KR20010072556A - 바이러스의 증식 및 생육을 위한 배지 및 이를 위한 방법 - Google Patents

바이러스의 증식 및 생육을 위한 배지 및 이를 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배양된 세포 상에서 바이러스를 증식 및 생육시키기 위한 배지에 관한 것으로, 상기 배지가 인간 또는 동물 단백질을 포함하지 않고, 감자 또는 오이로부터 추출된 단백질 또는 당단백질(미토젠 능력을 가지며, 분자량 범위가 1000 내지 200,000 달톤이다) 및/또는 식물 추출물의 가수분해산물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

바이러스의 증식 및 생육을 위한 배지 및 이를 위한 방법{Medium and method for viral propagation and growth}
바이러스 백신의 제조는 상기 백신이 단순히 독소를 약화시키거나 불활성화시킨 서브유니트이거나 혹은 재조합체이거나 간에, 대규모의 바이러스 생산을 수반한다.
이러한 제조는 바이러스의 성질, 바이러스의 복제를 허용하는 각종 지지체에 따라 수행될 수 있다. 일례로, 바이러스의 증식을 시중에서 상업적으로 입수할 수 있는 대부분의 항인플루엔자 백신에 대해서 배 상태의 계란 상에서 수행하는 반면, 일부 일본 뇌염 백신에 대해서는 상기 단계를 쥐의 뇌에서 수행한다.
그러나, 이러한 지지체의 사용은 많은 문제점들을 갖는다. 예를 들어 유용성, 번식성은 있으나, 바이러스, 마이코플라스마 또는 상기 지지체로부터 기인하는 임의의 다른 바람직하지 못한 요소들로 오염될 가능성으로 인해 상기와 같은지지체를 사용하는 것은 특히 안전하지 못하다. 따라서 이러한 지지체들을 불필요한 것으로 만들려는 시도가 점점 증가하고 있으며, 가능하다면, 생산하려는 소량의 바이러스로 감염시키고 이어서 상기 감염시킨 세포의 내부에서 바이러스의 복제를 증진시킬 뿐만 아니라 하나의 세포에서 또 다른 세포로의 감염을 전파시키는 조건 하에서 유지시킨 세포 배양액을 사용한다. 이어서 생산된 바이러스를, 분기 후에 세포를 남기는 세포 내 바이러스를 포함하는 경우 세포가 담긴 배양 배지로부터 수확하거나(특히 동일한 배양 세포를 사용하여 다수의 바이러스 수확물을 얻을 수 있다는 이점을 갖는다), 또는 세포 내 바이러스를 포함하는 세포 자체를 처리함으로써 수확한다.
이러한 기법은 양질의 세포 배양액을 가질 것을 필요로 한다. 따라서, 종래의 기술들은 세포 배양액의 개선, 특히 사용된 배양 배지와 관련하여 많이 개발되어 왔다. 국제 특허 출원 제 WO 96/15231 호에 공지되어 있는 바와 같이, 마이코플라스마, 바이러스, 소의 해면형 뇌 질환제 또는 임의의 다른 통상적이지 않은 전달제에 의한 세포의 오염 위험성을 제한하기 위해서 혈청이 없고 심지어는 단백질도 없는 배양 배지를 사용함이 제안되었다. 한편으로, 프랑스 출원 제 2,732,347 호에는 동물 혈청은 없으나 식물 추출물이 함유된 세포 배양 배지의 사용이 제시되어 있다.
따라서, 세포 배양 단계에 이러한 배지를 사용함으로 인해, 상기에 의해 생성된 세포를 사용하여 수득한 생성물들의 안전성이 증가한다.
그러나, 백신 조성물의 바이러스 형성 부분의 제조에 관한 문제인 경우, 상기 세포 배양 단계에 이어지는 단계들은 그 자체가 또한 최대한의 안전성을 나타내야 한다.
구체적으로, 통상적이고도 미국 특허 제 4525349 호에 공지된 바와 같이, 배양액 중의 세포를 바이러스의 생산에 사용하는 경우, 일단 세포 배양 단계가 수행되었다면, 세포 배양에 사용된 배지는 제거되고 이어서 세포의 세척을 위해 잠시동안 세포를 담가놓을 새로운 배지로 대체되며 이 새로운 배지는 이어서 제거되는데, 이러한 세포 세척과정은 선택적으로 수회 반복될 수 있다.
이어서, 새로운 배지를 세포 배양액 내에 도입시키는데, 이는 첫째로 세포를 생존하게도 하고 바이러스에 감염되게도 하며, 둘째로는 세포가 이들 바이러스의 복제를 위한 지지체가 되기에 충분한 임의로 처분 가능한 요소들을 갖게 한다. 그러나, 문헌["베로 세포의 단백질 비함유 배양액: 인간 병원성 바이러스의 복제를 위한 기질", Cell Biology International, Vol. 17 No. 9, 1993 pp. 885-895]에 공지된 바와 같이, 세포 배양을 단백질 비 함유 배지에서 수행할 때 조차도, 상기 바이러스의 증식 및 번식 단계에 있어서 종래 기술에 사용된 배양 배지는 일반적으로 송아지 태아 혈청을 함유하거나, 또는 오염 문제를 제한하기 위해서 적어도 인간 알부민을 함유한다. 이러한 바이러스 백신의 제조 단계에서 인간 알부민을 사용하는 것은 백신의 품질에 대한 위험성을 제거하는 것으로 간주된다. 그러나, 모든 위험성의 완전한 제거를 위해서, 비록 이론적이기는 하지만, 인간 또는 동물 단백질을 재조합체의 기원으로 조차도 함유하지 않으면서, 그럼에도 불구하고 배양액중의 세포 상에서 생산되는 바이러스를 포함하는 백신의 제조 비용을 증가시키지 않기 위해서 산업적 요구에 맞는 생산 수율을 허용하는, 배양액중의 세포로 이루어진 지지체 상에서 바이러스를 증식 및 번식시키기에 적합한 배지를 갖는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 목적은 특히 이러한 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이러스의 증식 및 번식, 이어서 경우에 따라 바이러스의 불활성화 단계를 수행하기 위한 배지 및 이를 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 배양액 중의 세포 상에서, 특히 백신의 제조를 위해,바이러스를 증식 및 번식시키기 위한 배지 및 이를 위한 방법에 관한 것이다.
이러한 다양한 목적들을 성취하기 위한 본 발명의 주제는 인간 또는 동물 단백질을 재조합체의 기원으로 조차도 함유하지 않고 식물 기원의 요소들을 함유함을 특징으로 하는, 배양액 중의 세포 상에서 바이러스를 증식 및 번식시키기 위한 배지이다.
본 발명의 하나의 특징에 따라, 바이러스의 증식 및 번식용 배지는 미토젠의 능력이 있고 1000 내지 200,000 달톤의 분자량을 갖는, 감자 또는 오이로부터 추출된 단백질 또는 당단백질을 포함한다.
하나의 특정 구현예에 따라, 본 발명에 따른 배지는 식물의 가수분해산물을 포함한다.
본 발명의 하나의 특정한 특징에 따라, 상기 단백질 또는 당단백질은 감자로부터 추출된다.
본 발명의 또 다른 특징에 따라, 단백질 또는 당단백질을 다음의 방식으로 수득한다:
-식물을 세척 및 분쇄하는 단계,
-수성 배지에 희석시키는 단계,
-수득된 혼합물을 가열-응고시키는 단계,
-크로마토그래피에 의해 정제시키는 단계.
본 발명의 하나의 특징에 따라, 식물의 가수분해산물을 목화, 대두, 밀 또는 쌀과 같은 원료 물질의 화학적 및/또는 효소적 가수분해에 의해 수득한다. 퀘스트 인터내셔널(Quest International) 사에 의해 공급되는 하이펩(HyPep)TM등급의 제품, 특히 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 펩티드를 고비율로 포함하는 제품을 사용하여 특히 우수한 결과를 얻었다.
또다른 특징에 따라, 본 발명에 따른 바이러스의 증식 및 번식용 배지는 베로(Vero) 세포 상에서 바이러스를 증식시키는데 특히 적합하다.
또다른 특징에 따라, 본 발명에 따른 바이러스의 증식 및 번식용 배지는 일본 뇌염 바이러스, 소아마비 바이러스 및 광견병 바이러스의 번식에 특히 적합하다.
또한, 본 발명의 주제는 배양액 중의 세포 상에서 바이러스를 생산시키는 단계를 포함하는 바이러스 백신의 제조 방법으로, 상기 바이러스의 증식 및 번식 단계를 인간 또는 동물 단백질을 재조합체의 기원으로 조차도 함유하지 않고 식물 추출물을 함유하는 배지의 존재 하에서 수행하는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명을 다음의 설명으로부터 더욱 잘 이해하게 될 것이다.
본 발명에 따른 배지 및 방법은 세포 배양액상에서 복제가 가능한 모든 바이러스의 생산에 적합하다. 이들 바이러스는 특히 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 레오바이러스(reovirus), 피코르나바이러스(picornavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 아레나바이러스(arenavirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus) 및 아데노바이러스(adenovirus)과에 속하는 바이러스일 수 있다. 또한, 이들 바이러스는 재조합 바이러스일 수도 있다. 특히, 본 발명은 백신, 특히 안전성을 최대의 요건으로 하는 인간 백신의 조성물의 일부를 형성할 수 있는 바이러스의 생산에 적합하다. 이들은 특히 소아마비, 광견병, 일본 뇌염, 황열병, 풍진, 유행성 이하선염, 뎅그열 또는 홍역 바이러스, 각종 형태의 간염 바이러스, 에이즈 또는 수두 바이러스, 허피스바이러스, 호흡기 다핵(syncytial) 바이러스에 의해 발병된 질환의 바이러스, 세포확대 바이러스, EBV, 로타바이러스 또는 인플루엔자일 수 있다.
본 발명은 소아마비, 광견병, 일본 뇌염, 풍진, 수두, A형 간염, 인플루엔자, 뎅그열, 홍역 또는 유행성 이하선염의 원인이 되는 바이러스의 생산에 특히 이롭다.
본 발명에 따른 바이러스의 생산에 사용될 수 있는 세포는 배양액 중에서 번식할 수 있고 생산하려는 바이러스에 복제가 허용되는 모든 세포이다. 이들은특히 베로 세포, CV-1 세포, LLC-MK2 세포, MDCK 세포, MDBK 세포, WI-38 세포, MRC5 세포(인간 섬유아세포) 또는 BHK21 세포일 수 있다. 베로 세포 배양액 또는 MRC5 세포 배양액을 사용으로 특히 우수한 결과를 얻었다.
세포 배양을 통상적으로 사용되는 다양한 기법들에 따라, 세포 배양기, 롤러 병, 루(Roux) 플라스크, 멀티트레이스(Multitrays)TM, 셀-큐브스(Cell-Cubes)TM에서 수행할 수 있다. 산업상 이유로, 세포 배양을 예를 들어 사이토덱스(Cytodex)TM비이드로 이루어진 미세지지체를 사용하여 세포 배양기에서 수행하는 것이 바람직하다.
이러한 세포 배양을 다양한 조건하에서, 특히 사용되는 배지를 고려하여 수행할 수 있으며, 실제로 세포 생육 단계에 사용되는 배양 배지가 혈청 또는 적어도 인간 또는 동물 단백질을 함유하는 경우조차도 본 발명의 수행이 가능하다. 이 경우, 물론 오염 위험성의 부재에 관하여 본 발명을 수행함으로써 제공되는 이점을 상실하지 않기 위해서, 세포의 감염 전에 상기 세포를 철저하게 세척해야 할 필요가 있을 것이다. 그러나, 인간 또는 동물 기원의 단백질을 또한 함유하지 않는 세포 배양 배지를 사용하여 수득한 세포 배양액을 사용하는 것이 바람직하다.
바이러스의 접종에 의해 바이러스 감염을 수행하기 위한 최적의 순간은 사용되는 세포 및 생산되는 바이러스의 성질에 따라 가변적일 수 있다. 일반적으로는, 상기 과정을 오히려 지수 생육기의 중간 또는 끝에서 수행하며, 실제로 이러한 조건 하에서 얻어진 결과들이 특히 만족할 만한 것으로 고시되었다.
본 발명에 따라, 바이러스의 증식 및 번식 단계에 사용되는 배양 배지는 인간, 동물 또는 재조합 단백질을 함유하지 않지만, 감자 또는 오이로부터 추출된 단백질 또는 당단백질(미토젠의 능력이 있고 1000 내지 200,000 달톤의 분자량을 갖는다) 및/또는 식물 추출물의 가수분해산물을 함유하는 배지이다. 이 배지는 바이러스의 번식에 통상적으로 사용되는 요소들을 전부 또는 일부 포함할 수 있는 배지, 예를 들어 HAM F 12 배지이나, 단 예를 들어 다음의 방식으로 수득된 식물 추출물이 보충된 배지이다:
-식물 펄프의 환원 단계,
-수득된 펄프의 용매 처리 단계,
-용매 증발 단계,
-수득된 추출물을 크로마토그래피에 의해 정제시키는 단계.
본 발명의 목적에 적합한 단백질 또는 당단백질의 미토젠 능력을 특히 M.M.T. 착색 분석과 같이 세포의 생육 및 미토젠 활성을 분석하는 분석법을 사용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 목적에 적합한 식물 추출물은 특히 프랑스 특허 출원 제 2,732,347 호에 공지된 것들이다. 바이오메디아(Biomedia) 사에서 GCR1003, TCR1005 또는 BCR1008이란 상표명으로 시판되는 제품들을 또한 단독으로 또는 혼합하여 사용하거나, 또는 상기 회사에서 또한 시판되는 제품인 프로리픽스(Prolifix)(적합한 식물 추출물이 보충된 통상적인 HAM F 12 배지의 모든 영양소들을 포함한다)를 사용할 수 있다.
한편, 식물의 가수분해산물, 예를 들어 하이펩TM제품이 5 g/ℓ의 비율로 보충된 통상적인 HAM F 12 배지를 사용할 수 있다.
또한, 식물 펄프를 가열 응고시켜 수득한 단백질 또는 당단백질과, 상기 언급한 것들과 같은 식물의 가수분해산물을 모두 포함하는 배지를 사용할 수 있다.
더욱이 이들 배지에, 상기 배지의 성질 변화 없이 상기 배지를 약간 변경시킬 수 있는 것처럼, 백신의 제조 단계들 중 하나의 단계를 개선시키거나 촉진시키기에 적합한 임의의 다른 요소를 첨가할 수도 있다.
다음 실시예들은 본 발명의 구현예들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 일본 뇌염에 대한 백신의 제조
베로 세포를 사용하여 일본 뇌염의 원인이 되는 바이러스를 생산한다. 사용되는 세포는 ATCC(American Typr Culture Collection)에서 기탁번호 ATCC-CCL 81-VERO F 1415(124 번째 계대배양물(passage)이고 통상적으로는 137 번째 계대배양으로 얻어진다)로 공급되는 균주로부터 유래된 세포이다. 생산하려는 바이러스는 NVSI에서 공급되는 88 번째 계대배양물의 P3 균주의 바이러스이다.
15 ℓ의 세포 배양기 조에, 사이토덱스 1TM미세담체를 함유하고 4% 송아지 혈청이 3.5 g/ℓ의 농도로 보충된 이스코브(Iscove) 배지를 채운다. 상기 배지를 베로 세포의 접종물을 사용하여 200,000 세포/㎖의 비율로 접종한다.
배양물을 증폭시키고 일주일에 2 회 매 4 내지 5 일마다 계대배양시킨다. 얻어진 세포 농도는 2 내지 3 x 106/㎖이다. 이어서 수득된 현탁액을 최대량의 잔여 송아지 혈청을 제거하기 위해서 바이러스 증식용 배지로 세정한다.
본 발명에 따른 배지를 종래 기술의 배지와 비교 시험하기 위해서, 동일한 과정을 다수의 동일한 세포 배양기에서 다음 2 개의 상이한 배지를 사용하여 병행 수행한다:
-바이오메디아 사에서 공급되는 프로리픽스 II 배지가 보충된 HAM F 12 배지[라이프 테크놀로지스 깁코(Life Technologies Gibco)에 의해 공급됨]로 이루어진 본 발명에 따른 배지(1996 카탈로그에 지시된 농도의 10 배 농도로, 10 부피의 HAM F 12에 대해 10 배-농축된 프로리픽스 II를 1 부피의 비로 사용함),
-배지 중의 최종 알부민 농도가 0.3%가 되도록 인간 알부민을 보충시킨 이스코브 배지(라이프 테크놀로지스 깁코에 의해 공급됨)로 이루어진 종래 기술에 따른 배지.
세정 후에, 바이러스 접종물을 1/6000의 MOI(감염의 배수)에 해당하는 양으로 각각의 세포-배양기에 도입시킨다
이어서 세포 배양기의 내용물을 37 ℃의 온도에서 3 일간 계속 교반시킨 다음, 바이러스 현탁액이 되어버린 바이러스 증식용 배지(이는 각 세포 배양기에서 동일한 성질을 갖는 동량의 새로운 배지로 대체됨)를 회수함으로써 첫번째 수확을 수행하고; 이어서 5 회의 수확물이 회수될 때까지 매 24 시간마다 증식용 배지의 수확을 수행한다. 각각의 수확물들을 0.22 ㎛의 차단 한계로 필터를 통해 여과시키고 동일한 세포 배양기로부터의 4 개의 다른 수확물들과 혼합될 때까지 기다리는 동안 +5 ℃에서 보관한다.
5 회의 수확을 수행한 후에, 상기 수확물들을 함께 혼합하고, 이어서 이 혼합물을 인자 100 까지 여과에 의해 농축시킨다. 동일한 세포 배양기로부터의 5 개의 수확물로 이루어진 혼합물은 배치(batch)를 구성한다.
생성된 바이러스의 양을 측정하기 위해서, 생성된 배치 각각에 대해 감염 활성 분석을 수행한다. 상기 분석은 2 개의 상이한 방식에 의해, 즉 세포 층상에서 측정된 감염 활성에 의해, 또는 쥐 내로의 대뇌 내부 접종에 의해 쥐에서 측정된 감염 활성(동물을 14 일간 관찰하고 LD50을 계산함)에 의해 수행한다.
결과를 세포 배양기 ℓ당 감염성 입자의 Log 10으로 나타낸다. 세포상의 역가를 고려하는 경우, 본 발명에 따른 배지를 사용하여 생성된 다양한 배치에 대해 얻어진 결과들의 평균은 8.84인 반면, 종래 기술에 따른 배지를 사용하여 생성된 배지에 대해 얻어진 평균은 7.85이다. 쥐에서의 역가를 고려하는 경우, 이번에는 본 발명에 따라 생성된 배치에 대한 평균이 9.22인 반면, 종래 기술에 따른 배지를 사용하여 생성된 배치에 대한 평균은 9.30이다. 따라서, 뜻밖에도 본 발명에 따른 배지를 사용하여 얻어진 결과가 종래 기술의 배지를 사용하여 얻어진 결과와 동일한 반면, 세포 내 영양소의 운반에 중요한 역할을 하는 것으로 간주되는 단백질인 알부민이 결핍된 결과 생성된 바이러스 양의 상당한 감소가 예상되는 것으로 나타났다.
이어서 수득된 배치들에 포름알데히드 용액을 혼합물 중의 최종 농도가1/4000이 되는 양으로 가함으로써 상기 배치들을 불활성화시키고 실온에서 14 일간 계속해서 교반한다. WHO에 의해 권장되는 프로토콜[기술 공보 771, 1988년]에 따른 대조군을 사용하여 불활성화를 확인한 결과, 생성된 배치들은 상기 WHO 권장사항에 부합하는 것으로 나타났다.
이어서 이들 불활성화된 배치를 상기 배치들로부터 백신에 바람직하지 않은 모든 바이러스성 단백질과 잔여 불순물들을 제거하기 위해서 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 투과에 의해 정제시킨다. 이어서 수득된 혼합물을 제형화하여 백신 투여량을 얻는다. 생성된 백신의 우수한 품질은 쥐에서 면역원성의 분석에 의해 확인되었으며, 상기 분석은 WHO에 의해 일본 뇌염 백신에 권장되고, 면역시킨 쥐에 의해 생성된 항체를 중화시키는 양을 측정하는 것으로 이루어진다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 백신의 활성은 종래 기술의 백신 활성보다 낮지 않으며, 이는 본 발명에 따른 배지 및 방법을 사용하여 알부민의 사용을 불필요하게 함으로써 안전성이 증가된 조건하에서 바이러스 백신의 제조가 가능함을 입증시켜 준다.
실시예 2: 본 발명에 따른 다양한 배지들의 비교
다양한 배지들을 비교 시험하기 위해서, 150-㎤의 플라스크를 사용하고, 이를 4% 송아지 혈청이 보충된 이스코브 배지 50 ㎖로 채운다. 이 배지를 베로 세포 접종물을 사용하여 250,000 세포/㎠의 비율로 접종시킨다. 상기 플라스크를 37 ℃에서 4 내지 5 일간 방치시킨 다음 바이러스의 번식 및 증식용 배지를사용하여 세정한다.
사용된 배지는 다음과 같다:
-배지 A: 배지 중의 최종 알부민 농도가 0.3%가 되도록 인간 알부민을 보충시킨 이스코브 배지(라이프 테크놀로지스 깁코에 의해 공급됨)로 이루어진, 종래 기술에 따른 배지,
-배지 B: 다음의 미토젠 분자들을 보충시킨 HAM F 12 배지로 이루어진 배지:
* 10-3g/ℓ 비율의 BCR 1008
* 10-4g/ℓ 비율의 TCR 1005
* 10-4g/ℓ 비율의 GCR 1003
-배지 C: 상기 언급한 배지(BCR 1008, TCR 1005 및 GCR 1003을 보충시킨 HAM F 12 배지)로 이루어졌으나, 퀘스텔(Questel) 인터내셔널사에 의해 공급된 글루텐 가수분해산물로 이루어진 하이펩 4602 제품 1 g/ℓ를 또한 포함하는 배지,
-배지 C': 하이펩 4602의 농도가 5 g/ℓ임을 제외하고 상기 배지 C와 동일한 배지,
-배지 D: 하이펩 4602를 1 g/ℓ로 보충시킨 HAM F 12 배지로 이루어졌으나, 미토젠 분자 BCR 1008, TCR 1005 또는 GCR 1003이 부족한 배지,
-배지 D': 하이펩 4602의 농도가 5 g/ℓ임을 제외하고 상기 배지 D와 동일한 배지.
세정 후에, 상기 실시예 1과 동일한 일본 뇌염 바이러스 접종물을 각각의 플라스크에 1/6000의 MOI에 해당하는 양으로 도입시킨다.
이어서 상기 플라스크 중의 내용물을 37 ℃에서 3 일간 유지시킨 후에, 첫 번째 수확을 실시한다. 후속의 수확들을 상기 실시예 1에 설명한 바와 동일한 방식으로 수행한다.
감염 역가를 측정하기 위한 분석을 BHK21 세포상에서 수행하고 다음의 결과를 얻는다(TCID50/㎖(Log 10)로 나타냄):
배지 A : 4.6
배지 B : 5.1
배지 C : 5.0
배지 C': 5.6
배지 D : 5.4
배지 D': 6.3.
이러한 결과는 본 발명에 따른 배지가 알부민을 함유하는 종래 기술에 따른 배지만큼(보다 우수하지는 않더라도) 우수한 수율을 얻을 수 있게 함을 입증한다.
실시예 3: 광견병 백신에 대한 제조
베로 세포 배양액을 통상적인 배지에서 2 ℓ세포 배양기에서 제조하고, 세척한 후에 세포를 광견병 바이러스를 사용하여 1/1000의 MOI로 감염시킨 다음, 상기 실시예 1에 설명한 배지와 동일한 배지[즉, 프로필릭스(Profilix)TMII를 보충시킨HAM F 12 배지]에서 유지시키고; 동일한 실험을 동일한 부피의 또 다른 세포 배양기에서 전체적으로 동일한 방식으로 수행한다. 유일한 차이는 인간 알부민을 포함하는 종래 기술의 바이러스 증식 및 번식용 배지를 사용하는 것이다. 수확을 감염 후 연속적으로 4, 5, 6 및 7 일째에 수행한다. 본 발명에 따른 배지를 사용하여 수득한 수확물과 종래 기술에 따른 배지를 사용하여 수득한 수확물을 계산하여 상기 두 배지에 대한 비교 결과를 얻을 수 있었으며; 유사하게, 얻어진 바이러스의 감염 역가는 동일하였다.
따라서 상기 결과는 세포상에서 광견병에 대한 바이러스를 생산할 수 있음을 입증한다.
실시예 4: 소아마비 백신에 대한 제조
배양액 중의 베로 세포상에서 1 형 소아마비 바이러스의 생산에 대한 시험을 수행하였다. 상기 실시예 1에 섦명한 조성물을 갖는 본 발명에 따른 바이러스의 증식 및 번식용 배지를 사용하여 얻어진 바이러스의 감염 역가는 시중에서 상업적으로 입수할 수 있는 백신의 제조에 사용된 배지를 사용하여 수행된 수확으로 얻어진 감염 역가의 평균과 동일하였다.

Claims (10)

  1. 재조합체의 기원으로 조차도 인간 또는 동물 단백질을 함유하지 않고, 식물 추출물을 함유하는 것임을 특징으로 하는 배양액 중의 세포 상에서 바이러스를 증식 및 번식시키기 위한 배지.
  2. 제 1 항에 있어서, 감자 또는 오이로부터 추출된 미토젠성(mitogenic) 단백질 또는 당단백질(glycoprotein)을 함유하는 것임을 특징으로 하는 배지.
  3. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 또는 당단백질은 감자 또는 오이 펄프(pulp)의 환원 단계, 상기 펄프의 용매 처리 단계, 가열-응고에 의한 처리 단계, 크로마토그래피에 의한 정제 단계에 의해 수득된 것임을 특징으로 하는 배지.
  4. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 추출물의 가수분해산물을 함유하는 것임을 특징으로 하는 배지.
  5. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스의 증식 및 번식을 위한 지지체로 사용된 세포가 베로(Vero) 세포인 것임을 특징으로 하는 배지.
  6. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 생산된 바이러스가 일본 뇌염, 광견병, 소아마비, A형 간염, 인플루엔자, 뎅그열, 홍역, 유행성 이하선염, 수두 및 풍진 바이러스인 것임을 특징으로 하는 배지.
  7. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 생산된 바이러스가 인간 백신용 일본 뇌염 바이러스인 것임을 특징으로 하는 배지.
  8. 재조합체의 기원으로 조차도 인간 또는 동물 단백질을 함유하지 않지만 식물 추출물을 함유하는 배지에서 바이러스의 증식 및 번식 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 배양액 중의 세포 상에서 바이러스를 생산하는 단계가 포함되는 바이러스 백신의 제조방법.
  9. 상기 청구항에 있어서, 상기 바이러스의 증식 및 번식을 위한 배지는, 감자 또는 오이로부터 추출된 것으로 미토젠 능력이 있고 1000 내지 200,000 달톤의 분자량을 갖는 단백질 또는 당단백질을 함유하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항 또는 9 항에 있어서, 바이러스의 증식 및 번식을 위한 배지는 식물의 가수분해산물을 함유하는 것임을 특징으로 하는 방법.
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