WO2012060678A2

WO2012060678A2 - Vacunas novedosas contra el virus de la influencia pandémica a/h1n1

Info

Publication number: WO2012060678A2
Application number: PCT/MX2011/000132
Authority: WO
Inventors: Hector Manuel ZEPEDA LÓPEZ
Original assignee: Zepeda Lopez Hector Manuel
Priority date: 2010-11-02
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2012-05-10
Also published as: KR20130140050A; JP2014511119A; CN103328629A; BR112013010830A2; EP2650362A2; WO2012060678A3; EA201300525A1; CA2826234A1; EP2650362A4; EP2650362A9; AP2013006835A0

Abstract

La invención se refiere a vacunas contra el virus de influencia, en particular a un virus de influencia en la que al menos, el gen de hemaglutinina contiene una mutación D222, y un gen de neruaminidasa resistente al oseltamivir. En algunas de las implementaciones en particular, la vacuna del virus de influencia comprende además una mutación que incrementa la respuesta inmune específica en humanos. El virus es útil para la producción de vacunas contra la influencia resistente al oseltamivir e hipervirulenta.

Description

VACUNAS NOVEDOSAS CONTRA EL VIRUS DE LA INFLUENZA

PANDÉMICA A/H1N1

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La invención aquí mostrada se relaciona con las vacunas contra el virus de la influenza, y en particular con las vacunas contra las cepas hipervirulentas del virus de la influenza pandémica A/H1 N1. La invención proporciona cepas de virus de la influenza útiles en la producción de la vacuna contra la influenza que porta mutaciones específicas en los segmentos HA y NA.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La influenza es causada por un virus ARN de la familia orthomyxoviridae. Existen tres tipos de este virus que causan tres tipos diferentes de influenza: los tipos A, B, y C. El virus tipo A de la influenza infecta a los mamíferos (humanos, cerdos, hurones, caballos) y aves. Este tema es de gran relevancia para la humanidad, ya que éste es el tipo de virus que ha ocasionado pandemias por todo el mundo. El virus tipo B de la influenza (que también se conoce sencillamente como influenza B) infecta únicamente a los humanos, ocasionalmente causa brotes locales de gripe. Los virus de influenza C también infectan sólo a humanos, la mayoría de los infectados son jóvenes y raramente causan enfermedad seria.

El virus de la influenza A infecta a una amplia variedad de mamíferos, incluyendo al hombre, los caballos, los cerdos, los hurones y las aves. El patógeno humano principal es asociado con epidemias y pandemias. Existen al menos 15 serotipos de hemaglutininas (H) y 9 serotipos de neuraminidasa (N) conocidos. Se cree que los cerdos y aves son reservónos particularmente importantes que generan fuentes de una diversidad genética y antigénica de virus que pueden ser retransferidos a la población humana a través del contacto cercano entre éstos y los animales. Los virus de la influenza B infectan únicamente a los mamíferos y causan enfermedad, pero generalmente no son tan severos como los de tipo A. A diferencia de los virus de influenza A, los virus de influenza B no tienen serotipos distinguibles. Los virus de la influenza C también infectan únicamente a los humanos, pero raramente causan enfermedad. Son genética y morfológicamente diferentes de los tipos A y B. En contraste con muchos otros virus, el genoma de la influenza se compone de ARN y no de ADN. El genoma abarca ocho segmentos y sólo las partículas de virus que contienen los ocho segmentos son viables. (SteinhauerDA, Dkehel JJ., Genetics of Influenza Viruses. Ann Rev Genet. 2002 36: 305-332).

Existen 4 antígenos presentes en el virus de la influenza, las proteínas hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), nucleocápsida (NA), matriz (M) y nucleocápsida (NP). La NP es un antígeno de tipo específico que se da en 3 formas: A, B y C proporcionando la base de la clasificación de los virus de la influenza humana. La proteína matriz (proteína M) rodea la nucleocápsida y forma de un 35 a un 45% de la masa de la partícula. Se observan dos glicoproteínas superficiales en la superficie como proyecciones en forma de vara. La hemaglutinina (HA) está formada de 2 subunidades, HA1 y HA2. La HA media el acoplamiento de los virus al receptor celular. Las moléculas de neuraminidasa (NA) están presentes en menores cantidades en la envoltura. Las cepas humanas en circulación son notorias por su tendencia a acumular las mutaciones de un año hacia el siguiente y causan epidemias recurrentes.

El virus de la influenza es uno de los pocos virus extraños que cuentan con un genoma en segmentos separados (ocho). La naturaleza segmentada del genoma también permite el cambio de genes enteros entre diferentes cepas extrañas lo que incrementa el potencial para que se formen recombinantes (por medio del intercambio de segmentos de genes si dos virus diferentes infectan a la misma célula). Esto es, si una célula se infecta con dos cepas distintas de influenza, es posible que los segmentos se reclasifiquen para crear virus nuevos que tengan segmentos de cada virus original. Esto puede contribuir al rápido desarrollo de cepas nuevas de gripe en la naturaleza. Se pueden ensamblar nuevos genomas como resultado de la mezcla entre dos virus. El proceso también puede ser duplicado en el laboratorio (y emplearse para elaborar cepas de vacunas). Las cepas aviares y humanas que se recombinan en los cerdos del Lejano Oriente pueden permitir la evolución de cepas virulentas de humanos.

La plasticidad genética de los virus de la influenza tiene también serias implicaciones potenciales con respecto al diseño de la vacuna, la patogenicidad y la capacidad de los virus nuevos para emerger de los reservónos naturales y causar pandemias globales.

El virus pandémico (H1 N 1) 2009 ha evolucionado en todo el mundo, cambiando desde un patrón ciado mezclado inicial a la predominancia de un ciado (ciado 7) durante el curso de la pandemia. El virus que constituye este ciado fue por lo tanto responsable de la mayoría de la carga pandémica esparcida por todo el mundo. La mutación S203T en la secuencia de la proteína hemaglutinina (HA) es específica de los cepas aisladas de ciado 7. (Valli MB y otros. Evolutionary pattern of pandemic influenza (H1 1 ) 2009 virus in the late phases of the 2009 pandemic. Influenza PLoS Curr. 2010 Marzo 3: RRN1 149). Entre las cepas aisladas de ciado 7 que comprenden la mutación S203T, existe un cambio en la secuencia del gen de la hemaglutinina HA1 al aminoácido correspondiente a la posición 222 (225 en numeración H3) donde el ácido aspártico (D) se cambia a glicina (G), y está asociado con resultados clínicos severos. La mutación D222G se registró entre las cepas aisladas globales de H1 N1 pdm en GenBank en diferentes puntos de medición temporal, entre abril y septiembre de 2009. (Chen GW, Shih SR (2009) Genomic. signaturas of influenza A pandemic (H1 N1 ) 2009 virus. Emerg Infecí Dis). La vacuna contra la influenza es una vacuna anual para proteger contra el altamente variable virus de la influenza. Cada vacuna contra la influenza estacionaria inyectada contiene tres virus de influenza: un virus A (H3N2), el virus pandémico 2009 H1 N1 , y un virus de influenza B. (www.dcd.gov/vaccines/pubs/vis/downloads/vis-flu.pdf)· Sin embargo, la vacuna contra la gripe pandémica sólo es débilmente efectiva contra los virus de influenza H1 1 que portan la mutación D222G en la proteína HA. Por lo tanto, se necesitan urgentemente las cepas virales y los antígenos derivados del virus que genera un título robusto de anticuerpo contra las variantes D222G de H1 N1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos y composiciones para preparar vacunas contra las versiones hipervirulentas y/o resistentes al oseltamivir del virus de la influenza pandémica A H1 1. Se proporcionan las composiciones de las vacunas que incluyen mutaciones en el residuo D222 de HA y residuo S275 de NA.

Esta invención proporciona una vacuna de virus contra la influenza que abarca un virus de influenza que contiene al menos: un segmento de gen de hemaglutinina (HA) que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34, derivada de la cepa aislada del virus 1 de la influenza pandémica del virus de influenza A H1/N1 y un segmento de gen de neuraminidasa (NA) que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 derivada de la cepa aislada del virus 1 de la influenza pandémica del virus de influenza A H1/N1. En una de las implementaciones en particular, el segmento de gen HA comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica de segmento 4 . del virus 1 (SEQ ID NO: 4). En algunas versiones del segmento de gen HA se comprende una secuencia específica HA de ciado 7 de influenza pandémica de virus de influenza A H1/N1.

En una de las implementaciones en particular, el segmento del gen HA comprende una mutación del residuo D222 del virus de influenza A H1/N1 de la influenza pandémica de tipo silvestre. En una de las implementaciones en particular, el segmento del gen HA comprende una mutación D222E. En algunas de las implementaciones en particular, el segmento del gen HA comprende una mutación S203T relacionada con el virus de la influenza A H1/N1 de la influenza pandémica de tipo silvestre.

La invención se relaciona con vacunas en las cuales el segmento del gen HA comprende, además, una o más mutaciones de P83S e I321V.

En una de las implementaciones en particular, el segmento del gen NA comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica de segmento 6 del virus 1 (SWQ ID NO: 6). El segmento del gen NA comprende una mutación Y275H -relativa a una influenza pandémica de tipo silvestre del virus de influenza A H1/N1. La invención se relaciona con vacunas en las que el segmento del gen NA además comprende una o más de las mutaciones I106V, D248N.

La vacuna de la invención puede comprender además: c) un segmento del gen matriz (MA) que codifica un péptido M1 que abarca una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, derivada de la cepa aislada del virus 1 de la influenza pandémica del virus de influenza A H1 1.

En una de las implementaciones en particular, el segmento del gen MA comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica del segmento 7 del virus 1 (SEQ ID NO: 7).

En algunas de las implementaciones en particular, el segmento del gen matriz (MA) codifica un péptido M2 abarcando una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 51 , derivada de la cepa aislada del virus 1 de la influenza pandémica del virus de influenza A H1 N1. En algunas de las implementaciones en particular, el péptido M1 comprende una mutación A198P. La invención se refiere a un método aquí revelado para inmunizar a un paciente contra el virus de la influenza, que incluye como un paso administrar una vacuna de influenza al paciente. La invención se refiere a un método aquí revelado para inmunizar a un paciente contra un virus de influenza hipervirulenta que incluye como un paso administrar una vacuna de influenza al paciente.

La invención se refiere a un método para inmunizar a un paciente contra un virus de influenza resistente al oseltamivir que incluye como un paso administrar una vacuna de influenza al paciente.

La invención se refiere a una vacuna que aquí se revela, en la que la vacuna es una vacuna de reordenamiento. En algunas de las implementaciones, el virus de reordenamiento de la influenza se obtiene por medio de un reordenamiento clásico.

La invención se refiere a una vacuna que aquí se revela, misma que es una vacuna viva atenuada o una vacuna inactiva. En algunas de las implementaciones, la vacuna se formula para ser administrada de manera oral o intranasal.

La invención se refiere a un método de preparación de vacuna para !a inmunización de un sujeto contra una cepa de virus de influenza hipervirulenta, que incluye como un paso mezclar un virus de la influenza que se revela aquí con un portador y de manera opcional un adyuvante.

Estos y otros aspectos serán evidentes a partir de la descripción subsecuente de la implementación en particular preferente tomada junto con las ilustraciones siguientes, aunque las variaciones y modificaciones de la misma puedan verse afectadas sin partir del espíritu y el campo de acción de los nuevos conceptos de la revelación. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las siguientes ilustraciones forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar más detalladamente ciertos aspectos de la presente revelación; las invenciones que podrán entenderse de mejor manera si se hace referencia a una o más de estas ilustraciones junto con la descripción detallada de las implementaciones en particular específicas que aquí se presenten. La patente o la presentación de la solicitud contiene al menos una ilustración realizada a color. La oficina proporcionará copias de la presente patente o de la publicación de la solicitud de la patente con ilustraciones a color una vez que ésta sea requerida y que la cuota necesaria sea cubierta.

La FIGURA 1 muestra ejemplos de la cuantificación de la carga viral mediante PCR en tiempo real.

La FIGURA 2 muestra un arreglo muestra para la detección de AH1 N1 realizada mediante PCR en tiempo real.

Las FIGURAS 3A y 3B muestran una representación gráfica de la interfaz del termociclador Light Cycler 2.0 en tiempo real mostrando curvas fluorescentes (Fig. 3A) Muestra Clínica (Fig. 3B) detección RNAseP (RP).

La FIGURA 4A muestra la adaptación del virus de influenza HZFLUJAL en la línea celular VERO. El virus fue capaz de replicarse de manera eficiente hasta en 4 subcultivos en las células VERO. La FIGURA 4B muestra las etapas de adaptación del virus de influenza HZFLUJAL en la línea celular MDCK. El virus de influenza HZFLUJA pudo replicarse de manera eficiente después de 3 subcultivos en las células MDCK. La FIGURA 5 muestra los anticuerpos totales contra la influenza p/AH1 N1 detectados por ELISA. La FIGURA 6A muestra los anticuerpos IgM contra la influenza p/AH1 N1 detectados en suero por ELISA.

La FIGURA 6B muestra los anticuerpos IgG contra la influenza p/AH1 N1 detectados en suero por ELISA.

La FIGURA 7A muestra los anticuerpos lgG2A contra la influenza p/AH1 N1 detectados en suero por ELISA. La FIGURA 7B muestra la función dosis- respuesta del lgG2A contra la influenza p/AH1 N1 detectada en suero por ELISA.

La FIGURA 8A muestra los anticuerpos IgA contra la influenza p/AH1 N1 detectada en mucosa respiratoria por ELISA. La FIGURA 8B muestra la función dosis-respuesta IgA contra la influenza p/AH1 N1 detectada en mucosa respiratoria por ELISA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los términos empleados en la presente especificación generalmente cuentan con su propio significado ordinario dentro de la técnica, del contexto de la invención, y dentro del contexto específico en el cual se utiliza cada término. Ciertos términos que son utilizados para describir la invención se discutirán más adelante o en algún otro segmento de la especificación para proporcionar una guía adicional al practicante con respecto a la descripción de la invención. Por conveniencia, ciertos términos pueden destacarse, ya sea utilizando letra cursiva y/o comillas. El uso del resaltado que se le da al término no influye en el enfoque y significado del mismo; el enfoque y el significado del término es igual, en el contexto que se está tratando, aún cuando éste no haya sido resaltado. Se apreciará que se puede expresar lo mismo en más de una manera. En consecuencia se puede utilizar un lenguaje alternativo y sinónimos para uno o más de los términos que aquí se discutan, y no hay un significado especial para ser empleado con un término que se elabore o discuta aquí. Se proporcionan sinónimos para ciertos términos. El empleo de uno o más sinónimos no excluye el uso de otros sinónimos. El uso de ejemplos en cualquier parte de la presente especificación incluyendo los ejemplos de cualquiera de los términos aquí discutidos es únicamente con propósitos ilustrativos, y de ninguna manera se limita el enfoque y significado de la invención o de algún término ejemplificado. De la misma forma, la invención no está limitada a las varias de las implementaciones en particular provistas en la presente especificación.

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos aquí empleados cuentan con el mismo significado con el que pueden entenderse en cualquiera de las técnicas ordinarias a las que pertenece la presente invención. En caso de entrar en conflicto, el presente documento, incluyendo sus definiciones será la referencia válida. Las siguientes referencias proporcionan, de acuerdo a la técnica, una definición general de los términos empleados en la presente invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed.1993); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., Cambridge University Press. 1990); The Glossary of Genetics, 5th ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Margham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).

Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con cultivos de células y tejidos, biología molecular y proteínas y Química e Hibridación de polinucleótidos u oligonucleótidos, así como sus técnicas que aquí se describen son bien conocidas y comúnmente usadas en el estado de la técnica. Las técnicas estándar se usan para recombinantes de ADN, síntesis de oligonucléotidos, y cultivo y transformación de tejidos (e.g. electroporación y lipofección). Se realizan reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como comúnmente se obtienen en el estado del arte o como aquí se describe. A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención empleará métodos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro del estado de la técnica, muchas de las cuales se describen en el presente para efectos de ilustración. Tales técnicas se explican a fondo en la literatura. Ver e.g., Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition,1989)¡ Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984). Los virus de Influenza A contienen genomas compuestos de ocho segmentos separados de ARN de sentido negativo como se muestra en la Tabla 1 a continuación. (Steinhauer DA, Skehel JJ., Genetics of influenza viruses. Ann Rev Genet. 2002 36: 305-332). Las cepas humanas circulantes son notorias por su tendencia a acumular mutaciones de un año a otro y causar epidemias recurrentes. Sin embargo, la naturaleza segmentada del genoma también permite el intercambio de genes enteros entre diferentes cepas virales. La plasticidad genética de los virus de influenza tiene también serias implicaciones potenciales con respecto al diseño de la vacuna, de la patogenicidad, y la capacidad de virus novedosos para emerger de reservónos naturales y causar pandemias mundiales.

Tabla Í. Ei genoma del virus de influenza consiste de s/s de ARN sentido (-) en 8 segmentos

§egmoito: Tamaño {nt) Fundóg

1 2341 PB2 Tragsoigtasa: enlace de capjich

2 2341 PB1 ransarigtasa: rigngadón

3 2233 PA Traasmptasa/ protease

4 1778 HA

5 1565 NP N-a^ojwoteÉoa: enl nje AR

6 1413 NA Nraraniinidasa: KÍM dón del viras

? 1027 Mi Proteína matriz: componente de virión

M2 Pxotema integral demem rane

8 890 NS1 No estructural: nuclear

NS2 No estructural: núcleo citoplasma

Un total de 950 virus fueron aislados por cultivo celular, de los cuales, se obtuvieron secuencias parciales a través de secuenciación capilar: 193 Neuraminidasas (NA) y 197 Hemaglutinina (HA). Ya que las NA y las HA son las secuencias más variables en el AH1 N1 , un análisis in silico (análisis filogenético Y BLAST) demostró que todas las 386 (secuencias HA y NA) pueden estar agrupadas en 20 grupos; por lo tanto, el genoma completo de un miembro representativo de cada grupo fue pirosecuenciado en un equipo de Pirosecuenciación 454 Titanium Roche (ROCHE). Se obtuvo un total de 20 genomas completos de AH1 1 , cada AH1 N1 consiste de 8 genes.

Los datos de secuenciación mostraron cuatro aislamientos virales con tres mutaciones diferentes: (i) un virus pAH1 N1 que posee mutaciones en NA (oseltamivirR), HA (Hipervirulencia) y segmentos de Matriz (Virus 1); (ii) un virus pAH1 1 que posee mutaciones en NA y segmentos de Matriz (Virus 2); (iii) un virus pAH1 N1 que posee mutaciones en segmento de matriz (MA) (Virus 3); y (iv) un virus de pAH1 N1 que posee mutaciones en segmento de neuraminidasa (NA) (Virus 4).

Un cambio en la secuencia del gen de hemaglutinina HA1 en el aminoácido correspondiente a la posición 222 (225 en la numeración H3) en donde el ácido aspártico (D) se cambia a glicina (G) se asocia con resultados clínicos severos. La mutación D222G fue observada en aislamientos internacionales H1 N1 pdm en el GenBank (banco de datos de secuencias genéticas) en distintos puntos de medición temporal durante abril a septiembre de 2009. (Chen GW, Shih SR (2009) Genomic signatures of influenza A pandemic (H1 N1) 2009 virus. Emerg Infecí Dis).

El enlace preferencial del virus de influenza al ácido siálico -a2,3-galactosa (receptor a2,3) o ácido siálico -a2,6-galactosa (receptor a2,6) puede determinar su tropismo siendo que los receptores a2,3 y a2,6 son dominantes en células respiratorias inferiores y superiores respectivamente (Shinya K, Ebina M.Yamada S, Ono M, Kasai N, Kawaoka Y. Avian flu: influenza virus receptors in the human

airway. Nature. 2006; 440(7083):435-6).

Recientes análisis de microarreglos sugieren que la sustitución de hemaglutinina (HA) D222G puede causar un cambio de receptores a2,6 a la especificidad de los receptores α2,3/α2,6 mezclados lo que podría incrementar el enlace hacia receptores a2,3 y contribuir con la gravedad de la enfermedad. (Stevens J, Blixt O, Glaser L, Taubenberger JK, Palese P, Paulson JC, et al. Glycan microarray analysis of the hemagglutinins from modern and pandemic influenza viruses reveáis different receptor specificities. J Mol Biol. 006;355(5): 1143-55). Esta posición parece influenciar a la especificidad de enlace del receptor y la diferencia de D a G entre dos variantes de virus 1918 (Id.) se correlaciona con un cambio de una preferencia ácido siálico a2-6-ligado a una especificidad dual α2-3/α2-6, i.e. cabe la posibilidad de que pueda hacer al virus más propenso a infectar más profundamente en los conductos de aire en donde las células que expresan receptores a2-3 son más abundantes, de esta manera, causando hipervirulencia. Sin embargo, no se observaron grupos filogenéticos distintos de casos de gravedad con sustitución D222G (Mak GC et al., Association of D222G substitution in hemagglutinin of 2009 pandemic influenza A (H1 N1) with severe disease. Eurosurveillance, Volume 15, Issue 1 , 08 April 2010). Todos los virus que se observó que contienen cambios en HA1 posición 222 pertenecen a un subclado de virus H1 N1 pandémicos caracterizados por la sustitución S203T en HA1 (característica del ciado 7) el cual también está rodeado de una bolsa de aminoácidos que expone una región antigénica específica para esta cepa hipervirulenta y el resto de las cepas de AH1 N 1. Este subclado forma la gran mayoría de virus pandémicos en Europa y el resto del hemisferio norte. Con respecto al hemisferio sur, este subclado también se encuentra muy esparcido. Con base en datos compartidos con la OMS disponibles en la actualidad la prevalencia de la sustitución D222G es menor a 1.8% (52 detecciones entre más de 2755 secuencias HA). De 364 casos fatales analizados, los virus de 26 casos (7.1 %) tenían la sustitución D222G. La información clínica sobre potenciales condiciones médicas esenciales en estos casos es limitada. Los virus pandémicos (H1 N1) de 2009 con sustitución D222G han sido antigénicamente similares al virus A/California/7/2009 (H1 N1 ), el virus de la vacuna recomendada por la OMS.

Entre los mismos virus A (H1 N1 )2009 mencionados anteriormente se encontraron (i) una mutación Gly222 en la hemaglutinina (HA) y (ii) una mutación Tyr275 en la neuraminidasa (NA) asociada con resistencia al Oseltamivir (McKimm-Breschkin JL. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors— a review. Antiviral Res 2000; 47: 1-17; Collins PJ et al. Structural basis for oseltamivir resistance of influenza viruses. Vaccine 27 (2009) 6317-6323). Ya que ambas mutaciones se relacionan con fenotipos importantes (hipervirulencia y resistencia al Oseltamivir), y regiones antigénicas se asocian con esas mutaciones, la presente vacuna candidata puede reconocer eficientemente ambas cepas mutantes y el tipo silvestre de AH1 N1.

Tres variantes del virus D222G portan la sustitución H275Y en la neuraminidasa (NA) asociada con la resistencia al oseltamivir. Reporte de la OMS. Revisión preliminar de la sustitución del aminoácido D222G en la hemaglutinina de los virus pandémicos de influenza A (H1 N1) de 2009. 28 de diciembre de 2009

(\AAAAA .who.int/csr/resources/publications/swineflu/cp165_2009_2812_review_ d222g_amino_acid_substitution_in_ha_h1 n1_viruses.pdf)

La vacuna pandémica disponible actualmente también reconoce a los mutantes hipervirulentos y de resistencia al oseltamivir, pero aunque la mutación se sitúa en la cavidad de enlace del receptor y no en el sitio antígeno de la hemaglutinina H1 , una caracterización antigénica preliminar llevada a cabo en el Instituto Sueco de Control de Enfermedades Infecciosas y en nuestro laboratorio mostró una reactividad reducida significativa de virus mutantes con antisuero contra la vacuna pandémica actual en comparación con la cepa pandémica de tipo silvestre AH1 N1. Por lo tanto, la vacuna actual no es tan eficiente como la presente vacuna candidata para reconocer estas nuevas cepas mutantes que se expandieron rápidamente en todo el mundo.

Una mutación en el extremo 3' del segmento 7 (segmento Matriz) del genoma viral muestra similitud (60%) con el segmento B M de Influenza. Se ha reportado anteriormente que esta mutación aumenta la respuesta inmune específica en humanos y también podría conferir protección contra la Influenza B. No obstante, la inmunidad mediada por células principalmente contra matrices de virus y antígenos de nucleoproteína, no protegen contra la infección, pero es crucial para la eliminación del virus y la sanación. Las secuencias de aminoácidos de los cuatro aislamientos virales se dedujeron de la determinación de la secuencia nucleótida. El Virus 1 portaba mutaciones de interés en proteínas HA, NA y MA. El Virus 2 portaba mutaciones de interés en proteínas NA y MA. El Virus 3 portaba mutaciones de interés en la proteína NA. El Virus 4 portaba mutaciones de interés en la proteína MA.

Las secuencias HA se analizaron en busca de mutaciones de interés relativas al tipo silvestre de la secuencia pandémica de influenza A H1 N1. Los cuatro aislamientos portaban mutaciones P83S y I321V que parecen prevalecer en el ciado 7 de la cepa pandémica de A/H1 N1.

El virus 1 también tiene (i) un ciado 7 con mutación característica S203T y (¡i) una mutación D222E en la posición 222 de la secuencia HA. En las posiciones 222-223 el virus 1 tiene aminoácidos E-R en lugar del tipo silvestre D-Q. Una concordancia exacta de la secuencia HA del virus 1 se encuentra en la proteína HA del virus de Influenza A (A/Novgorod/01 /2009(H 1 N 1 )). Los virus 1 , 2 y 4 portan mutaciones en los residuos I106V, D248N, Y275H del segmento NA (6) relativo a la secuencia del tipo silvestre A/California/07/2009. La mutación Y275H se asocia con la resistencia al oseltamivir. Concordancias exactas de la secuencia NA encontradas en estos tres aislamientos se encuentran en otros aislamientos. La vacuna de tipo silvestre actual es menos efectiva contra el virus 1 que porta ambas mutaciones HA y NA en estos sitios específicos. (Puzelli et al., Transmission of Hemagglutinin D222G mutant strain of pandemic (H1 N1 ) 2009 virus. Emerging Infectious Diseases 16(5): 863-865 (2010). Una vacuna generada por un virus (como el virus 1 ) que porta tanto hipervirulencia (D222G/E en la región HA) como resistencia al oseltamivir (Y275H en la región NA) supera la falta de eficiencia de las vacunas pandémicas de tipo silvestre H1 N1 y ofrece protección tanto para virus con hipervirulencia como para virus con resistencia al oseltamivir. Los virus 1 , 2 y 3 portan la mutación A198P en la región M1 (segmento 7) relativa a la secuencia del tipo silvestre A/California/07/2009. Además, estos tres aislamientos carecen de residuo correspondiente D34 en la región M2.

Se ha reportado que esta mutación incrementa la inmunidad mediada por células (pero no protege contra la infección). La región mutada tiene un 60% de similitud en la secuencia con el virus de la influenza B en la región MA y las vacunas generadas contra este aislamiento viral que portan esta mutación pueden generar inmunidad contra la influenza B.

También, la mutación M1 puede usarse como blanco de terapia para eliminación viral y recuperación.

Los métodos de la invención usan los antígenos del virus de influenza aquí revelados para dar inmunidad contra la infección del virus de la influenza. El virus específico del cual se derivan los antígenos puede ser igual o distinto del virus específico del que se proporciona la protección, porque se sabe que puede ocurrir una protección cruzada entre diferentes aislamientos de virus de influenza, en particular, dentro de los mismos subtipos virales.

Las actuales vacunas de influenza en uso se designan vacunas de virus completo (VW) o subvirión (SV) (también llamado "dividido" o antígeno superficie purificado"). La vacuna WV contiene virus inactivado, intacto mientras que la vacuna SV contiene un virus purificado desestabilizado con detergentes que solubilizan la envoltura viral que contiene lípidos, seguido por una inactivación química de virus residual. También se están desarrollando vacunas virales atenuadas contra la influenza. Se puede consultar una discusión sobre métodos de preparación de vacunas convencionales en Wright, P. F. & Webster, R. G., FIELDS VIROLOGY, 4d Ed. (Knipe, D. M. et al. Ed.), 1464-65 (2001 ), Mientras que una vacuna incluye más de una cepa de influenza, las distintas cepas se cultivan típicamente de manera separada y se mezclan después de que los virus se han cosechado y que los antígenos han sido preparados. Alternativamente, distintos segmentos de distintos aislamientos de virus de influenza pueden combinarse para generar una vacuna multipotente. El (los) virus de influenza usado(s) en los procesos .de la invención pueden ser cepas reordenandas y/o pueden haberse obtenido por técnicas de reversión de genética inversa. Los virus pueden estar atenuados, sensibles a la temperatura o adaptados al frío. Se puede utilizar una cepa reordenada que incluya segmentos virales de HA y/o NA a partir de una cepa patógena y los seis o siete segmentos restantes de una cepa no patógena.

El antígeno de virus de influenza usado en la composición inmunogénica de acuerdo con la invención puede estar en forma de un virus vivo o, preferentemente, de un virus inactivado. La inactivación del virus normalmente involucra tratamiento con un químico, como la formalina o β- propiolactona. Mientras que cuando se usa un virus inactivado, el antígeno puede ser un virus completo, un virus dividido o subunidades virales. Los virus divididos se obtienen tratando viriones con detergentes (e.g. éter etílico, polisorbato 80, desoxicolato, tri-n-butil fosfato, Tritón X-100, Tritón N101 , bromuro de cetil-trimetil-amonio, etc.) para producir preparaciones de subviriones. Las vacunas con subunidad comprenden uno o ambos antígenos superficie de influenza, hemaglutinina y neuraminidasa. Los antígenos de la influenza también pueden presentarse en forma de virosomas.

Cuando un antígeno se prepara a partir de un virus de influenza (i.e. en lugar de ser producido en un sistema sintético o recombinante que no involucra cultivo de virus de influenza. El virus puede hacerse desarrollar en huevos o en cultivo celular. El cultivo en huevos embrionados libres de patógenos es la ruta tradicional por la cual los virus de influenza han sido cultivados para la producción de vacunas y el cultivo celular es un desarrollo más reciente. Cuando se usa cultivo de células, entonces la vacuna de virus será normalmente cultivada en células mamíferas, como células MDCK, células Vero o células PER.C6. Estas líneas celulares se encuentran ampliamente disponibles e.g. en la colección de Cultivo de Células de Tipo Americano (ATCC por sus siglas en inglés) o en los Coriell Cell Repositories. Por ejemplo, la ATCC proveé varias células Vero distintas en los catálogos número CCL-81 , CCL-81.2, CRL-1586 y CRL-1587, así como células MDCK en los catálogos número CCL-34. El cultivo en líneas células aviares, incluyendo células derivadas de gallina, por ejemplo, fibroblastos de embrión de pollo, también es posible (CEF). Las composiciones inmunogénicas y de medicamentos de la invención son propicias para su administración al paciente. Esto puede lograrse de varios modos, incluyendo pero sin limitarse a: inyección intradérmica, administración transdérmica y administración tópica. Estas pueden usarse en conjunto con abrasión de piel, e.g. con papel lija o con el uso de microabrasivos.

Las composiciones inmunogénicas y de medicamentos de la invención se presentan preferentemente como vacunas.

Las composiciones de la invención pueden incluir un adyuvante. Los adyuvantes que se han usado en vacunas de influenza incluyen sales de aluminio, quitosano, oligodesoxinucleótidos CpG como el CpG 7909, emulsiones de aceite en agua, como la MF59, emulsiones aceite en agua o agua en aceite, toxina lábil al calor de E. coli y sus mutantes desintoxicados, monofosforil lípido A y su derivado 3-O-desacilado, mutantes de toxina pertusis, muramil dipéptido, etc.

La hemaglutinina (HA) es el inmunógeno principal en las vacunas de influenza inactivadas y las dosis de vacunas están estandarizadas con referencia a niveles HA, normalmente como se miden con una prueba de inmunodifusión radial simple (SRID). Las vacunas de inyección intramuscular normalmente contienen cerca de 15 pg de HA por cepa, aunque también se usan dosis más bajas (e.g. para niños, o en situaciones pandémicas) y se han usado dosis fraccionadas como1/2 (i.e. 7.5 pg HA por cepa), 1/4 y 1/8. Las composiciones de la invención normalmente contendrán entre 0.1 y 8 pg de HA por cepa de influenza, preferentemente, e.g. cerca de 7.5, cerca de 5, cerca de 3, cerca de 2.5, cerca de 2, cerca de 1.5, cerca de 1 , cerca de 0.75, cerca de 0.5, cerca de 0.4, cerca de 0.2 pg, etc.

Las vacunas de inyección intramuscular normalmente tienen un volumen de 0.5 mi. Las composiciones pueden incluir conservadores como el tiomersal o el 2-Fenoxietanol. No obstante, es preferible que las composiciones estén sustancialmente libres de material de mercurio (Le. menos de 1 pg/ml), e.g. libres de tiomersal. Se prefieren las vacunas que no contienen mercurio.

Cuando el virus de influenza ha sido desarrollado a través de un cultivo celular, las composiciones de la invención contienen preferentemente menos de 100 pg de ADN celular residual del anfitrión por dosis, aunque puede haber presencia de rastros de ADN celular del anfitrión. El ADN contaminante puede ser eliminado durante la preparación de la vacuna usando procedimientos de purificación estándar e.g. cromatografía, etc. La eliminación del ADN celular residual del anfitrión puede mejorarse con tratamiento de nucleasa, e.g. usando el Benzonase® DNase. Se prefieren las vacunas que contienen <100 pg de ADN celular del anfitrión por 10 pg de hemaglutinina, así como las vacunas que contienen <100 pg de ADN celular del anfitrión por 0.25 mi. de volumen. Se prefieren las vacunas que contienen <100 pg de ADN celular del anfitrión por 50 pg de hemaglutinina, al igual que las que contienen <100 pg de ADN celular del anfitrión por mi. de volumen.

Las vacunas de la invención pueden lanzarse como un régimen de dosis única de inmunización. Alternativamente, pueden lanzarse como el elemento principal de un régimen de combinación "prime-boost" (que significa que la primera inmunización es seguida por una segunda inyección de antigenicidad similar después de algunas semanas o meses). Los métodos para poner a prueba la inmunogenicidad del las vacunas de influenza son bien conocidos en el arte de la técnica. Uno de los métodos involucra el siguiente procedimiento: a) justo antes de la vacunación, se toma del paciente una muestra de sangre de la vena de 10 mi., normalmente del brazo, para titulación con línea de base, de anticuerpos anti-HA circulantes; b) inmediatamente después, el paciente recibe una dosis de vacuna que, si se administra en el brazo, será en el brazo opuesto de donde se retiró la sangre; c) Aproximadamente 3 semanas después de la vacunación, se tomará una muestra de sangre de 10 mL del paciente. Los sueros se separan de las muestras de sangre y se almacenan (si es necesario) a -20°C. Los sueros se someten a pruebas de anticuerpos anti hemaglutinina contra las cepas relevantes por inhibición de hemaglutinina (Hl) o hemolisis radial sencilla (SRH). Los sueros positivos y negativos así como las preparaciones de referencia pueden obtenerse de laboratorios de referencia públicos. Las titulaciones de anticuerpos se realizan por duplicado y los sueros antes y después de la vacunación se titulan simultáneamente. El título asignado a cada muestra es la media geométrica de dos determinaciones independientes (pero, para efectos de cálculo, cualquier resultado Hl <10 (=no detectable) se expresa como 5 y cualquier resultado negativo SRH se expresa como 4 mm2 bajo condiciones estándar).

En pruebas Hl, la seroconversión corresponde a una proporción de títulos pre y post inmunización de≥ 40 y un aumento significativo (e.g. al menos 4 veces) en títulos de anticuerpos. En pruebas SRH la seroconversión corresponde a un área de posvacunación de≥ 25 mm2 con al menos 50% en el área relativa al área de pre-vacunación.

EJEMPLOS Sin intentar limitar el enfoque de esta invención, a continuación se proporcionan los instrumentos ejemplares, aparatos, métodos y sus correspondientes resultados de acuerdo con las declaraciones de la presente invención. Tenga en cuenta que los títulos o subtítulos pueden usarse en ejemplos a conveniencia del lector, lo que de ninguna manera limita el enfoque de la presente invención. Además, se proponen y revelan ciertas teorías en la presente, pero de ninguna manera, si son o no correctas, se limita el enfoque de la invención en tanto que ésta se lleve a la práctica de acuerdo con la invención sin importar ninguna de las teorías específicas o esquemas de acción. EJEMPLO 1 : línea celular

Las células VERO son una línea celular muy bien estudiada, aislada primero del riñon del mono verde africano (Cercopithecus aethiops) y ampliamente usada en la Microbiología, en la biología celular y en los estudios de virología. Ha sido autorizada en EE.UU. para la producción de vacunas virales (rotavirus y polivirus), también ha sido probada y en algunos casos aprobada para la producción de vacunas contra la rabia, reovirus y encefalitis japonesa. Hemos elegido esta línea celular por su susceptibilidad a la coinfección, así como por su capacidad de desarrollo a escala industrial en fermentadores y bioreactores, características deseables para la producción de vacunas.

La línea celular VERO usada fue comprada en ATCC y mantenida a -70°C con dimetilsulfóxido (DMSO). Las células se descongelaron de acuerdo con las instrucciones de CORNING.

EJEMPLO 2: Condiciones estériles

Todas nuestras instalaciones en nivel de bioseguridad III III están cuidadosamente tratadas y monitoreadas para evitar contaminación. Regularmente se llevan a cabo pruebas de esterilidad en cuartos, material, reactivos y equipos. El área de cultivo celular se limpia constantemente y se desinfecta cada mes, y se realizan varias rondas de desinfección cada 24, 48 y 72 horas usando Benzal, 70% etanol y 5% cloro. Se realizan pruebas de al final de estas rondas, también, todos los reactivos son sometidos a pruebas de contaminación cultivando una alícuota en medio líquido de tioglicolato.

EJEMPLO 3: Propagación celular

La propagación de células Vero se llevó a cabo de conformidad con condiciones físicas y químicas tales como almacenamiento en matraces de cultivo de células de poliestireno (25 cm2, 50 cm2 y 75 cm2). Estos matraces también pasan por rayos Gamma para reducir la hidrofobicidad. Estos contenedores permiten una adhesión celular eficiente y por lo mismo una formación de monocapas. Para incrementar la proliferación celular, se uso medio de crecimiento M199 de DMEM (Medio Eagle modificado por Dulbecco) y con suplemento de 10% de suero de feto bovino (BFS) (SIGMA- Aldrich); el mantenimiento de pH fisiológico fue monitoreado usando Rojo de Fenol. Se agregó una mezcla antimicrobiótica (penicilina, estreptomicina y anfotericina B) y también para inhibir la contaminación micótica se agregó anti-PPLO. Los cultivos celulares se incubaron a 35°C / 5% C02 / 5% de humedad. El crecimiento y calidad de las células se monitoreó con microscopio de contraste de fases, esto nos permite descartar aquéllos cultivos que presentan contaminación bacterial o micótica.

El subcultivo celular de matraces que presentan completa confluencia se lleva a cabo de la siguiente manera:

1. Remueva y deseche el medio de cultivo.

2. Brevemente enjuague la capa celular con solución de tripsina al 0.25% (w/v) - 0.53 mM de EDTA para remover todos los rastros de suero que contienen inhibidor tripsina.

3. Agregue de 2.0 a 3.0 mi de solución de tripsina EDTA al matraz y observe las células bajo un microscopio invertido hasta que la capa celular se disperse (generalmente de 5 a 15 minutos).

4. Agregue de 6.0 a 8.0 mi de medio de cultivo completo y aspire las células pipeteando cuidadosamente.

5. Agregue las alícuotas adecuadas de la suspensión celular a los nuevos recipientes de cultivo.

6. Incube los cultivos a 37°C. Cuando se obtuvo el 80% de confluencia, las células fueron inoculadas con el virus p AHN1 a 1x106. Este nivel de confluencia fue óptimo para la observación del efecto citopatogénico causado por el virus de influenza A/H1 N1. EJEMPLO 4: Aislamiento viral

Se realizó el aislamiento viral en matraces de 25cm2 inoculados con células VERO (80% de confluencia); para el aislamiento viral, se retiró el medio de cultivo, las células fueron centrifugadas y resuspendidas tres veces para descartar los restos celulares. A partir de una muestra en hisopo obtenida de un paciente diagnosticado clínicamente con influenza AH1 N1 y confirmado por PCR en tiempo real, se inocularon 50 μΙ en el cultivo celular y se incubaron durante 30 minutos para permitir la fijación viral a la superficie celular. Subsecuentemente, el M199 fue adicionado con BFS al 1% e incubado a 40°C/40 min.

Los cultivos inoculados fueron monitoreados para detectar la presencia de efecto citopático celular mediante el microscopio de contraste de fases. Simultáneamente, se determinó la carga viral por PCR en tiempo real. Al alcanzar el 1x106, los cultivos fueron congelados a -80°C (DMSO 10%) y almacenados para estudios posteriores.

EJEMPLO 5: Confirmación de infección vira! y cuantificación por RT- PCR en tiempo real. El ARN viral fue extraído de los cultivos celulares VERO utilizando equipo comercial (ROCHE) como se describió anteriormente, después, se cuantificó el ARN por espectofotometría utilizando equipo NanoDrop. Se realizó el protocolo CDC para la detección de AH1 N1 por PCR en tiempo real en un termociclador Light Cycler 480 (ROCHE), incluyendo un estándar para Influenza con el objeto de cuantificar (101 a 106 copias del gen H1 clonado en un plásmido). La determinación de carga viral se realizó calculando el formato de puntos de intersección para cada muestra. La Figura 1 muestra ejemplos de la cuantificación de carga viral. EJEMPLO 6: Selección de muestras

Un total de 193 de 3760 muestras positivas de pAH1 N1 para secuenciación con base en datos clínicos y epidemiológicos. Los criterios clínicos para la selección fueron: severidad de la infección, resistencia del medicamento y escenario clínico atípico. Los cirterios epidemiológicos se basaron en lugar, género y edad. Las muestras seleccionadas fueron recolectadas durante los 4 puntos más álgidos del brote reportados de Marzo a Noviembre de 2009. Las muestras fueron resuspendidas en 2.5 mi de medio de transporte viral y se prepararon y almacenaron alícuotas de 500 μΙ a -70 °C.

EJEMPLO 7: Extracción de ácido nucleico

Los ácidos nucleicos totales de las muestras clínicas fueron aislados y resuspendidos en agua desionizada (100μ) utilizando el Kit de MagNA Puré LC Total Nucleic Acid Isolation (Roche) en el instrumento MagNA Puré LC (Roche) mediante el protocolo de Lisis Externa de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en resumen: 500 μΙ de la muestra fueron colocados en el cartucho de ácido nucleico MagnaPure y se agregó un volumen de solución amortiguadora de lisis, posteriormente, se establecen y se inician todos los parámetros. El ARN extraído fue colocado a -70°C para análisis posteriores.

EJEMPLO 8: Detección de Influenza p/AH1N1 por PCR en tiempo real

La detección de Influenza pandémica AH1 N1/09 fue realizada por medio de dos métodos: Set de detección Real-time ready Influenza A/H1 N1 (Roche), utilizando el kit Real-time ready RNA Virus Master 53 (Roche). El proceso de ciclos térmicos fue realizado con instrumentos Light Cycler (Roche) bajo las siguientes condiciones: 30 min a 50 °C; 15 min a 95 °C; 45 ciclos de 15 s a 94 °C; y 30 s a 60°C. El segundo método fue el protocolo de RT-PCR en tiempo real para influenza A (H1 N1), utilizando los partidores y sondas descritos en el protocolo anterior y el kit one step RT-PCR Invitrogen SuperScript™ III Platinum® One-Step Quantitative. El proceso de ciclos térmicos fue realizado con instrumentos Light Cycler 2.0 (Roche) bajo las siguientes condiciones: 50 min a 50 °C; 2 min a 95 °C; 45 ciclos de 15 s a 95 °C; y 30 s a 55 °C.

Todas las reacciones en ambos métodos fueron realizadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando 5 μΙ del ARN total en un volumen de reacción total de 20 μΙ. En ambos métodos de detección se incluyó un control interno (gen humano de miostatina para el método Roche y RnaseP para el protocolo CDC).

Cada muestra fue probada y el PCR en tiempo real por separado utilizando las siguientes sondas: Influenza A (InfA), porcina universal (SwFlu A), Hemaglutinina porcina (SwH1) y un control interno para el ácido nucleico humano RNaseP (RP). Se introdujeron controles positivos y negativos.

La mezcla de reacción contenía 0.8 μΜ de cada partidor, 0.2 μΜ de cada sonda, solución amortiguadora PCR 1X y 0.5 U de SuperScript lll/Platinum Taq Mix (Invitrogen).

La Figura 2 muestra un ejemplo de ordenación de muestra.

Las condiciones de amplificación fueron las siguientes:

Transcripción inversa— 50°C / 30 min

Inactivación— 15°C / 2 min

Extensión— 95°C / 15 ciclos y 55°C / 30 ciclos.

EJEMPLO 9: Análisis de datos Los resultados fueron analizados de acuerdo con los criterios de la OMS de la siguiente manera:

1.- No debe haber fluorescencia en el control negativo. 2. - Las muestras experimentales deben presentar fluorescencia para la sonda RP.

3. - El control de ácido nucleico humano no debe emitir fluorescencia para las sondas InfA, SwFluA y SwH1.

4. - El control positivo (A/H1 N1 ácido nucleico) debe emitir fluorescencia para todos los partidores y sondas.

5. - Si se satisfacen todos los criterios, la muestra se considera positiva.

Las Figuras 3A y 3B muestran vistas gráficas de la interfaz del termociclador en tiempo real Light Cycler 2.0 mostrando curvas de fluorescencia. Fig. 3A) Muestra clínica. Fig. 3B) detección RNAseP (RP). EJEMPLO 10: Secuenciacion

Se aisló un total de 950 virus por cultivo celular, de los cuales se obtuvieron 193 secuencias genéticas parciales de Neuraminidasa (NA) y 197 de Hemaglutinina (HA) mediante secuenciacion de capilaridad en una máquina de secuenciacion ABI 3100 (Applied Biosystems). Dado que la HA y la NA son las secuencias más variables en el AH1 1 , un análisis in silico (análisis filogenético y BLAST) demostró que las 386 (secuencias HA y NA) podían ser agrupadas en 20 grupos, por lo tanto, el genoma completo de un miembro representativo de cada grupo fue pirosecuenciado en un equipo de Pirosecuenciación 454 Titanium Roche Pyrosequencing (ROCHE).

EJEMPLO 11 : Propagación del virus de influenza en un embrión de pollo Se realizaron varios intentos para propagar los candidatos propuestos para la vacuna de la influenza en células VERO. Sin embargo, estos intentos fallaron inicialmente porque la cantidad de virus recuperado fue muy baja incluso después de 3 pasajes. Considerando esto, se realizaron uno o dos pasajes en pollos embriones SPF (exentos de patógenos específicos). Estos fueron inoculados en el fluido amniótico con 0.1 mi de cada candidato. Otros 40 virus previamente aislados durante el periodo de gripe pandémica también fueron incluidos y la inoculación se realizó utilizando dos huevos para cada virus.

Después de tres días a 35°C el fluido amniótico fue extraído de cada embrión infectado y el liquido recolectado fue centrifugado a 3000xg para eliminar restos celulares y el sobrenadante fue analizado mediante qRT-PCR y almacenado a -80°C. Todos los procedimientos fueron realizados de conformidad con del nivel de bioseguridad III siguiendo los estándares requeridos para evitar riesgos de bioseguridad. Después del pasaje dentro del embrión la carga viral fue muy alta para tres cepas, una de ellas era el virus candidato. Se detectaron diez cepas aisladas más mediante la prueba RT-PCR pero mostraron cargas virales bajas. Por lo tanto, fueron inoculadas nuevamente en otro embrión de pollo SPF pero, este caso, la inoculación fue realizada en el fluido alantoideo. Después de 72 hrs de incubación siguiendo las mismas condiciones descritas anteriormente, el virus fue extraído recolectando solamente el fluido alantoideo. Se analizó un volumen más bajo utilizando la técnica RT-PCR y el resto fue almacenado a -80°C. Los resultados mostraron que seis de las diez cepas aisladas fueron capaces de reproducirse con alta eficacia mostrando alta carga viral.

Certificado de secuencia del Karolinska Institute

Anterior a la propagación del embrión de pollo, la cepa viral cDNA fue enviada al instituto Karolinska para verificar la secuencia mediante un sistema pirosecuenciador 454 ROCHE. El análisis bioinformático confirma la secuencia determinada previamente en nuestro laboratorio. Identificación de la semilla primaria

El nombre del virus candidato para la vacuna contra la influenza fue HZFLUJAL.

Adaptación del virus de influenza para su crecimiento en la línea de células VERO

El virus candidato (HZFLUJAL) y otros dos virus extraídos del embrión fueron inoculados en la línea de células VERO. Con el objeto de lograr la adaptación, se realizaron varios pasajes, recolectando el sobrenadante del cultivo después de 7 a 10 días de infección. Cada sobrenadante fue utilizado para infectar un nuevo pasaje de células VERO. Se cuantificó la carga viral de cada pasaje. La Figura 4A muestra las diferencias entre la carga viral en el embrión y los respectivos subcultivos del mismo virus. En dicha figura se muestra claramente que la adaptación viral a esta línea de células de tejido podía ser obtenida hasta los cuatro pasajes.

Adaptación del virus de influenza para su crecimiento en la línea de células DCK

No solamente la línea de células VERO fue evaluada como substrato del virus de influenza, sino también la línea de células MDCK fue utilizada para propagar el virus. Los mismos procedimientos aplicados para la adaptación de las células VERO fueron realizados para las células MDCK. Los resultados preliminares muestran una mejor adaptación a esta línea celular porque aparentemente solamente se necesitaron tres pasajes para obtener una carga viral más alta que la del embrión de pollo (Figura 4B). Propagación del virus para obtener la semilla primaria HZFLUJAL

Para la propagación del virus previamente adaptado para su crecimiento en la línea de células VERO, se descongeló un criovial del cuarto pasaje en las células VERO y se utilizó para infectar las células VERO en matraces de 175 cm2. Después de 10 días a 33°C en un incubador C02, se obtuvieron 120 mi de semilla primaria, la cual mostró una carga viral mayor a 107 partículas virales/ml (aproximadamente 107.7). Se obtuvieron120 crioviales con 1 mi de semilla primaria.

Control de calidad de la semilla primaria

Se realizaron las pruebas de esterilidad y de hemaglutinación en la semilla primaria. Para la primera, fueron descongelados 4 crioviales de semilla primaria, dos fueron utilizados para inocular dos matraces con 100 mi de Medio Líquido de Tioglicolato NH, y los otros dos crioviales fueron destinados a la inoculación del medio DMEM sin antibióticos. Ambos medios fueron incubados a 35 °C de 8 a 15 días. No se observó crecimiento ni cambio en los medios después del periodo de incubación, por lo tanto se consideró estéril (libre de bacterias, hongos y protozoos).

La prueba de hemaglutinación fue realizada para determinar el título de hemaglutinina en la semilla primaria. Para este ensayo, se realizaron diluciones seriales de 1 :2 a 1 :1024 de semilla primaria en PBS, ph=7.4, en una microplaca en forma de U de 96 pozos. Se agregó el mismo volumen de suspensión de eritrocito humano del grupo O 0.5% (v/v) en PBS a cada dilución. La microplaca fue incubada 2 horas a 4°C, los resultados mostraron un título de hemaglutinación de 1 :8. EJEMPLO 12: Ensayos previos preclínicos utilizando la vacuna HZFLUJAL

Inactivación de virus para los ensayos previos preclínicos

Para realizar el ensayo previo preclínico, se descongeló un criovial de semilla primaria y se utilizó para infectar un cultivo VERO en un matraz de 80cm2 después de 7 días a 33°C en un incubador C02. El cultivo fue inactivado mediante formalina a una concentración final de 0.02% (v/v) para 18h a 35 °C. La formalina fue eliminada dializando contra DMEM cuatro veces en 48h. Posteriormente, el título de hemaglutinina fue cuantificado, siendo nuevamente de 1 :8. La suspensión viral inactivada fue ajustada a106 partículas virales por 25μΙ y utilizadas como vacuna en los grupos mencionados más adelante.

Modelo animal para ensayos previos preclínicos

Se emplearon ratones hembras BALB/c de 7 a 8 semanas para los ensayos previos preclínicos. Cada grupo fue colocado en un estante cubierto con filtros Hepa. Todos los animales fueron manipulados evitando sufrimiento innecesario. Cuando el protocolo fue finalizado a todos los ratones se les practicó la eutanasia.

Ensayos de seroconversión en pruebas previas preclínicas

Se realizaron ensayos de seroconversión en nueve grupos de 5 ratones cada uno.

Grupo 1 vacuna con106 partículas virales + factor de transferencia + administración sublingual

Grupo 2 vacuna con partículas virales106 + factor de transferencia + administración intramuscular Grupo 3 vacuna con partículas virales106 + administración sublingual Grupo 4 vacuna con partículas virales106 + administración intramuscular Grupo 5 vacuna comercial + administración sublingual Grupo 6 vacuna comercial + administración intramuscular Grupo 7 DMEM sin suero fetal Bovino + administración sublingual Grupo 8 DMEM sin suero fetal Bovino + administración intramuscular

Grupo 9 sin tratamiento Ensayos dosis-respuesta en pruebas previas preclínicas

Se realizaron ensayos dosis-respuesta en cinco grupos de 3 ratones cada uno. Grupo A Vacuna con partículas virales 107 + factor de transferencia + administración sublingual

Grupo B Vacuna con partículas virales 105 + factor de transferencia + administración sublingual

Grupo C Vacuna con partículas virales 104 + factor de transferencia + administración sublingual

Grupo D Vacuna con partículas virales 103 + factor de transferencia + administración sublingual

Grupo E Vacuna con partículas virales 102 + factor de transferencia + administración sublingual

Desde el comienzo del protocolo de inmunización todos los ratones fueron mantenidos durante 4 días en un cuarto de experimentación anima! el cual cuenta con los requerimientos de bioseguridad para la realización de ensayos inmunológicos. Después del tiempo de adaptación se registraron datos clínicos como el peso y apariencia, y se extrajo una muestra de sangre sin anticoagulante de cada ratón antes de la inmunización. Subsecuentemente, cada grupo fue inoculado mediante la respectiva ruta de administración. Se obtuvieron cuatro muestras de sangre de cada ratón a 7, 14, 21 and 28 días posteriores a la inmunización.

Se obtuvo suero mediante la centrifugación de las muestras de sangre y fue utilizado para la detección de anticuerpos lgG2 contra el virus de Influenza A H1 N1. Además se recolectaron muestras de secreciones de los ratones para detectar la presencia de secreción de inmoglobulina A (IgA). EJEMPLO 13: Detección de anticuerpos contra la influenza p/AH1 N1 generados por la vacuna CIATEJ/OPKO

Se desarrolló una vacuna ejemplar, descrita aquí como vacuna CIATEJ/OPKO en células Vero, y fue probada para conocer su capacidad de generación de anticuerpos contra la influenza pandémica AH1 N1. El antígeno desarrollado por la CIATEJ/OPKO en células Vero fue capaz de inducir la producción de anticuerpos al ser empelada como vacuna en ratones. El título de anticuerpos inducido por el antígeno CIATEJ/OPKO fue mayor que el de la vacuna comercial. La FIGURA 5 muestra los anticuerpos totales contra la influenza p/AH1 N1 detectados por ELISA. La vacuna CIATEJ/OPKO fue desarrollada en células Vero, TF= Factor de Transferencia. La inmunización fue realizada en ratones hembras BALB/c de 7 a 8 semanas de edad. La inmunización fue sublingual o intramuscular.

La FIGURA 6A muestra anticuerpos IgM contra influenza p/AH1 N1 detectada en suero por ELISA. La vacuna CIATEJ/OPKO fue desarrollada en células Vero, TF = Factor de Transferencia. La inmunización fue realizada en ratones hembra BALB/c de 7 a 8 semanas de edad. La inmunización fue intramuscular.

Cuando el factor de transferencia fue agregado a la vacuna CIATEJ/OPKO, se quintuplicaron los niveles de anticuerpos IgG, de la misma manera que el factor de transferencia tripiicó los títulos del anticuerpo IgM durante la primera semana de inmunización. La FIGURA 6B muestra los anticuerpos IgG contra la influenza p/AH1 N1 detectados en suero por ELISA. La vacuna CIATEJ/OPKO fue desarrollada en célulasVero, TF = Factor de Transferencia. La inmunización fue realizada en ratones hembra BALB/c de 7 a 8 semanas de edad. La inmunización fue intramuscular. La administración intramuscular de la vacuna CIATEJ/OPKO mostró una inducción mayor de anticuerpos lgG2A que la de administración sublingual. La FIGURA 7A muestra anticuerpos lgG2A contra la influenza p/AH1 N1 detectados en suero mediante ELISA. La vacuna CIATEJ/OPKO fue desarrollada en células Vero, TF = Factor de Transferencia. La inmunización fue realizada en ratones hembra BALB/c de 7 a 8 semanas de edad. La inmunización fue sublingual o intramuscular.

La FIGURA 7B muestra la dosis-respuesta de lgG2A contra la influenza p/AH1 N1 detectada en suero mediante ELISA. La vacuna CIATEJ/OPKO fue desarrollada en células Vero, TF = Factor de Transferencia. La inmunización fue realizada en ratones hembra BALB/c de 7 a 8 semanas de edad. La inmunización fue sublingual. La administración intramuscular de la vacuna CIATEJ/OPKO mostró inducción de anticuerpos IgA a niveles comparables a los de la administración sublingual. La FIGURA 8A muestra los anticuerpos IgA contra la influenza p/AH1 N1 detectados en mucosa respiratoria mediante ELISA. La vacuna CIATEJ/OPKO fue desarrollada en células Vero, TF = Factor de Transferencia. La inmunización fue realizada en ratones hembra BALB/c de 7 a 8 semanas de edad. La inmunización fue sublingual o intramuscular (día 21 después de la inmunización).

La FIGURA 8B muestra la relación dosis-respuesta IgA contra la influenza p/AH1 N1 detectada en mucosa respiratoria mediante ELISA. La vacuna CIATEJ/OPKO fue desarrollada en células Vero, TF =Factor de Transferencia. La inmunización fue realizada en ratones hembra BALB/c de 7 a 8 semanas de edad. La inmunización fue sublingual o intramuscular (día 21 después de la inmunización). REFERENCIAS

Magna Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit. Versión December 2008. Kit for isolation of total viral nucleic acids from mammalian serum, plasma and whole blood. Cat. No.03 038 505 001.

SuperScript III Platinum One Step Quantitative RT-PCR System. Cat. No. 1 1738-088.

World Health Organization. CDC protocol of Real time for Influenza A (H1 N1). April 29 2009.

CENAVECE-InDRE. Lineamientos para la red Nacional de laboratorios de salud pública e institutos nacionales de salud para vigilancia de influenza en México 2009.

Ammerman N., Beier M., and Azad F. 2008 Growth and Maintenance of Vero Cell Lines. Curr Protoc Microbiol. Pp. 1-10.

Erlich H., Müller M., Helen M., Tambyah P., Joukhadar M., Montomoli M., Fisher D., Berezuk D., Fritsch M., Lów-Baselli A., Vartian N., Bobrovsky R., Borislava G., Pavlova, Pollabauer E., Kistner O., and Barrett N. 2008 A Clinical Trial of a Whole-Virus H5N1 Vaccine Derived from Cell Culture for the Baxter H5N1 Pandemic Influenza Vaccine Clinical Study Team. N. Engl. J. Med. 358;24. Pp. 2573-2584.

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri". 2003. Manual de procedimientos para el diagnostico de laboratorio de la infecciones respiratyorias agudas de etiología viral. Organización panaméricana de la salud. Organización mundial de la salud. Kistner O., Howard K., Spruth M., Wodal W., Brühl P., Gerencer M., Crowe B., Savidis H., Livey I., Reiter M., Mayerhofer I., Tauer C, Grillberger L, Mundt G., Falkner F., and P. Noel. 2007 Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1 ) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses. Baxter AG, Biomedical Research Center, Uferstrasse, Austria. Vaccine. 2007 10; 25(32). P. 6028-6036. Reina J. , Fernández V., Blanco I. y Munar M. 1997. Comparison of Madin- Darby Canine Kidney Cells (MDCK) with a Green Monkey Continuous Cell Line (Vero) and Human Lung Embryonated Cells (MRC-5) in the Isolation of Influenza A Virus from Nasopharyngeal Aspirates by Shell Vial Culture. American Society for Microbiology Vol. 35, No. 7. P. 1900-1901.

Ryan John. Ph.D. Introduction to animal cell culture. Corning Incorporated Life Sciences 900 Chelmsford St. Lowell, Bulletin Technical. MA 01851. P. 1 - 24. Ryan John. Ph.D. Subculturing Monolayer cell cultures Proíocol Corning Incorporated Life Sciences 900 Chelmsford St. Lowell, MA 01851. P. 1-5. Sheets R. 2000 History and Characterization of the Vero Cell Line. Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee Meeting to be held. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta especificación son incorporadas en la presente por referencia, como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específica e individualmente indicada para ser incorporada por referencia. Aunque la invención mencionada ha sido descrita con cierto detalle por medio de ilustraciones y ejemplos para efectos de una clara comprensión, seguramente les parecerá, a aquellos que son expertos en el ámbito, a la luz de los preceptos de esta invención, que pudieran realizarse ciertos cambios y modificaciones a la misma sin alejarse de la esencia o ámbito de la reivindicación adjunta.

Claims

REIVINDICACIONES Lo que se reivindica es:

1. Una vacuna de virus de influenza que contiene un virus de influenza que consta al menos de:

a) Un segmento génico de hemaglutinina (HA) que contiene una secuencia de amino ácido de SEQ ID NO: 34 derivado de la cepa aislada del virus 1 del virus de influenza AH1/N1 de la influenza pandémica, y

b) Un segmento génico de neuraminidasa (NA) que contiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 39 derivado de la cepa aislada del virus 1 del virus de influenza AH1/N1 de la influenza pandémica.

2. La vacuna de la reivindicación 1 , en la que el segmento génico HA contiene una secuencia de aminoácido codificada por la secuencia nucleótida del segmento 4 del virus 1 (SEQ ID NO: 4).

3. La vacuna de la reivindicación 1 , en la que el segmento génico HA contiene una secuencia HA específica de ciado 7 del virus de influenza

AH1/N1 de la influenza pandémica.

4. La vacuna de la reivindicación 1 , en la que el segmento génico HA contiene una mutación en el residuo D222 del tipo silvestre del virus de influenza A H1/N1de la influenza pandémica.

5. La vacuna de la reivindicación 4, en la que el segmento génico HA contiene una mutación D222E.

6. La vacuna de la reivindicación 4, en la que el segmento génico HA contiene una mutación S203T relativa al tipo silvestre del virus de influenza A H1/N1de la influenza pandémica.

7. La vacuna de la reivindicación 4, en la que el segmento génico HA consta además de una o más mutaciones P83S y 1321 V.

8. La vacuna de la reivindicación 1 , en la que el segmento génico NA contiene una secuencia de aminoácido codificada por la secuencia neuclotídica del segmento 6 del virus 1 (SEQ ID NO: 6).

9. La vacuna de la reivindicación 1 , en la que el segmento génico NA contiene una mutación Y275H relativa al tipo silvestre del virus de influenza

A H1/N1de la influenza pandémica.

10. La vacuna de la reivindicación 9, en la que el segmento génico NA consiste además de uno o más mutaciones I106V, D248N.

11. La vacuna de la reivindicación 1 , contiene además:

C) Un segmento de gen matriz (MA) codificando un péptido M1 que contiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 50 derivado de la cepa aislada del virus de influenza AH1/N1 de la influenza pandémica.

12. La vacuna de la reivindicación 11 , en la que el segmento génico MA contiene una secuencia de aminoácido codificada por la secuencia neuclotídica del segmento 7 del virus 1 (SEQ ID NO: 7).

13. La vacuna de ¡a reivindicación 11 , en la que el segmento del gen matriz (MA) que codifica un péptido M2 que contiene una secuencia de aminoácido amino de SEQ ID NO: 51 derivado de la cepa aislada del virus de influenza AH1/N1 de la influenza pandémica.

14. La vacuna de la reivindicación 1 , en la que el péptido M1 contiene una mutación A198P.

15. Un método para inmunizar a un paciente contra el virus de la influenza que incluye, como uno de los pasos, la administración al paciente de una vacuna de influenza de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

16. Un método para inmunizar a un paciente contra el virus de influenza hipervirulenta que incluye, como un paso, la administración al paciente de una vacuna de influenza de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

17. Un método para inmunizar a un paciente contra el virus de influenza resistente al oseltamivir, que incluye, como un paso, la administración al paciente de una vacuna de influenza de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

18. Una vacuna, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que es una vacuna de reordenamiento.

19. Una vacuna, de acuerdo con la reivindicación 18, en la que el virus de influenza reordenante se obtiene por reordenamiento clásica.

20. Una vacuna, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que es una vacuna viva atenuada o vacuna inactivada.

21. Una vacuna, según la reivindicación 20, que es formulada para administración oral o intranasal.

22. Un método de preparación de vacuna para la inmunización del individuo contra una cepa de virus de influenza hipervirulenta que incluye, como un paso, la mezcla del virus de influenza reordenante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 con un portador y de manera opcional, un adyuvante.