CN117946982A - H1n1流感病毒冷适应疫苗骨架毒株cv1-pr8及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了H1N1流感病毒冷适应疫苗骨架毒株CV1‑PR8及其构建方法和应用，属于医用配制品技术领域。本发明要解决的技术问题是：如何制备冷适应的流感毒株，用于制备流感疫苗。为解决上述技术问题，本发明提供重组H1N1流感病毒，其特征在于：所述重组H1N1流感病毒表达或含有PB2突变蛋白、PB1突变蛋白、PA突变蛋白、NP突变蛋白和NS突变蛋白。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行专利程序保藏的编号为CGMCC No.45373。本发明获得的流感冷适应疫苗骨架毒株CV1‑PR8可作为冷适应疫苗骨架毒株，与流行流感病毒HA和NA基因进行重构制备流感疫苗。
Description
技术领域
本申请属于医用配制品技术领域，具体涉及H1N1流感病毒冷适应疫苗骨架毒株CV1-PR8及其构建方法和应用。
背景技术
流感病毒是一种分节段的单股负链的RNA病毒，分为A、B、C和D四型，目前，人群中主要流行的流感病毒是A型的H1N1和H3N2亚型及B型的Yamagata和Victoria季节性流感病毒。截至目前，流感病毒已经造成了四次大流行，分别是1918年的H1N1亚型、1957的H2N2亚型、1968年的H3N2亚型以及2009年的H1N1亚型流感，每次都给全世界人民的生命健康带来巨大的危害。自流感出现以来，全球每年都有季节性流感的流行和发生，给社会带来了严重的疾病负担。
流感疫苗是目前预防流感病毒感染和流行最有效的途径，流感疫苗主要有灭活流感疫苗和减毒活疫苗等几种类型。灭活疫苗是我们目前使用较多的疫苗，目前使用灭活流感疫苗株主要是鸡胚适应的A/Puerto Rico/8/1934(PR8)(H1N1)骨架毒株的内部6个基因片段，与WHO推荐的流行株的HA和NA基因片段，通过重配而构建，该类疫苗主要通过诱导机体产生体液免疫来发挥作用，展现出保护时间短和交叉保护作用差的特点。
目前获批的甲型流感病毒的减毒活疫苗的主要供体骨架有两种，分别是A/Leningrad/17/57H2N2 LAIV(Len LAIV)和A/Ann Arbor/6/60H2N2(AA/60)，减毒活疫苗是由供体毒株的6个内部基因，与WHO推荐的流行病毒HA和NA基因，通过重配而构建。减毒活疫苗主要通过喷鼻的方式进行接种，模仿了自然感染的途径，可以同时诱导宿主产生体液免疫、细胞免疫以及免疫应答，且细胞免疫反应在针对不同亚型病毒的交叉免疫保护中有着重要的作用。
但是目前有研究显示，已获批的减毒活疫苗的有效性出现了下降。这种免疫原性的下降很可能是使用的疫苗骨架毒株与当前流行的毒株差异较大所引发。H2N2亚型流感病毒早在人群中消失，当前流行的主要是H1N1和H3N2亚型流感病毒。此外，在减毒活疫苗的生产过程和接种减毒活疫苗的儿童中发现了疫苗毒株突变的现象，这种现象也对目前所使用的减毒活疫苗的安全性提出了疑问。种种现象提示，需要构建一个新的流感减毒活疫苗骨架。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何制备冷适应的流感毒株，作为冷适应疫苗骨架毒株用于制备流感疫苗。
为解决上述技术问题，第一个方面本发明提供重组甲型流感病毒，其特征在于：所述重组甲型流感病毒表达或含有PB2突变蛋白、PB1突变蛋白、PA突变蛋白、NP突变蛋白和NS突变蛋白，
所述PB2突变蛋白选自A1)或A2)：
A1)、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)、在A1)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述PB1突变蛋白选自A3)或A4)：
A3)、氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A4)、在A3)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述PA突变蛋白选自A5)或A6)：
A5)、氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
A6)、在A5)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述NP突变蛋白选自A7)或A8)：
A7)、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A8)、在A7)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述NS突变蛋白选自A9)或A10)：
A9)、氨基酸序列是SEQ ID No.5和/或氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；
A10)、在A9)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
进一步地，所述的重组甲型流感病毒还包括M蛋白、HA蛋白和NA蛋白，
所述M蛋白包括M1蛋白和述M2蛋白，所述M1蛋白选自A11)或A12)：
A11)、氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质；
A12)、在A11)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述M2蛋白选自A13)或A14)：
A13)、氨基酸序列是SEQ ID No.8的蛋白质；
A14)、在A13)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述HA蛋白选自A15)或A16)：
A15)、氨基酸序列是SEQ ID No.9的蛋白质；
A16)、在A15)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述NA蛋白选自A17)或A18)：
A17)、氨基酸序列是SEQ ID No.10的蛋白质；
A18)、在A17)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
进一步地，所述的重组甲型流感病毒中的HA蛋白和NA蛋白也可根据流行性甲型流感病毒的类型进行适应性调整，以保证所述重组甲型流感病毒中的HA蛋白和NA蛋白与所述流行性甲型流感病毒相同。
进一步地，所述重组甲型流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述单股负链、分节段的RNA转录获得与所述单股负链、分节段的RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB2-RNA、PB1-RNA、PA-RNA、NP-RNA和NS-RNA，所述PB2-RNA为编码上述PB2突变蛋白的RNA分子；所述PB1-RNA为编码上述PB1突变蛋白的RNA分子；所述PA-RNA为编码上述PA突变蛋白的RNA分子；所述NP-RNA为编码上述NP突变蛋白的RNA分子；所述NS-RNA为编码上述NS突变蛋白的RNA分子。
进一步地，所述的重组甲型流感病毒中，所述成套正链RNA还包括M-RNA、HA-RNA和NA-RNA，所述M-RNA为编码上述M1蛋白和M2蛋白的RNA分子；所述HA-RNA为编码上述HA蛋白的RNA分子；所述NA-RNA为编码上述NA蛋白的RNA分子。
进一步地，所述的重组甲型流感病毒中，所述PB2-RNA是核苷酸序列是SEQ IDNo.11的RNA分子；所述PB1-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.12的RNA分子；所述PA-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.13的RNA分子；所述NP-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.14的RNA分子；所述NS-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.15的RNA分子。
进一步地，所述的重组甲型流感病毒中，所述M-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.16的RNA分子；所述HA-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.17的RNA分子；所述NA-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.18的RNA分子。
进一步地，所述的重组甲型流感病毒中，所述HA-RNA和NA-RNA也可根据流感病毒的变异情况进行适应性调整，例如与流行性变异毒株的序列相同。
进一步地，所述重组甲型流感病毒为流行性感冒病毒A型，其株号为CV1-A/PuertoRico/8/1934(PR8)(H1N1)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.45373。
为解决上述技术问题，第二个方面本发明提供与所述重组甲型流感病毒相关的生物材料，所述生物材料选自下述任一种：
E1)、编码上述重组甲型流感病毒的所述成套正链RNA的成套DNA分子，所述成套DNA分子包括编码所述PB2-RNA的DNA分子、编码所述PB1-RNA的DNA分子、编码所述PA-RNA的DNA分子、编码所述NP-RNA的DNA分子和编码所述NS-RNA的DNA分子，
E2)、成套载体，包括下述E2a)、E2b)、E2c)、E2d)和E2e)，
E2a)、含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体；
E2b)、含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体；
E2c)、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2d)、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体；
E2e)、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体；
E3)、含有上述重组甲型流感病毒的微生物；
E4)、含有上述重组甲型流感病毒的动物细胞系；
E5)、含有上述重组甲型流感病毒的动物组织；
E6)、含有上述重组甲型流感病毒的动物器官。
进一步地，所述的生物材料中，E1)所述成套DNA分子还包括编码所述M-RNA的DNA分子、编码所述HA-RNA的DNA分子和编码所述NA-RNA的DNA分子。
进一步地，所述的生物材料中，E2)所述成套载体还包括：E2f)、E2g)和E2h)，E2f)、含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体；
E2g)、含有编码所述HA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2h)、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体。
进一步地，所述的生物材料中，E2a)所述编码PB2-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.31；E2b)所述编码PB1-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.32；E2c)所述编码PA-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.33；E2d)所述编码NP-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.34；E2e)所述编码NS-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.35。
进一步地，所述的生物材料中，所述编码M-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ IDNo.36；所述编码HA-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.37；所述编码NA-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.38。
进一步地，所述的生物材料中，所述编码HA-RNA的DNA分子和编码NA-RNA的DNA分子也可根据流行性甲型流感病毒的类型进行适应性调整，以保证所述生物材料制备获得的重组流感病毒HA和NA与所述流行性甲型流感病毒相同。
为解决上述技术问题，第三个方面本发明提供所述重组甲型流感病毒的构建方法，所述方法包括M1)或/和M2)：
M1)、将权利要求5中所述的成套载体、含有编码甲型流感病毒M蛋白基因的重组载体、含有编码流行性甲型流感病毒HA蛋白基因的重组载体和含有编码所述流行性甲型流感病毒NA蛋白基因的重组载体导入细胞中，得到含有所述流行性甲型流感病毒HA和NA的重组甲型流感病毒；
M2)、将权利要求1-4中任一项所述的重组甲型流感病毒与流行性甲型流感病毒混合培养获得含有所述流行性甲型流感病毒HA和NA的重组甲型流感病毒。
进一步地，M1)所述方法中，所述细胞可为包装细胞。在本发明的一个实施例中，M1)所述方法包括将上述的载体导入MDCK和293T细胞中，将细胞混合培养物转染鸡胚，然后收集鸡胚尿囊液即得到含有重组流感病毒CV-PR8骨架毒株的Egg P1。
本发明中，所述载体可为流感病毒的反向遗传学拯救系统质粒，例如病毒拯救系统质粒。在本发明的一个实施例中，所述病毒拯救系统质粒为pHW2000。将流感病毒每一节段基因组的cDNA构建至病毒拯救系统质粒获得重组载体，将所有的节段的质粒共转染细胞，所述重组载体即可生成流感病毒的基因组RNA，也可生成流感病毒蛋白从而获得重组流感病毒。
所述重组流感病毒中，所述编码HA-RNA的DNA分子和编码NA-RNA的DNA分子可根据流行性甲型流感病毒的类型进行适应性调整，以保证所述重组甲型流感病毒中的HA蛋白和NA蛋白与所述流行性甲型流感病毒相同。
为解决上述技术问题，第四个方面本发明提供上述的重组流感病毒或上述的生物材料在制备治疗和/或预防流感病毒的药物中的应用。
为解决上述技术问题，第五个方面本发明提供上述的重组流感病毒或上述的生物材料在制备流感疫苗中的应用。
为解决上述技术问题，第六个方面本发明提供流感疫苗，所述流感疫苗以上述的重组甲型流感病毒作为骨架毒株，或以上述的重组甲型流感病毒作为活性成分。
本发明中，所述骨架毒株可为含有上述的PB2突变蛋白、PB1突变蛋白、PA突变蛋白、NP突变蛋白和NS突变蛋白及对应基因组的流感病毒。HA蛋白和NA蛋白及其对应的基因组序列可根据病毒的变异情况进行适应性调整，以保证流感疫苗对变异的流感毒株同样产生免疫效果。
本发明中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
本发明取得的有益技术效果
本发明获得的流感冷适应疫苗骨架毒株CV1-A/PuertoRico/8/1934(PR8)(H1N1)(简称为CV1-PR8)可作为冷适应疫苗骨架毒株，与流行流感病毒HA和NA基因进行重构制备流感疫苗。目前我国流感病毒冷适应减毒疫苗骨架的知识产权和产品严重匮乏，本发明可以弥补这一空缺。同时，目前国际上批准的流感病毒冷适应减毒疫苗的免疫效果有下降的趋势，且有研究对该疫苗的安全性提出了疑问，本发明为流感病毒冷适应减毒疫苗骨架毒株提供了更多的选择。
保藏说明
菌种名称：流行性感冒病毒A型
拉丁名：Influenza A virus
菌株编号：CV1-A/PuertoRico/8/1934(PR8)(H1N1)
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年12月19日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.45373。
附图说明
图1为构建的CV-PR8骨架毒株在不同温度下的复制能力。
图2为构建的CV1-PR8冷适应疫苗骨架毒株在不同温度条件下的复制能力。
图3为PCR扩增产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MDCK细胞由中国科学院微生物研究所高福课题组惠赠，在文献“Song H,GaoGF.Evaluation of the Glycan-Binding and Esterase Activities of Hemagglutinin-Esterase-Fusion Glycoprotein from Influenza D Virus.Methods Mol Biol.2022；2556:187-203.doi:10.1007/978-1-0716-2635-1_15.PMID:36175636.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
293T细胞购自中国医学科学院基础医学研究所-北京协和医学院基础学院，细胞编号为1101HUM-PUMC000091，订单号：2021010716891。
MDCK和293T细胞用含有10％的胎牛血清(Gibco)和双抗(100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素)的DMEM(Gibco)在37℃和5％ CO2的培养箱中进行培养。9-11日龄的SPF级鸡胚来自北京勃林格殷格翰通生物技术有限公司。下述实施例中pHW2000载体由Erich Hoffmann构建并公开，其核苷酸序列为SEQ ID No.19。
下述实施例中的A/Anhui/1/2005(H5N1)和A/Hong Kong/2108/2003(H9N2)毒株根据毒株的GISAID登录号提供的基因组信息合成对应的cDNA，并参照实施例1的方法(实施例1中的转染温度和鸡胚培养温度均更换为37℃)利用反向遗传技术、通过病毒拯救质粒获得对应的毒株。
下述实施例中的A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1)和A/Hong Kong/2671/2019(H3N2)由中国疾控中心提供的毒株。
下述实施例中的A/Anhui/1/2013(H7N9)为本实验室保存，在论文“Bi Y,Xie Q,Zhang S,Li Y,Xiao H,Jin T,Zheng W,Li J,Jia X,Sun L,Liu J,Qin C,Gao GF,LiuW.Assessment of the internal genes of influenza A(H7N9)virus contributing tohigh pathogenicity in mice.JVirol.2015Jan；89(1):2-13.doi:10.1128/JVI.02390-14.Epub 2014Oct 15..”里公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的A/Shenzhen/TH002/2016(H5N6)为本实验室保存，在论文“Bi Y,Tan S,Yang Y,Wong G,Zhao M,Zhang Q,Wang Q,Zhao X,Li L,Yuan J,Li H,Li H,Xu W,Shi W,Quan C,Zou R,Li J,Zheng H,Yang L,Liu WJ,Liu D,Wang H,Qin Y,Liu L,JiangC,Liu W,Lu L,Gao GF,Liu Y.Clinical and Immunological Characteristics of HumanInfections With H5N6 Avian Influenza Virus.Clin Infect Dis.2019Mar 19；68(7):1100-1109.”里公开，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、流感病毒CV-PR8骨架毒株的构建及培养
通过反向遗传学操作系统，在A/Puerto Rico/8/1934(PR8)(H1N1)疫苗骨架毒株(也称WT-PR8，基因组的公开号GenBank:AB671295.1)基础上，人工引入突变基因位点PB2(N265S)、PB1(K391E、E581G、A661T)、NP(M239L)，构建CV-PR8骨架毒株。
1)、CV-PR8质粒的获得：以PR8病毒拯救系统基因质粒pHW2000(载体全序列为SEQID No.19)为骨架载体，分别构建重组质粒pHW2000-CV-PB2、pHW2000-CV-PB1、pHW2000-CV-NP、pHW2000-CV-PA、pHW2000-CV-M、pHW2000-CV-NS、pHW2000-CV-HA与pHW2000-CV-NA。其中CV-PB2含有N268S的突变(CV-PB2)、CV-PB1含有K391E、E581G、A661I的突变(CV-PB1)和CV-NP中有M239L的突变(CV-NP)，这些点突变均由金斯瑞生物科技股份有限公司完成。
重组质粒pHW2000-CV-PB2是用核苷酸序列是SEQ ID No.20的DNA分子(CV-PB2的cDNA)替换骨架质粒pHW2000 BsmBI酶切位点之间的片段，保持骨架质粒pHW2000的其它核苷酸序列不变得到的重组表达质粒。重组质粒pHW2000-CV-PB2转入细胞后CV-PB2的cDNA可转录获得流感病毒的CV-PB2单股负链RNA，并翻译生成流感病毒蛋白CV-PB2，流感病毒蛋白CV-PB2的氨基酸序列是SEQ ID No.25。
重组质粒pHW2000-CV-PB1是用核苷酸序列是SEQ ID No.21的DNA分子(CV-PB1的cDNA)替换骨架质粒pHW2000 BsmBI酶切位点之间的片段，保持骨架质粒pHW2000的其它核苷酸序列不变得到的重组表达质粒。重组质粒pHW2000-CV-PB1转入细胞后CV-PB1的cDNA转录获得流感病毒的CV-PB1单股负链RNA，并翻译获得流感病毒蛋白CV-PB1，流感病毒蛋白CV-PB1的氨基酸序列是SEQ ID No.26。
重组质粒pHW2000-CV-PA是用核苷酸序列是SEQ ID No.22的DNA分子(CV-PA的cDNA)替换骨架质粒pHW2000 BsmBI酶切位点之间的片段，保持骨架质粒pHW2000的其它核苷酸序列不变得到的重组表达质粒。重组质粒pHW2000-CV-PA转入细胞后CV-PA的cDNA转录获得流感病毒的CV-PA单股负链RNA，并翻译生成流感病毒蛋白CV-PA，流感病毒蛋白CV-PA的氨基酸序列是SEQ ID No.27。
重组质粒pHW2000-CV-NP是用核苷酸序列是SEQ ID No.23的DNA分子(CV-NP的cDNA)替换骨架质粒pHW2000 BsmBI酶切位点之间的片段，保持骨架质粒pHW2000的其它核苷酸序列不变得到的重组表达质粒。重组质粒pHW2000-CV-NP转入细胞后CV-NP的cDNA转录获得流感病毒的CV-NP单股负链RNA，并翻译生成流感病毒蛋白CV-NP，流感病毒蛋白CV-NP的氨基酸序列是SEQ ID No.28。
重组质粒pHW2000-CV-NS是用核苷酸序列是SEQ ID No.24的DNA分子(CV-NS的cDNA)替换骨架质粒pHW2000 BsmBI酶切位点之间的片段，保持骨架质粒pHW2000的其它核苷酸序列不变得到的重组表达质粒。重组质粒pHW2000-CV-NS转入细胞后CV-NS的cDNA转录获得流感病毒的CV-NS单股负链RNA，并翻译生成流感病毒蛋白CV-NS1和CV-NS2，流感病毒蛋白CV-NS1的氨基酸序列是SEQ ID No.29，流感病毒蛋白CV-NS2的氨基酸序列是SEQ IDNo.30。
重组质粒pHW2000-CV-M是用核苷酸序列是SEQ ID No.36的DNA分子(CV-M的cDNA)替换骨架质粒pHW2000 BsmBI酶切位点之间的片段，保持骨架质粒pHW2000的其它核苷酸序列不变得到的重组表达质粒。重组质粒pHW2000-CV-M转入细胞后CV-M的cDNA转录获得流感病毒的CV-M单股负链RNA，并翻译生成流感病毒蛋白CV-M1和CV-M2，流感病毒蛋白CV-M1和CV-M2的氨基酸序列分别是SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8。
重组质粒pHW2000-CV-HA是用核苷酸序列是SEQ ID No.37的DNA分子(CV-HA的cDNA)替换骨架质粒pHW2000 BsmBI酶切位点之间的片段，保持骨架质粒pHW2000的其它核苷酸序列不变得到的重组表达质粒。重组质粒pHW2000-CV-HA转入细胞后CV-HA的cDNA转录获得流感病毒的CV-HA单股负链RNA，并翻译生成流感病毒蛋白CV-HA，流感病毒蛋白CV-HA的氨基酸序列是SEQ ID No.9。
重组质粒pHW2000-CV-NA是用核苷酸序列是SEQ ID No.38的DNA分子(CV-NA的cDNA)替换骨架质粒pHW2000 BsmBI酶切位点之间的片段，保持骨架质粒pHW2000的其它核苷酸序列不变得到的重组表达质粒。重组质粒pHW2000-CV-NA转入细胞后CV-NA的cDNA转录获得流感病毒的CV-NA单股负链RNA，并翻译生成流感病毒蛋白CV-NA，流感病毒蛋白CV-NA的氨基酸序列是SEQ ID No.10。
2)、转染方法：MDCK：293T按1:5-10的比例铺在六孔板中，用含有10％的胎牛血清和双抗的DMEM在37℃、5％ CO2的温箱中培养16-20h后进行转染实验。转染时，将重组质粒pHW2000-CV-PB2、pHW2000-CV-PB1、pHW2000-CV-NP、pHW2000-CV-PA、pHW2000-CV-M、pHW2000-CV-NS、pHW2000-CV-HA与pHW2000-CV-NA与转染试剂Lipofectamine 2000(六孔板中每个孔加入每个重组质粒500ng与转染试剂10μL)分别加入到加入到含有MEM-opti(Gibco)的EP管并混合均匀，静置5min，然后将两者混合，将混合物静置20min后将混合物均匀的加入六孔板并轻轻晃动使混合物分散均匀，然后33℃放置6-8h后换液，每个孔加入含有1μg/mL TPCK-胰酶(Sigma-Aldrich)的Opti-MEM，放置33℃、5％ CO2培养箱中培养72h后接种两枚9-11日龄的SPF级鸡胚，每枚鸡胚接种500μL，置于33℃温箱中培养96h后置于4℃过夜，然后收集鸡胚尿囊液并用1％鸡血(北京互特生物科技有限公司)测其血凝效价，若有血凝效价即得到含有重组流感病毒CV-PR8骨架毒株的Egg P1。
3)、生长曲线的测定：用鸡胚测毒株的生长曲线，将病毒稀释0.1HAU倍，每枚鸡胚接种量为0.1HAU/100μL，共接种9枚9-11日龄的SPF级鸡胚，37℃、33℃和25℃分别放置3枚鸡胚，然后分别在24h、48h、72h、96h和120h抽取鸡胚尿囊液300μL，分别测定所取尿囊液的血凝效价和使用qRT-PCR试剂盒(Vazyme，Q223-01)测定CT值，并通过CT值计算其copies(拷贝数)(换算公式为：copies＝-0.2654*CT值+11.842，如无CT值，直接记为0)。
试剂盒型号:Vazyme Q223-01
所用引物探针的核苷酸序列如下(5’-3’)：
IFA-BF：TGGITAAAGACAAGACCAATCYTG；
IFA-BR：TCTACGYTGCWGTCCTCGCTCA；
IFA-BP：TTGTRTTYACGCTCACCGTGCCCAG。
其中I表示肌苷，Y表示T或C，W表示A或T，R表示G或A。
结果如图1所示，图1中左侧附图为37℃、33℃和25℃培养鸡胚所取尿囊液的血凝效价，其中纵坐标为HA滴度，横坐标为鸡胚的培养时间；图1中右侧附图为37℃、33℃和25℃培养鸡胚所取尿囊液的流感病毒拷贝数测定结果，其中纵坐标为单位体积(mL)中流感病毒拷贝数的对数值(以2为底)，横坐标为鸡胚的培养时间。图1的结果表明：构建的CV-PR8骨架毒株不具备在37℃条件下的复制能力，能够在33℃很好的复制，但在25℃条件下的复制能力很差。
实施例2、流感病毒冷适应疫苗毒株CV1-PR8的获得
研究发现，CV-PR8骨架毒株可以在33℃复制，但不能在37℃和25℃复制(图1)。因此，在后续实验中，采用如下方式进行进一步冷适应驯化传代：在25℃对疫苗骨架毒株CV-PR8进行连续传代，在传代过程中我们发现毒株逐步获得在25℃的复制能力，最终获得能在25℃复制能力良好的冷适应毒株CV1-PR8(图2)。
在传代过程中，通过一代和二代测序对冷适应前、过程中和适应后基因位点的变化情况进行分析，结果发现，随着病毒对25℃的适应，多处基因发生了适应性突变(表1)。因此，确定这些基因位点突变赋予了疫苗骨架毒株CV1-PR8在25℃的生长能力，也获得了一株适用于鸡胚繁殖的H1N1亚型流感病毒冷适应疫苗骨架毒株CV1-Egg P45，将CV1-Egg P45编号为CV1-A/PuertoRico/8/1934(PR8)(H1N1)，以下简称CV1-PR8。而且CV1-PR8在37℃连续传代5代，仍不能在37℃条件下生长。说明构建的H1N1亚型流感病毒冷适应疫苗骨架毒株具有良好的遗传稳定性，可作为甲型冷适应疫苗毒株构建所用的骨架毒株，将流行的流感病毒HA和NA基因插入到疫苗骨架毒株进而构建针对流行的流感病毒的冷适应疫苗毒株。
具体步骤如下：
1)、CV1-Egg P45获得的传代方法：直接在25℃进行冷适应传代，如果上一代无血凝效价，则直接用原液接种下一代进行继代，每枚鸡胚(9-11日龄)的接种量为100μL，将接种完毕的鸡胚置于25℃温箱培养120h后，置于4℃冰箱过夜，然后收集鸡胚尿囊液并测其血凝效价和CT值。如果有血凝效价则接种1HAU/100μL和0.1HAU/100μL进行继代，在25℃培养96h或者120h后置于4℃过夜，然后收集鸡胚尿囊液并用1％鸡血测其血凝效价，用试剂盒(Vazyme Q223-01)测其CT值。
2)、生长曲线的测定：用鸡胚测毒株的生长曲线，将病毒稀释0.1HAU倍，每枚鸡胚接种量为0.1HAU/100μL，共接种9枚鸡胚，37℃、33℃和25℃分别放置3枚鸡胚，然后分别在24h、48h、72h、96h和120h抽取鸡胚尿囊液300μL，后测各时间所取尿囊液的血凝效价
3)、血凝效价的测定即HA titer：用1×PBS将各时间样品(步骤2)抽取的鸡胚尿囊液)在96孔V底板中进行2倍比稀释，然后加入等体积的1％鸡悬浮红细胞，在室温静置20min，然后通过观察鸡红细胞是否沉降来读取样本的血凝效价。
血凝效价的测定的结果如图2所示，图2中纵坐标为HA滴度的对数值(以2为底)，横坐标为鸡胚培养时间。图2的结果表明：该毒株在33℃和25℃均具有较好的复制能力，在37℃复制能力较差。
4)、CV1-PR8的突变位点检测
提取CV1-PR8接种获得的鸡胚尿囊液RNA作为模板(以ddH2O作为阴性对照)，以MBTuni-12和MBTuni-13为引物，使用PCR试剂盒(Vazyme，P611-01)进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，电泳胶图如图3，将扩增产物送测，进行二代测序。测序结果表明：相比于骨架毒株CV-PR8，CV1-PR8毒株出现如表1中的突变。
PCR扩增引物信息：
MBTuni-12 ACg CgT gAT CAg CAA AAg CAg g；
MBTuni-13ACg CgT gAT CAg TAg AAACAA gg。
表1：CV1-PR8中出现的适应性突变位点(与CV-PR8相比)
| CV1-PB2 | CV1-PB1 | CV1-PA | CV1-NP | CV1-NS1 | |
| CV1-PR8 | S470N | S678N | L336M | E18G、L239M | W102C、M119I |
相比于现有毒株，CV1-PR8毒株存在下述突变：
C1)、流感病毒PB2蛋白含有N268S(骨架毒株CV1-PR8)和S470N的突变；
C2)、流感病毒PB1蛋白含有K391E、E581G、A661I(骨架毒株CV-PR8)和S678N的突变；
C3)、流感病毒PA蛋白含有L336M的突变；
C4)、流感病毒的核蛋白(NP)含有E18G突变；
C5)、流感病毒NS1蛋白含有W102C、M119I的突变。
即，测序结果表明CV1-PR8毒株表达PB2突变蛋白、PB1突变蛋白、PA突变蛋白、NP突变蛋白、NS1突变蛋白、NS2突变蛋白、M1蛋白、M2蛋白、HA蛋白和NA蛋白。PB2突变蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质，PB1突变蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质，PA突变蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质，NP突变蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质，NS1突变蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质，NS2突变蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质，M1蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质，M2蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.8的蛋白质，HA蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.9的蛋白质，NA蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.10的蛋白质。
CV1-PR8流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述单股负链、分节段的RNA转录获得与所述单股负链、分节段的RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB2-RNA、PB1-RNA、PA-RNA、NP-RNA、NS-RNA、M-RNA、HA-RNA和NA-RNA。所述PB2-RNA为编码上述PB2突变蛋白的RNA分子，所述PB1-RNA为编码上述PB1突变蛋白的RNA分子，所述PA-RNA为编码上述PA突变蛋白的RNA分子，所述NP-RNA为编码上述NP突变蛋白的RNA分子；所述NS-RNA为编码上述NS突变蛋白的RNA分子，所述M-RNA为编码上述M1蛋白和M2蛋白的RNA分子，所述HA-RNA为编码上述HA蛋白的RNA分子，所述NA-RNA为编码上述NA蛋白的RNA分子。
即，所述PB2-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.11的RNA分子，所述PB1-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.12的RNA分子，所述PA-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.13的RNA分子，所述NP-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.14的RNA分子，所述NS-RNA是核苷酸序列是SEQ IDNo.15的RNA分子，所述M-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.16的RNA分子，所述HA-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.17的RNA分子，所述NA-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.18的RNA分子。
将获得的CV1-PR8毒株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行专利程序的保藏，保藏日期为2022年12月19日，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.45373。
CV1-PR8可参照实施例1的方法拯救获得。其中，CV1-PB2的cDNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.31；CV1-PB1的cDNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.32；CV1-NP的cDNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.33；CV1-PA的cDNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.34；CV1-NS的cDNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.35；CV1-M的cDNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.36；CV1-HA的cDNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.37；CV1-NA的DNA分子的核苷酸序列是SEQID No.38。
在本项发明中选择在现有的鸡胚适应的灭活疫苗骨架毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)作为基础病毒株上进行改造，用反向遗传学技术联合冷适应传代的技术方法构建适用于鸡胚繁殖的H1N1亚型冷适应疫苗骨架毒株，为在不改变鸡胚疫苗生产线的基础上生产冷适应疫苗提供技术支撑，提高了改疫苗转化实际生产的可能性。在本发明中发现的冷适应位点能够大大减弱毒株在37℃的复制能力，并能够使毒株在低温下(33℃和25℃)良好复制，在这三个温度条件下的复制能力满足冷适应减毒流感疫苗在不同温度下复制能力的要求，表明含有这些位点的毒株有成为减毒活疫苗骨架的潜力。
实施例3、CV1-PR8动物实验及作为骨架形成新的毒株
3.1、试验动物：
SPF级BALB/c小鼠，雌性，6～7周龄，体重16～18g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
3.2、试验步骤
将试验小鼠分为三组，每组5只，第一组滴鼻25μL的1×PBS作为对照，第二组滴鼻感染25μL的106EID50/50μL的PR8的野生流感毒株(实施例1中的WT-PR8)，第三组滴鼻感染25μL的106EID50/50μL的CV1-PR8流感病毒，监测其存活情况(小鼠死亡及体重下降25％及以上判定为死亡)，并在免疫后14天取血并分离血清，测HI抗体滴度。小鼠14天的存活情况及HI抗体情况如表2所示。PBS对照组及CV1-PB1组14天内小鼠均无明显的体重下降，致死率为0％，而等剂量的WT-PR8组小鼠的致死率达100％，说明CV1-PR8达到了减毒的目的并具备一定的安全性。免疫14天后的HI抗体均高于1：40，说明CV1-PR8滴鼻后产生的抗体具有保护作用。
其中106EID50/50μL的CV2-PR8流感病毒的制备方法为：用1×PBS将CV2-PR8稀释为106EID50/50μL。
106EID50/50μL的PR8的野生流感毒株的制备方法参照CV2-PR8流感病毒。
3.3、HI抗体滴度测定方法
取所分离血清20μL于1.5mL EP管中，并加入80μL的RBD混匀，37℃作用16～18h，56℃灭活作用30min，加入20％红细胞泥混匀后于37℃1h，期间反复颠倒混匀；1000×g离心吸取上清即为处理好的血清，放4℃待用。用八道移液器向96孔V型血凝板中每孔加25μL的1×PBS。然后用单道移液器向96孔V型血凝板第1孔分别加入25μL处理后的血清，吹打混匀，再用八道移液器从第1孔吸出25μL至第2孔，吹打混匀，依次倍比稀释到第11孔，弃去25μL。第12孔加25μL生理盐水或PBS做阴性对照。用八道移液器吸依次加入25μl的4HAU病毒液，37℃(室温)作用30min，加入1％鸡红细胞悬液，室温放置15～20min，观察结果
结果判定：将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集或将血凝板置。使红细胞完全凝集抑制的最高稀释度作为判定终点，即HI效价。
表2：动物实验结果
| 毒株名称 | 小鼠致死率 | 体重下降 | 14dpi HI抗体滴度 |
| 1×PBS | 0％ | 未见明显下降 | 0 |
| WT | 100％ | >25％ | 14天全部死亡未检测 |
| CV1-PR8 | 0％ | 未见明显下降 | 5只小鼠均>1：40 |
实施例4、病毒构建
4.1、反向遗传拯救病毒
MDCK：293T按1:5-10的比例铺在六孔板中，用含有10％的胎牛血清和双抗的DMEM在37℃、5％ CO2的温箱中培养16-20h后进行转染实验。转染时，将重组质粒pHW2000-CV1-PB2、pHW2000-CV1-PB1、pHW2000-CV1-NP、pHW2000-CV1-PA、pHW2000-CV1-M、pHW2000-CV1-NS、pHW2000-HA(表3中所示毒株的HA)、pHW2000-NA(表3中所示毒株的NA)与转染试剂Lipofectamine 2000(六孔板中每个孔加入每个重组质粒500ng与转染试剂10μL)分别加入到含有MEM-opti(Gibco)的EP管并混合均匀，静置5min，然后将两者混合，将混合物静置20min后将混合物均匀的加入六孔板并轻轻晃动使混合物分散均匀，然后33℃放置6-8h后换液，每个孔加入含有1μg/mL TPCK-胰酶(Sigma-Aldrich)的Opti-MEM，放置33℃、5％ CO2培养箱中培养72h后接种两枚9-11日龄的SPF级鸡胚，每枚鸡胚接种500μL，置于33℃温箱中培养96h后置于4℃过夜，然后收集鸡胚尿囊液并用1％鸡血(北京互特生物科技有限公司)测其血凝效价，若有血凝效价即得到目标毒株。
重组质粒pHW2000-CV1-PB2、pHW2000-CV1-PB1、pHW2000-CV1-NP、pHW2000-CV1-PA、pHW2000-CV1-M、pHW2000-CV1-NS、pHW2000-HA(生成表3中所示毒株的HA的DNA分子)、pHW2000-NA(生成表3中所示毒株的NA的DNA分子)的制备参照实施例1，其区别仅在于，将cDNA进行对应性替换。其中，生成HA和NA的cDNA分子可参照表3中所示毒株的基因组信息直接合成。
4.2、自然感染获得重配病毒
将CV1-PR8稀释至10-3，分别与表3中毒株等体积混合，接种鸡胚，每枚鸡胚接种200μL，放至37℃温箱培养72h，收取鸡胚尿囊液。将收获的鸡胚尿囊液与抗PR8的血清等体积混合，在37℃中和2h，然后接种鸡胚(100μL/枚)，在25℃培养96h，然后收取鸡胚尿囊液，用抗PR8的血清继续中和然后接种鸡胚，总共进行4次抗血清循环，测其血凝效价(1％鸡血细胞)。
其中抗PR8的血清的制备方法为：β-丙内酯灭活WT-PR8后，与铝佐剂按说明书所载的方法混匀后及进行乳化，通过肌肉注射免疫兔(新西兰大白兔和70日龄)，多次免疫后取血分离血清。具体的，每只兔注射体积在500μL-1mL，首次免疫中灭活WT-PR8免疫剂量为100μg/只。首次免疫两周后按照灭活WT-PR8为100μg/只的免疫剂量将灭活WT-PR8与铝佐剂混匀进行加强免疫。加强免疫每两周进行一次，共加强免疫4次。免疫间隔期对兔进行取血，每次取5mL左右，2000rpm离心5min取上清，即得到WT-PR8免疫组的免疫血清。HI效价≥1280即可全部采血。
表3：甲型流感毒株信息
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.重组甲型流感病毒，其特征在于：所述重组甲型流感病毒表达或含有PB2突变蛋白、PB1突变蛋白、PA突变蛋白、NP突变蛋白和NS突变蛋白，
所述PB2突变蛋白选自A1)或A2)：
A1)、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)、在A1)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述PB1突变蛋白选自A3)或A4)：
A3)、氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A4)、在A3)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述PA突变蛋白选自A5)或A6)：
A5)、氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
A6)、在A5)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述NP突变蛋白选自A7)或A8)：
A7)、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A8)、在A7)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述NS突变蛋白选自A9)或A10)：
A9)、氨基酸序列是SEQ ID No.5和/或氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；
A10)、在A9)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒，其特征在于：所述重组甲型流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述单股负链、分节段的RNA转录获得与所述单股负链、分节段的RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB2-RNA、PB1-RNA、PA-RNA、NP-RNA和NS-RNA，
所述PB2-RNA为编码权利要求1中所述PB2突变蛋白的RNA分子；
所述PB1-RNA为编码权利要求1中所述PB1突变蛋白的RNA分子；
所述PA-RNA为编码权利要求1中所述PA突变蛋白的RNA分子；
所述NP-RNA为编码权利要求1中所述NP突变蛋白的RNA分子；
所述NS-RNA为编码权利要求1中所述NS突变蛋白的RNA分子。
3.根据权利要求2所述的重组甲型流感病毒，其特征在于：
所述PB2-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.11的RNA分子；
所述PB1-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.12的RNA分子；
所述PA-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.13的RNA分子；
所述NP-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.14的RNA分子；
所述NS-RNA是核苷酸序列是SEQ ID No.15的RNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组甲型流感病毒，其特征在于：所述重组甲型流感病毒为流行性感冒病毒A型，其株号为CV1-A/PuertoRico/8/1934(PR8)(H1N1)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.45373。
5.与权利要求1-4中任一项所述重组甲型流感病毒相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料选自下述任一种：
E1)、编码权利要求2-4中任一所述重组甲型流感病毒的所述成套正链RNA的成套DNA分子，所述成套DNA分子包括编码所述PB2-RNA的DNA分子、编码所述PB1-RNA的DNA分子、编码所述PA-RNA的DNA分子、编码所述NP-RNA的DNA分子和编码所述NS-RNA的DNA分子；
E2)、成套载体，包括下述E2a)、E2b)、E2c)、E2d)和E2e)，
E2a)、含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体；
E2b)、含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体；
E2c)、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2d)、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体；
E2e)、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体；
E3)、含有权利要求1-4中任一所述重组甲型流感病毒的微生物；
E4)、含有权利要求1-4中任一所述重组甲型流感病毒的动物细胞系；
E5)、含有权利要求1-4中任一所述重组甲型流感病毒的动物组织；
E6)、含有权利要求1-4中任一所述重组甲型流感病毒的动物器官。
6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：
E2a)所述编码PB2-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.31；
E2b)所述编码PB1-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.32；
E2c)所述编码PA-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.33；
E2d)所述编码NP-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.34；
E2e)所述编码NS-RNA的DNA分子的核苷酸序列是SEQ ID No.35。
7.重组甲型流感病毒的构建方法，其特征在于：所述方法包括M1)或/和M2)，
M1)、将权利要求5中所述的成套载体、含有编码甲型流感病毒M蛋白基因的重组载体、含有编码流行性甲型流感病毒HA蛋白基因的重组载体和含有编码所述流行性甲型流感病毒NA蛋白基因的重组载体导入细胞中，得到含有所述流行性甲型流感病毒HA和NA的重组甲型流感病毒；
M2)、将权利要求1-4中任一项所述的重组甲型流感病毒与流行性甲型流感病毒混合培养获得含有所述流行性甲型流感病毒HA和NA的重组甲型流感病毒。
8.权利要求1-4中任一项所述的重组甲型流感病毒或权利要求5或6所述的生物材料在制备治疗或/和预防流感病毒的药物中的应用。
9.权利要求1-4中任一项所述的重组流感病毒或权利要求5或6所述的生物材料在制备流感疫苗中的应用。
10.流感疫苗，其特征在于：所述流感疫苗以权利要求1-3中任一项所述的重组甲型流感病毒作为骨架毒株，或以权利要求1-4中任一项所述的重组甲型流感病毒作为活性成分。
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