CN1301297A - 用于病毒繁殖和增殖的培养基和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于病毒的繁殖和增殖的培养基,其特征在于,它不含有人或动物蛋白,且它含有提取自马铃薯或黄瓜的具有促有丝分裂能力的蛋白或糖蛋白,其分子量为1000至200000道尔顿和/或植物提取物的水解产物。

Description

用于病毒繁殖和增殖的培养基和方法
本发明涉及一种用于在培养物中的细胞上进行病毒繁殖和增殖的培养基和方法、特别涉及用于产生疫苗的培养基和方法。
生产病毒疫苗，无论它们是单纯减毒、失活的亚单位还是重组体均包括大规模病毒的生产。
可以根据病毒的性质，在允许病毒复制的各种载体中，进行这种生产，因此，例如，对于大多数目前可商购的抗流感疫苗来说，在胚化鸡蛋上进行病毒增殖，而对于某些抗日本脑炎的疫苗来说，在小鼠脑上进行该步骤。
然而，这类载体的应用有许多问题：有效性、重复性、且特别是由病毒、支原体或来源于所述载体的任何其它不需要成分的可能的污染所导致的安全性问题。由此愈加进行各种尝试以便用这类载体来配制药品，且如果可能，可使用细胞培养物，所述培养物被欲生产的少量病毒感染然后被维持在可促进感染细胞内病毒复制以及使感染在细胞间扩散的条件下。接着当培养基中含有在出芽后离开细胞的(特别具有使得用相同培养细胞进行几次病毒收集成为可能的优点)胞内病毒时，从浸有细胞的所述培养基中收集所产生的病毒；或当细胞中含有胞内病毒时通过处理细胞自身而从所述培养基中收集所产生的病毒。
这些技术要求拥有良好质量的细胞培养物；现有技术中的许多开发研究由此涉及改进细胞培养物且特别是改进所用的培养基。为了限制由支原体、病毒、牛海绵状脑病致病因子或任何其它非常规传染因子污染细胞所导致的危害，正如专利申请WO 96/15231中所述。已经提出使用不含血清且甚至不含蛋白质的培养基，另一方面，法国专利申请FR 2,732,347中提出了使用不含动物血清而含有植物提取物的细胞培养基。
因此，由于将这类培养基用于细胞培养步骤，所以使用由此产生的细胞所获得的产品的安全性得到了提高。
然而，当生产形成疫苗组合物的一部分的病毒是首要问题时，对于这种细胞培养期来说是连续的步骤自身也应表现出最大程度的安全性。
具体地说，通常且如美国专利4525349中所述，当将培养物中的细胞用于生产病毒时，一旦已经进行到细胞培养期，则除去用于细胞培养的培养基，然后用一种新的培养基取代，在所述的新培养基中将细胞浸没片刻以便进行洗涤；接着除去这种新培养基；可以将这种细胞洗涤程序任意重复一定的次数。
接下来，将新培养基引入细胞培养物，该步骤使得细胞首先能存活下来并被病毒感染，且随后使细胞带有足以成为这些病毒复制的载体的处理成分。然而，正如论文“Vero细胞的不含蛋白质的培养物：用作人病原体病毒复制的底物”中所述(Cell国际细胞生物学，Vol.17 No.9,1993,pp.885-895)，甚至当在不含蛋白质的培养基中进行细胞培养时，现有技术在这种病毒增殖和繁殖步骤中所用的培养基中通常含有胎牛血清或至少是人清蛋白以限制污染问题。人们认为在制备病毒疫苗之方法的该步骤中使用人清蛋白对疫苗的质量没有危险。然而，为了完全消除所有的危险(甚至在理论上)，需要拥有一种适于病毒在由培养物中的细胞组成的载体上繁殖和增殖的培养基，它不含人或动物蛋白、甚至不含重组体来源的蛋白质，而依然具有与工业化需求相适应的产量以便不会增加生产疫苗的成本，所述疫苗含有在培养物中细胞上产生的病毒。
本发明的目的特别是提供这样一种培养基。
本发明的另一个目的是提供一种用于病毒繁殖和增殖然后在需要时进行使病毒失活步骤的培养基和方法。
为了达到这些目的，本发明的主题是一种用于在培养物中细胞上进行病毒繁殖和增殖的培养基，其特征在于它不含人或动物蛋白、甚至不含重组体来源的人或动物的蛋白质，因此它含有来源于植物的成分。
根据本发明的一个特征，用于病毒繁殖和增殖的培养基中含有提取自马铃薯或黄瓜的蛋白质或糖蛋白，它们具有促有丝分裂潜能且具有1000-200,000道尔顿的分子量。
根据一个特定的实施方案，本发明的培养基中包括植物水解产物。
根据本发明的一个特殊的特征，所述的蛋白质或糖蛋白提取自马铃薯。
根据本发明的另一个特征，所述的蛋白质或糖蛋白通过下列方式获得：
-洗涤并粉碎植物；
-在含水介质中稀释；
-对所获得的混合物进行热凝结；
-通过层析法纯化。
根据本发明的一个特征，通过化学和/或酶促方式水解原料诸如棉花、大豆、小麦或稻米来获得所述的植物水解产物。使用由QuestInternatinal公司提供的HyPepTM系列产品、特别是使用含有高比例的分子量小于1000道尔顿的肽类产品已经获得了特别良好的结果。
根据另一个特征，本发明用于病毒繁殖和增殖的培养基特别适合于在Vero细胞上进行病毒增殖。
根据另一个特征，本发明用于病毒繁殖和增殖的培养基特别适合于繁殖日本脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒和狂犬病病毒。
本发明的主题还是一种用于制备病毒疫苗的方法，该方法包括在培养物中细胞上产生病毒的步骤，其特征在于在存在有不含人或动物蛋白、甚至不含重组体来源的人或动物蛋白质而含有植物提取物的培养基的情况下进行病毒繁殖和增殖的步骤。
通过阅读下列描述会更好地理解本发明。
本发明的培养基和方法适合于生产能够在细胞培养物上复制的所有病毒。它们特别可以是属于下列类别的病毒：正粘病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小核糖核酸病毒、黄病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、痘病毒和腺病毒。它们还可以是重组体病毒。特别地，本发明特别适合于生产可以形成疫苗组合物之一部分、且特别是对安全性有最高要求的人体疫苗组合物之一部分的病毒。它们特别是脊髓灰质炎、狂犬病、日本脑炎、黄热病、风疹、流行性腮腺炎、登革热或麻疹的病毒、各种形式肝炎的病毒、AIDS或水痘的病毒、疱疹病毒、由呼吸道合胞病毒所导致的疾病的病毒、巨细胞病毒、EBV、轮状病毒或流感病毒。
本发明特别有利于生产可导致脊髓灰质炎、狂犬病、日本脑炎、风疹、水痘、甲型肝炎、流感、登革热、麻疹或流行性腮腺炎的病毒。
可以用于本发明病毒生产的细胞是可以在培养物中倍增并允许需要被生产的病毒透入的所有细胞。它们特别可以是Vero细胞、CV-1细胞、LLC-MK2细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、WI-38细胞、MRC5细胞(人成纤维细胞)或BHK21细胞。使用Vero细胞培养物或MRC5细胞培养物已经获得了特别良好的结果。
可以根据通常使用的不同技术在细胞培养箱中、摇瓶中、Roux培养瓶中、MultitraysTM中、Cell-CubesTM中来进行细胞培养。由于工业化的原因，优选使用由例如CytodexTM珠组成的微载体在细胞培养箱中进行细胞培养。
可以在不同条件下特别是根据所用的培养基来进行这种细胞培养；尽管用于细胞生长期的培养基中含有血清或至少含有人或动物蛋白，但实际上能够完成本发明；当然，在这种情况中，必须在细胞被感染前对其进行彻底地洗涤，以便不会失去由于不存在污染危险而完成本发明所产生的优点。然而，应用使用不含人或动物来源的蛋白质的细胞培养基获得的细胞培养物是优选的。
根据所用细胞和所生产病毒的性质，使用病毒接种物进行病毒感染的最合适的时机可以改变。一般来说，该步骤是在指数生长期的中期或在其结束时进行；实际上已经注意到在这些条件下获得的结果特别令人满意。
根据本发明，用于病毒繁殖和增殖步骤的培养基是一种不含人、动物或重组体蛋白质而含有提取自马铃薯或黄瓜的具有促分裂潜能并具有1000-200,000道尔顿分子量的蛋白质或糖蛋白和/或植物提取物水解产物的培养基。这种培养基是一种可以含有通常用于病毒增殖的所有或部分成分的培养基，诸如HAM F 12培养基，不过其中要添加用例如下列步骤得到的植物提取物：
-磨碎植物的果肉；
-用一种溶剂处理所获得的果肉；
-蒸发溶剂；
-通过层析法纯化所获得的提取物。
特别可以使用分析细胞生长和促分裂活性的试验诸如M.T.T.着色试验来评估适合于本发明目的的蛋白质或糖蛋白的促分裂潜能。
适合于本发明目的的植物提取物特别是那些描述于专利申请FR2,732,347中的物质。还可以单独或以混合方式使用由Biomedia公司销售的名称为GCR1003、TCR1005或BCR1008的产品；或也可使用由该公司销售的产品Prolifix，该产品包括添加有合适的植物提取物的常规HAM F 12培养基中的所有营养成分。
另一方面，能够使用添加有5g/l比例的植物水解产物诸如HyPepTM产品的常规HAM F 12培养基。
还能够使用包括通过热凝结诸如如上所述的那些植物果肉和植物水解产物获得的蛋白质或糖蛋白的培养基。
此外，能够向这些培养基中添加能够改进或有利于导致疫苗产生的步骤之一的任何其它成分，此时能够轻度改进该培养基而不会改变其特性。
下列实施例用来解释而非限制本发明的实施方案。
实施例1：抗日本脑炎之疫苗的生产
将Vero细胞用于生产可导致日本脑炎的病毒。所用的细胞是来源于由ATCC(美国典型培养物保藏中心)保藏号为ATCC-CCL 81-VEROF 1415所指定细胞株的细胞，它已传代至第124代且按照常规方式将它传代至第137代。需要被生产的病毒是由NVSI提供的处于第88代的P3细胞株的病毒。
使15升细胞培养箱中的储存器充满含有3.5g/l浓度的Cytodex1TM微载体并添加有4％小牛血清的Iscove培养基。给该培养基接种200,000个细胞/ml比例的Vero细胞接种物。
将该培养物每隔4-5天一周两次进行扩增并传代培养。所获得的细胞浓度为2-3×106/ml。然后为了除去最大量的残余小牛血清而用病毒繁殖用培养基冲洗所获得的细胞悬浮液。
为了对本发明的培养基与现有技术的培养基进行比较试验，使用2种不同的培养基在几种相同细胞培养箱中平行进行相同的步骤，所述的培养基如下：
-由添加有由Biomedia公司提供的ProlifixⅡ培养基的HAM F12培养基(由Life Technilogies Gibco提供)组成的本发明培养基，其中ProlifixⅡ的浓度10倍于1996年目录中所示的浓度，添加比例为每10个体积的HAM F 12中有1个体积10倍浓缩的ProlifixⅡ。
-由添加有人清蛋白以便培养基中最终清蛋白浓度为0.3％的Iscove培养基(由Life Technilogies Gibco提供)组成的现有技术的培养基。
在冲洗后，将病毒接种物以相当于MOI(感染复数)为1/6000的量导入各个细胞培养箱。
然后将细胞培养箱中的内容物在37℃下持续搅拌3天并通过回收病毒繁殖用培养基来进行第一次收集，所述的培养基已经变成了病毒悬浮液，用等量的相同性质的新鲜培养基替换各细胞培养箱中已耗尽的培养基；接着每隔24小时进行一次繁殖用培养基的收集，直到回收了5次收集物为止。使各次收集物通过截断阈值为0.22μm的滤器并将其储存在+5℃下，同时等待与来自相同细胞培养箱的4次其它收集物混合。
当已经进行5次收集时，它们彼此混合且然后通过过滤浓缩100倍。由来自相同细胞培养箱的5次收集物组成的混合物构成一批产品。
为了测定所生产的病毒的量，对所产生的各批量病毒进行感染活性检测试验。所述的检测试验以2种不同的方式来进行：通过测定细胞层上的感染活性；或通过对小鼠进行大脑内接种、观察动物14天并计算LD50而在小鼠中测定的感染活性。
将结果表示为每升细胞培养箱中感染颗粒的Log 10。当考虑对细胞进行滴定时，使用本发明培养基生产的不同批量病毒获得的结果的平均值为8.84，而使用现有技术的培养基生产的批量病毒获得结果的平均值为7.85。如果考虑在小鼠中滴定，那么这一次按照本发明生产的批量病毒的平均值为9.22，而使用现有技术的培养基生产的批量病毒的平均值为9.30。由此令人意外地观察到使用本发明培养基获得的结果与使用现有技术的培养基获得的结果相当，而被认为对在细胞内运输营养成分起重要作用的蛋白质即清蛋白不足的结果预计会显著降低所生产的病毒的量。
接着通过使混合物中的终浓度为1/4000的量添加甲醛溶液来使所获得的批量病毒失活并将其维持在室温下连续搅拌14天。通过由WHO推荐的技术方案(来自1988年的Technical Bulletin 771)的对照组验证的失活情况表明所生产的批量病毒遵循了WHO的推荐技术。
然后通过离子交换层析法并通过凝聚过滤法来纯化这些失活的批量病毒以便从中除去疫苗中不需要的所有的病毒蛋白质和残余的杂质。接着配制所获得的混合物以便进行疫苗剂量的生产。使用由WHO推荐的用于抗日本脑炎疫苗的小鼠免疫原性试验和主要在于测定由免疫化小鼠产生的中和性抗体的量的检测试验来验证所生产的疫苗的良好质量。由于按照本发明方法生产的疫苗的活性不低于现有技术的疫苗的活性，所以这证明使用本发明的培养基和和方法能够在通过用清蛋白配制而提高安全性的条件下生产病毒疫苗。
实施例2：本发明不同培养基的比较
为了对各种培养基进行对比试验，使用充满50ml添加有4％小牛血清的Iscove培养基的150-cm2培养瓶。以250,000个细胞/cm2的比例给该培养基接种Vero细胞接种物。在37℃下将培养瓶保持4-5天且然后用病毒增殖和繁殖用培养基冲洗。
所用的培养基如下：
-培养基A，它是一种现有技术的培养基，由添加有人清蛋白的Iscove培养基(由Life Technologies Gibco提供)组成，从而使所述培养基中的最终清蛋白浓度为0.3％；
-培养基B，它由添加有下列促分裂分子的HAM F 12培养基组成：
★10-3g/l比例的BCR1008
★10-4g/l比例的TCR1005
★10-4g/l比例的GCR1003；
-培养基C，它由上述培养基(添加有BCR1008、TCR1005和GCR1003的HAM F 12)组成、而且还含有QuestelInternatinal公司提供的由谷蛋白水解产物组成的1g/l的HyPep4602产品；
-培养基C’，它与培养基C相同，不过其中的HyPep 4602的浓度为5g/l；
-培养基D，它由添加有1g/l比例的HyPep 4602的HAM F 12培养基组成，不过其中缺乏促分裂分子BCR1008、TCR1005和GCR1003；
-培养基D’，它与培养基D相同，不过其中的HyPep 4602的浓度为5g/l。
冲洗后，以相当于MOI为1/6000的量将与上述实施例相同的日本脑炎病毒接种物导入各培养瓶中。
在进行第一次收集前，在37℃下将培养瓶中的内容物维持3天。按照与上述实施例中所述相同的方式进行随后的收集。
用于测定感染滴度的检测试验在BHK21细胞上进行并得到下列结果，将它们表示为TCID50/ml(Log 10)：
培养基A:4.6
培养基B:5.1
培养基C:5.0
培养基C’:5.6
培养基D:5.4
培养基D’:6.3。
这些结果证明本发明的培养基使得获得实际上等于(如果不优于)含有清蛋白的现有技术的培养基的产量成为可能。
实施例3：抗狂犬病疫苗的生产
在2-1细胞培养箱中的常规培养基内制备Vero细胞培养物且在洗涤后用1/1000MOI的狂犬病病毒感染所述的细胞并将其维持在与实施例1中所述相同的培养基中(即添加有ProfilixTMⅡ的HAM F 12培养基)；按照一种完全相同的方式在另一个相同体积的细胞培养箱中进行相同的实验，唯一的区别在于使用了包括人清蛋白的现有技术的病毒繁殖和增殖用培养基。在感染后连续进行4、5、6和7天的收集。对使用本发明培养基获得的收集物和对使用现有技术培养基获得的收集物进行计数使得能够获得将两种培养基进行比较的结果；类似地，所获得的病毒感染滴度是等同的。
这些结果由此证明了在细胞上生产抗狂犬病病毒的可能性。
实施例4：抗脊髓灰质炎疫苗的生产
在培养物中的Vero细胞上进行1型脊髓灰质炎病毒生产的试验。使用具有实施例1中所述组成的本发明病毒繁殖和增殖用培养基获得的病毒感染滴度等同于使用用于制备目前商购疫苗的培养基进行收集所获得的感染滴度。

Claims (10)

1．用于在培养物中细胞上繁殖和增殖病毒的培养基，其特征在于它不含人和动物蛋白、甚至不含重组体来源的人或动物蛋白质；还在于它含有植物提取物。
2．根据权利要求1所述的培养基，其特征在于它含有提取自马铃薯或黄瓜的促有丝分裂蛋白或糖蛋白。
3．根据上述权利要求之一所述的培养基，其特征在于所述的蛋白质或糖蛋白通过下列方式获得：
■磨碎马铃薯或黄瓜的果肉；
■用一种溶剂处理所述的果肉；
■通过热凝结法处理；
■通过层析法纯化。
4．根据上述权利要求之一所述的培养基，其特征在于它含有植物提取物的水解产物。
5．根据上述权利要求之一所述的培养基，其特征在于所述用于承载病毒繁殖和增殖的细胞是Vero细胞。
6．根据上述权利要求之一所述的培养基，其特征在于所生产的病毒是日本脑炎、狂犬病、脊髓灰质炎、甲型肝炎、流感、登革热、麻疹、流行性腮腺炎、水痘和风疹的病毒。
7．根据上述权利要求之一所述的培养基，其特征在于所产生的病毒是用于人体疫苗的日本脑炎病毒。
8．包括在培养物中细胞上进行病毒生产步骤的制备病毒疫苗的方法，其特征在于在不含人或动物蛋白、甚至不含重组来源的人或动物蛋白而含有植物提取物的培养基中进行所述病毒繁殖和增殖的步骤。
9．根据上述权利要求所述的方法，其特征在于用于病毒繁殖和增殖的培养基中包括提取自马铃薯或黄瓜的蛋白质或糖蛋白，它们具有促有丝分裂潜能并具有1000-200,000道尔顿的分子量。
10．根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于用于病毒繁殖和增殖的培养基中包括植物水解产物。
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