KR20130140050A

KR20130140050A - Ａ/ｈ1ｎ1 범유행 인플루엔자 바이러스에 대한 신규한 백신

Info

Publication number: KR20130140050A
Application number: KR1020137014167A
Authority: KR
Inventors: 헥토 마뉴엘 제페다 로페즈
Original assignee: 헥토 마뉴엘 제페다 로페즈
Priority date: 2010-11-02
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2013-12-23
Also published as: CA2826234A1; EP2650362A9; AP2013006835A0; EP2650362A4; EA201300525A1; EP2650362A2; BR112013010830A2; JP2014511119A; WO2012060678A3; CN103328629A; WO2012060678A2

Abstract

본 발명은, 인플루엔자 바이러스 백신, 특히, 적어도 D222 돌연변이를 포함하는 그 헤마글루티닌 유전자, 및 오셀타미비르 내성 뉴라미니다아제 유전자를 갖는 인플루엔자 바이러스에 관한 것이다. 추가 실시예에서, 인플루엔자 바이러스 백신은 인간에서 특이적 면역 반응을 증가시키는 돌연변이를 포함하는 기질 단백질을 더 포함한다. 바이러스는 고병독성 및 오셀타미비르-내성 인플루엔자에 대한 백신의 제조에 유용하다.

Description

Ａ/Ｈ1Ｎ1 범유행 인플루엔자 바이러스에 대한 신규한 백신{NOVEL VACCINES AGAINST THE A/H1N1 PANDEMIC FLU VIRUS}

본 발명은, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신, 특히, 범유행 A/H1N1 인플루엔자 바이러스의 고병독성 균주에 대한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 HA 및 NA 분절(세그먼트)(segment)에 특정 돌연변이를 보유한 인플루엔자 백신의 제조에 유용한 인플루엔자 바이러스 균주를 제공한다.

인플루엔자는 오르쏘믹소 바이러스과의 RNA 바이러스에 의해 야기된다. 이들 바이러스에는 3가지 유형이 있으며, 이들은 서로 상이한 유형의 인플루엔자 A형, B형 및 C형을 일으킨다. 인플루엔자 A형 바이러스는 포유류(인간, 돼지, 페럿, 말) 및 새를 감염시킨다. 이것은 세계적인 범유행을 일으킨 바이러스 유형이므로 인류에게 매우 중요하다. 인플루엔자 바이러스 B형(또한 간단히 인플루엔자 B로도 알려져 있음)은 인간만을 감염시킨다. 이는 때때로 인플루엔자의 국소 발발을 일으킨다. 인플루엔자 C 바이러스는 또한 인간만을 감염시킨다. 이들은 어릴 때 대부분의 사람을 감염시키며, 거의 심각한 질환을 일으키지 않는다.

인플루엔자 A 바이러스는, 사람, 말, 돼지, 페럿, 및 새를 포함한 다양한 포유류를 감염시킨다. 유행 및 범유행에 연관된 주요 병원체이다. 적어도 15개의 공지된 헤마글루티닌(혈구응집소)(Hemagglutinin)(H) 혈청형들 및 9개의 공지된 뉴라미니다아제(N) 혈청형들이 있다. 돼지들 및 새들은 인간들 및 동물들 간의 친밀한 접촉을 통해 인간 개체군으로 다시 전달되는 유전적이고 항원적으로 다양한 바이러스들의 풀들을 생성하는 특히 중요한 저장소들로 여겨진다. 인플루엔자 B 바이러스는 포유류들만을 감염시키며 질병을 일으키지만, 일반적으로는 A형들만큼 심각하지 않다. 인플루엔자 A 바이러스들과는 달리, 인플루엔자 B 바이러스는 구별 가능한 혈청형들을 갖지 않는다. 인플루엔자 C 바이러스는 또한 포유류들만을 감염시키지만, 거의 질병을 일으키지 않는다. 이들은 A형 및 B형과 유전적으로 그리고 형태학적으로 구별된다.

여러 다른 바이러스들과는 대조적으로, 인플루엔자 게놈은 DNA가 아닌 RNA로 이루어진다. 게놈은 8개 분절(세그먼트)(segment)을 포함하며, 전체 8개 분절들을 함유하는 바이러스성 입자들만이 생활성이 있다(Steinhauer DA, Skehel JJ., Genetics of influenza viruses. Ann Rev Genet. 2002 36: 305-332).

인플루엔자 바이러스에는 4개 항원들 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다아제(NA), 뉴클레오캡시드(NA), 기질(M) 및 뉴클레오캡시드 단백질들(NP)이 존재한다. NP는 3개 형태 A, B 및 C로 생성되는 유형-특이적 항원으로, 인간 인플루엔자 바이러스 분류의 기반을 제공한다. 기질 단백질(M 단백질)은 뉴클레오캡시드를 둘러싸며, 입자 질량의 35-45%를 차지한다. 2개 표면 당단백질들이 막대형 돌출부들로 표면 상에 보인다. 헤마글루티닌(HA)은 2개 서브유닛 HA1 및 HA2로 이루어진다. HA는 세포 수용체로의 바이러스 부착을 매개한다. 뉴라미니다아제(NA) 분자들은 외피에 더 적은 양으로 존재한다. 순환하는 인간 균주들은 한 해에서 다음 해까지 돌연변이를 축적하는 이들의 경향성으로 유명하며, 재발성 유행들을 일으킨다.

인플루엔자 바이러스는 별개 분절들(8개)에 그 게놈을 갖는 드문 소수의 바이러스 중 하나이다. 게놈의 분절화된 성질은 또한 재조합체들이 형성될 가능성을 증가시키는 상이한 바이러스 균주들 간 전체 유전자들의 교환을 허용한다(두 상이한 바이러스들이 동일한 세포를 감염시키는 경우 유전자 분절들의 교환에 의해). 즉, 세포가 두 상이한 인플루엔자 균주들로 감염된 경우, 각각의 원래 바이러스 유래 분절들을 갖는 새 바이러스를 생성하기 위해 분절들이 재배열될 수 있다. 이는 자연계에서 새로운 인플루엔자 균주들의 빠른 발생에 기여할 수 있다. 신규 게놈들은 두 바이러스 간 혼합 결과 조립될 수 있다. 이 절차는 또한 실험실에서 복제될 수 있다(백신 균주들의 제조에 사용됨). 극동에서 돼지들에서 재조합되는 조류 및 인간 균주들이 병독성 인간 균주들의 진화를 허용할 수 있다.

인플루엔자 바이러스들의 유전적 형성력은 또한 백신 설계, 병원성, 및 신규한 바이러스들이 천연 저장소들에서 출현하여 세계적 범유행을 야기할 능력에 대해 중요한 잠재적 시사점들을 갖는다.

범유행(H1N1) 2009 바이러스는 범유행 과정 동안 초기의 혼합 클래드 패턴에서 1개의 클래드 현저형(클래드 7)으로 변화하여 세계적으로 진화하였다. 따라서, 상기 클래드를 구성하는 바이러스는 대부분의 세계적 범유행 부담에 관여하였다. 헤마글루티닌(HA) 단백질 서열에서의 돌연변이 S203T는 클래드 7 단리체들에 특이적이다(Valli MB 등, Evolutionary pattern of pandemic influenza (H1N1) 2009 virus in the late phases of the 2009 pandemic. PLoS Curr Influenza. 2010 March 3: RRN1149).

S203T 돌연변이를 포함하는 클래드 7 단리체들 가운데, 위치 222(H3 번호지정에서는 225)에 해당하는 아미노산에서의 헤마글루티닌 HA1 유전자 서열의 변화(여기서 아스파르트산(D)이 글리신(G)으로 변화됨)는 중증 임상 결과들에 연관된다. D222G 돌연변이는 2009. 4-9월 사이 상이한 시점들에서 GenBank에서 H1N1 pdm 세계적 단리체들에서 주지되었다(Chen GW, Shih SR (2009) Genomic signatures of influenza A pandemic (H1N1) 2009 virus. Emerg Infect Dis).

인플루엔자 백신은 고가변형 인플루엔자 바이러스에 대해 보호하는 연차성 백신이다. 각각의 주입된 계절성 인플루엔자 백신은 3가지 인플루엔자 바이러스: 하나의 A형(H3N2) 바이러스, 2009 범유행 H1N1 바이러스, 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스를 함유한다 (www.cdc.gov/vaccines/pubs/vis/downloads/vis-flu.pdf). 그러나, 범유행 인플루엔자 백신은 HA 단백질에 D222G 돌연변이를 보유하는 인플루엔자 H1N1 바이러스에 대해서만 약하게 유효하다.

따라서, H1N1의 D222G 변이체에 대해 강한 항체 역가를 생성하는 바이러스 균주와 바이러스 유도 항원이 크게 요구된다.

본 발명은 범유행 인플루엔자 A H1N1 바이러스의 고병독성 및/또는 오셀타미비르-내성 버전들에 대한 백신들의 제조를 위한 방법들 및 조성물들에 관한 것이다. HA의 D222 잔기 및 NA의 S275 잔기에 돌연변이를 포함하는 백신 조성물들이 제공된다.

본 발명은 적어도 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 바이러스 1 단리체에서 유도된 서열 목록 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 헤마글루티닌(HA) 유전자 분절, 및 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 바이러스 1 단리체에서 유도된 서열 목록 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 뉴라미니다아제(NA) 유전자 분절을 갖는 인플루엔자 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신을 제공한다.

일 실시예에서, HA 유전자 분절은 바이러스 1의 분절 4의 뉴클레오티드 서열로 인코딩되는 아미노산 서열(서열 목록 번호 4)을 포함한다. 일부 버전들에서, HA 유전자 분절은 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 클래드 7 특이적 HA 서열을 포함한다.

일 실시예에서, HA 유전자 분절은 야생형 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 D222 잔기에 돌연변이를 포함한다. 일 실시예에서, HA 유전자 분절은 D222E 돌연변이를 포함한다. 추가 실시예에서, HA 유전자 분절은 야생형 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스에 비해 S203T 돌연변이를 포함한다.

본 발명은 HA 유전자 분절이 하나 이상의 P83S 및 I321V 돌연변이를 더 포함하는 백신들에 관한 것이다.

일 실시예에서, NA 유전자 분절은 바이러스 1의 분절 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열(서열 목록 번호 6)을 포함한다. NA 유전자 분절은 야생형 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스에 비해 Y275H 돌연변이를 포함한다.

본 발명은 NA 유전자 분절이 하나 이상의 I106V, D248N 돌연변이를 더 포함하는 백신들에 관한 것이다.

본 발명의 백신은, c) 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 바이러스 1 단리체에서 유도된 서열 목록 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 M1 펩티드를 인코딩하는 기질(MA) 유전자 분절을 더 포함할 수 있다.

일 실시예에서, MA 유전자 분절은 바이러스 1의 분절 7의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열(서열 목록 번호 7)을 포함한다.

일부 실시예에서, 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 바이러스 1 단리체에서 유도된 서열 목록 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 M2 펩티드를 인코딩하는 기질(MA) 유전자 분절이 포함된다. 추가 실시예에서, M1 펩티드는 A198P 돌연변이를 포함한다.

본 발명은, 환자에게 본원에 개시된 인플루엔자 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대한 환자의 면역화 방법에 관한 것이다.

본 발명은, 환자에게 본원에 개시된 인플루엔자 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 고병독성 인플루엔자 바이러스에 대한 환자의 면역화 방법에 관한 것이다.

본 발명은, 환자에게 본원에 개시된 인플루엔자 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 오셀타미비르-내성 인플루엔자 바이러스에 대한 환자의 면역화 방법에 관한 것이다.

본 발명은 본원에 개시된 백신에 관한 것이며, 여기서 백신은 재편성 백신이다. 추가 실시예에서, 재편성 인플루엔자 바이러스는 전통적 재편성에 의해 수득된다.

본 발명은 약독화 생백신 또는 비활성화 백신인 본원에 개시된 백신에 관한 것이다. 추가 실시예에서, 백신은 경구 또는 비강 내 투여를 위해 제형화된다.

본 발명은 본원에 개시된 인플루엔자 바이러스를 담체, 및 선택적으로 항원보강제와 혼합하는 단계를 포함하는, 고병독성 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 대상체를 면역화하기 위한 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

이들 및 다른 측면들은 하기 도면들과 함께 얻는 바람직한 실시예의 하기 설명에서 자명할 것이나, 여기에서 변화들 및 개질들이 본 개시의 신규한 개념들의 요지 및 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있다.

본 발명은, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신, 특히, 범유행 A/H1N1 인플루엔자 바이러스의 고병독성 균주에 대한 백신을 제공하는 효과를 갖는다.

하기 도면들은, 본 명세서의 일부를 형성하며 본 개시의 특정 측면을 추가로 설명하기 위해 포함되고, 이 발명들은 본원에 제공된 구체적 실시예의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면들을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 특허 또는 출원 파일은 적어도 하나의 유색 도면을 함유한다. 본 특허 또는 특허 출원 공보와 유색 도면(들)의 사본은 요청 및 소요 비용의 지불시 청에서 제공될 것이다.
도 1은, 실시간 PCR에 의한 바이러스량 정량의 예를 보여주는 도면.
도 2는, AH1N1 실시간 PCR 검출을 위한 시료 배열을 보여주는 도면.
도 3a 및 3b는, 형광 곡선들을 보여주는 Light Cycler 2.0 실시간 열교환기 인터페이스의 그래프도를 보여주는 도면. 도 3a) 임상적 시료. 도 3b) RNAseP(RP) 검출.
도 4a는, VERO 세포주에서 인플루엔자 바이러스 HZFLUJAL의 적응을 보여주는 도면. 바이러스는 VERO 세포에서 4차 계대까지 효율적으로 복제할 수 있었다. 도 4b는 MDCK 세포주에서 인플루엔자 바이러스 HZFLUJAL의 적응 단계들을 보여준다. 인플루엔자 바이러스 HZFLUJA는 MDCK 세포에서 3차 계대 후 효율적으로 복제할 수 있었다.
도 5는, ELISA에 의해 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 전체 항체를 보여주는 도면.
도 6a는, ELISA에 의해 혈청에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgM 항체를 보여주는 도면.
도 6b는, ELISA에 의해 혈청에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgG 항체를 보여주는 도면.
도 7a는, ELISA에 의해 혈청에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgG₂ _A 항체를 보여주는 도면. 도 7b는, ELISA에 의해 혈청에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgG₂ _A 용량-반응을 보여주는 도면.
도 8a는, ELISA에 의해 호흡 점막에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgA 항체를 보여주는 도면. 도 8b는, ELISA에 의해 호흡 점막에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgA 용량-반응을 보여주는 도면.

본 명세서에서 사용되는 용어는, 일반적으로 본 발명의 맥락 내에서 그리고 각각의 용어가 사용되는 특정 맥락에서, 당분야에서 이들의 일반적 의미들을 갖는다. 본 발명을 설명하는데 사용되는 특정 용어들이 하기 또는 명세서의 다른 곳에서 논의되어 본 발명의 설명에 대해 숙련자에게 추가 지침을 제공한다. 편의를 위해, 특정 용어들은 예를 들어 이탤릭체들 및/또는 인용 부호들을 이용하여 강조될 수 있다. 강조의 이용은 용어의 범위 및 의미에 영향을 미치지 않는다; 용어의 범위 및 의미는 동일 문맥에서 강조 여부와 무관하게 동일하다. 동일한 것이 하나를 초과하는 방식으로 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

결과적으로, 대안적 언어 및 동의어들이 본원에서 논의되는 하나 이상의 용어들에 대해 사용될 수 있으나, 용어가 본원에서 공들이거나 논의되는지 여부와 무관하게 어느 것에도 어떠한 특별한 의미가 부여되지는 않는다. 특정 용어들에 대한 동의어가 제공된다. 하나 이상의 동의어들의 언급이 다른 동의어들의 사용을 배제하지는 않는다. 본원에서 논의된 임의 용어들의 예를 포함하여 본 명세서 모든 곳에서의 예의 사용은 단지 예시적인 것이며, 어느 경우에도 본 발명 또는 임의의 예시된 용어의 범위 및 의미를 제한하지 않는다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 주어진 다양한 실시예에 제한되지 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 문헌을 따를 것이다. 하기 참고문헌들은 본 발명에서 사용되는 여러 용어들의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: [Singleton 등, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1993); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., Cambridge University Press. 1990); The Glossary of Genetics, 5th ed., R. Rieger 등 (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Margham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)].

일반적으로, 본원에 기재되는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리-뉴클레오티드 화학 및 혼성화에 관한 및 그 기법들에서 사용되는 명명법들은 당분야에서 널리 공지되고 일반적으로 사용된다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양과 형질전환(예로 전기천공, 리포펙션)을 위한 표준 기법들이 사용된다. 효소 반응들 및 정제 기법들은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 제조업체의 명세서들에 따라 수행된다. 본 발명의 실시는 구체적으로 반대로 제시되지 않는 한, 당분야의 기술 내의 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기법들의 종래 방법들을 채용할 것이며, 그 다수가 예시를 위한 목적으로 하기에 기재된다. 이러한 기법들은 문헌에서 자세히 설명된다. 예로 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]를 참고하라.

인플루엔자 A 바이러스는 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 네거티브 센스 RNA의 8개 별도 분절들로 이루어진 게놈들을 함유한다(Steinhauer DA, Skehel JJ., Genetics of influenza viruses. Ann Rev Genet. 2002 36: 305-332). 순환하는 인간 균주들은 한 해에서 다음 해까지 돌연변이를 축적하는 이들의 경향성으로 유명하며, 재발성 유행을 일으킨다. 그러나 게놈의 분절화된 성질은 또한 상이한 바이러스 균주들 간 전체 유전자들의 교환을 허용한다. 인플루엔자 바이러스들의 유전적 형성력은 또한 백신 설계, 병원성, 및 신규한 바이러스들이 천연 저장소들에서 출현하여 세계적 범유행을 야기할 능력에 대해 중요한 잠재적 시사점들을 갖는다.

[표 1]

총 950개 바이러스를 세포 배양물에서 단리하였으며, 여기에서 193개 뉴라미니다아제(NA) 및 197개 헤마글루티닌(HA) 부분 유전자 서열들을 모세관 서열분석을 통해 수득하였다. HA 및 NA는 AH1N1에서 가장 가변성이 높은 서열들로, 컴퓨터 내 분석(계통 분석 및 BLAST)은 전체 386개(HA 및 NA 서열)가 20개 클러스터로 그룹화될 수 있음을 보여주어, 각 클러스터에서 하나의 대표 구성원의 전체 게놈을 454 Titanium Roche Pyrosequencing 장비(ROCHE)에서 파이로시퀀싱하였다. 총 20개의 전체 AH1N1 게놈들을 수득하였으며, 각각의 AH1N1은 8개 유전자로 구성된다.

서열분석 데이터는 3개의 상이한 돌연변이를 갖는 4개의 바이러스 단리체들을 나타내었다: (i) NA(오셀타미비르^R), HA(고병독성) 및 기질 분절들에 돌연변이를 보유한 pAH1N1 바이러스(바이러스 1); (ii) NA 및 기질 분절들에 돌연변이를 보유한 pAH1N1 바이러스(바이러스 2); (iii) 기질(MA) 분절에 돌연변이를 보유한 pAH1N1 바이러스(바이러스 3); 및 (iv) 뉴라미니다아제(NA) 분절에 돌연변이를 보유한 pAH1N1 바이러스(바이러스 4).

위치 222(H3 번호지정에서는 225)에 해당하는 아미노산에서의 헤마글루티닌 HA1 유전자 서열의 변화(여기서 아스파르트산(D)은 글리신(G)으로 변화됨)는 중증 임상 결과들에 연관된다. D222G 돌연변이는 2009. 4-9월 사이 상이한 시점들에서 GenBank에서 H1N1pdm 세계적 단리체들에서 주지되었다(Chen GW, Shih SR (2009) Genomic signatures of influenza A pandemic (H1N1) 2009 virus. Emerg Infect Dis).

인플루엔자 바이러스의 시알산-α2,3-갈락토오스(α2,3 수용체) 또는 시알산-α2,6-갈락토오스(α2,6 수용체)에 대한 선호적 결합은 α2,3 및 α2,6 수용체들로서의 그 친화성이 각각 상기도 및 하기도 세포들 상에서 우세한 것으로 결정될 수 있다(Shinya K, Ebina M, Yamada S, Ono M, Kasai N, Kawaoka Y. Avian flu: influenza virus receptors in the human airway. Nature. 2006; 440(7083):435-6).

최근의 글리칸 마이크로어레이 분석은 헤마글루티닌(HA) D222G 치환이 α2,3 수용체들에 대한 결합을 증가시키고 질병의 중증도에 기여할 수 있는 α2,6 수용체들에서 혼합 α2,3/α2,6 수용체들로의 전환을 야기할 수 있음을 시사하였다(Stevens J, Blixt O, Glaser L, Taubenberger JK, Palese P, Paulson JC 등, Glycan microarray analysis of the hemagglutinins from modern and pandemic influenza viruses reveals different receptor specificities. J Mol Biol. 2006;355(5): 1143-55). 이 위치는 수용체 결합 특이성에 영향을 미치며, 두 1918 바이러스 변이체들(상동) 간의 D에서 G로의 차이는 α2-6-연관 시알산 선호에서 이중 α2-3/α2-6 특이성으로의 전환과 연관되는 것으로 보인다, 즉 α2-3 수용체들을 발현하는 세포들이 보다 풍부한 하부 기도에서 바이러스가 감염되기 더 쉽게 만들어서 고병독성을 야기하는 것으로 생각될 수 있다.

그러나, D222G 치환을 갖는 중증 사례들에서는 구별되는 계통적 클러스터링이 관찰되지 않았다(Mak GC 등, Association of D222G substitution in hemagglutinin of 2009 pandemic influenza A (H1N1) with severe disease. Eurosurveillance, Volume 15, Issue 14, 08 April 2010).

HA1 위치 222에 변화들을 함유하는 것으로 나타난 모든 바이러스는 HA1 치환 S203T(클래드 7의 특징)를 특징으로 하는 범유행 H1N1 바이러스들의 서브클래드에 속하며, 이는 또한 상기 고병독성 및 나머지 AH1N1 균주들에 대해 특이적인 항원 영역을 노출하는 아미노산 포켓으로 둘러싸인다. 상기 서브클래드는 유럽 및 나머지 북반구에서 대다수의 범유행 바이러스를 형성한다. 남반구에 대해서도 상기 서브클래드가 꽤 널리 퍼져 있다.

WHO에 공유된 현재 이용 가능한 데이터에 근거하여, D222G 치환의 유병률은 1.8% 미만이다(2755개를 초과하는 HA 서열들 가운데 52개 검출). 현재까지 분석된 364개의 치명적 사례들에서, 26 사례들(7.1%)에서의 바이러스는 D222G 치환을 가졌다. 이들 사례들에서 의학적 상태들에 내재하는 가능성에 대한 임상적 정보는 제한되어 있다. D222G 치환을 갖는 범유행(H1N1) 2009 바이러스는 WHO-권장 백신 바이러스인 A/California/7/2009(H1N1) 바이러스와 항원적으로 유사하였다.

동일한 상기 언급된 바이러스 A(H1N1) 2009 중에서 (i) 헤마글루티닌(HA)에서의 Gly222 돌연변이 및 (ii) 오셀타미비르에 대한 내성에 연관된 뉴라미니다아제(NA)에서의 Tyr275 돌연변이(McKimm-Breschkin JL. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors-a review. Antivirus Res 2000; 47: 1-17; Collins PJ 등, Structural basis for oseltamivir resistance of influenza viruses. Vaccine 27 (2009) 6317-6323)가 발견되었다. 두 돌연변이들은 모두 중요한 표현형들(고병독성 및 오셀타미비르 내성)에 관련되며, 항원성 영역들이 이들 돌연변이들과 연관되므로, 본 발명의 백신 후보물은 돌연변이체 균주들 및 AH1N1 야생형 둘 다를 효율적으로 인지할 수 있다.

세 개의 D222G 변이체 바이러스는 오셀타미비르 내성에 연관된 뉴라미니다아제(NA)에 H275Y 치환을 보유한다 [WHO Report. Preliminary review of D222G amino acid substitution in the hemagglutinin of pandemic influenza A (H1N1) 2009 viruses. 2009. 12. 28] (www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/cp165_2009_2812_review_d222g_amino_acid_substitution_in_ha_H1N1_viruses.pdf).

현재 이용 가능한 범유행 백신도 고병독성 및 오셀타미비르 내성 돌연변이체들을 인지하지만, 돌연변이는 H1 헤마글루티닌의 항원성 부위가 아닌 수용체 결합강 내에 존재하며, 스웨덴 전염병 통제 연구소 및 당 연구소에서 수행된 예비 항원 특징분석은 야생형 범유행 AH1N1 균주 대비 현재의 범유행 백신에 대해 항혈청에 대한 돌연변이체 바이러스들의 상당히 감소된 반응성을 나타내었다. 따라서, 현재의 백신은 전 세계에 걸쳐 빠르게 퍼지고 있는 이러한 새로운 돌연변이체 균주들을 인식함에 있어 본 발명의 백신 후보물처럼 효율적이지 않다.

바이러스 게놈의 분절 7(기질 분절)의 3' 말단에서의 돌연변이는 인플루엔자 B M 분절에 대한 유사성(60%)을 보여준다. 상기 돌연변이는 인간들에서 특이적 면역 반응을 증가시키는 것으로 앞서 보고되었으며 인플루엔자 B에 대한 보호도 부여할 수 있다. 그러나 주로 바이러스 기질 및 핵단백질 항원들에 대한 세포 매개 면역성은 감염에 대해 보호하지 않으며, 바이러스의 제거 및 질병으로부터의 회복에 필수적이다.

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

네 개의 바이러스 단리체의 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열 결정에서 추론되었다. 바이러스 1은 HA, NA 및 MA 단백질에 관심 돌연변이를 보유하였다. 바이러스 2는 NA 및 MA 단백질에 관심 돌연변이를 보유하였다. 바이러스 3은 NA 단백질에 관심 돌연변이를 보유하였다. 바이러스 4는 MA 단백질에 관심 돌연변이를 보유하였다.

HA 서열이 야생형 범유행 인플루엔자 A H1N1 서열에 비해 관심 돌연변이에 대해 분석되었다. A/H1N1 범유행 균주의 클래드 7에서 유행하는 것으로 나타난 모든 네 단리체들은 돌연변이 P83S 및 I321V를 보유하였다.

바이러스 1은 또한 (i) 클래드 7에 특징적인 S203T 및 (ii) HA 서열의 222 위치에 D222E 돌연변이를 갖는다. 위치들 222-223에서, 바이러스 1은 야생형 D-Q 대신에 E-R 아미노산들을 갖는다. 바이러스 1의 HA 서열에 대한 정확한 매치는 인플루엔자 A 바이러스(A/Novgorod/01/2009(H1N1)) HA 단백질에서 확인된다.

바이러스 1, 2 및 4는 야생형 A/California/07/2009 서열에 비해 NA 분절(6) 의 잔기들 I106V, D248N, Y275H에 돌연변이를 보유한다. Y275H 돌연변이는 오셀타미비르 내성에 연관된다. 이들 세 단리체들에서 확인되는 NA 서열의 정확한 매치들은 다른 단리체들에서 확인된다.

현재의 야생형 백신은 이러한 특정 부위들에 HA 및 NA 돌연변이를 모두 보유하는 바이러스 1에 비해 덜 효과적이다(Puzelli 등, Transmission of Hemagglutinin D222G mutant strain of pandemic (H1N1) 2009 virus. Emerging Infectious Diseases 16(5): 863-865 (2010)). 고병독성(HA 영역에 D222G/E) 및 오셀타미비르 내성(NA 영역에 Y275H)을 모두 보유하는 바이러스(예컨대 바이러스 1)에 의해 생성되는 백신은 야생형 H1N1 범유행 백신들의 효율성 부족을 극복하고 고병독성 및 오셀타미비르-내성 바이러스 모두에 대한 보호를 제공한다.

바이러스 1, 2 및 3은 야생형 A/California/07/2009 서열에 비해 M1 영역(분절 7)에 돌연변이 A198P를 보유한다. 또한 이러한 세 단리체들은 M2 영역에 D34에 해당하는 잔기가 없다.

상기 돌연변이는 세포 매개 면역성을 증가시키는 것으로 보고되었다(그러나 감염에 대해 보호하지는 않음). 돌연변이된 영역은 인플루엔자 B 바이러스 MA 영역과 60% 서열 유사성을 가지며, 상기 돌연변이를 보유하는 바이러스 단리체들에 대해 생성되는 백신들은 인플루엔자 B에 대해 면역성을 일으킬 수 있다.

또한, M1 돌연변이는 바이러스 제거 및 회복을 위한 치료적 표적들로 사용될 수 있다.

본 발명의 방법들은 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 면역화하기 위해 본원에 개시된 인플루엔자 바이러스 항원들을 사용한다. 항원들로부터 유도된 특정 바이러스는 인플루엔자 바이러스들에서, 특히 동일한 바이러스 서브타입들 내에서 상이한 단리체들 간에 교차 보호가 일어나는 것으로 알려져 있기 때문에 보호가 제공되는 특정 바이러스와 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

현재 사용되는 인플루엔자 백신들은 전체 바이러스(WV) 백신 또는 서브비리온(SV)(또한 "분할" 또는 "정제된 표면 항원")으로 명명된 것이다. WV 백신은 온전한 비활성화 바이러스를 함유하는 반면, SV 백신은 지질-함유 바이러스 외피를 가용화하는 세제들로 손상된 후 잔여 바이러스의 화학적 비활성화된 정제된 바이러스를 함유한다. 인플루엔자에 대한 약독화 바이러스 백신들도 개발 중이다. 종래 백신의 제조 방법들에 대한 논의는 [Wright, P. F. & Webster, R. G., FIELDS VIROLOGY, 4d Ed. (Knipe, D. M. 등 Ed.), 1464-65 (2001)]에서 확인할 수 있다.

백신이 한 균주를 초과하는 인플루엔자를 포함하는 경우, 상이한 균주들을 전형적으로 별도로 성장시키고 바이러스를 수확하고 항원들을 제조한 뒤 바이러스를 혼합한다. 대안적으로, 인플루엔자 바이러스의 상이한 단리체의 상이한 분절들을 조합하여 다능성 백신을 생성할 수 있다. 본 발명의 방법들에서 사용되는 인플루엔자 바이러스(들)은 재편성 균주들일 수도 있고/있거나 리버스 제네틱스 기법들에 의해 수득될 수도 있다. 바이러스(들)은 약독화될 수 있다. 바이러스(들)은 온도에 민감할 수 있다. 바이러스(들)은 저온-적응될 수 있다. 병원성 균주의 HA 및/또는 NA 바이러스 분절들 및 비병원성 균주의 나머지 6 또는 7개 분절들을 포함하는 재편성 균주가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물에서 사용되는 인플루엔자 바이러스 항원은 생바이러스, 또는 바람직하게는 비활성화 바이러스의 형태일 수 있다. 바이러스 비활성화에는 전형적으로 포르말린 또는 β-프로피오락톤과 같은 화학제로의 처리가 관여된다. 비활성화 바이러스가 사용되는 경우, 항원은 전체 바이러스, 분할 바이러스, 또는 바이러스 서브유닛일 수 있다. 분할 바이러스는 서브비리온 제조물을 제조하기 위해 세제들(예로 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, Triton X-100, Triton N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 등)로의 비리온들 처리에 의해 수득된다. 서브유닛 백신들은 하나 또는 둘 모두의 인플루엔자 표면 항원들 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제를 포함한다. 인플루엔자 항원들은 또한 바이로솜들의 형태로 제시될 수 있다.

항원이 인플루엔자 바이러스에서 제조되는 경우(즉 인플루엔자 바이러스들의 성장이 관여되지 않는 재조합 또는 합성 시스템에서 제조되는 것이 아님), 바이러스는 계란들 상에서 또는 세포 배양물 중에서 성장시킬 수 있다. 특정 병원체가 없는 배아 계란들에서의 성장은 인플루엔자 바이러스를 백신 제조를 위해 성장시키는 전통적인 경로이며, 세포 배양은 보다 최근에 개발된 것이다. 세포 배양을 이용하는 경우, 인플루엔자 바이러스 백신은 전형적으로 포유류 세포, 예컨대 MDCK 세포, Vero 세포 또는 PER.C6 세포 상에서 성장시킬 것이다. 이들 세포주들은 예로 미국 유형 세포 배양(ATCC) 콜렉션 또는 코리엘 세포 기탁처들에서 널리 이용 가능하다. 예를 들어 ATCC는 카탈로그 번호들 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587 하에 다양하고 상이한 Vero 세포들을 공급하며, 카탈로그 번호 CCL-34 하에 MDCK 세포들을 공급한다. 암닭 유래 세포주, 예로 닭 배아 섬유아세포(CEF)를 포함하는 조류 세포주 상에서의 성장도 가능하다.

본 발명의 면역원성 및 약제 조성물은 환자에게 투여하기 적합하다. 이는 피내 주사; 경피 투여; 및 국소 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방식들로 달성될 수 있다. 이들은 피부 마모와 함께, 예로 에머리 페이퍼에 의해 또는 마이크로마모제의 이용에 의해 사용될 수 있다.

본 발명의 면역원성 및 약제 조성물은 백신들로 바람직하게 제시된다.

본 발명의 조성물은 항원보강제를 포함할 수 있다. 인플루엔자 백신들에 사용된 항원보강제들은 알루미늄염, 키토산, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 예컨대 CpG 7909, 수중유 에멀션, 예컨대 MF59, 수중유중수 에멀션, 대장균 감열성 독소 및 그 탈독화 돌연변이체, 모노포스포릴 지질 A 및 그 3-O-탈아실화 유도체, 백일해 독소 돌연변이체, 무라밀 디펩티드 등을 포함한다.

헤마글루티닌(HA)은 비활성화 인플루엔자 백신들에서 주요 면역원이며, 백신들의 용량들은 전형적으로 단일 방사형 면역확산(SRID) 검정으로 측정되는 HA 수준들을 참조하여 표준화된다. 근육내 주사용 백신들은 전형적으로 균주 당 약 15㎍의 HA를 함유하지만, 더 낮은 용량들도 사용되며(예로 아동용 또는 범유행 상황들에서) 분할 용량, 예컨대 1/2(즉 균주 당 7.5㎍의 HA), 1/4 및 1/8이 사용되었다. 본 발명의 조성물은 전형적으로 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 8㎍의 HA, 바람직하게는 예로 약 7.5, 약 5, 약 3, 약 2.5, 약 2, 약 1.5, 약 1, 약 0.75, 약 0.5, 약 0.4, 약 0.2㎍ 등을 포함할 것이다.

근육내 주사용 백신은 전형적으로 0.5ml 부피를 갖는다. 조성물은 보존제, 예컨대 티오메살 또는 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 그러나, 조성물에 수은제 재료가 실질적으로 없는(즉 1㎍/ml 미만인), 예로 티오메살이 없는 것이 바람직하다. 수은을 함유하지 않는 백신들이 보다 바람직하다.

인플루엔자 바이러스를 세포 배양 상에 성장시킨 경우, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 용량 별로 잔여 숙주 세포 DNA 100pg 미만을 함유하지만, 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수 있다. 오염 DNA는 표준 정제 절차, 예로 크로마토그래피 등을 이용하여 백신 제조 동안 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는 뉴클레아제 처리에 의해, 예로 Benzonase^® DNase를 이용하여 증강될 수 있다. 0.25ml 부피당 100pg 미만의 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 바람직한 것과 같이 헤마글루티닌 10㎍ 당 100pg 미만의 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신들이 바람직하다. 1ml 부피당 100pg 미만의 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신들이 바람직한 것과 같이 헤마글루티닌 50㎍ 당 100pg 미만의 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신들이 보다 바람직하다.

본 발명의 백신은 단일 용량 면역화 요법으로 전달될 수 있다. 대안적으로, 이들은 초회-추가 요법(첫번째 면역화에 여러 주 또는 여러 달 내에 유사한 항원성을 갖는 두 번째 샷이 뒤따름을 의미)의 초회 성분으로 전달될 수 있다.

인플루엔자 백신들의 면역원성 평가 방법들은 당분야에 널리 공지되어 있다. 하나의 방법에는 하기 절차가 관여된다: (a) 백신 접종 직전에, 10ml의 정맥혈 시료를 환자에서 보통 팔에서 순환 항-HA 항체의 기준선 적정을 위해 취한다; (b) 직후에, 환자는 팔에 투여되는 경우 혈액을 취한 쪽의 반대쪽 팔에 백신 1용량을 제공받는다; (c) 백신 접종 대략 3주 후, 10ml의 혈액 시료를 환자들에게서 취한다. 혈청을 혈액 시료들로부터 분리하고, (필요한 경우) -20℃에 보관한다. 혈청을 관련 균주들에 대한 항-헤마글루티닌 항체에 대해, 헤마글루틴화 저해(HI) 또는 단일 방사형 용혈(SRH)로 분석한다. 양성 및 음성 혈청뿐만 아니라 참조 제조물은 공공 참고 연구실들에서 수득할 수 있다. 항체 적정들을 이중으로 수행하고, 백신 접종 전 및 후 혈청을 동시에 적정한다. 각각의 시료에 지정된 역가는 두 독립적 결정값들의 기하 평균이다(그러나 계산의 목적을 위해, 10미만인(검출 불가능한) 임의의 HI 결과는 5로 표현되며, 임의의 음성 SRH 결과는 표준 조건들 하에서 4mm²로 표현된다).

HI 평가에서, 혈청 전환은 40 이상의 면역화 전 및 후 역가들의 비, 및 항체 역가의 유의미한(예로 적어도 4배의) 증가에 해당한다. SRH 평가에서, 혈청 전환은 25mm² 이상의 백신 접종 후 면적에 해당하며, 백신 접종 전 면적에 비해 적어도 50% 이상의 면적이다.

예

본 발명의 범위를 제한하지 않고, 본 발명의 실시예에 따른 예시적 기기, 장치, 방법, 및 이들의 관련 결과가 아래에 제공한다. 표제 또는 하위 표제는 독자의 편의를 위해 예에서 사용될 수 있으나, 이는 결코 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 주지하라. 또한 특정 이론이 본원에 제안되고 개시된다; 그러나 어떠한 방식으로든 이들이 옳고 그름과 상관없이, 본 발명이 임의의 특정 이론 또는 작용 방식에 상관없이 본 발명에 따라 실시될 수 있는 한, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

예 1: 세포주

VERO 세포는 아프리카 녹색 원숭이 신장(세르코피테쿠스 애티옵스)에서 최초로 단리된 매우 널리 연구된 세포주로, 미생물, 세포 생물학 및 바이러스학 연구들에서 널리 사용되어 왔다. USA에서는 바이러스 백신 제조용(로타바이러스 및 폴리바이러스)으로 인가되었으며, 또한 광견병, 레오바이러스 및 일본 뇌염에 대한 백신 제조용으로 평가되고 일부 사례들에서 허가되었다. 본 발명자들은 이 세포주를 공동 감염에 대한 그 감수성으로 인해서뿐만 아니라 백신 제조에 바람직한 특징들인 발효기들 또는 생물 반응기들에서 산업적 규모로 성장할 수 있는 그 능력으로 인해 선택하였다.

사용한 Vero 세포주는 ATCC에서 구매했으며, 디메틸 설폭시드(DMSO)와 함께 -70℃에서 보관하였다. 세포들을 CORNING 지침에 따라 해동하였다.

예 2: 멸균 조건

BSLIII의 모든 설비들을 주의 깊게 처리하고 모니터링하여 오염을 방지하며, 규칙적으로 방, 재료, 시약들 및 장비 멸균성 평가들을 수행하였다. 세포 배양 영역은 규칙적으로 세척하고 매달 살균하며, 매 24, 48 및 72시간마다 수회 살균을 Benzal, 70% 에탄올 및 5% 염소를 이용하여 수행한다. 멸균성 평가들은 이들 회수들의 말기에 수행하며, 또한 모든 시약들은 분취량을 티오글리콜레이트 액체 배지에서 배양하여 오염에 대해 평가한다.

예 3: 세포 증식

Vero 세포 증식을 폴리스티렌 세포 배양 플라스크들(25cm², 50cm² 및 75cm²)에서의 보관과 같이 적절한 물리적 및 화학적 조건들 하에서 수행하였다. 이들 플라스크들에 또한 소수성을 감소시키기 위해 감마선을 조사한다. 이들 용기들은 효율적인 세포 부착, 및 이에 따른 단층 형성을 허용한다. 세포 증식을 증가시키기 위해, 성장 배지 M199 또는 DMEM(Dulbecco 개질 배지)을 사용하였고, 10% 소 태아 혈청(BFS)(SIGMA-Aldrich)으로 보강하였다; 생리학적 pH의 유지는 페놀 레드를 이용하여 모니터링하였다. 항미생물제 혼합물(페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B)을 첨가했으며, 또한 진균 오염을 저해하기 위해 항-PPLO를 첨가하였다.

세포 배양물을 35℃/5% CO₂/5% 습도에서 인큐베이션하였다. 세포 품질 및 성장을 위상차 현미경으로 모니터링하여 박테리아 또는 진균 오염을 나타내는 배양물을 폐기할 수 있었다.

완벽한 융합성을 나타내는 플라스크들의 세포 후속 배양을 하기와 같이 수행한다:

1. 배양 배지를 제거 및 폐기한다.

2. 세포층을 0.25%(w/v) 트립신-0.53mM EDTA 용액으로 짧게 헹구어 트립신 저해제를 함유한 전량의 혈청을 제거한다.

3. 플라스크에 2.0 내지 3.0ml의 트립신-EDTA 용액을 첨가하고 세포층이 분산될 때까지(보통 5 내지 15분 내) 역상 현미경 하에서 세포들을 관찰한다.

4. 6.0 내지 8.0ml의 완전 성장 배지를 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 세포들을 흡인한다.

5. 적절한 분취량의 세포 현탁액을 새 배양 용기들에 첨가한다.

6. 37℃에서 배양물을 인큐베이션한다.

80% 융합성이 관찰되었을 때, 세포에 1x10⁶ p AHN1 바이러스를 접종하였다. 이 융합성 수준이 인플루엔자 바이러스 A/H1N1에 의해 야기되는 세포독성 효과 관찰에 최적이었다.

예 4: 바이러스 단리

VERO 세포들이 접종된 25cm² 플라스크들(80% 융합성)에서 바이러스 단리를 수행하였으며, 바이러스 단리를 위해 성장 배지를 제거하고, 세포 파편들을 폐기하기 위해 세포들을 3회 원심분리 및 재현탁하였다. 임상적으로 인플루엔자 AH1N1을 가진 것으로 진단되고 실시간 PCR에 의해 확인된 환자에서 수득된 면봉 시료에서 50㎕을 세포 배양물에 접종하고 30분 동안 인큐베이션하여 바이러스가 세포 표면에 부착하도록 하였다. 이후, M199에 BFS 1%를 보강하고 40℃/40분 인큐베이션하였다.

접종된 배양물을 위상차 현미경으로 세포 독성 효과의 존재에 대해 모니터링하였다. 동시에, 바이러스량을 실시간 PCR로 결정하였다. 1x10⁶에 도달하면, 배양물을 -80℃에서 동결하고(DMSO 10%) 후속 연구들을 위해 보관하였다.

예 5: 실시간 RT - PCR 에 의한 바이러스 감염 확인 및 정량

바이러스 RNA를 전술된 바와 같은 시판 키트(ROCHE)를 이용하여 VERO 세포 배양물들에서 추출하고, 이후 RNA를 NanoDrop 장비를 이용하여 분광측정으로 정량하였다. 정량을 위해 인플루엔자에 대한 표준을 포함하는 실시간 PCR에 의한 AH1N1 검출을 위한 CDC 프로토콜을 Light Cycler 480 열교환기(ROCHE)에서 수행하였다(플라스미드에 클로닝된 HI 유전자 101 a 106 복제). 바이러스량 결정은 각각의 시료에 대해 교차점 포맷을 계산하는 것에 근거하였다. 도 1은 바이러스량 정량의 예를 나타낸다.

예 6: 시료 선택

서열분석을 위해 pAH1N1에 대한 3760개 양성 시료들 중 총 193개가 임상적 및 역학적 데이터에 근거하였다. 임상적 선택 기준은 감염 중증도, 약물 내성 및 비전형적 임상 설정이었다. 역학적 기준은 위치, 성별 및 연령에 근거하였다. 선택된 시료들을 2009년 3월에서 11월까지 보고된 4회 발생 피크들 동안에 수집하였다. 시료들을 2.5ml의 바이러스 수송 배지 중에 재현탁하고, 500㎕ 분취량들을 분배하여 -70℃에 보관하였다.

예 7: 핵산 추출

제조업체의 지시들에 따라, 간략하게 500㎕의 시료를 MagnaPure 핵산 카트리지 중에 놓고 1부피의 용해 완충액을 첨가하였으며, 이후 모든 파라미터들을 설정하고 개시하여 외부 용해 프로토콜에 의해 MagNA Pure LC 기기(Roche) 상에서 MagNA Pure LC 전체 핵산 단리 키트(Roche)를 이용하여 임상적 시료들의 전체 핵산들을 단리하고 증류수(100μ) 중에 재현탁하였다. 추출된 RNA는 후속 분석을 위해 -70℃에 보관하였다.

예 8: 인플루엔자 p/ AH1N1 실시간 PCR 검출

범유행 인플루엔자 AH1N1/09의 검출을 Real-time ready RNA 바이러스 마스터 키트(Roche)를 이용하여 Real-time ready 인플루엔자 A/H1N1 검출 세트(Roche) 두 방법들에 의해 수행하였다. 열 순환은 하기 조건들 하에 Light Cycler 2.0 기기들(Roche) 상에서 수행하였다: 50℃에서 30분; 95℃에서 15분; 94℃에서 15초 45 사이클; 및 60℃에서 30초.

두 번째 방법은 상기 프로토콜에 기재된 프라이머들과 탐침들 그리고 1단계 RT-PCR Invitrogen SuperScript™III Platinum® 일단계 정량 키트를 이용하여 인플루엔자 A(H1N1)에 대한 실시간 RT-PCR의 CDC 프로토콜이었다. 열 순환은 하기 조건들 하에 Light Cycler 2.0 기기들(Roche) 상에서 수행하였다: 50℃에서 50분; 95℃에서 2분; 95℃에서 15초 45 사이클; 및 55℃에서 30초.

두 방법의 모든 반응들은 20㎕의 총 반응 부피 중에 5㎕의 총 RNA를 이용하여 제조업체의 지시들에 따라 수행하였다. 두 검출 방법들에서, 내부 대조군(Roche 방법을 위한 인간 미오스타틴 유전자 및 CDC 프로토콜을 위한 RnaseP)을 포함시켰다.

각각의 시료를 평가하고, 하기 탐침들을 이용하여 실시간 PCR를 별도로 수행하였다: 인플루엔자 A(InfA), 범발성 돼지(SwFlu A), H1 돼지(SwH1) 및 인간 핵산 RNaseP에 대한 내부 대조군(RP). 양성 및 음성 대조군들을 도입하였다.

반응 혼합물은 0.8μM의 각 프라이머, 0.2μM의 각 탐침, 1XPCR 완충액 및 0.5U의 SuperScript III/Platinum Taq 혼합물(Invitrogen)을 함유하였다.

시료 배열의 예를 도 2에 나타낸다.

증폭 조건들은 다음과 같았다:

역전사-50℃/30분

비활성화-15℃/2분

연장-95℃/15사이클들 및 55℃/30사이클들.

예 9: 데이터 분석

WHO 기준에 따라 결과들을 다음과 같이 분석하였다:

1.- 음성 대조군에 형광이 존재하지 않아야 한다.

2.- 실험 시료들이 RP 탐침에 대해 형광을 나타내야 한다.

3.- 인간 핵산 대조군이 InfA, SwFluA 및 SwH1 탐침들에 대해 형광을 방출하지 않아야 한다.

4.- 양성 대조군(A/H1N1 핵산)이 모든 프라이머들 및 탐침들에 대해 형광을 방출해야 한다.

5.- 모든 기준이 충족되는 경우, 시료는 양성으로 간주된다.

도 3a 및 3b는 형광 곡선들을 보여주는 Light Cycler 2.0 실시간 열교환기 인터페이스의 그래프도들을 보여준다. 도 3a) 임상적 시료. 도 3b) RNAseP(RP) 검출.

예 10: 서열 분석

총 950개 바이러스를 세포 배양물로부터 단리하였고, 이로부터 ABI 3100 서열분석기(Applied Biosystems)에서 모세관 서열분석을 통해 193개 뉴라미니다아제(NA) 및 197개 헤마글루티닌(HA) 부분 유전자 서열들을 수득하였다. HA 및 NA가 AH1N1에서 가장 가변성이 높은 서열들이므로, 컴퓨터 내 분석(계통 분석 및 BLAST)은 모든 386개(HA 및 NA 서열)가 20개 클러스터들로 그룹핑될 수 있음을 나타내었으며, 따라서, 각 클러스터의 하나의 대표 구성원의 전체 게놈을 454 Titanium Roche Pyrosequencing 장비(ROCHE)에서 파이로시퀀싱하였다.

예 11: 닭 배아에서의 인플루엔자 바이러스 증식

VERO 세포에서 인플루엔자 백신을 위해 제안된 후보물을 증식시키기 위한 몇몇 시도가 있었다. 그러나 이들 시도들은 회수된 바이러스의 양이 3차 계대들 후에도 매우 낮았기 때문에 초기에 실패하였다. 이를 고려하여, SPF(특정 병원체가 없는) 닭 배아에서 1차 내지 2차 계대를 수행하였다. 이들을 각 후보물 0.1ml과 함께 양수액 내로 접종하였다. 인플루엔자 범유행 기간 동안 미리 단리된 40개의 다른 바이러스를 또한 포함시키고, 각각의 바이러스에 대해 2개 계란들을 이용하여 접종을 수행하였다.

35℃에서 3일 후, 양수액을 각각의 감염된 배아에서 수확하였고, 세포성 파편을 제거하기 위해 수집된 액체를 3000xg에서 원심분리하고 상청액을 qRT-PCR에 의해 분석하여 -80℃에서 보관하였다. 모든 절차들은 생체보안 위험성들을 배제하기 위해 필요한 표준들에 따라 BSL III으로 수행하였다.

배아 내로의 계대 후 바이러스량은 3개 균주들에서 매우 높았으며, 그 중 하나가 바이러스 후보물이었다. 또한 10개를 초과하는 단리된 균주들이 RT-PCR 평가로 검출되었으나 낮은 바이러스량들을 나타내었다. 따라서, 이들을 또 다른 SPF 닭 배아에 다시 접종하였지만, 이 경우 접종은 요막강액 내로 수행하였다. 상술된 바와 동일한 조건을 따른 접종 72시간 후, 바이러스를 요막강액만을 수집하여 수확하였다. 더 적은 부피를 RT-PCR을 이용하여 분석하였고, 나머지를 -80℃에서 보관하였다. 결과들은 10개 바이러스 단리체들 중 6개가 높은 바이러스량을 보여주며 높은 효율로 복제할 수 있음을 나타내었다.

Karolinska 연구소의 서열 인증

닭 배아 증식 전에, 바이러스 균주 cDNA를 Karolinska 연구소로 송부하여 454 파이로시퀀서 시스템 ROCHE를 이용하여 서열을 확인하였다. 생체정보학 분석은 본 연구소에서 미리 결정한 서열을 확인시켰다.

마스터 시드 확인

인플루엔자 백신에 대한 바이러스 후보물을 HZFLUJAL로 명명하였다.

인플루엔자 바이러스가 VERO 세포주 상에서 성장하기 위한 적응

바이러스 후보물(HZFLUJAL) 및 다른 두 바이러스를 배양에서 수확하여 VERO 세포주 상에 접종하였다. 적응을 달성하기 위해, 몇 차례 계대들을 수행하였으며, 감염 7 내지 10일 후 배양 상청액을 수집하였다. 각각의 상청액을 이용하여 새로운 VERO 세포 계대를 감염시켰다. 각각의 계대에 대한 바이러스량을 정량하였다. 도 4a는 배아 및 동일한 바이러스의 해당 계대들에서의 바이러스량 간 차이들을 나타낸다. 해당 도에서, 본 조직 세포주에 대한 바이러스 적응이 4차 계대들까지 수득될 수 있음이 명확하다.

인플루엔자 바이러스가 MDCK 세포주 상에서 성장하기 위한 적응

인플루엔자 바이러스에 대한 기질로서 VERO 세포주를 평가했을뿐만 아니라 MDCK 세포주도 이용하여 바이러스를 증식시켰다. VERO 세포들의 적응을 달성하기 위해 적용된 동일한 절차들을 MDCK 세포들 상에서 수행하였다. 예비 결과들은 닭 배아보다 더 큰 바이러스량을 얻기 위해 3차 계대들만이 필요함이 뚜렷했기 때문에, 상기 세포주에 대해 더 우수한 적응을 나타낸다(도 4b).

마스터 시드 HZFLUJAL 을 얻기 위한 바이러스의 증식

VERO 세포주 상에서 성장하도록 미리 적응시킨 바이러스의 증식을 위해, VERO 세포들 상에서 4차 계대의 한 동결 바이알을 해동하고, 175cm² 플라스크들 상에서 VERO 세포들을 감염시키는데 사용하였다. CO₂ 인큐베이터 내에 33℃에서 10일 후 마스터 시드 120ml을 수득하고, 이는 10^{7 바이러스성 입자}들/mL(대략 10^7.7)보다 큰 바이러스량을 나타내었다. 1mL의 마스터 시드가 든 120개 동결 바이알들을 수득하였다.

마스터 시드의 품질 관리

멸균성 평가 및 헤마글루틴화 평가를 마스터 시드 상에서 수행하였다. 첫번째 평가를 위해서는 마스터 시드의 4개 동결 바이알들을 해동하여 2개는 100mL의 유체 티오글리콜레이트 배지 NIH가 든 두 플라스크들을 접종하는데 사용하였고 나머지 두 동결 바이알들은 항생제들이 없는 DMEM 배지를 접종하는데 채용하였다. 두 배지들을 모두 8 내지 15일 동안 35℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후 배지 중에 성장이나 변화가 보이지 않았으므로, 멸균된 것으로 간주되었다(박테리아, 진균 및 원생동물이 없음).

헤마글루틴화 평가는 마스터 시드에서 헤마글루티닌의 표제를 결정하기 위해 수행하였다. 상기 검정을 위해, 마스터 시드의 1:2 내지 1:1024의 연속 희석액들을 96웰 U자형 마이크로플레이트 내에서 PBS, pH=7.4 중에 제조하였다. PBS 중 인간 O 적혈구 현탁액 0.5%(v/v)의 동일 부피를 각 희석액에 첨가하였다. 마이크로플레이트를 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였고, 결과들은 헤마글루틴화 역가 1:8을 나타내었다.

예 12: HZFLUJAL 백신을 이용한 전- 전임상 실험

전- 전임상 실험들을 위한 바이러스의 비활성화

전-전임상 실험을 수행하기 위해, 마스터 시드의 1개 동결 바이알을 해동하여 CO₂ 인큐베이터 내에 33℃에서 7일 후 80cm² 플라스크 상 VERO 배양물을 감염시키는데 사용하였다. 배양물을 35℃에서 18h 동안 0.02%(v/v)의 최종 농도로 포르말린에 의해 비활성화하였다. DMEM에 대해 48h 동안 4회 투석하여 포르말린을 제거하였다. 이후, 헤마글루티닌 역가를 정량했으며, 이는 또 다시 1:8이었다. 비활성화 바이러스 현탁액을 25㎕ 당 10⁶ 바이러스성 입자로 조정하고, 하기 군들에서 백신으로 사용하였다.

전- 전임상 실험들을 위한 동물 모델

7 내지 8주령 자성 BALB/c 마우스를 전-전임상 실험들을 위해 채용하였다. 각 군을 케이지 헤파 필터 커버가 있는 랙에 넣었다. 모든 동물을 불필요한 고통을 배제하며 조작하였다. 프로토콜 완료 시, 모든 마우스를 안락사시켰다.

전- 전임상 실험들의 혈청 전환 검정들

혈청 전환 검정들을 각각 5마리 마우스의 9개 군들에서 수행하였다.

1군 10⁶ 바이러스성 입자들이 있는 백신 + 전달 인자 + 설하 투여

2군 10⁶ 바이러스성 입자들이 있는 백신 + 전달 인자 + 근육내 투여

3군 10⁶ 바이러스성 입자들이 있는 백신 + 설하 투여

4군 10⁶ 바이러스성 입자들이 있는 백신 + 근육내 투여

5군 시판 백신 + 설하 투여

6군 시판 백신 + 근육내 투여

7군 소 태아 혈청이 없는 DMEM + 설하 투여

8군 소 태아 혈청이 없는 DMEM + 근육내 투여

9군 처리하지 않음

전- 전임상 실험들에서의 용량 반응 검정

용량 반응 검정들을 각각 3마리 마우스들의 5개 군들에서 수행하였다.

A군 10⁷ 바이러스성 입자들이 있는 백신 + 전달 인자 + 설하 투여

B군 10⁵ 바이러스성 입자들이 있는 백신 + 전달 인자 + 설하 투여

C군 10⁴ 바이러스성 입자들이 있는 백신 + 전달 인자 + 설하 투여

D군 10³ 바이러스성 입자들이 있는 백신 + 전달 인자 + 설하 투여

E군 10² 바이러스성 입자들이 있는 백신 + 전달 인자 + 설하 투여

면역화 프로토콜 시작에서부터 모든 마우스를 면역학적 검정들을 수행하기 위한 생체보안 요건들을 갖춘 동물 실험실에서 4일간 유지시켰다. 적응 시간 후, 체중 및 외관과 같은 임상적 데이터를 기록하였고, 항응고제 없이 혈액 시료를 면역화 전에 각 마우스에서 추출하였다. 그 후, 각 군에 해당 투여 경로를 이용하여 접종하였다. 4개 혈액 시료들을 면역화 후 7, 14, 21 및 28일 후에 각 마우스에서 수득하였다.

혈청을 혈액 시료들의 원심분리에 의해 수득하였고, 인플루엔자 A H1N1 바이러스에 대한 IgG2 항체의 검출을 위해 사용하였다. 또한 분비 면역글로불린 A(IgA)를 검출하기 위해 분비 시료들을 마우스로부터 수집하였다.

예 13: CIATEJ / OPKO /백신에 의해 생성된 인플루엔자 p/ AH1N1 에 대한 항체의 검출

본원에서 CIATEJ/OPKO/백신으로 기재되는 예시적 백신을 Vero 세포에서 개발하고, 범유행 인플루엔자 AH1N1에 대해 항체들을 생성하는 능력을 평가하였다. Vero 세포에서 CIATEJ/OPKO에 의해 발생된 항원은 이것이 마우스에서 백신으로 채용되는 경우 항체 제조를 유도할 수 있었다.

CIATEJ/OPKO 항원에 의해 유도되는 항체의 역가는 시판 백신에 비해 더 높았다. 도 5는 ELISA에 의해 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 전체 항체들을 나타낸다. CIATEJ/OPKO/백신은 Vero 세포에서 개발되었으며, TF = 전달 인자이다. 면역화는 7 내지 8주령 BALB/c 자성 마우스에서 수행되었다. 면역화는 설하 또는 근육내였다.

도 6a는 ELISA에 의해 혈청에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgM 항체들을 나타낸다. CIATEJ/OPKO/백신은 Vero 세포에서 개발되었으며, TF = 전달 인자이다. 면역화는 7 내지 8주령 BALB/c 자성 마우스에서 수행되었다. 면역화는 근육내였다.

전달 인자를 백신 CIATEJ/OPKO에 첨가한 경우, IgG 항체 수준들을 5배 증가시켰으며, 전달 인자는 면역화 첫주 동안 IgM 항체 역가들을 동일한 방식으로 증가시켰다. 도 6b는 ELISA에 의해 혈청에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgG 항체들을 나타낸다. CIATEJ/OPKO/백신은 Vero 세포에서 개발되었으며, TF = 전달 인자이다. 면역화는 7 내지 8주령 BALB/c 자성 마우스에서 수행되었다. 면역화는 근육내였다.

백신 CIATEJ/OPKO의 근육내 투여는 설하 투여에 비해 더 큰 IgG₂ _A 항체의 유도를 나타내었다. 도 7a는 ELISA에 의해 혈청에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgG₂ _A 항체들을 나타낸다. CIATEJ/OPKO/백신은 Vero 세포에서 개발되었으며, TF = 전달 인자이다. 면역화는 7 내지 8주령 BALB/c 자성 마우스에서 수행되었다. 면역화는 설하 또는 근육내였다.

도 7b는 ELISA에 의해 혈청에서 검출되는 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgG₂ _A 용량-반응을 나타낸다. CIATEJ/OPKO/백신은 Vero 세포에서 개발되었으며, TF = 전달 인자이다. 면역화는 7 내지 8주령 BALB/c 자성 마우스에서 수행되었다. 면역화는 설하였다.

백신 CIATEJ/OPKO의 근육내 투여는 설하 투여에 비해 대등한 수준으로 IgA 항체의 유도를 나타내었다. 도 8a는 ELISA에 의해 호흡 점막에서 검출된 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgA 항체들을 나타낸다. CIATEJ/OPKO/백신은 Vero 세포에서 개발되었으며, TF = 전달 인자이다. 면역화는 7 내지 8주령 BALB/c 자성 마우스에서 수행되었다. 면역화는 설하 또는 근육내였다(면역화 후 21일).

도 8b는 ELISA에 의해 호흡 점막에서 검출된 인플루엔자 p/AH1N1에 대한 IgA 용량 반응을 나타낸다. CIATEJ/OPKO/백신은 Vero 세포에서 개발되었으며, TF = 전달 인자이다. 면역화는 7 내지 8주령 BALB/c 자성 마우스에서 수행되었다. 면역화는 설하 또는 근육내였다(면역화 후 21일).

참조 문헌

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본 명세서에 언급된 모든 공보들 및 특허 출원들은 그 각각의 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고문헌으로 도입된 것으로 나타내는 바와 같이 본원에 참고문헌으로 도입된다.

상기 발명이 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 예로서 일부 상세히 기재되었으나, 당업자에게는 본 발명의 교시들의 견지에서 첨부된 특허청구범위의 요지 또는 범위에서 벗어나지 않고 일정한 변화들 및 개질들이 수행될 수 있음이 쉽게 자명할 것이다.

Claims

인플루엔자 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신에 있어서,
a) 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 바이러스 1 단리체에서 유도된 서열 목록 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 헤마글루티닌(Hemagglutinin)(HA) 유전자 분절(세그먼트)(segment)과,
b) 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 바이러스 1 단리체에서 유도된 서열 목록 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 뉴라미니다아제(NA) 유전자 분절을
적어도 갖는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항에 있어서, 상기 HA 유전자 분절은 바이러스 1의 분절 4의 뉴클레오티드 서열로 인코딩되는 아미노산 서열(서열 목록 번호 4)을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항에 있어서, 상기 HA 유전자 분절은 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 클래드 7 특이적 HA 서열을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항에 있어서, 상기 HA 유전자 분절은 야생형 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 D222 잔기에 돌연변이를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 4항에 있어서, 상기 HA 유전자 분절은 D222E 돌연변이를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 4항에 있어서, 상기 HA 유전자 분절은 야생형 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스에 비해 S203T 돌연변이를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 4항에 있어서, 상기 HA 유전자 분절은 하나 이상의 P83S 및 I321V 돌연변이를 더 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항에 있어서, 상기 NA 유전자 분절은 바이러스 1의 분절 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열(서열 목록 번호 6)을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항에 있어서, 상기 NA 유전자 분절은 야생형 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스에 비해 Y275H 돌연변이를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 9항에 있어서, 상기 NA 유전자 분절은 하나 이상의 I106V, D248N 돌연변이를 더 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항에 있어서, c) 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 바이러스 1 단리체에서 유도된 서열 목록 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 M1 펩티드를 인코딩하는 기질(MA) 유전자 분절을 더 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 11항에 있어서, 상기 MA 유전자 분절은 바이러스 1의 분절 7의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열(서열 목록 번호 7)을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 11항에 있어서, 범유행 인플루엔자 A H1/N1 인플루엔자 바이러스의 바이러스 1 단리체에서 유도된 서열 목록 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 M2 펩티드를 인코딩하는 기질(MA) 유전자 분절이 포함되는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 11항에 있어서, 상기 M1 펩티드는 A198P 돌연변이를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 백신.
환자에게 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 인플루엔자 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대한 환자의 면역화 방법.
환자에게 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 인플루엔자 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 고병독성 인플루엔자 바이러스에 대한 환자의 면역화 방법.
환자에게 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 인플루엔자 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 오셀타미비르-내성 인플루엔자 바이러스에 대한 환자의 면역화 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 재편성 백신인, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 18항에 있어서, 재편성 인플루엔자 바이러스는 전통적 재편성에 의해 수득되는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 약독화 생백신 또는 비활성화 백신인, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 20항에 있어서, 경구 또는 비강 내 투여를 위해 제형화되는, 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 재편성 인플루엔자 바이러스를 담체, 및 선택적으로 항원보강제와 혼합하는 단계를 포함하는, 고병독성 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 대상체를 면역화하기 위한 백신의 제조 방법.