CN107043739A - 一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法 - Google Patents

一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法 Download PDF

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Abstract

一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法，属于兽用生物制品技术领域。该细胞培养液每1000ml PBS溶液中含有以下组分：龟板提取物1‑20 mg、枸杞多糖5‑20 mg、云芝多糖2‑20 mg、亚硒酸钠0.1‑1 mg、胰岛素生长因子1‑20 ug。本发明具有以下有益效果：本发明所使用的Vero细胞培养液添加剂，大大减少了血清的使用量，降低了细胞培养的成本；提高Vero细胞生长速度；增强IBDV对Vero细胞的敏感性，提高了TCID50含量；由本发明所使用的Vero细胞培养液还可以大幅度提高鸡传染性法氏囊活疫苗免疫原性。

Description

一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法。
背景技术
非洲绿猴肾细胞系 Vero细胞为全球认可的生产人用及动物用疫苗的细胞基质，基于其对多种病毒敏感的特性，Vero 细胞的规模化培养技术在病毒性疫苗、重组蛋白、单克隆抗体等生产技术平台中具有重要的价值。
鸡传染性法氏囊病（infectious bursal ,IBD）是由鸡传染性法氏囊病毒（infectious bursal virus,IBDV）引起的一种烈性传染病，该病主要通过疫苗来防控，疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程，鸡传染性法氏囊疫苗通常是大规模培养细胞收获病毒液，但目前多采用含血清的培养基培养细胞，血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度；从病毒疫苗的安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患。
由使用血清所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。无血清培养基具有诸多优势：简化下游目的产物的分离纯化、节约成本；避免血清批次间的差异巧性，提高细胞培养的稳定性及结果的可靠性；避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染；无血清培养基由于添加成分相对确定，可用于研究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种Vero细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法的技术方案。
所述的一种Vero细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：龟板提取物1-20 mg、枸杞多糖5-20 mg、云芝多糖2-20 mg、亚硒酸钠0.1-1 mg、胰岛素生长因子1-20 ug。
所述的一种Vero细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：龟板提取物5-15 mg、枸杞多糖8-16 mg、云芝多糖4-16 mg、亚硒酸钠0.2-0.8mg、胰岛素生长因子5-15 ug。
所述的一种Vero细胞培养液添加剂的制备方法，其特征在于将所述重量配比的组分混合后，加入到PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，即得。
所述的一种Vero细胞培养液添加剂的使用方法，其特征在于按药物混合液：DMEM重量比=1:1~1:3将两者充分混合后使用。
本发明中龟板提取物购买于：安徽远徽药业有限公司 ；枸杞多糖购买于：荆州金海药业有限公司；云芝多糖购买于：武汉福鑫化工有限公司；亚硒酸钠购买于：河南博特尔化工产品有限公司；胰岛素生长因子购买于：Sigma 。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所制备的Vero细胞培养液添加剂，可替代血清，大幅度降低生产成本，保证了疫苗的质量和安全性。
2、本发明所制备的Vero细胞培养液添加剂，可以大大提高细胞的生长速度。
3、本发明所制备的Vero细胞培养液添加剂，可以促进鸡传染性法氏囊病毒对Vero细胞的感染敏感性，提高其病毒含量，从而提高鸡传染性法氏囊活疫苗的免疫原性。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：培养液添加剂的制备
龟板提取物：1 mg (购买于：安徽远徽药业有限公司 )
枸杞多糖：5 mg （购买于：荆州金海药业有限公司）
云芝多糖：2 mg (购买于：武汉福鑫化工有限公司)
亚硒酸钠：0.1mg (购买于：河南博特尔化工产品有限公司)
胰岛素生长因子：1ug (购买于：Sigma )
将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM =1:1制备一种Vero细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
实施例2：培养液添加剂的制备
龟板提取物：8 mg (购买于：安徽远徽药业有限公司 )
枸杞多糖：15 mg （购买于：荆州金海药业有限公司）
云芝多糖：8 mg (购买于：武汉福鑫化工有限公司)
亚硒酸钠：0.5 mg (购买于：河南博特尔化工产品有限公司)
胰岛素生长因子：8 ug (购买于：Sigma )
将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM =1:2制备一种Vero细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
实施例3：培养液添加剂的制备
龟板提取物： 20 mg (购买于：安徽远徽药业有限公司 )
枸杞多糖： 20 mg （购买于：荆州金海药业有限公司）
云芝多糖： 20 mg (购买于：武汉福鑫化工有限公司)
亚硒酸钠：1 mg (购买于：河南博特尔化工产品有限公司)
胰岛素生长因子： 20ug (购买于：Sigma )
将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM=1：3制备一种Vero细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
试验例1 本发明培养液添加剂的应用
1材料
1.1 Vero细胞培养液添加剂
按本发明实施例1-3制得
1.2 DMEM基础培养基、胎牛血清 购于GIBCO公司，
硫乙醇酸盐培养基(TG)、胰酪蛋白胨培养基（TSB）购于北京中海生物科技有限公司
1.3 Vero细胞 购于ATCC，由浙江美保龙生物技术有限公司保存
1.4 鸡传染性法氏囊病毒（D78株/B87株）， 购于中国兽医药品监察所
1.5 试验动物 14日龄SPF鸡60只，购于青岛易邦生物技术有限公司实验动物中心
2 方法
2.1 培养基检验
2.1.1 无菌检验
将实施例1-3制备的Vero细胞培养液添加剂，各取3个不同批次进行无菌检验，每个批次分别取1ml接种于2支50ml TG大管中，1支置于35-37℃培养，1支置于23-25℃培养，3d后各吸取培养物分别接种于10个 TG小管，再分别置于35-37℃和23-25℃培养，另外每个批次分别取0.2ml接种于TSB小管内，置于23-25℃培养，同时做阴性对照，均培养7日，观察结果。
2.1.2 内毒素测定
将实施例1-3制备的Vero细胞培养液添加剂，各取3个不同批次进行内毒素检验，每个批次分别取1.7ml用鲎试剂盒分别进行检测，用酶标仪选择波长405nm测其OD值，同时做阴性对照。
2.2 细胞生长速度测定
由实施例1-3使用的Vero细胞培养液添加剂，以及含8%、10%胎牛血清的Vero完全培养液分别将已消化好的Vero细胞，稀释成3*104个/ml的细胞密度接种于24 孔培养板，每孔培养液体积为 2mL，每种培养基接种 1块 24 孔培养板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养 2d后，用 0.25%(w/v) 的胰蛋白酶溶液消化用不同培养液培养的Vero细胞细胞各 4 个培养孔，用 Cedex AS-20 细胞密度和活力自动分析仪计数细胞密度和活力。
2.3 病毒培养
用DMEM基础培养基将鸡传染性法氏囊病毒（D78株/B87株）稀释成1500 TCID50/ml，分别接种于由2.2培养的5种细胞中，分别置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养96 h 之后进行收毒。
2.4 TCID50测定
分别将由实施例1-3制备的Vero细胞培养液添加剂培养的细胞、含8%、10%FBS的VERO培养液培养的细胞，均稀释成105～106 个/m L，按 0. 2 m L /孔转入96孔培养板中，置于37℃，5%的培养箱中培养2d，弃掉培养液上清，将2.3收获的鸡传染性法氏囊病毒（D78株/B87株）分别用DMEM基础培养基作连续10倍稀释 ，按0.2 mL /孔接种，置于37℃，5%的培养箱中培养4d，每天观察细胞病变并记录，按Reed-Muench 法计算TCID50。
2.5 免疫原性测定
将2.3收获的五种病毒液经检验合格，加入佐剂后制作成疫苗成品测定疫苗的免疫原性。将60只14日龄的SPF鸡共分为6组，每组10只，第Ⅰ组采用经本发明实施例1制备的培养液添加剂，用于培养Vero细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫；第Ⅱ组采用经本发明实施例2制备的培养液添加剂，用于培养Vero细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫；第Ⅲ组采用经本发明实施例3制备的培养液添加剂，用于培养Vero细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫；第Ⅳ组采用含10%FBS培养基，用于培养Vero细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫；第Ⅴ组采用含8%FBS培养基，用于培养Vero细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫。第Ⅳ组，疫苗对照组，不进行免疫。各组均在免疫后第7d、14 d 、21d、28d、35 d、45d、49d分别翅静脉采血并分离血清，用ELISA方法进行测定IBDV的抗体水平。
由2.2培养的5种细胞在培养鸡传染性法氏囊病毒的同时，我们又试着培养犬瘟热病毒（CDV）， 经加工处理后制成的疫苗，对45日龄的犬只进行免疫，同时设疫苗对照组，分别在60、75 日龄对试验犬进行前肢静脉采血，离心，制备血清，采用血清微量中和试验测定血清中CDV 抗体效价。
3.1 检验结果
表1 无菌检验结果
表2 内毒素检验结果（405nm）
由表1、表2可以看出，由实施例1、2、3制备的不同批次的培养基添加剂均既无菌生长又不含内毒素，该方法制备的培养基添加剂安全可靠。
3.2 细胞密度及活力测定
表3 细胞密度测定结果
由表3可以看出，由实施例1、2、3制备的培养基添加剂培养的Vero细胞密度明显大于含FBS培养基培养的Vero细胞。
表4 细胞活率测定结果
由表4可以看出，在相同的培养时间内，由实施例1、2、3制备的培养基添加剂培养的Vero细胞存活率明显大于由含FBS培养基培养的Vero细胞。
3.3 TCID50测定结果
表5 TCID50测定结果
由表5可以看出，由实施例1、2、3制备的培养基添加剂培养的Vero细胞比由含FBS培养基培养的Vero细胞更有利于IBDV的繁殖，敏感性更强。
3.4 免疫原性测定结果
表6 IBDV的抗体水平测定结果
由表6可以看出，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的抗体水平明显高于Ⅳ、Ⅴ组，由实施例1、2、3制备的添加剂培养的IBDV加工制成的疫苗产生的抗体水平高于含FBS培养基培养的IBDV加工制成的疫苗。
表7 60日龄CDV的抗体水平测定结果
表8 75日龄CDV的抗体水平测定结果
我们意外的发现，由实施例1、2、3制备的添加剂培养的CDV加工制成的疫苗产生的中和抗体水平明显优于疫苗对照组，使更多的犬只得到保护。
4 结论
综上所述，本发明所制备的Vero细胞培养液添加剂，在可以大大提高细胞的生长速度的前提下，一方面能增强鸡传染性法氏囊病毒对Vero细胞的敏感性，提高病毒的TCID50含量；另一方面，还可以增强鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的免疫原性。使用本发明所制备的细胞培养液添加剂培养的Vero细胞，不限于只用来繁殖鸡传染性法氏囊病毒，还可以用来培养犬瘟热病毒等病毒，经过加工处理后制得疫苗，产生的抗体水平具有明显的优势。

Claims (4)

1.一种Vero细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：龟板提取物1-20 mg、枸杞多糖5-20 mg、云芝多糖2-20 mg、亚硒酸钠0.1-1 mg、胰岛素生长因子1-20 ug。
2.如权利要求1所述的一种Vero细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：龟板提取物5-15 mg、枸杞多糖8-16 mg、云芝多糖4-16 mg、亚硒酸钠0.2-0.8mg、胰岛素生长因子5-15 ug。
3.如权利要求1或2所述的一种Vero细胞培养液添加剂的制备方法，其特征在于将所述重量配比的组分混合后，加入到PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，即得。
4.如权利要求3所述的一种Vero细胞培养液添加剂的使用方法，其特征在于按药物混合液：DMEM重量比=1:1~1:3将两者充分混合后使用。
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