KR20070060049A

KR20070060049A - 인플루엔자 백신의 제조방법

Info

Publication number: KR20070060049A
Application number: KR1020067026887A
Authority: KR
Inventors: 피에르 트래패니어; 로버트 두그레; 탐 하셀
Original assignee: 아이디 바이오메디칼 코포레이션
Priority date: 2004-05-20
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2007-06-12
Also published as: RU2006145303A; MA28641B1; IL179251A0; CN101094915A; JP2007537760A; AU2005245943A1; BRPI0511152A; NO20065882L; EP1747268A1; NZ551640A; CA2566858A1; WO2005113758A1; US20080254067A1; ZA200609543B; MXPA06013411A

Abstract

본 발명은 예방, 진단, 면역치료 또는 치료 목적을 위한 인플루엔자 바이러스 또는 항원의 산업적-규모의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인플루엔자 백신, 보다 특히 인플루엔자 A형 및 B형을 포함하는 사람 백신의 매딘-다비 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney; MDCK) 유래의 세포주 및 세포 배양물에 기반한 제조방법에 관한 것이다.

인플루엔자 백신, 매딘-다비 개 신장(MDCK) 유래 세포주, 산업적-규모 제조방법, 인플루엔자 A형 및 B형

Description

인플루엔자 백신의 제조방법{Process for the production of an influenza vaccine}

본 출원은 2004년 5월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/572,612호[이는 본원에서 참조로 인용된다]를 우선권으로 주장한다.

본 발명은 일반적으로 예방, 진단, 면역치료 또는 치료 목적을 위한 인플루엔자 바이러스 또는 항원의 산업적-규모의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인플루엔자 백신, 보다 특히 인플루엔자 A형 및 B형을 포함하는 사람 백신의 매딘-다비 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney; MDCK) 유래의 세포 배양물에 기반한 제조방법에 관한 것이다.

전통적으로, 시판용 인플루엔자 백신은 암탉의 발육란에서 백신 바이러스 균주를 성장시킴으로써 제조되어 왔다. 이러한 바이러스는 요막액으로부터 수거되고 가공되어 백신으로 제조된다. 그러나, 이러한 과정은 전염병 기간 동안 심각한 제약을 나타내는 요인인, 노동 집약적이고 난(卵)당 수율이 낮다는 단점을 지니고 있 다. 따라서, 암탉의 발육란 방법의 비용, 시간 및 수율 단점을 극복하는 인플루엔자 바이러스 백신의 대규모 제조법이 요구되고 있다.

상기에 대한 대안적 방법은 인플루엔자 바이러스 입자 또는 바이러스 단백질을 제조하기 위한 세포 배양물의 사용을 포함한다.

세포 배양물로 제조된 인플루엔자 백신은 난에서 생산된 백신에 비해 안전하고 아동 및 성인이 경험하는 난-기반 백신에 대한 과민성을 유도하지 않을 것으로 사료된다. 또한, 이러한 백신은, 바이러스 복제의 정확도(fidelity)가 난에서보다 세포 배양물에서 클 것으로 사료되기 때문에, 특히 장년층에서 보다 광범위한 스펙트럼의 야생 균주에 대한 보다 우수한 보호를 부여할 것이다[참조: Katz, J.M., et al, 5 J. Infect Diseases 160:191, 1989]. 게다가, 전염병 또는 범유행병의 경우, 난 공급의 한계 때문에 현재 가능한 공급량보다 많은 공급량의 인플루엔자 백신을 제조할 수 있다.

인플루엔자 A 및 B 바이러스 증식은 닭 배아, 사람 배아 폐 및 신장, 원숭이 신장 및 소 태아 신장을 포함하는 각종 조직-배양물 시스템에서 입증되었다.

특히, 개 신장 세포는 낮은 수율, 즉 백신 제조 목적으로 불충분하기는 하나 인플루엔자 바이러스의 제조용으로 유용한 것으로 제시되어 왔다.

개 신장 세포는 본래 1958년에 매딘(S.H. Madin) 및 다비(N.B. Darby)에 의해 외견상 정상인 성체 암컷 코커 스파니엘(Cocker Spaniel)으로부터 유도되었다[참조: American Type Culture Collection(ATCC), Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7th edition, p.21, 1992]. MDCK 세포주는 1964년에 (제CCL 34호로) ATCC에 기탁되었으며 수포성 구내염, 백시니아, 콕사키, 레오바이러스 및 아데노바이러스를 포함하는 수개의 바이러스의 복제를 가능하게 하는 것으로 확인되었다.

인플루엔자 바이러스 B형의 연속 증식(serial propagation)은 1962년에 그린(Green)[참조: Science 30 138:42, 1962]에 의해 MDCK 세포주에서 최초로 입증되었다. 증식은 6개의 연속적 조직-배양물 계대 각각에서 세포병변 효과와 인플루엔자 바이러스의 주요 당단백질인 헤마글루티닌(HA)의 존재에 의해 및 조직 배양액에서 난-감염 역가에 의해 증명되었다. 그러나, 이들 데이타는 소규모로 제한되며 백신 목적을 위한 바이러스 입자 또는 단백질의 대규모 제조를 달성하는 수단은 제공하지 못한다. 가우쉬(Gaush) 등은 1966년에 MDCK 세포가 인플루엔자 A 감염에도 감수성이었음을 입증하였다. 그러나, 상기 논문은 감염성만을 보고하였으며 이러한 배지에서의 바이러스의 증식 문제에 대해서는 제기하지 않았다[참조: Gaush et al., Proc. Soc. Exp. Biol, and Med., 122: 931, 1966]

1975년에, 토비타(Tobita) 등은 트립신을 함유한 중층 배지내의 확립된 MDCK 세포주에서의 매우 광범위한 인플루엔자 A 바이러스의 성장을 최초로 기술하였다. 바이러스 증식은 이의 이전 계대 내역에도 불구하고 잘 한정된 플라크를 형성하였으며, 이는 트립신이 HA 폴리펩타이드의 분열에 기여함으로써 인플루엔자 바이러스의 성숙을 가속화시킴을 제안하였다. 트립신의 사용이라는 진보가 이루어졌음에도 불구하고, 아가 배지내 바이러스 분리는 바이러스의 대규모 제조를 성취하기 위한 수단을 제공하지 못하였다. 동일한 참조문헌에서는, MDCK 세포는 환자의 인후 세척액으로부터 인플루엔자 A 바이러스를 1차 분리하기 위해 성공적으로 사용되기도 하였다.

이후, 류베니(Reuveny) 등은 셀룰로즈-기반한 미립담체(미립담체)상의 MDCK 세포에서 A형 인플루엔자 바이러스를 회분 배양으로 성장시켰다[참조: Develop. Biol. Standard 50:115, 1982]. 트립신-함유 배지에서 수득된 인플루엔자 바이러스 역가는 발육란에서와 유사하였다.

미국 특허 제4,500,513호(Brown 등)에는 바이러스 항온처리 동안 트립신과 같은 단백질가수분해 효소를 배양물에 포함시킴으로써 인플루엔자 바이러스를 동일한 액체 배양물의 연속적 세포 수로 복제하는 방법이 기재되어 있다. 단백질분해 효소는 HA가 기능적이 되게 함으로써 종래의 액체 배양 기술의 1단계 성장 사이클을 극복하는데 요구된다. 이는 액체 세포 배양물로부터의 "시판용" 인플루엔자 백신 제조 가능성에 대한 최초의 기재이다.

그러나, 현재 용액 중의 트립신의 존재는 MDCK 세포의 특정 분획을 이의 고체 지지체로부터 제거해야 한다는 단점을 갖고 있는 것으로 간주된다. 따라서, 트립신 필요성은 상기한 특허받은 방법의 잠재적 유용성에도 불구하고 인플루엔자 백신의 상업적 제조에 대한 심각한 제약이 된다. 따라서, 인플루엔자 백신의 제조를 위한 상업적 세포 배양물-기반한 방법이 여전히 요구된다. 이는 문헌의 다음 보고서에 의해 뒷받침된다[참조: Kodihalli et al., J. Virol. 69(8) : 4888, 1995: "Embryonated chicken eggs are currently the only host in which sufficient quantities of virus can be cultivated economically and within the short time necessary to ensure a vaccine supply"].

또한, 1995년에 세계보건기구(WHO)는, 1995년 여름에 인플루엔자 백신의 세포 배양물-기반 제조방법에 관한 최근의 진보를 평가하기 위해 당해 분야의 숙련가들이 모였을 때 이루어진 논의를 요약하는 비망록을 공표하였다[참조: Bull. W.H.O. 73(4) : 431, 1995]. 상기 문서는 신속하게 규모를 확대시킬 수 있는 세포 배양 다량의 인플루엔자 백신의 신속한 제조를 달성하기 위해서 더욱 연구할 것을 권고하고 있다.

조사 목적을 위한 세포 배양물중 바이러스의 성장을 위해, MDCK 및 Vero 세포는 몇몇 바이러스의 가장 우수한 생산자로서 가장 빈번하게 언급되고 있다. 그러나, 대규모 제조 목적상, 1가지 또는 다수의 바이러스에 대한 감수성, 바이러스 역가의 산출, 부착(anchorage)-의존성, 종양발생성 등과 같은 몇몇 요인들이 다른 세포주에서 특정 세포주를 선택하는데 영향을 준다.

MDCK 세포가 몇몇 바이러스 균주에 대해 감수성이라 해도, 수득된 불량한 역가는 대규모 제조 목적을 위한 당해 세포주의 유용성을 제한할 수 있다.

MDCK 세포주의 특성은 일부 연구의 주제가 되어 왔다. 1970년에, 라이튼(Leighton) 등[참조: Cancer 26:1022]은 MDCK 세포가 콜라겐-피복된 셀룰로즈 스폰지상에서 3차원 조직 배양물 중에서 유두상 선암종의 형태 패턴을 나타냈음을 보고하였다. 당해 세포주의 종양 성질은 11일령 또는 12일령 닭 배아에게 주사된 세포의 현탁액이 뇌 전이의 다수의 병소(focus)를 발생시킨 것으로 확인된 경우에 입증된 것이다.

세포주의 종양발생성의 평가는 당해 세포주가 생물학적 제품의 제조에서 사 용하기에 바람직한가를 평가하기 위해 중요하다. 미국식품의약청 산하 생물제제 평가 및 연구센터(Center for Biologics Evaluation and Research)는 세포 배양물을 생물제제의 제조를 위한 기질로서 사용하는 경우에 고려해야 하는 주안점들을 공표하였다[참조: Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals, Office of Biologies Research and Review, Center for Drugs and Biologies, FDA (USA), 1993]. 이러한 주안점 중 하나는 사용되는 세포주의 종양발생성이며, FDA는 생체내 종양발생성 시험에 대한 지침을 고안하였다. 이 지침은 특히 누드 마우스(nu/nu)에서 피하 또는 근욱내 경로로 투여되는 세포의 시험을 요구한다.

발명의 개요

따라서, 본 발명은

(a) 인플루엔자 바이러스를 복제할 수 있는 MDCK 세포주를 성장시키는 단계;

(b) MDCK 세포 배양물을 인플루엔자 바이러스 균주로 감염시키고 당해 바이러스가 복제되도록 항온처리하는 단계; 및

(c) 복제된 바이러스를 수거하고 이로부터 바이러스 입자 또는 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 입자 또는 단백질의 대규모 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 바이러스 감염에 대해 고도로 감수성이고 이의 모(母) 세포주보다 높은 역가로 인플루엔자 바이러스를 생산하는, MDCK 세포주로부터 유래된 세포주를 제공한다.

도 1은 본 발명의 관류 수단에서 사용되는 경사분리기의 전방 단면도이다.

도 2는 당해 경사분리기의 상단 입면도이다.

도 3은 당해 경사분리기의 하단 입면도이다.

하나의 양태에서, 본 발명의 MDCK 유래의 세포주는 인플루엔자 바이러스의 다단계 복제를 가능하게 한다. 다른 양태에서, 본 발명의 MDCK 세포주는 부착-의존성이고 비-종양발생성이다.

본 발명은 바이러스 감염에 대해 초-감수성인 MDCK 클론의 유도법을 제공한다. "초-감수성"이란 용어는 적어도 1개의 바이러스에 대해 고도로 감수성이여서 모 MDCK 세포주에 비해서 고 역가의 바이러스 입자를 생산하는 MDCK 유래 세포주를 지칭하기 위해 사용된다. 이렇게 유도된 클론 MDCK.5F1은 1996년 2월 8일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬레션(American Type Culture Collection; ATCC)에 제CRL-12042호로서 기탁되었다. 하나의 양태에서, 본 발명의 MDCK 유래의 세포주는 FDA 지침에 따라 수행된 시험에서 비-종양발생성이며, 따라서 예방, 진단, 면역치료 또는 치료 목적을 위한 바이러스 또는 항원의 제조에서 사용하기에 적합하다. 당해 세포주는 오염 미생물의 존재에 대해 시험되었으며 어떠한 오염 미생물도 검출되지 않았다.

본 발명에 따라서, 백신 제조를 위한 인플루엔자 바이러스 입자 또는 단백질의 대규모 제조방법이 또한 제공된다.

본 발명의 한 측면에 따라서, 인플루엔자 백신의 제조를 위한 인플루엔자 바이러스 입자 또는 단백질의 대규모의 세포-배양된 미립담체-기반 산업적 제조방법이 또한 제공된다.

본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스의 다중 복제를 위해 MDCK 세포주를 사용하여 수행된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 MDCK 세포주는 ATCC 세포주 제CRL-12042호의 생물학적 특성과 동일한 생물학적 특성을 갖는다. 하나의 양태에서, 당해 방법에서 사용되는 세포주는 ATCC 제CRL-12042호로서 기탁된, 본원에서 MDCK.5F1로서 지정된 MDCK 세포주의 클론이다.

본 발명의 MDCK 유래의 세포주는 바이러스 감염에 대해 고도로 감수성이다. 이러한 범주에서 바이러스 감염에 대해 "매우 감수성인"은 당해 세포주가 하나 이상의 바이러스 균주에 대해 모 세포주에 의해 생산되는 역가에 비해 높은 역가를 생산할 수 있음을 의미한다.

하나의 양태에서, "높은 감수성"은 모 세포주에 의해 생산된 바이러스 역가의 약 1.2배 이상의 역가로 바이러스를 생산할 수 있는 세포주로서 정의된다. 하나의 양태에서, 높은 감수성 세포주는 3B5, 5F1, ID11, 5H12, 9C2, 9D9, P79, 9E9, 7C1 및 P123으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 클론이다.

하나의 양태에서, 보다 높은 감수성은 동일한 바이러스에 대해 모 세포주에 의해 생산된 역가의 약 2배 이상의 역가로 다수의 바이러스를 생산할 수 있는 세포주로서 정의된다. 하나의 양태에서, 이러한 클론은 3B5, 5F1, 5H12, 9C2, 7C1 및 P123로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 보다 높은 감수성은 동일한 바이러스의 2가지 상이한 균주에 대해 모 세포주에 의해 생산된 바이러스 역가의 약 2배 이상의 역가로 다수의 바이러스를 생산할 수 있는 세포주로서 정의된다. 하나의 양태에서, 이러한 클론은 호흡기 합포체 바이러스 및 인플루엔자 A형 및 B형에 대해 모 세포주의 바이러스 역가보다 2배 높은 바이러스 역가를 생산할 수 있다. 하나의 양태에서, 이러한 클론은 5F1 및 5H12로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 세포주는 인플루엔자, 호흡기 합포체 바이러스, 파포바바이러스, 파라인플루엔자, 수포성 구내염, 백시니아, 콕사키, 레오바이러스, 파보바이러스, 아데노바이러스, 소아마비, 홍역, 광견병, 헤르페스 및 기타 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이러스에 의해 감염될 수 있다.

하나의 양태에서, 바이러스는 인플루엔자 A형, B형 및 C형; 호흡기 합포체 바이러스; 파포바바이러스; 수포성 구내염(인디아나(Indiana) 균주); 콕사키 B-5; 레오바이러스 2형 및 3형; 및 아데노바이러스 4형 및 5형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 바이러스는 인플루엔자 A형, B형 및 C형 및 호흡기 합포체 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 바이러스는 사람, 말, 돼지 또는 조류 인플루엔자 균주로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 바이러스는 사람 인플루엔자 A형, B형 또는 C형으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 본 발명의 세포주는 사람 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형에 의해 감염될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명의 세포주는 사람 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형 둘다에 의해 감염될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명의 세포주는 트립신, 키모트립신, 펩신, 판크레아틴, 파파인, 프로나제 및 카복시펩티다제와 같은 단백질분해 효소를 부가하는 경우 인플루엔자 바이러스의 다단계 복제를 가능하게 한다. 하나의 양태에서, 이러한 세포주는 트립신을 부가하는 경우 인플루엔자 바이러스의 다단계 복제를 가능하게 한다.

대안으로, 본 발명의 세포주는 트립신, 키모트립신, 펩신, 판크레아틴, 파파인, 프로나제 및 카복시펩티다제와 같은 단백질분해 효소의 부가를 요구함이 없이 인플루엔자 바이러스의 다단계 복제를 가능하게 한다. 하나의 양태에서, 이러한 세포주는 트립신의 부가를 요구함이 없이 인플루엔자 바이러스의 다단계 복제를 가능하게 한다.

바이러스 또는 바이러스 균주가 단백질분해 효소의 사용을 요구할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다.

본 발명의 세포주를 현탁액 중에서 배양할 수 있지만, 이를 부착-의존성 방식으로 성장시키는 것이 바람직하다. 하나의 양태에서, 미립담체 비이드상에서 성장시켜 세포 배양물중에서 고농도의 세포를 수득하는 것도 가능하다.

하나의 양태에서, 본 발명의 MDCK 유래의 세포주는 비-종양발생성이다. 하나의 양태에서 본 발명의 세포주는 연질 아가에서 최소 효율(즉, 1% 미만의 효율)로 성장한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 세포주는 3개월 이상 관찰하는 경우 누드 마우스에서 결절을 발생시키지 않는다.

본 발명은 바이러스 입자 또는 바이러스 단백질을 대량으로 생산하기 위한 본 발명에 따른 세포주의 사용을 의도한다.

이러한 바이러스 입자 또는 단백질은 숙주에서 바이러스 감염의 예방을 위한 백신의 제조에서 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 숙주는 포유동물이다. 포유동물에는 예를 들면, 사람, 말, 돼지 종이 포함된다. 다른 양태에서, 숙주는 사람이다. 추가의 양태에서, 숙주는 조류 종(예를 들면, 오리 또는 닭)이다.

본 발명의 방법은 트립신의 존재가 배양물중에서 성장하는 부착-의존성 MDCK 세포의 능력에 영향을 미치지 않는 한 트립신의 존재 또는 부재하에 수행할 수 있다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 약 4㎍/ml 이하의 농도의 트립신의 존재하에 수행한다. 대안으로, 당해 방법은 트립신의 부재하에 수행한다.

본원에서 기술하는 방법은 호흡기 합포체 바이러스 및 인플루엔자 바이러스의 사람, 말, 돼지 및 조류 균주와 같은 각종 인플루엔자 바이러스의 생산을 위함이다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술하는 방법은 사람 인플루엔자 A형, B형 또는 C형의 생산을 위함이다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술하는 방법은 사람 인플루엔자 A형 또는 B형의 생산을 위함이다. 하나의 양태에서, 본원에서 기술하는 방법은 사람 인플루엔자 A형 또는 B형 중 어느 한 형에 의해 감염될 수 있는 MDCK 세포주를 사용하여 사람 인플루엔자 A형 및 B형을 생산하기 위함이다.

본 발명의 방법은 4㎍ HA/10⁶개 MDCK 세포의 범위의 수율을 산출한다. 실시예 9에 기술된 바와 같이, 당해 방법은 4㎍ HA/10⁶개 MDCK 세포보다 많은, 보다 특히 9㎍ HA/10⁶개 MDCK 세포의 범위의 바이러스 단백질 양을 산출한다.

"대규모 방법"은 다량의 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법을 의미한다. 이러한 방법은 일반적으로 배양 플라스크와 대조적으로 생물반응기에서 수행된다. 상기 생물반응기는 요구되는 최종 수율/용량에 따라서 크기가 달라질 수 있다. 예를 들면, 이러한 생물반응기는 크기가 약 5리터(이때 사용 용적(working volume)은 약 4리터이다)일 수 있거나, 5000리터 이하일 수 있다. 물론, 대규모 세포 배양물-기반 백신 생산 분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 모든 반응물, 배지, 영양소, 세포 농도, 미립담체 농도, 관류속도 등은 생물반응기의 크기에 따라서 조정될 수 있다.

본 발명의 방법은 현탁 배양으로 수행될 수 있지만, 세포 농도를 증가시키기 위해(이에 따라 바이러스 산출량을 증가시키기 위해) 미립담체 수단상에서 수행한다. 예를 들면, 덱스트란 중합체(Cytodex^TM)와 같은 당업계에 공지된 종류의 미립자담체 비이드를 선택할 수 있다. 이들 미립담체는 약 5 내지 25g/L 범위의 농도로 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 미립담체 농도는 약 10 내지 25g/L의 범위이다. 하나의 양태에서, 미립담체 농도는 약 15 내지 20g/L의 범위이다.

관류 수단은 당해 방법에서 세포 성장 및 바이러스 복제 둘다를 최대화하기 위해 도입된다. 관류는 영양소가 일정하게 공급될 수 있게 하는 동시에 배양 배지에서 생성물에 의한 잠재적인 독성의 축적을 피하는 수단을 제공한다. 관류 동안, 영양소 유형 및 양은 당해 방법의 다양한 단계 동안에 변화될 수 있다. 예를 들면, 혈청은 성장기 동안 세포에 도입시킬 수 있지만, 이상적으로는 세포 컨플루언시(confluency)에서 바이러스를 도입하기 전에 제거해야만 한다. 관류 유속을 세포 성장기 동안에 점차 증가시켜 적당한 영양소 공급을 제공한다. 관류는 바이러스 복제 동안에 계속한다.

관류속도는 당해 방법의 단계에 따라서 약 0.5 내지 4 생물반응기 용적/일로 조정한다.

관류 수단은 생물반응기에 부가한다. 이는 생물반응기에 배양 배지를 연속적으로 도입하기 위한 입구 수단 및 사용된 배양 배지를 생물반응기로부터 연속적으로 제거하기 위한(이에 따라 생물반응기에서 미립담체 현탁액을 통해서 배양 배지의 연속 흐름을 생성하는) 2개의 출구 수단, 및 당해 출구 수단과 결합된 경사분리기를 포함한다. 상기 제안된 바와 같은 관류 수단을 사용하고 10g/L 초과의 미립담체 농도를 사용하는 경우, 세포 성장이 위쪽을 향해서 이동하고 당해 출구 수단을 경유해 빠져나오거나 당해 출구 수단을 막는 미립담체의 경향에 의해 세포 성장이 제한된다는 것이 인지되었을 때, 본원에서 기술되고 본 발명의 방법에서 사용되는 경사분리기를 5L(3.7L 사용 용적) 생물반응기용으로 특수하게 고안하였다. 따라서, 보다 높은 미립담체 농도를 달성하기 위해, 당해 경사분리기내 난류의 형성을 최소화하고 현탁액의 상향류 속도에 비해 빠른 미립담체 침강 속도를 달성하는 특징을 갖는 경사분리기를 구축하였다.

본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 도 1에 도시한 바와 같은 경사분리기(10)은 방사평판(3)에 의해 보다 큰 상단 챔버(2)에 연결된 하단 챔버(1)을 포함한다. 2개의 출구 수단(4)는 당해 경사분리기의 상층에서 하단 챔버(2)에 부착되어 있다. 하단 챔버(1) 및 상단 챔버(2)는 반원통형 모양이며 생물반응기의 회전축 뿐만 아니라 본 발명의 방법을 모니터링하기 위해 생물반응기로 도입된 각종 프로브를 수용하고자 축방향으로 지시된 중심 원형 강(5)를 둘러싸고 있다. 당해 경사분리기는 고체 금속 벽으로 마감된다.

도 2는 상기한 부재(2), (4) 및 (5)의 상단 입면도를 도시한 것이다.

도 3은 당해 경사분리기의 하단 챔버(1)의 하단 입면도를 도시한 것이다. 하단 챔버(1)은 방사상으로 배향된 종방향 격벽(7)에 의해 분리된 다수의 규칙적으로 분배된 종방향 채널(6)을 갖으며, 여기서 종방향 채널들은 경사분리기의 상단 챔버(2) 및 방사평판(3)을 통해서 서로 상호교통한다. 하나의 양태에서, 종방향 채널(6)은 동일하며 각각 원형 단면을 갖는다. 또한, 다수의 종방향 채널(6)은 축방향으로 지시된 중심 원형 강(5) 주변에 규칙적으로 분배되어 있으며 종방향 채널(6)의 주변은 방사상으로 배향된 종방향 격벽(7)에 의해 서로 분리되어 있다.

관류 수단의 출구 수단은 감염 시점에 폐기물 저장소에서 수거물 수용기로 전환된다. 복제가 완료될 때까지(약 4 내지 5일) 연속적 수거가 일어난다.

본 발명의 방법은 MDCK 세포 배양물을 10:1 내지 l:10¹⁰의 감염다중도(M.O.I.)로 접종시킴으로써 수행한다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 1:10 내지 l:10⁸의 감염다중도에서 수행한다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 1:10⁴ 내지 l:10⁷의 감염다중도에서 수행한다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 1:10⁵ 내지 l:10⁶의 감염다중도에서 수행한다.

하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 MDCK 세포의 성장은 약 33 내지 40℃의 온도에서 약 7 내지 10일 동안 수행한다. 하나의 양태에서, MDCK 세포의 성장은 약 36 내지 38℃의 온도에서 약 7일 동안 수행한다.

하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 MDCK 세포의 성장은 약 37℃의 온도에서 약 7일 동안 수행한다.

하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 바이러스 복제는 약 30 내지 37℃의 온도에서 약 4 내지 6일 동안 수행한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 바이러스 복제는 약 32 내지 34℃의 온도에서 약 5일 동안 수행한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 바이러스 복제는 약 33℃의 온도에서 수행한다.

바이러스 입자 또는 단백질은 다음 방식으로 정제한다. 바이러스 수거물을 여과한 다음, 당해 여과물을 포름알데히드로 불활성화시킨다. 이어서, 수득된, 불활성화된 바이러스 현탁액을 원심분리하고, 농축된 바이러스 분획을 백신 제조에서 사용하기 위해 선별한다.

본 발명의 백신을 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물의 인플루엔자 감염을 예방하는 방법이 또한 제공된다.

정제된 바이러스 입자 또는 단백질을 사용하여 인플루엔자 바이러스 감염 검출용 진단 키트를 제조하는 방법이 또한 제공된다.

포유동물에서 인플루엔자 바이러스 감염의 검출 및 진단용 키트를 제조하기 위한, 분리된 다량의 바이러스 입자 또는 단백질의 용도가 또한 제공된다.

본 발명의 방법의 사용 및 사람 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형의 선별된 균주의 증식에 대한 구체적 예는 하기에서 논의된다. 본 발명의 본질 및 범주로부터 벗어나거나 본 발명의 실질적 이점을 감소시키지 않으면서 본 발명의 배열 및 성분에서 다양한 변화가 이루어질 수 있고, 이후에 기술되는 형태는 단지 바람직하거나 예시적인 양태임이 명백할 것이다.

실시예 1은 클론 MDCK.5F1의 유도를 기술한다. 실시예 2는 MDCK.5F1 세포주의 순도를 고려한다. 실시예 3은 트립신 존재 및 부재하에 MDCK.5F1 세포주에서의 인플루엔자 바이러스의 성장을 예시한 것이다. 실시예 4는 MDCK.5F1에 대한 종양발생성 연구를 요약한 것이다. 실시예 5는 비흉선 누드 마우스에게 MDCK.5F1의 세포 현탁액을 접종한 후의 결과를 논의한 것이다. 실시예 6은 당해 방법의 특정 양태를 단계별로 기술한 것이다. 실시예 7은 트립신 존재하에 모 MDCK 세포 및 인플루엔자 균주 A/상하이/11/87를 사용하여 수행된 검정의 결과를 기술한 것이다. 실시예 8은 트립신 부재하에 모 MDCK 세포 및 인플루엔자 균주 A/상하이/11/87를 사용하여 수행된 검정의 결과를 기술한 것이다. 실시예 9는 트립신 부재하에 MDCK.5F1 세포 및 인플루엔자 균주 B/하얼빈/7/94를 사용하여 수행된 검정의 결과를 기술한 것이다.

실시예 1

클론 MDCK.5F1의 유도

MDCK 세포 제CCL 34호를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(메릴랜드주 록크빌 소재)로부터 입수하였다. 스톡은 3.4×10⁶개 세포를 함유하는 1ml 앰풀 중에 동결된 상태로 수령되었다. 당해 세포주는 이의 54회 계대 상태에 있었다.

계대 후, MDCK 세포를 계대 64회에서 수거하고 10%(v/v) 태소 혈청(FBS)를 함유하는, 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) 및 배지 199로 1:1 비율(DMEM-199)로 이루어진 영양 배지에 희석시켰다. 이어서, 희석된 세포 현탁액을, 용액 중 세포가 균일하게 분포되어 있다는 가정하에 각 웰이 1개 미만의 세포를 수용하도록 96웰 플레이트에 분배해 넣었다. 상기 플레이트를 37℃에서 CO₂ 항온처리기에 위치시키고, 성장을 위해 웰마다 스코어를 매기기 위해 광학현미경하에 1주 간격으로 검사하였다.

클론에서 요구되는 특징을 다음으로부터 선별하였다:

(1) 바이러스 감염에 대해 모주보다 높은 감수성(즉, 클론은 모주보다 높은 바이러스 역가를 생산한다);

(2) 하나 이상의 바이러스에 대해 높은 감수성(하나의 양태에서, 수개의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 감수성);

(3) 트립신과 같은 단백질분해 효소의 부가를 요구함이 없이 인플루엔자 바이러스의 다단계 복제를 가능하게 하는 능력; 및 임의로

(4) 부착-의존성(즉, 배양물 중에서 보다 높은 농도의 세포를 수득하기 위해).

표 1은 트립신을 부가하지 않은, 인플루엔자 A형 및 B형 바이러스에 의한 감염에 대한 수개 클론의 감수성을 예시한 것이다.

"높은 감수성"은 TCID₅₀으로 평가한 경우 모 세포주의 감수성보다 약 1.2배이상 높은 감수성으로서 정의되었다. 클론 3B5, 5F1, ID11, 5H12, 9C2, 9D9, P79, 9E9, 7C1 및 P123은 감수성이 높은 것으로 확인되었다. 클론 3B5, 5Fl, ID11, 5H12, 9C2, 9D9, 7C1 및 P123은 모 세포주에 비해서 2배 이상 더 감수성인 것으로 확인되었다.

클론 5F1 및 5H12은 가장 고도로 감수성인 2개의 클론으로서 선별되었고, 5F1은 본원에서 MDCK.5F1로 지정된 세포주를 확립시키기 위해 선택되었다.

세포 세대 번호(cell generation number)는 클로닝 시점에서 0으로서 정의되었으며, 각각의 후속적 세포 배양에서 세포 개수를 세어서 계산되었다. 배양물을 초기에는 다중-웰 플레이트 배양물에서 계대하고 최종적으로 플라스틱 플라스크로 옮겼다.

또한, 실험을 호흡기 합포체 바이러스를 이용하여 실시하여, 모 MDCK 세포주 및 MDCK.5F1 클론의 상기 바이러스 감염에 대한 감수성을 측정하였다. 바이러스 역가는, MDCK 세포주가 호흡기 합포체 바이러스 숙주 Hep 2 세포주보다 감염에 대해 훨씬 덜 감수성이지만, MDCK.5F1 클론은 모 MDCK 세포주보다 상기 바이러스 감염에 대해 약 10배 이상 더 감수성이였음을 나타냈다.

실시예 2

MDCK.5F1의 클론형성능 측정

선택된 임의의 특정 클론의 클론형성능을 측정하는 파라메터는 당해 클론이 선별되는 다중-웰 플레이트에서의 성장율(%)이다. 선별된 배양물이 실제로 클론(즉, P(1))일 확률은 이러한 성장율로부터 결정된다[참조: Coller and Coller, Methods in Enzymology, vol. 121, pp. 412-417 (Academic Press, 1986].

웰의 5%가 당해 클로닝에서 성장을 보였다면, 세포주 MDCK.5F1이 단일 세포로부터 유래할 확률은 > 97.5%이다.

299개 앰풀의 마스터 세포 뱅크(Master Cell Bank; MCB) 및 283개 앰풀의 제조용 세포 뱅크(Manufacturer's Working cell bank; WCB)를 MDCK.5F1 세포주로부터 제조하였다. 이들 뱅크는 우수 의약품 제조관리기준(Good Manufacturing Practice)에 관한 캐나다 지침에 따라 제조하였으며, 진균, 효모, 마이코플라스마, 세균 및 바러스 인자 형태의 오염에 대해 평가하였다. 어떠한 종류의 오염도 발견되지 않았다.

지속가능한 생존성 배양물을 제조된 세포 뱅크로부터 수득하고, 세포주를 WCB 이상으로 50 세포수 배가(population doubling) 동안의 생성물 생산, 형태, 종양발생성 및 동위효소 특징에 대한 안정성에 대해 시험하였다. 결과는 당해 세포주가 이들 특징에 대해 안정함을 보여주었다.

실시예 3

트립신 부가의 존재 또는 부재하에 MDCK.5F1 클론에서의 인플루엔자 바이러스의 성장을 예시하는 실험

트립신의 존재 또는 부재하에 클론 MDCK.5F1의 배양물 중에서 인플루엔자 바이러스가 증식하는 능력을 측정하기 위해 실험을 수행하였다. 인플루엔자 균주 A/요하네스버그, A/텍사스 및 B/하얼빈을 사용한 3회의 실험의 결과는 표 2에 제시되어 있다.

실시예 4

시험관내 종양발생성 연구의 개요

문헌[참조: Furesz et al., Develop. Biol. Stand, vol. 70, pp. 233-243, S. Kargel ed. , Basel, 1989]에 의해 기술된 방법을 수행 후, 10% (v/v) FBS를 함유한 DMEM-199 배지 중의 0.6% 아가 4ml을 직경이 35nm인 6개의 웰을 함유한 조직 배양 접시에 고정되게 하였다. 고정 후, 이들 웰을 42℃ 및 60,000개 세포/ml의 세포 농도에서 유지되는 0.3% W/V의 비겔화 아가를 함유하는 배지 3ml로 중충시킨다. 플레이트를 37℃에서 5% CO₂로 항온처리하였다. 3일, 7일, 10일 및 14일째에 광학현미경으로 관찰하였다. 콜로니는 연질 아가내의 4개 이상의 세포 형성 구형 그룹으로 이루어졌다. 효율(%)을 계수된 세포 콜로니 수를 플레이팅된 총 세포 수로 나눈 비율에 의해 측정하였다.

표 3의 결과는 MDCK.5F1 세포주가 연질 아가에서 최소 효율로 성장함을 보여주며, 이는 동물에서 비-종양발생성일 수 있음을 가리킨다. 이러한 특성은 18회 계대 후에도 유지되었으며, 이는 표현형이 안정함을 입증한다.

이러한 비-종양발생성 결과를 추가로 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 비흉선 누드 마우스에서 MDCK.5F1 세포주의 종양 형성 잠재성을 시험하였다.

실시예 5

MDCK.5F1 클론의 세포 현탁액의 피하 접종 후 누드(nu/nu) 비흉선 마우스에서의 종양 형성의 평가

비흉선 누드(nu/nu) 마우스는 세포 매개된 반응을 일으키지 못하므로 동종 및 이종 종양 세포주의 성장을 유지할 것이다. 이 마우스는 생체내에서 신생물을 형성하는 접종물의 능력을 평가할 수 있게 한다.

6주령 암컷 누드 마우스에게 시험 물질 MDCK.5F1을 약 1×10⁷개 세포로 피하 접종한 다음, 84일 후에 임상적으로 부검하였다. 양성 대조군 세포 및 음성 대조군 세포가 접종된 누드 마우스를 유사하게 처리하였다. 접종 부위(피부), 폐, 견갑 림프절 및 육안적 병변을 처리하고, 절단하고, 염색하고 현미경으로 검사하였다. 당해 실험의 보다 상세 사항은 하기에 제시되어 있다.

시험 물질 및 대조군 물질의 접종

각 케이지내의 모든 마우스를 동일하게 시험하였다.

각각의 마우스에게 하기하는 바와 같이 적당한 접종물 0.2ml을 견갑 사이에 피하 접종시켰다. 22게이지 바늘을 접종을 위해 사용하였으며 모든 마우스는 동일한 날에 접종하였다.

그룹 1 및 2: 시험 물질 MDCK.5F1(5×10⁷개 세포/ml 농도).

그룹 3 및 4: 양성 대조군(5×10⁷개 세포/ml 농도의 18C1-10T 세포)

그룹 5 및 6: 음성 대조군(1×10⁷개 세포/ml 농도의 SHE 세포)

모든 동물들을 매 근무일마다 관찰하였고 접종 부위를 최대 84일의 기간 동안 주 2회로 촉진하였다.

결과

임상 소견

모든 양성 대조군 마우스는, 이들 모두가 접종 부위에 직경이 적어도 하나의 크기가 1cm를 초과하는 거대한 덩어리를 지녔기 때문에 접종 후 14일째에 희생시키고 부검하였다.

모든 음성 대조군 마우스를 접종 후 84일째에 희생시키고 부검하였다.

10마리의 시험 물질(5F1) 마우스 중 9마리를 접종 후 84일째에 희생시키고 부검하였다. 5F1 접종된 마우스 중 1마리는 접종 부위에서 병변의 증대가 퇴행하기 시작하였기 때문에 접종 후 33일째에 희생시키고 부검하였다. 상기 병변은 이후에 낭포인 것으로 밝혀졌다.

촉진

양성 대조군 물질이 접종된 10마리의 누드 마우스는 접종 후 14일까지 적어도 하나의 크기가 1cm를 초과하는 촉진가능한 병변을 지녔다.

10마리의 음성 대조군 물질이 접종된 누드 마우스의 접종 부위에서 소형 비-증대성 병변이 촉진될 수 있었다. 접종 후 4일째에 최초로 주지된 이들 병변은 관찰 기간 동안 10마리의 음성 대조군 마우스 중 8마리에서 지속되었다. 촉진 결과는 표 4에 요약되어 있다.

모든 10마리의 5F1 마우스는 접종한지 4일후까지 병변을 지녔다. 10마리의 5F1 마우스 중 9마리에서, 이들 병변은 작았으며 더이상 진행되지 않았다. 접종한 후 56일까지 시험 물질 마우스 중 8마리에서 촉진가능한 병변이 없었다. 5F1이 접종된 1마리의 마우스는 접종 부위 병변을 지녔는데, 이는 크기가 25일째 내지 28일째에 유의적으로 증대되었으며 접종 후 32일째까지 크기가 현저하게 감소되었다. 이러한 병변은 현미경 검사에 의해 낭포로 확인되었다(표 6 참조). 병변을 나타내는 다른 마우스는 국소화된 면역을 염증을 지녔다.

육안적 부검 소견

처리-관련 육안적 부검 소견은 표 5에 요약되어 있다.

처리 관련 육안적 소견
기관/병변	5F1	양성 대조군	음성 대조군
피부 접종 부위(검사된 마릿수)	(10)	(10)	(10)
덩어리 또는 결절	3	10	6

접종 부위의 덩어리는 모든 양성 대조군 동물에서 발견되었다. 덩어리 또는 결절은 10마리의 5F1 마우스 중 3마리 및 10마리의 음성 대조군 마우스 중 6마리의 접종 부위에서 발견되었다.

현미경적 소견

관심대상의 병변은 표 6에 요약되어 있다.

신생물(섬유육종)은 모든 양성 대조군 마우스의 접종 부위에서 진단되었다. 이 섬유육종은 섞어 짜여진 패턴으로 다양한 밀도의 다발내에 배열된 방추형 세포로 이루어져 있다. 콜라겐 침착은 최소한이었다. 인접 조직은 압축되었지만, 드물게는 신생물로 침습되었다.

모든 음성 대조군 마우스에서 신생물은 진단되지 않았지만, 골성 증식의 병소가 음성 대조군 물질 마우스 중 2마리의 접종 부위에서 주지되었다. 이는 음성 대조군으로서 접종된 SHE 세포의 선택된 분화 및 성장을 나타내는 것으로 사료된다.

모든 5F1 마우스에서 신생물은 진단되지 않았지만, 1마리의 마우스에서는 낭포가 주지되었으며 1마리의 다른 5F1 마우스에서는 아급성 국소 염증이 주지되었다.

결론

섬유육종은 모든 10마리의 양성 대조군 마우스의 접종 부위에서 진단되었다.

음성 대조군 또는 시험 물질 마우스 중 어떠한 것에서도 신생물은 나타나지 않았다.

상기한 연구의 조건하에, 시험 물질 MDCK.5F1은 종양발생성인 것으로 간주되지 않는다.

실시예 6

일반적 과정

a) 세포 증식

생물반응기에 접종하지 전에 MDCK.5F1(ATCC 제CRL-12042호) 세포를 세포 증식 동안 수회 계대하였다. 약 5 내지 10×10⁶개를 37℃ 수욕에서 해동시키고, 영양배지를 함유한 폴리스티렌 세포 배양 플라스크로 옮기고 37℃에서 항온처리하였다. 3 내지 4일 후, 상기 플라스크로부터의 세포를 분리시켜 5개의 다른 플라스크를 접종시키는데 사용하였다. 이어서, 상기 5개의 플라스크를 동일한 방식으로 20개의 플라스크를 접종시키는데 사용하였다. 세포 성장을 위해 사용된 영양 배지는 탈이온수 중에 1:1 비율로 제조되고 4.5g/L의 글루코스, 0.58g/L의 글루타민 및 1g/L의 중탄산나트륨을 함유하는 둘베코 변형된 이글 배지 및 배지 199(DMEM-199)였다. 당해 영양 배지에 10% 감마-방사선 조사된 태소 혈청(I-FBS)을 보충시켰다. 세포 계대용 플라스크에서 세포를 분리시키기 위해 사용되는 용액은 마그세슘 및 칼슘을 함유하지 않는 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중에서 제조된 0.02% 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) 용액을 함유한 0.25% 트립신이었다.

상기 20개의 플라스크 내의 세포를 3 내지 4일 동안 성장시키고, 트립신 처리하고, 수거하여 3 내지 5g/L의 미립답체 비이드를 함유하는 1000-ml 스피너 플라스크 내의 3가지 미립담체 세포 배양물을 접종시키는데 사용하였다. 상기 스피너 플라스크를 약 50rpm으로 교반을 유지하면서 37℃에서 항온처리하였다. 세포 성장을 5 내지 7일 동안 지속하고, 이후에 세포를 미립담체로부터 트립신 처리하고 5-L 생물반응기(CelliGen™ 제조원: New Brunswick of Edison, N.J.)을 접종시키는데 사용하였다.

미립담체로부터 세포의 트립신 처리는 다음 방식으로 수행하였다. 미립담체 세포 배양물을 PBS 및 0.02% EDTA의 용액으로 2회 세척하였다. 제2 세포 세척 후, 트립신 약 200ml를 플라스크에 붓고 교반하면서 약 20분 동안 37℃에서 정치시켰다. 광학 현미경으로 측정한 바에 따라 세포 분리가 완료된 후, 세포를 2% I-FBS를 함유하는 DMEM-199를 사용하여 유리 미립담체로부터 회수한 다음, 펠렛화하고 10% I-FBS를 함유하는 DMEM-199에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 적절한 수의 세포(약 10¹⁰개)를 사용하여 생물반응기를 접종시켰다.

당해 세포 배양을 위해 사용되는 구형 비이드 또는 미립담체는 파마시아(Pharmacia, Sweden)에 의해 제조된 것으로 상표명 Cytodex 1하에 시판되고 있다. Cytodex 1 미립담체의 밀도는 1.03(0.9% NaCl 중의 g/ml)이였으며 이의 크기는 131 내지 220㎛로 다양했으며 평균은 180㎛이었다. 세포 성장에 대한 대략적 표면적은 4,500cm²/g 미립담체(건식 중량)이었으며, 1g당 약 6.8×10⁶개 미립담체를 함유한다.

b) 생물반응기 내에서의 세포 접종 및 성장

15 내지 25g/L 농도의 Cytodex 1 미립담체를 5-L 생물반응기(3.7L 사용 용적)에 도입시켰다. 생물반응기는 다음과 같이 접종시켰다. 이미 제조한 스톡(상기 참조)으로부터 수득된 약 4×10⁹ 내지 1×10¹⁰개 세포를 관 모양의 유리병에 넣었다. 20g/L의 미립담체의 멸균 용액으로부터, 미립담체 55.5 내지 92.5g(배양물 중의 목적하는 농도에 의존함)을 DMEM-199로 2회 세척하고 상기 유리 병내의 세포에 부가하였다. 이어서, 유리병에 10% I-FBS를 함유하는 DMEM-199를 3.7L의 최종 용적까지 충전시켰다. 이어서, 유리병의 내용물(DMEM-199 중의 세포, 미립담체)을 약 20rpm에서 회전하는 중심 축을 갖는 생물반응기 용기에 부었다. 상기 용기를 충전시키면서 교반 속도를 50rpm으로 증가시키고, 온도를 37℃로 조정하고 용존 산소 함량을 5 내지 50%의 공기 포화율에서 유지시켰다. 또한, 배양물의 pH를 6.8 내지 7.4에서 유지시켰다. 미립담체 세포 배양물의 관류는 1일째에 2.5% I-FBS 및 0.5g/L 황산마그네슘을 함유한 DMEM-199를 사용하여 0.5용적/일로 개시하였다. 약 7 내지 10일 동안 세포 성장을 지속시키고 관류 유속을 2용적/일까지 점차적으로 증가시켰다.

c) 바이러스 감염

바이러스를 미립담체 세포 배양물에 부가하기 전에, 관류를 감염 당일에 4 혈청-비함유 용적/일로 증가시키고, 온도를 33℃로 저하시키고, 산소 분압을 15% 공기포화율에서 조절하였다. 세포 컨플루언시에서 바이러스 감염 직전에(동일한 날에), 배양 배지를 혈청을 함유하지 않는 동일한 배양 배지로 교체하고, 관류 속도를 7시간 동안 4용적/일까지 증가시켰다. 이는 배양물의 혈청 함량이 감염 전에 최소 수준으로 감소되었음을 보장한다. 이러한 기간 후에, 관류를 중단시키고 사람 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형을 미립담체 세포 배양물에 도입시켰다. 당해 바이러스를 생물반응기에 도입하기 전에 일반적으로 영양 배지(6.5g 글루코즈/L을 함유하는 DMEM-199)로 희석시켜, 1:10 내지 1:10⁸ 범위의 M.O.I를 수득하였다. 다음날, 관류를 세포병변 효과가 완료될 때까지 2 용적/일에서 유지시켰다. MDCK 세포의 총 파괴는 전형적으로 5일 이내에 관찰되었다. 이어서, 인플루엔자 바이러스 현탁액을 함유하는 유출물을 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이 수거하고 처리하여 백신을 제조하였다.

d) 불활성화 및 정제

일가 인플루엔자 바이러스를 다음과 같이 정제하였다. 생물반응기로부터 일반적으로 15 내지 30L로 수거된 바이러스 수거물을 먼저 1.2㎛ 필터(Sartorius Sartopure GF^R, 길이: 10인치, 0.6m²)를 통해서 청정화하여 큰 세포 파편을 제거하였다. 이어서, 인플루엔자 바이러스를 함유하는 청정화된 현탁액을 16시간 동안 0.125%(V/V) 포름알데히드(최종 농도)를 부가하여 불활성화시켰다. 그 다음, 불활성화된 바이러스 현탁액을 이온 교환, DNAase 처리 및 겔 여과에 의해 정제하였다.

농축된 바이러스 분획을 수거하였는데, 이는 백신 제조에서 사용될 상질의 물질을 나타낸다. 이어서, 이들 분획을 모아서 현재 국제 기구에 의해 권장되는 바와 같은 용량당 균주당 HA 15㎍의 최종 농도가 수득되도록 희석시켰다.

e) 백신 제조

바이러스 단백질을 백신의 각각의 용량마다 15㎍가 되도록 희석시켰다. 티메로살(0.01%)을 각각 보존 및 멸균을 위해 부가하여, 백신 제조를 완료하였다. 표준 삼가(trivalent) 백신의 경우, 각각의 3가지 순환 균주의 일가 용량을 혼합하고 상기한 보존제 및 안정화제에 부가하였다.

다른 공지된 보존제, 예를 들면, 아미노메틸 프로판올, 소르브산 및 폴리아미노프로필 비구아나이드, 질산 페닐제2수은, 붕산 페닐제2수은, 2-페녹시에탄올과 포름알데히드, 페놀, 염화벤제토늄 및 2-페녹시에탄올을 백신 제조를 위해 사용할 수 있다. 이들 보존제의 농도는 산업 규격을 충족해야할 필요가 있다.

실시예 7 트립신 부가하에 모 세포주의 균주 A/상하이/11/87로의 감염

모 세포주로부터의 MDCK 세포를 CelliGen™ 생물반응기에서 성장시켰다. 생물반응기의 사용 용적은 3.7L였으며, 미립담체 농도는 25g/L였으며, 교반 속도는 50rpm로 설정하였다. 7일째에, 배양물을 A/상하이/11/87로 지정된 사람 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. M.O.I는 1:133,000였으며, 바이러스 복제를 증진시키기 위한 2.5㎍/ml 트립신을 부가하였다. 표 7에는 당해 검정과 관련된 데이타가 제시되어 있으며, 표 8에는 당해 검정의 결과가 요약되어 있다. 백신 수율은 전체 수거 용적 18L 및 단일 방사 확산(Single Radial Diffusion; SRD) 검정 값 7.38㎍ HA/ml 및 9 ㎍ HA/ml을 기준으로 하여 15㎍ HA의 9,828 일가 용량이었다(표 8 참조).

감염 시점에서의 총 세포 수는 다음과 같이 계산된다: 9.34×10⁶개 MDCK 세포/ml×3700 ml = 34,558×10⁶개 세포.

HA의 전체 양의 계산은 다음과 같이 결정된다: 9,828 용량×15㎍/용량 = 전체 147,420㎍ HA. 이를 34558×10⁶개 세포로 나누면 4.26㎍ HA/10⁶개 MDCK 세포이다.

실시예 8

트립신 부재하에 MDCK.5F1 클론의 균주 A/상하이/11/87로의 감염

클론 MDCK.5F1(ATCC 제CRL-12042호)로부터 유래된 세포를 25g/L 농도의 미립담체를 함유하는 CelliGen™ 생물반응기에서 성장시켰다. 당해 생물반응기의 사용 용적은 3.7L였으며, 교반 속도를 50 내지 55rpm로 설정하였다. 7일째에, 배양물을 A/상하이/11/87로 지정된 사람 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. 바이러스 복제를 증진시키기 위한 트립신을 부가하지 않았다. M.O.I.는 1:133,000이었으며, 당해 검정으로 32L와 9.2㎍ HA/ml의 SRD 값이 수득되었으며 이로부터 19,626 일가 용량이 수득되었다. 표 9에는 당해 검정의 데이타가 요약되어 있으며, 표 10에는 당해 검정의 결과가 열거되어 있다.

감염 시점에서의 총 세포 수는 다음과 같이 계산된다: 16.8×10⁶개 MDCK 세포/ml×3700 ml = 62,160×10⁶개 세포.

HA의 전체 양의 계산은 다음과 같이 결정된다: 19,626 용량×15㎍/용량 = 전체 294,390㎍ HA. 이를 62,160×10⁶개 세포로 나누면 4.73㎍ HA/10⁶개 MDCK 세포가 된다.

실시예 9

트립신의 부재하에 MDCK.5F1 클론의 균주 B/하얼빈/7/94로의 감염

MDCK.5F1로부터 유래된 세포를 미립담체의 농도가 15g/L임을 제외하고는 실시예 3과 같이 성장시켰다. 8일째에, 배양물을 B-하얼빈/7/94로 지정된 사람 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. M.O.I는 1:10,000이었다. 바이러스 복제를 촉진하기 위한 트립신을 부가하지 않았다. 당해 검정의 데이타 및 결과는 표 11 및 12에 제시되어 있다. 수율은 수거량 35L 및 SRD 값 16.35㎍ HA/ml를 기준으로 하여 38,150 용량이었다.

감염 시점에서의 총 세포 수는 다음과 같이 계산된다: 16.7×10⁶개 MDCK 세포/ml×3700 ml = 61,790×10⁶개 세포.

HA의 전체 양의 계산은 다음과 같이 결정된다: 38,150 용량×15㎍/용량 = 전체 572,250㎍ HA. 이를 61,790×10⁶개 세포로 나누면 9.26㎍ HA/10⁶개 MDCK 세포가 된다.

다시 한번, 본 발명의 방법은 트립신의 존재를 필요로 하는 종래기술의 방법으로 수득된 수율과 같거나 이를 초과하는 수율을 제공함이 입증된다.

Claims

바이러스 감염에 대해 모(母) 매딘-다비 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney; MDCK) 세포주보다 높은 감수성을 가짐을 특징으로 하는, MDCK 유래의 세포주.
제1항에 있어서, 높은 감수성이 모 세포주에서 생산된 바이러스 역가의 약 1.2배 이상의 바이러스 역가로서 정의되는 세포주.
제2항에 있어서, 바이러스가 인플루엔자, 호흡기 합포체 바이러스, 파포바바이러스, 파라인플루엔자, 수포성 구내염, 백시니아, 콕사키, 레오바이러스, 파보바바이러스, 아데노바이러스, 소아마비, 홍역, 광견병 및 헤르페스 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포주.
제3항에 있어서, 바이러스가 인플루엔자 바이러스 또는 호흡기 합포체 바이러스인 세포주.
제4항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 사람, 말, 돼지 또는 조류 균주를 포함하는 세포주.
제5항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 사람 인플루엔자 바이러스 A형, B형 또는 C형으로부터 선택되는 세포주.
제6항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 A형 또는 B형으로부터 선택되는 세포주.
제7항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형 둘다에 대해 고도로 감수성인 세포주.
비-종양발생성임을 특징으로 하는 MDCK 유래의 세포주.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 비-종양발생성임을 특징으로 하는 세포주.
제10항에 있어서, 비-종양발생성이, 관찰한지 약 3개월 후 누드 마우스에서의 촉진가능한 결절의 부재로서 정의되는 세포주.
ATCC CRL-12042의 생물학적 특성을 갖는 세포주.
ATCC CRL-12042로서 정의되는 세포주.
제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 부착(anchorage)-의존성임을 추가로 특징으로 하는 세포주.
예방, 진단, 면역치료 또는 치료용 바이러스 입자 또는 바이러스 단백질의 생산을 위한 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 세포주의 용도.
제15항에 있어서, 바이러스 입자 또는 단백질이 바이러스 감염의 예방을 위해 사용되는 백신 제조를 위해 사용되는 용도.
제16항에 있어서, 바이러스 감염이 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 용도.
제17항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 사람, 말, 돼지 또는 조류 균주를 포함하는 용도.
제18항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 사람 인플루엔자 바이러스 A형, B형 또는 C형으로부터 선택되는 용도.
제19항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 사람 인플루엔자 바이러스 A형 또 는 B형인 용도.
인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신의 제조를 위해 사용되는 바이러스 입자 또는 바이러스 단백질의 제조를 위한 ATCC CRL-12042로서 정의되는 세포주의 용도.
제21항에 있어서, 바이러스 감염이 사람 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형에 의해 유발되는 용도.
제21항에 있어서, 바이러스 감염이 사람 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형 둘다에 의해 유발되는 용도.
(a) 인플루엔자 바이러스를 복제할 수 있는 MDCK 세포주를 성장시키는 단계;

(b) 상기 MDCK 세포주를 인플루엔자 바이러스 균주로 감염시키는 단계;

(c) 상기 바이러스가 복제될 수 있도록 항온처리하고, 복제된 바이러스를 수거하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 입자 또는 단백질의 제조방법.
제24항에 있어서, 수거된 바이러스로부터 바이러스 입자 또는 단백질을 정제함을 추가로 포함하는 방법.
제24항에 있어서, MDCK 세포주가 ATCC 제CRL-12042호의 생물학적 특성을 갖는 세포주서 정의되는 방법.
제24항에 있어서, MDCK 세포주가 ATCC 제CRL-12042호로서 정의되는 방법.
제24항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 사람, 말, 돼지 또는 조류 균주를 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 바이러스가 사람 인플루엔자 바이러스 A형, B형 또는 C형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제24항에 있어서, 생물반응기 내에서 수행되는 방법.
제30항에 있어서, 생물반응기의 크기가 약 5L인 방법.
제30항에 있어서, 생물반응기의 크기가 약 5 내지 5000L인 방법.
제24항에 있어서, 단계 a)에서, 세포가 미립담체 수단을 함유하는 배지에서 성장되고, 단계 b)에서 항온처리가 관류 수단을 사용하여 수행되는 방법.
제33항에 있어서, 관류 수단이 수거물 중의 미립담체의 누출을 피하기 위한 경사분리기를 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 미립담체 수단이 약 5 내지 25g/L 농도의 미립담체 비이드를 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 미립담체 비이드 농도가 약 10 내지 25g/L 범위인 방법.
제35항에 있어서, 미립담체 비이드 농도가 약 15 내지 20g/L 범위인 방법.
제34항에 있어서, 관류가 1일당 약 0.5 내지 4.0 용적의 생물반응기의 비율로 수행되는 방법.
제24항에 있어서, 단계 b)에서, 인플루엔자 바이러스가 약 10:1 내지 1:10¹⁰의 감염다중도로 접종되는 방법.
제24항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 약 1:10 내지 1:10⁸의 감염다중도로 접종되는 방법.
제24항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 약 1:10⁴ 내지 1:10⁷의 감염다중도로 접종되는 방법.
제24항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 약 1:10⁵ 내지 1:10⁶의 감염다중도로 접종되는 방법.
제24항에 있어서, 단계 a)에서, MDCK 세포주가 약 7일 동안 성장되는 방법.
제43항에 있어서, MDCK 세포주가 약 33 내지 40℃ 범위의 온도에서 성장되는 방법.
제43항에 있어서, MDCK 세포주가 약 36 내지 38℃ 범위의 온도에서 성장되는 방법.
제24항에 있어서, 단계 b)에서, 인플루엔자 바이러스가 약 30 내지 37℃의 온도에서 복제되는 방법.
제43항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 약 32 내지 34℃의 온도에서 복제되는 방법.
제43항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 약 33℃의 온도에서 복제되는 방법.
제24항에 있어서, 정제된 바이러스 입자 또는 단백질이 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하기 위한 백신을 제조하기 위해 사용되는 방법.
제49항에 따른 방법으로 제조된, 포유동물의 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신.
제50항에 있어서, 포유동물이 사람인 백신.
제50항 또는 제51항에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물의 인플루엔자 감염을 예방하는 방법.
제24항에 따른 방법으로 분리된 바이러스 입자 또는 바이러스 단백질을 보존제와 혼합하여 포함하는, 포유동물의 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 백신.
백신을 제조하기 위한 제24항에 따른 방법의 용도.
제24항에 있어서, 정제된 바이러스 입자 또는 단백질이 인플루엔자 바이러스 감염 검출용 진단 키트를 제조하기 위해 사용되는 방법.
포유동물에서 인플루엔자 바이러스 감염의 검출 및 진단을 위한 키트를 제조하기 위한 제24항에 따른 분리된 다량의 바이러스 입자 또는 단백질의 용도.