыворотки проводили путем пассажей полученного из ΜΌΕΚ вируса 4 раза на клетках Уего при отсутствии амфотерицина В.

А/Вена/28/2006(№№) и А/Висконсин/67/2005(Η3N2)-подобный вирус выделяли из клинического образца и пассировали 1 раз на клетках ΜΌΕΚ с последующими 5 переносами на клетки Уего без сыворотки в присутствии и при отсутствии амфотерицина В.

В/Вена/32/2006, В/Малайзия/2506/2004-подобный вирус выделяли из клинического образца на ΜΟί,’Κ клетках (2 переноса), а затем адаптировали к росту на клетках Уего без сыворотки, пассируя 6 раз в присутствии амфотерицина В.

Анализ активности.

Титрование вирусов проводили с помощью анализа ТСГО50 (доза инфицирования клеточной культуры), теста на основе клеток, позволяющего проводить статистическое определение активности вируса на 96-луночном планшете. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали субконфлюэнтный монослой клеток Уего (96-луночный планшет), выращивали вирус в присутствии 5 мкг/мл трипсина и 250 нг/мл амфотерицина В при 33°С (В вирус) и 37°С (А вирус). Спустя 3-6 дней инкубации проверяли цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титр на основании формулы по Рееб ЬЭ. е1 а1., 1938, Ат. 1. Ηγ§. 27:493-497.

Пример 2.

Вирус В (В/Малайзия/2506/2004-подобный) и вирус Α/Η1Ν1 (А/Новая Каледония/20/99(Ш№)подобный ΔΝ81) титровали двумя различными методами в присутствии и при отсутствии амфотерицина В. В обоих случаях отмечалось четкое влияние вещества на окончательный титр вируса, как показано на фиг. 2а и Ь.

- 6 018438

На фиг. 2а В/Вена/32/2006 (В/Малайзия/2506/2004-подобный) серийно разводили и титровали в параллелях в присутствии и при отсутствии 250 нг/мл амфотерицина В в реакции розеткообразования. Спустя 5 суток инкубации при 33°С подсчитывали розетки и напрямую сравнивали их число.

На фиг. 2Ь (А/Новая Каледония/20/99(НШ1)-подобный ΔΝ81 вирус серийно разводили и титровали в параллелях в присутствии и при отсутствии 250 нг/мл амфотерицина В с помощью ТСГО50 анализа. Спустя 3 суток инкубации при Лйет 37°С оценивали цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титры.

Как можно видеть на фиг. 2а, был получен титр на 2 1од выше, когда тот же самый вирус выращивали в присутствии амфотерицина В. В присутствии амфотерицина В был достигнут титр вируса В более 1Е+08 БОЕ/мл. Этот результат четко показывает, что чувствительность реакции розеткообразования существенно возрастает при добавлении вещества.

На фиг. 2Ь Α/Η1Ν1 вирус титровали путем ТСГО50 в присутствии и при отсутствии амфотерицина В. Также отмечено значительное повышение титра, достигнуто повышение чувствительности около 1 1од.

Материалы и методы.

Клетки и вирусы.

Клетки Уего культивировали в бессывороточных условиях, используя среду ОрБРто™ 8РМ с добавлением 4 мМ Ь-глутамина. Клетки культивировали путем пассажей каждые 2-3 дня в отношении 1:31:4 при 37°С, 5% СО₂.

В/Вена/32/2006 получали из В/Малайзия/2506/2004-подобного клинического изолята, выделяли на МОСК клетках (2 переноса), а затем адаптировали к росту на клетках Уето без сыворотки, перенося 6 раз в присутствии амфотерицина В при 33°С.

А/Новая Каледония/20/99(НШ1)-подобный ΔΝ81 вирус содержит поверхностные белки НА и ΝΑ из вируса А/Новая Каледония/20/99(НШ1) и внутренние сегменты из А/Пуэрто-Рико/8/34, при отсутствии части N8 (неструктурного) сегмента. Вирус получали методом обратной генетики и переносили на клетки Уего при отсутствии амфотерицина В при 37°С.

Анализ активности.

Реакция розеткообразования.

Титрование вируса проводили реакцией розеткообразования. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали конфлюэнтный монослой клеток Уего в верхний слой, состоящий из питательной среды Уего, добавляли 0,01% ДЭАЭ декстран, 10/ЭМЕМ. насыщенную гидрокарбонатом натрия, 5 мкг/мл трипсина и 0 или 250 нг амфотерицина В.

ТС1Э50 анализ.

ТСГО50 (дозы инфицирования клеточной культуры) анализ является тестом на основе клеток, позволяющим проводить статистическое определение активности вируса на 96-луночном планшете. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали субконфлюэнтный монослой клеток Уего (96луночный планшет), выращивали вирус в присутствии 5 мкг/мл трипсина и в присутствии или при отсутствии 250 нг/мл амфотерицина В при 37°С. Спустя 3 дня инкубации проверяли цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титр на основании формулы по Яееб ЬЭ. е1 а1., 1938, Ат. 1. Нуд. 27:493497.

Пример 3.

В данном эксперименте различные дозы амфотерицина В добавляли после инфекции клеток Уего А/Висконсин/67/2005(Н3№)-подобным вирусом. При повышении концентрации амфотерицина В репликация вируса могла усиливаться, концентрации между 62,5 и 1000 нг/мл показали четкий эффект.

Субконфлюэнтный монослой клеток Уего без сыворотки инфицировали А/Вена/28/2006(Н3№) А/Висконсин/67/2005-подобным вирусом при множественности заражения 0,001. Вирус выращивали в присутствии различных концентраций амфотерицина В, а именно 0, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 и 1000 нг/мл. Вирус собирали спустя 48 ч и титровали с помощью ТСГО50 анализа в присутствии 250 нг/мл амфотерицина В.

Были получены титры в диапазоне от 8Е+05 до 4Е+07 ТСГО50/мл. При двух самых низких концентрациях (0 и 31,25 нг/мл) титры вируса были ниже 1Е+06 ТСГО50/мл, при этом титры вируса возрастали до более 3Е+07 ТСГО50/мл при 250 и 500 нг/мл амфотерицина В. Для иллюстрации результатов см. фиг. 3.

Материалы и методы.

Клетки и вирусы.

Клетки Уего культивировали в условиях без сыворотки, используя среду ОрДРто™ 8РМ с добавлением 4 мМ Ь-глутамина. Клетки культивировали путем пассажей каждые 2-3 дня в отношении 1:3-1:4 при 37°С, 5% СО₂.

А/ВеНа/28/2006(Н3№), А/Висконсин/67/2005(Н3№)-подобный вирус, полученный из клинического образца, переносили 1 раз на МОСК клетки с последующими 5 переносами на клетки Уего без сыворотки в присутствии и при отсутствии амфотерицина В.

- 7 018438

Анализ активности.

Титрование вирусов проводили с помощью анализа ТСГО50 (доза инфицирования клеточной культуры), теста на основе клеток, позволяющего проводить статистическое определение активности вируса на 96-луночном планшете. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали субконфлюэнтный монослой клеток Уего (96-луночный планшет), выращивали вирус в присутствии 5 мкг/мл трипсина и 250 нг/мл амфотерицина В при 33°С (В вирус) и 37°С (А вирус). Спустя 3-6 дней инкубации проверяли цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титр на основании формулы по Вееб Ь.1. е1 а1., 1938, Ат. 1. Нуд. 27:493-497.

Пример 4. Применение амфотерицина В для эффективного восстановления вируса после трансфекции.

В данном примере свободные от сыворотки клетки Уего трансфицировали 8 плазмидами, кодирующими 8 сегментов А/Висконсин/67/2005(Н3Ы2)-подобного вируса, как описано НоГГтап е1 а1., включая некоторые модификации (НоГГтапп Е. е1 а1., РгосНабАсаб8с1, 2002, 99:11411-6). Питательную среду, содержащую 250 нг/мл амфотерицина В и 5 мкг/мл трипсина, добавляли спустя 6 ч. Вирус частично собирали спустя 6 дней после трансфекции, когда наблюдался четкий цитопатический эффект трансфицирующего вируса, выращенного в присутствии амфотерицина В, и также были видны признаки цитопатического эффекта при отсутствии амфотерицина В. Вирус без амфотерицина В дополнительно контролировали еще 3 дня, при этом не наблюдалось каких-либо признаков нарастания цитопатического эффекта. Титр определяли с помощью ТСГО50 анализа в присутствии 250 нг/мл амфотерицина В.

Как показано в табл. 1, в присутствии амфотерицина В получен титр 2Е+04 ТСГО50/мл, в то время как при его отсутствии не обнаруживалось вируса.

Этот пример четко указывает, что вирус, который иначе не растет, может быть эффективно восстановлен только в присутствии амфотерицина В.

Материалы и методы.

Клетки и вирусы.

Клетки Уего культивировали в условиях без сыворотки, с применением среды ОрбРго™ 8РМ с добавлением 4 мМ Ь-глутамина. Клетки культивировали путем пассажей каждые 2-3 дня в отношении 1:3 1:4 при 37°С, 5% СО₂.

А/Вена/28/2006(Н3Ы2), являющийся А/Висконсин/67/2005(Н3Ы2)-подобным вирусом, полученным из клинического образца, переносили 1 раз на МОСК клетки с последующими 5 переносами на клетки Уего без сыворотки в присутствии и при отсутствии амфотерицина В.

Сегменты вируса клонированы в плазмиды, в одно и то же время делающие возможной транскрипцию вирусной РНК в качестве матрицы для генома, а также мРНК для дальнейшего процессинга для вирусного белка (НоГГтапп е1 а1.; Е|д1и-р1а51шб куйет Гог 1Не гар1б депегабоп оГ тПиепха νίπΐδ уасстек, Уасс1пе (20). 2002), где плазмиды были соответственно модифицированы. Все 8 плазмид трансфицировали в клетки Уего путем электропорации. Спустя 6 ч после трансфекции добавляли среду без сыворотки, содержащую 5 мкг/мл трипсина, а также 0 и 250 нг/мл амфотерицина В соответственно. Трансфицированный вирус частично собирали спустя 6 суток и дополнительно наблюдали последующие 3 суток.

Анализ активности.

Титрование вируса проводили с помощью анализа ТСГО50 (доза инфицирования клеточной культуры), теста на основе клеток, позволяющего проводить статистическое определение активности вируса на 96-луночном планшете. Готовили серийные разведения вируса, инфицировали субконфлюэнтный монослой клеток Уего (96-луночный планшет), выращивали вирус в присутствии 5 мкг/мл трипсина и 250 нг/мл амфотерицина В при 33°С (В вирус) и 37°С (А вирус). После периода инкубации до 6 суток проверяли цитопатический эффект в лунках и подсчитывали титр на основании формулы по Вееб Е1. е1 а1., 1938, Ат. 1. Нуд. 27:493-497.

В таблице показано восстановление вируса после трансфекции в присутствии и при отсутствии амфотерицина В. Клетки Уего трансфицировали 8 плазмидами, кодирующими 8 сегментов А/Висконсин/67/2005(Н3Ы2)-подобного вируса. Спустя 6 ч после трансфекции добавляли среду, содержащую 5 мкг/мл трипсина и 0 или 250 нг/мл амфотерицина В. Вирус титровали с помощью ТСГО50 анализа.

Добавление амфотерицина В [+/-]	титр [ТСЮ50/МЛ]
	2.0Е+04
-	< 1.0Е+01

Пример 5. Выделение вируса из клинических образцов на клетках Уего с применением амфотерицина В.

клинических образцов от пациентов с подтвержденной инфекцией вирусом гриппа В оценивали на частоту вирусного выделения на клетках Уего в присутствии или при отсутствии амфотерицина В. Когда амфотерицин В не добавляли, вирус был успешно выделен только из 3 образцов. В то же самое

- 8 018438 время, когда в поддерживающую среду добавляли 500 нг/мл амфотерицина В, все 9 проб были положительными.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение амфотерицина В в качестве добавки в культуральную среду для стимуляции роста вируса.
2. Применение по п.1, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 0,5 нг/мл и 5 мкг/мл.
3. Применение по п.2, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 0,5 нг/мл и 2,5 мкг/мл.
4. Применение по п.2, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 10 и 900 нг/мл.
5. Применение по п.2, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 100 и 500 нг/мл.
6. Применение по п.2, в котором амфотерицин В находится в концентрации между 200 и 400 нг/мл.
7. Применение по любому из пп.1-6, в котором вирус является ДНК- или РНК-вирусом.
8. Применение по любому из пп.1-7, в котором вирус является членом семейства Оййотухоушбае, Ркотаушбае, Тодаушбае или Рататухоушбае.
9. Применение по любому из пп.1-7, в котором РНК-вирус выбран из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, вируса гриппа С, риновируса, вируса кори, вируса свинки, вируса краснухи, вируса бешенства или вируса парагриппа и их производных.
10. Применение по любому из пп.1-9, в котором РНК-вирус содержит модификацию в гене N81 и/или РВ1.
11. Применение по любому из пп.1-10, в котором вирус является онколитическим вирусом.
12. Применение по любому из пп.1-11, в котором клетки выбраны из группы, состоящей из В8С-1 клеток, ЕЬС-МК се11§, СУ-1 клеток, СНО клеток, СО8 клеток, мышиных клеток, человеческих клеток, НеЬа клеток, 293 клеток, УЕВО клеток, МБВК клеток, МОСК клеток, МБОК клеток, СВЕК клеток, КАЕ клеток, ТСМК клеток, БЬС-РК клеток, РК15 клеток, \¥-38 клеток, МВС-5 клеток, Т-ЕЬУ клеток, ВНК клеток, 8Р2/0 клеток, N80, РегС6, клеток или производных куриного эмбриона, клеток оплодотворенных яиц, в том числе оплодотворенных куриных яиц.
13. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 0,1 1од 10.
14. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 0,5 1од 10.
15. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 1 1од 10.
16. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 2 1од 10.
17. Применение по любому из пп.1-12, в котором увеличение вирусного роста составляет 2,5 1од 10.
18. Способ культивирования вируса в присутствии амфотерицина В, включающий:

a) инфицирование клеток по крайней мере одной инфекционной вирусной частицей,

b) добавление амфотерицина В в культуральную среду вместе с трипсином,

c) инкубацию инфицированных клеток в культуральной среде, полученной на стадии Ь), в подходящих условиях в присутствии амфотерицина В и

б) сбор полученного вируса.
19. Способ по п.18, дополнительно включающий очистку и/или определение характеристик вируса.
20. Способ культивирования вируса в присутствии амфотерицина В, включающий:

a) добавление амфотерицина В в вирусный инокулят,

b) инфицирование клеток указанным инокулятом,

c) инкубацию инфицированных клеток в культуральной среде в подходящих условиях в присутствии амфотерицина В и

б) сбор полученного вируса.
21. Способ по п.20, дополнительно включающий очистку и/или определение характеристик вируса.
22. Способ идентификации вируса, полученного из клинических образцов респираторного тракта пациента, включающий:

a) инфицирование клеток вирусом, полученным из респираторного тракта пациента;

b) инкубацию инфицированных клеток в культуральной среде в подходящих условиях в присутствии амфотерицина В;

c) выделение и определение характеристик вируса.