CN103060356A - 鸭瘟病毒缺失gE基因转移载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体及其构建方法。本发明首先利用基因重组获得含有CMV启动子、多克隆酶切位点MCS、BHG pA的质粒pCMV，将LacZ基因表达盒插入载体质粒pCMV中得到载体质粒pCMV-LacZ；其次利用PCR扩增和基因重组构建含有gE基因上下游同源臂共2.1kb DNA序列的载体pdgE；最后将含有CMV启动子、多克隆酶切位点MCS、LacZ基因、BHG pA基因序列亚克隆入载体pdgE内，构建成鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体pdgE-LacZ，获得鸭瘟病毒gE基因缺失重组病毒株DPV/ gE^—，同时保留了原有的抗原性。本产品可以用来构架鸭瘟病毒gE基因缺失疫苗，还可以用来构建重组活载体疫苗。

Description

鸭瘟病毒缺失gE基因转移载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程制品的构建方法，具体地说是一种鸭瘟病毒缺失gE基因转移载体以及其构建方法。

背景技术

近年来我国水禽养殖业发展迅猛，存栏量和出栏量长期保持世界第一的位置，到2010年仅肉鸭的出栏量就达到20.84亿只。但随着集约化、规模化养殖的发展，各种疾病常导致鸭群大面积死亡，仅2010年因鸭群各种疾病累计造成直接和间接养殖经济损失50亿元。鸭的多种常发疾病中，鸭瘟流行广泛，传播迅速，发病率高，病死率大，通常在90％以上，因此对水禽业发展危害极大。初步估计鸭瘟作为鸭群养殖的常见病多发病其常规预防和治疗用药在国内每年至少拥有15亿元销售市场。目前，临床上常用鸭瘟弱毒疫苗来预防鸭瘟疾病，并取得一定的临床效果。但是弱毒疫苗的应用带来的副作用也相对比较突出，比如弱毒疫苗存在毒力返强的风险、临床难以区分野毒和疫苗毒、无法根除鸭瘟疾病等。因此，临床急需开展鸭瘟基因工程标记疫苗的研究来改进上述疫苗的缺点，为彻底根除水禽业的鸭瘟疾病打下基础。

病原鸭瘟病毒（Duck Plague Virus）属于疱疹病毒科疱疹病毒属中的滤过性的病毒。鸭瘟病毒的DNA具典型的疱疹病毒DNA的特征，大小约为150kb，两端为末端重复序列，中间有内部重复序列。囊膜蛋白为疱疹病毒的主要保护性抗原，它在介导病毒进入细胞，以及病毒的成熟与释放中均起重要的作用。疱疹病毒gE基因是疱疹病毒从视网膜、嗅觉上皮细胞、三叉神经节侵入中枢神经组织所必需的毒力基因，对疱疹病毒在体内毒力表达、侵袭神经和沿着神经传递起着决定性的作用。疱疹病毒gE蛋白对于病毒感染及复制都是非必需的。疱疹病毒中，囊膜糖蛋白不仅介导病毒对靶细胞的感染而且还是被感染的宿主免疫系统识别的主要抗原。随着DNA重组技术的发展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速发展，其中基因缺失疫苗和活载体疫苗成为当前新型疫苗的研究热点。与传统疫苗相比，基因缺失疫苗和活载体疫苗具有使用安全、免疫力持久、接近动物自然感染的方式，多价苗还可以达到一针预防多病的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体及其构建方法。

本发明的载体，为包含有CMV启动子、多克隆酶切位点MCS、BHG pA，以及鸭瘟病毒gE基因缺失序列的pdgE载体。

上述的载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明的载体，其构建方法如下：首先获得含有CMV启动子、多克隆酶切位点MCS、BHG pA的质粒pCMV，将LacZ基因表达盒插入载体质粒pCMV中得到载体质粒pCMV-LacZ；然后构建含有gE基因上下游同源臂共2.1kb DNA序列的载体pdgE；最后将含有CMV启动子、多克隆酶切位点MCS、LacZ基因、BHG pA基因序列亚克隆入载体pdgE内，构建成鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体pdgE-LacZ。

本发明构建的载体用来制备预防鸭瘟的疫苗。

本发明鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体pdgE-LacZ是利用基因工程技术，利用PCR扩增gE基因上、下游同源臂将其亚克隆在pGEM-T载体上构建得到pdgE质粒；利用基因重组获得含有CMV启动子-多克隆酶切位点MCS-BHG pA基因序列和LacZ基因的基因序列，并将其插入pdgE质粒中构建鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体pdgE-LacZ；获得鸭瘟病毒gE基因缺失重组病毒株DPV/ gE^—，同时保留了原有的抗原性。本发明制备的载体可用来构建鸭瘟病毒gE基因缺失疫苗，为构建重组鸭瘟病毒搭建物质平台。

附图说明

图1： gE基因同源臂引物应用设计示意图；

图2：重组载体pCMV-LacZ的构建示意图；

图 3：gE基因缺失载体pdgE质粒的构建示意图；

图 4： 鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体pdgE-LacZ构建示意图。

具体实施方式

本发明所制备的载体中鸭瘟病毒gE基因的上下游同源臂分别为1046bp和1081bp；含有CMV启动子、多克隆酶切位点MCS、LacZ基因、BHG pA基因序列的长度为4146bp。本发明的核酸长度为6217bp。

下面结合具体实施例对本发明载体的制备及应用效果进行详细的描述。

一．设计引物

（1）扩增gE基因兼并引物：

gE1: 5’ ATGATGGTTACTTTTATATCTACAG  3’

gE2: 5’ TCAGATGCGGAAACTAGATT  3’

（2）gE基因上游同源臂扩增引物：

UpgE1: 5’ GGCGGAGCAACTGCCTTCAAG  3’

UpgE2:5’TTGTCGACCCCGGGCGTACCAATTGTTGAGGTTCC 3’  （SmaI和SalI）

（3）gE基因下游同源臂扩增引物：

DogE1: 5’ GCGCCCGGGTCATGGATGTTGAACTAAT  3’  （SmaI）

DogE2:5’CTTGTCGACCGCGTCGGTACGTAGCGTCAC  3’  （SalI）

扩增gE基因及上、下游同源臂引物，引物应用示意图见附图1。

（4）扩增CMV+MCS+BHG pA基因序列引物

gE3: 5’ TTCCCGGGGTTGACATTGATTATTG 3’  （SmaI）

gE4: 5’ AACCCGGGCCATAGAGCCCACCGCAT 3’  （SmaI）

（5）扩增LacZ基因序列引物

gE5: 5’ AAGGTACCAGTTGATCCCGTCGTTTTA  3’  （KpnI）

gE6: 5’ TTCTAGATTATTTTTGACACCAGACCAACTG  3’ （XbaI）

二．重组载体pCMV-LacZ的构建

重组载体pCMV-LacZ的构建策略见附图2。

1.  pCMV序列的克隆

利用扩增CMV+MCS+BHG pA基因序列引物以pcDNA5_TO质粒（购自LifeTechnologies公司，货号：V103320）为模板，进行PCR扩增，连接pGEM-T easy载体(购自Promega公司，货号：A3600)，测定序列正确，构成质粒pCMV。

2.  重组载体pCMV-LacZ的构建

分别用内切酶KpnI和XbaI双酶切质粒pcDNA3.1/His/LacZ（购自LifeTechnologies公司，货号：V38520）和pCMV，获得LacZ序列和线性pCMV序列，分别纯化回收。酶切后的LacZ片段与pCMV载体进行连接、转化、及阳性克隆筛选，获得转移质粒pCMV-LacZ。

三．gE基因缺失载体pdgE质粒的构建

gE基因缺失载体pdgE质粒的构建策略见附图3。

1.  gE基因上下游同源臂基因克隆的构建

分别利用UpgE1/ UpgE2、DogE1/ DogE2两对引物以鸭瘟病毒基因组DNA为模板进行上、下游同源臂PCR扩增，获得上游同源臂和下游同源臂基因。同源臂序列分别连接pGEM-T easy载体，转化DH5a感受态细胞。将测序正确质粒分别命名为pUPgE和pDOgE。

2.  gE基因缺失载体pdgE质粒的构建

用内切酶分别双酶切pUPgE和pDOgE质粒，获得UPgE片段和线性pDOgE质粒片段，进行纯化回收。UPgE和线性pDOgE质粒片段进行连接，并转化DH5a感受态细胞。筛选阳性克隆，构建质粒命名为pdgE。

四．带有LacZ基因的鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体的构建

带有LacZ基因的鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体的构建策略见附图4。

用内切酶酶切pdgE、pCMV-LacZ质粒。将片段CMV-LacZ插入线性化的质粒pdgE，连接，转化DH5a感受态细胞。利用酶切鉴定筛选阳性克隆，获得重组质粒pdgE –LacZ，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1,与最初的构思的序列相一致。

五．表达LacZ基因的gE^—毒株的筛选和鉴定

1．pdgE-LacZ转移载体质粒的纯化

使用Wizard Purefection Plasmid DNA纯化试剂盒（购自Promega公司）纯化pdgE-LacZ转移载体质粒。

2．转染细胞的准备

将长成单层鸡胚成纤维细胞用胰酶消化后，用含有10%牛血清的液体培养基营养液吹打分散细胞，以1×10⁶/mL的浓度接种于六孔细胞培养板，在37℃、5% CO₂的培养箱中培养约20小时至细胞长至80%单层，用于转染。

3．转染

将制备的鸭瘟病毒液稀释1000倍，以500uL接种于单层鸡胚成纤维细胞细胞，在37℃、5% CO₂的培养箱中吸附1小时，吸弃病毒液，加入含2%牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO₂的培养箱中培养4小时，吸弃培养基，加入新鲜的不含有抗生素和血清的DMEM培养基洗涤细胞，弃去培养基，重复洗涤3次，使用Invitrogen公司Lepofectamine 2000脂质体将质粒pdgE–LacZ转染鸡胚成纤维细胞细胞。制备250uL A液(用不含有抗生素和血清的培养基稀释2.5ug pdgE –LacZ质粒)，300 uL B液(240uL不含有抗生素和血清的培养基、10 uL脂质体)，室温放置5min后，逐滴将A液加入B液，室温放置20min，将混合液温和混匀，逐滴接种细胞，在37℃、5% CO₂的培养箱中培养2小时，吸弃上清，加入含2%牛血清培养基，在37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

4. 重组病毒的筛选

逐日用显微镜观察转染的细胞，待出现明显CPE后，吸取细胞培养物，反复冻融3次，离心去掉细胞碎片，保存上清作为重组病毒的原液。将上述病毒液作10倍梯度稀释，以10^-1、10^-2、10^-3的浓度分别接种生长至90%以上的单层鸡胚成纤维细胞，感作1小时后加入含2%牛血清、1%甲基纤维素的DMEM培养基，在37℃、5% CO₂的培养箱中培养至出现CPE后，吸弃培养基，加入融化的含1 %低熔点琼脂糖、150 u g/mLX-gal的DMEM培养基，待培养基凝固后，在37℃、5% CO₂的培养箱中培养，当蓝色蚀斑出现时，挑取彼此分离的单个蚀斑，用巴氏管小心刺穿培养基吸取蓝斑，放入1mL含有2%牛血清的DMEM培养基中，冻融3次进行新一轮的蚀斑纯化，直至病变细胞全为蓝色。

5. 重组病毒的PCR鉴定

利用扩增LacZ和gE基因两对引物进行分别PCR鉴定，确定转入了上述构建的质粒pdgE –LacZ，获得鸭瘟gE基因缺失疫苗株DPV/ gE^—。

六．鸭瘟gE基因缺失疫苗株（DPV/ gE^—）产生鸭瘟抗体水平

1. 鸭瘟gE基因缺失疫苗（DPV/ gE^—）的制备

（1）制苗毒液制备  将毒种鸭瘟gE基因缺失疫苗株DPV/ gE^—加入长有致密单层的鸡胚成纤维细胞转瓶内，37℃吸附1小时，弃毒液，加入维持液，37℃培养。每天在倒置显微镜下观察细胞病变情况。接毒后1-3天75%以上细胞出现病变，即可反复冻融3次后，10000rpm离心10min,收获病毒液。

（2）配苗及分装  将检验合格的半成品苗于37℃水浴中快速融化，过滤除去细胞碎片，加入5%蔗糖脱脂牛乳保护剂，充分混匀，无菌分装于小瓶中。

（3）无菌检验  按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验，结果无菌生长，符合规定。

2. 鸭瘟gE基因缺失重组病毒免疫产生鸭瘟抗体水平测定

按鸭瘟弱毒活疫苗的标准免疫程序分别用鸭瘟gE基因缺失重组病毒、鸭瘟标准毒株（阳性对照组）和生理盐水接种1日龄雏鸭，将100倍稀释的重组病毒的ELD50作为免疫剂量。建立试验组、阳性对照组和空白对照组，每组5只，0.5mL/只，正常条件下饲养。分别于免疫后1周、2周、3周、4周抽取雏鸭血清。将抽取的血清灭活处理后，每组血清按1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280做梯度稀释，分别与体积为0.5mL的鸭瘟病毒等体积混合，用含有100个ELD50/0.2mL作为中和剂量，混合物37℃感作30min，混合物接种9日龄鸭胚，各组5枚，每枚0.2mL，37℃条件培养，6天后记录培养结果。通过鸭胚中和试验检测抗血清的中和滴度，结果显示雏鸭经过鸭瘟gE基因缺失重组病毒免疫后可以产生鸭瘟病毒抗体，而且抗体水平再统计期内呈增高趋势，说明鸭瘟gE基因缺失重组病毒保持了原有的抗原性。

Claims (4)

1.一种鸭瘟病毒缺失gE基因转移载体，其特征在于，所述的载体为包含有CMV启动子、多克隆酶切位点MCS、BHG pA，以及鸭瘟病毒gE基因缺失序列的pdgE载体。

2.权利要求1所述的载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.权利要求1所述的载体，其构建方法如下：首先获得含有CMV启动子、多克隆酶切位点MCS、BHG pA的质粒pCMV，将LacZ基因表达盒插入载体质粒pCMV中得到载体质粒pCMV-LacZ；然后构建含有gE基因上下游同源臂共2.1kb DNA序列的载体pdgE；最后将含有CMV启动子、多克隆酶切位点MCS、LacZ基因、BHG pA基因序列亚克隆入载体pdgE内，构建成鸭瘟病毒gE基因缺失转移载体pdgE-LacZ。

4.权利要求1所述的载体在来制备预防鸭瘟的疫苗中的应用。

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