CN1330376C - 重组鸡痘病毒联合疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表达鸡II型干扰素的重组鸡痘病毒(rFPV)与表达不同病原体保护性抗原基因的rFPV组合动物疫苗；本发明还涉及保持或增强疫苗保护力的方法；也包括使用表达其他细胞因子的rFPV和作为疫苗使用剂量的表达病原体保护性抗原基因的rFPV混合作为动物疫苗达到相同目的的方法；该疫苗能降低FPV有害的副作用，特别是降低rFPV疫苗免疫动物后产生的影响增重等副反应。
Description
技术领域
本发明涉及-种重组鸡痘病毒疫苗，特别是一种表达鸡II型干扰素的重组鸡痘病毒和表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒的联合疫苗。
背景技术
鸡痘病毒(Fowl pox virus，FPV)属痘病毒科禽痘病毒属的成员，病毒粒子核心中含有双股线状DNA，G+C＝35％，基因组长约300kb，FPV DVA不具有感染性。通过重组DNA技术，以FPV为载体研制禽类基因工程重组活病毒载体疫苗，或哺乳动物非复制型重组活病毒载体疫苗受到越来越多研究者的重视。FPV载体与已报道的病毒载体如痘苗病毒、乳头状瘤病毒、腺病毒、细小病毒、马立克氏病病毒、烟草花叶病毒等相比具有明显的优势。FPV的基因组较大，可以将二个或多个病原体保护性抗原基因插入其基因组中表达而制备多价疫苗；其自然条件下只感染禽类，但能在哺乳动物细胞产生顿挫性感染，虽不产生有感染性的子代病毒粒子，却能自动合成加工外源抗原并提呈到细胞表面，刺激机体产生免疫应答反应。
已有多种类型的具有生物活性的蛋白质在重组鸡痘病毒(recombi nantFowlpox virus，rFPV)中得到表达。如禽流感病毒(AIV)的血凝素基因(HA)(Tripathy等人，Tripathy DN，Schnitzlein WM.Expression of avianinfluenza virus hemagglutinin by recombinant fowlpox virus.Avian Dis，1991，35(1)：186-191.；Boyle DB，Selleck P，Heine HG.Vaccinating chickensagainst avian influenza with fowlpox recombinants expressing the H7haemagglutinin.Aust Vet J，2000，78(1)：44-48；Swayne等人，Swayne DE，Garcia M，Beck JR et al.Protection against diverse highly pathogenic H5avian influenza viruses in chickens immunized with a recombinant fowlpoxvaccine containing an H5 avian influenza hemagglutinin gene insert.Vaccine，2000，18(11-12)：1088-1095；)、新城疫病毒(NDV)的融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因(Letellier等人，Letellier C，Burny A，Meulemans G.Construction of a pigeonpox virus recombinant：expressionof the Newcastle disease virus(NDV)fusion glycoprotein and protectionof chickens against NDV challenge.Arch Virol，1991，118(1-2)：43-56.；Taylor等人，Taylor J，Christensen L，Gettig R et al.Efficacy of arecombinant fowl pox-based Newcastle disease virus vaccine candidateagainst velogenic and respiratory challenge.Avian Dis，1996，40(1)：173-180；Taylor J，Edbauer C，Rey-Senelonge A et al.Newcastledisease virus fusion protein expressed in a fowlpox virus recombinantconfers protection in chickens.J Virol，1990，64(4)：1441-1450；Nagy等人，Nagy E，Krell PJ，Heckert RA et al.Vaccination of chickens with arecombinant fowlpox virus containing the hemagglutinin-neuraminidase geneof Newcastle disease virus under the control of the fowlpox virus thymidinekinase promoter.Can J Vet Res，1994，58(4)：306-308；Wu等人，Wu YT，PengDX，Liu XF et al.A recombinant fowlpox virus expressing the fusion proteinof Newcastle disease virus strain F48E8 and its protective efficacy.ChinesJournal of Biotechnology，2000，16(5)：591-594.)、马立克氏病病毒(MDV)的gB基因(Yanagida等人，Yanagida N，Ogawa R，Li Y et al.Recombinantfowlpox viruses expressing the glyeoprotein B homolog and the pp38 geneof Marek’s disease virus.J Virol，1992，66(3)：1402-1408.；Yoshida等人，Yoshida S，Lee LF，Yanagida N et al.The glycoprotein B genes of Marek’sdisease virus serotypes 2 and 3：identification and expression byrecombinant fowlpox viruses.Virology，1994，200(2)：484-493，Omar等人，Omar AR，Schat KA，Lee LF et al.Cytotoxic T lymphocyte response inchickens immunized with a recombinant fowlpox virus expressing Marek’sdisease herpesvirus glycoprotein B.Vet Immunol Immunopathol，1998，62(1)：73-82；Liu等人，Liu X，Peng D，Wu X et al.A recombinant fowlpox virusvaccine expressing glycoprotein B gene from CVI988/Rispens strain of MDV：protection studies in different chickens.Acta Virol，1999，43(2-3)：201-204)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因(Heine等，Heine HG，BoyleDB.Infectious bursal disease virus structural protein VP2 expressed bya fowlpox virus recombinant confers protection against disease in chickens.Arch Virol，1993，131(3-4)：277-292.)、狂犬病病毒糖蛋白(Taylor等，TaylorJ，Weinberg R，Languet B et al.Recombinant fowlpox virus inducingprotective immunity in non-avian species.Vaccine，1988，6(6)：497-503)和麻疹病毒融合蛋白基因(Wild等人，Wi1d F，Giraudon P，Spehner D et al.Fowlpox virus recombinant encoding the measles virus fusion protein：protection of mice against fatal measles encephalitis.Vaccine，1990，8(5)：441-442.)等，以表达外源基因的rFPV进行免疫，可提供特异性的免疫保护，因此，FPV载体不仅可以用作家禽的疫苗，而且可以用作哺乳动物的疫苗。
现有技术中，FPV疫苗在商品禽中已使用了70多年，此疫苗可引起轻微的、自限性局部感染。同时，FPV宿主范围较窄，仅感染禽，因此是相对比较安全的疫苗病毒。但常用的FPV疫苗作为家禽疫苗在使用过程中仍存在着一定副作用。如中国鹌鹑化FPV弱毒疫苗应用于20日龄的鸡是安全的，对7日龄的雏鸡可能发生重反应，以不应用为宜(Zhou等人，Zhou TC，Li JG，Pan Bn et al.The studyon an fowlpox vaccine attenuated by passaging in Quail.Acta VeterinaryEt Zootechnica Sinica，1981，12(2)：107-113.)。Springer等(Springer WT，Truman RW.Effect of subcutaneous pox vaccnation of young chickens onimmune responses and weight gains.Poultry Sci，1998，60：1213-1220).和Tripathy等(Tripathy DN，Schnitzlein WM.Expression of avian influenzavirus hemagglutinin by recombinant fowlpox virus.Avian Dis，1991，35(1)：186-191.)分别报道了FPV对雏鸡的增重有抑制作用。郑厚旌等(Zheng HJ，DangCH，Liu JC.The observation for interferon effect of Fp vaccine and NDvaccine immunization on ND HI antibody.Chinese Journal of PreventiveVeterinary Medicine，2000，22(2)：106-108.)报道，使用荷兰intervet公司生产的FPV疫苗，对鸡新城疫的血凝抑制抗体的产生有轻度的抑制作用，本发明人也观察到中国鹌鹑化FPV弱毒疫苗株282E4细胞适应毒对雏鸡的增重有抑制作用和对新城疫血凝抑制抗体的产生有抑制作用。这使FPV作为重组鸡痘病毒基因工程疫苗的载体的应用受到限制。目前，采用FPV作为载体表达外源基因的插入部位选择在FPV的复制非必需区，这样既可以保证插入的外源基因的正确表达，又不影响FPV的复制、繁殖，所以rFPV与野生型FPV(wild type FPV，wtFPV)的复制、繁殖、生长速度是一致的，免疫鸡后产生的影响也是一致的。为了降低FPV的毒性，许多研究者作了多方面的努力。Tripathy等(Tripathy DN，SchnitzleinWM.Expression of avian influenza virus hemagglutinin by recombinantfowlpox virus.Avian Dis，1991，35(1)：186-191.)选用FPV TK基因作为外源基因的插入位点，TK基因插入失活降低了rFPV的毒力，使其比亲本病毒具有更小的毒性。虽然禽痘病毒的增殖与TK基因的活性无关，但由此构建的重组病毒不稳定，在传代过程中易导致插入外源基因的缺失(Nazerian等，Nazerian K，Dhawale S.Structural analysis of unstable intermediate and stable formsof recombinant fowlpox virus.J Gen Virol，1991，72(Pt11)：2791-2795.)。Paoletti等(US patent，5，378，457，1995)应用缺失的方法去除rFPV基因组中对干扰素提供抵抗力的K3L基因，增强了rFPV对干扰素的敏感性而增加了rFPV的安全性。但这种方法并不能增强外源基因的免疫效力。Rautenschlein等(Rautenschlein S，Sharma JM，Winslow BJ et al.Embryo vaccination ofturkeys against Newcastle disease infection with recombinant fowlpoxvirus constructs containing interferons as adjuvants.Vaccine，1999，18(5-6)：426-433.)和Karaca等(Karaca K，Sharma JM，Winslow BJ et al.Recombinant fowlpox viruses coexpressing chicken type I IFN and Newcastledisease virus HN and F genes：influence of IFN on protective efficacy andhumoral responses of chickens following in ovo or post-hatchadministration of recombinant viruses.Vaccine，1998，16(16)：1496-1503)分别用FPV共表达了新城疫病毒F基因、HN基因和I型、II型干扰素，证明干扰素可以降低rFPV免疫鸡的体重减轻副反应，可以达到正常对照组的增重水平。同时，干扰素也降低了rFPV免疫后产生针对F、HN蛋白的抗体水平。我们以FPV载体构建了共表达马立克氏病病毒gB基因和鸡II型干扰素基因的rFPV载体，1日龄免疫试验鸡，与单表达MDV gB的rFPV相比，同样显著降低了FPV减轻体重的副反应，达到健康对照组的增重水平，但其对马立克氏病强毒的攻击保护力比单表达MDV gB的rFPV的低，说明II型干扰素的共表达虽然增加了rFPV基因工程疫苗的安全性，同时也降低了疫苗的免疫保护性，可能起到得不偿失的作用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，能增加重组鸡痘病毒基因工程疫苗的安全性，降低重组鸡痘病毒免疫鸡后出现的增重减缓等副反应，同时保持和增强重组鸡痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表达产物的免疫原性，就必须调整干扰素表达产物的含量，使其既产生免疫佐剂作用，又能在一定程度上限制FPV繁殖，降低FPV的有害副作用。
本发明的技术方案在于提供一种能降低重组鸡痘病毒免疫鸡出现增重减缓等副反应，同时保持或增强重组鸡痘病毒免疫效力的疫苗。
本发明的另一技术方案在于提供一种重组鸡痘病毒疫苗的配制方法。
本发明的另一技术方案在于提供一种制备含表达鸡II型干扰素(cIFN-II)的重组鸡痘病毒(rFPV)组合疫苗的方法。
本发明的再一技术方案在于提供一种免疫禽类动物的方法。
具体地讲，本发明涉及一种由表达免疫调节因子基因的重组鸡痘病毒(rFPV)和作为疫苗使用量的表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒组成的疫苗。所述的重组鸡痘病毒(rFPV)中的免疫调节因子为鸡的细胞因子。所述的鸡的细胞因子选自鸡干扰素、鸡白细胞介素2或鸡白细胞介素12。
本发明所述的鸡干扰素为II型干扰素。
所述的免疫调节因子是在同源启动子、异源病毒或人工合成启动子调控下表达出的免疫调节因子。而所述的启动子为FPV早晚期启动子。
本发明中表达免疫调节因子的重组鸡痘病毒(rFPV)是下文所述的1175IFN。
所述的病原体保护性抗原基因是引起禽类疾病的病原体的保护性抗原基因。该病原体保护性抗原基因可编码抗原多肽，基本上包括下述基因中的任选一种、二种或二种以上：马立克氏病病毒糖蛋白B，新城疫病毒融合蛋白或血凝素神经氨酸酶，传染性法氏囊病毒VP2蛋白，传染性喉气管炎病毒糖蛋白B，禽流感病毒血凝素，传染性支气管炎病毒S蛋白，鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白。
表达免疫调节因子基因的重组鸡痘病毒(rFPV)剂量范围为103-106PFU/羽。
本发明的表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒(rFPV)的疫苗使用量范围为104-107PFU/羽。
本发明还涉及一种重组鸡痘病毒疫苗的配制方法，该方法包括将独立的表达免疫调节因子基因的重组鸡痘病毒和独立的作为疫苗使用量的表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒在配苗时混合，也可以在使用时混合。
根据本发明的要求，可以采用经过现有技术制得的表达免疫调节基因的rFPV和作为疫苗使用剂量的表达病原体保护性抗原基因的rFPV配伍成本发明的疫苗。
可见，本发明还涉及一种免疫禽类动物的方法，该方法包括对所述的禽类，特别是鸡皮下使用本发明所述的联合疫苗。
换言之，本发明的主题是涉及103-106PFU/羽的表达II型干扰素的重组鸡痘病毒和104-107PFU/羽表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒组合成疫苗，重组鸡痘病毒表达的鸡II型干扰素(chicken type II interferon，cIFN-II)具有免疫佐剂作用和增加rFPV的安全性的作用。以FPV作为载体和强启动子稳定高效表达鸡II型干扰素(cIFN-II)，该强启动子可以用人工合成的强启动子，也可以是天然FPV强启动子或痘苗病毒强启动子。用适量的表达cIFN-II的rFPV与表达病原体保护性抗原基因的rFPV混合组成疫苗免疫鸡，能增强抗FPV和所述病原体的免疫反应，为抵抗相应病原体感染提供有效的保护，而免疫鸡不产生FPV疫苗免疫常见的增重减缓等副作用。
本发明也包括构建成同时表达鸡II型干扰素和病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒(rFPV)，调控鸡II型干扰素基因的启动子与调控病原体保护性抗原基因的启动子不一样，调控鸡II型干扰素基因的启动子的强度的选择应根据所获得的共表达的重组鸡痘病毒(rFPV)免疫动物后能保持或增强免疫效力而又不影响免疫动物增重来决定，所涉及的启动子包括已鉴定的FPV、痘苗病毒的启动子和人工合成启动子，用来调控基因在FPV感染的细胞内表达。
鸡I型干扰素、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)等细胞因子也和鸡II型干扰素一样，可以对重组鸡痘病毒(rFPV)的复制形成抑制作用。因此以FPV作为载体用不同强度启动子调控共表达上述细胞因子和病原体保护性抗原基因构建重组鸡痘病毒，及以适宜剂量的表达细胞因子的重组鸡痘病毒作为组份与表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒联合使用，达到降低重组鸡痘病毒免疫鸡减缓增重的副反应和免疫抑制副作用的方法也构成本发明的组成部分。
FPV载体所表达的病原体保护性抗原基因包括马立克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、呼肠孤病毒(REOV)、网状内皮增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、鸡腺病毒、鸡败血支原体菌、大肠杆菌、沙门氏菌、鸡球虫等病原体的保护性抗原基因，将表达相关病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒免疫鸡，即可诱导产生对相应病原体感染的免疫力。
本发明还涉及一种制备含表达鸡II型干扰素(cIFN-II)的重组鸡痘病毒(rFPV)组合疫苗的方法，包括下述步骤：
①获得含cIFN-II基因、MDV gB基因、AIV HA基因、NDV F基因整个阅读框架的基因；
②将上述基因置于合适启动子下游，插入到含FPV复制非必需片段和报告基因(LacZ)的插入载体中构建成转移载体；
③用转移载体转染已感染wtFPV的鸡胚成纤维细胞(CEF)，通过同源重组获得表达cIFN-II基因或病原体保护性抗原基因的rFPV；
④增殖和收获表达cIFN-II基因和表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒(rFPV)。
以不同剂量的表达cIFN-II基因的重组鸡痘病毒(rFPV)与作为疫苗剂量的表达MDV gB、NDV F、AIV HA等病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒(rFPV)制备疫苗免疫鸡。
可以相应的病原体攻毒，测定免疫鸡的体重和统计疫苗的免疫保护效力，确定达到降低重组鸡痘病毒减缓增重等副反应而又保持或增强免疫保护效力的表达cIFN-II基因的重组鸡痘病毒(rFPV)的最适剂量。
在第一步骤中，cIFN-II基因可以通过以下方法获得，用刀豆素A(ConA)刺激鸡脾淋巴细胞，提取细胞和诱导产生的mRNA的总RNA，根据已发表的cIFN-II基因序列合成一对引物，以其中一个引物反转录合成与cIFN-II基因mRNA互补的第一链cDNA，加入此对引物PCR扩增出鸡的cIFN-II基因。
MDV gB基因可以通过以下方法获得，用MDV疫苗株Rispens株感染CEF，待完全病变后收获感染病毒的CEF，按常规方法提取CEF和MDV基因组总DNA，根据已发表的MDV gB基因序列合成一对包括整个阅读框架的的引物，以上述的总DNA为模板，扩增出MDV gB基因。
NDVF基因和AIV HA基因可按下述方法获得，用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，酚-SDS法提取病毒基因组RNA；根据已发表的NDV F基因和AIV HA基因序列设计引物，先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出NDV F基因和AIV HA基因整个阅读框架。将cIFN-II基因、MDV gB基因、NDV F基因、AIV HA基因分别连接到T载体，测序证明所得各基因序列的正确性。
在第二步骤中，为了表达cIFN-II基因、MDV gB基因、NDV F基因、AIV HA基因，需有足够长度和功能活性的启动子连接到上述基因上。启动子可以是任何能够在重组鸡痘病毒(rFPV)感染细胞中指导基因转录的FPV启动子、痘苗病毒启动子或人工合成启动子，启动子和上述基因可以通过酶切加接的方法或用PCR设计引物加接的方法连接在一起，按常规方法将其插入到含FPV复制非必需片段和报告基因LacZ的FPV插入载体中(Wang等人，Wang ZL，Peng DX，Liu XF etal.Construction of recombinant fowlpox virus from chinese vaccine strain282E4 and expression of Marek’s Disease virus gB gene.Chinese Journal ofVirology，1996，12(12)：48-54，Yanagida等人，Yanagida N，Ogawa R，Li Y etal.Recombinant fowlpox viruses expressing the glycoprotein B homolog andthe pp38 gene of Marek’s disease virus.J Virol，1992，66(3)：1402-1408.)，再将此连接产物转化到适当的宿主细胞中，按常规方法纯化并分析重组体，以确保得到正确的转移载体。碱裂解方法制备转移载体的质粒DNA并以PEG纯化质粒DNA。
在第三步骤中，以鉴定的转移载体按下述方法转染，用10日龄SPF鸡胚制备CEF，以wtFPV感染CEF，吸附完全后，以无血清的基础培养基冲洗CEF单层两次；同时在指形管中制备脂质体和FPV转移载体质粒DNA的混合物，即静止形成混悬物后，将上述混悬物均匀分散于含无血清培养基的培养皿中，保温一定时间后加入完全培养基，使其长至完全病变后收获。
rFPV的纯化按下述方法进行，用10日龄鸡胚制备CEF，长成单层后按常规方法制备次代CEF，将上述完全病毒的细胞冻融后稀释接种于次代CEF上，待其形成单个完全蚀斑后，覆盖含X-gal的营养琼脂，继续保温培养，以蓝斑筛选重组鸡痘病毒(rFPV)。以同样的方法在24孔和96孔细胞培养板的CEF单层上进行纯化，获得稳定纯化的重组病毒。
rFPV中外源基因的插入和表达，可通过核酸杂交、PCR扩增外源基因、重组病毒与特异性抗体结合的反应性及所表达外源基因产物的生物学活性等方法予以鉴定。
如用核酸探针和PCR方法鉴定重组鸡痘病毒(rFPV)中插入外源基因的存在。以纯化的重组鸡痘病毒(rFPV)感染CEF单层，至CEF产生完全病变后收获，按常规方法提取细胞和重组鸡痘病毒(rFPV)的总DNA。以提取的DNA作模板，用相应的引物作PCR扩增，鉴定重组病毒基因组中是否插入外源基因。或以适当的限制性内切酶消化提取的总DNA，电泳后转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，使用地高辛标记的外源基因核酸探针进行杂交，出现与目的片段大小相符的阳性杂交条带则证明重组鸡痘病毒(rFPV)中含有外源基因的插入。
也可用其他方法来检测重组体中外来基因的存在，特别是表达病原体保护性抗原基因和表达产物的鉴定。例如，可使用对外来基因产物特异性的抗体着染含重组鸡痘病毒(rFPV)感染的CEF，MDV gB单抗或抗血清、NDV F单抗或抗血清和AIV HA单抗或抗血清能特异性地分别识别感染重组鸡痘病毒(rFPV)的CEF中的MDV gB、NDV F、和AIV HA基因的表达产物。
还可通过检测外源基因表达产物的生物学活性，特别是干扰素等细胞因子的活性，来验证重组病毒中外源基因的插入和表达。例如，根据水泡性口炎病毒(VSV)对II型干扰素的敏感性，观察VSV培养在干扰素存在的条件下的蚀斑产生受抑制的情况，证实rFPV表达干扰素的活性。
在第四步骤中，将表达cIFN-II基因和表达病原体保护性抗原基因(如MDVgB、NDV F和AIV HA基因)的rFPV在CEF单层上增殖，长成完全病变后收获，于24孔细胞培养板次代CEF单层上进行病毒含量的蚀斑计数。将10倍系列稀释的表达cIFN-II基因的重组鸡痘病毒(rFPV)与表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒(rFPV)混合后，免疫SPF雏鸡，定期测定体重和疫苗免疫抗体产生能力，以相应的病原体攻击，观察组合病毒的免疫保护力和免疫鸡的增重趋势。以不影响免疫鸡的增重趋势，同时又不降低表达保护性抗原基因的重组鸡痘病毒(rFPV)的免疫效力为标准，选择表达cIFN-II基因的rFPV与表达保护性抗原基因的重组鸡痘病毒(rFPV)的最佳配比。
表达cIFN-II基因的rFPV在组份疫苗中的含量为103～106PFU/羽，表达病原体保护性抗原基因的rFPV在组份疫苗中的含量为104-107PFU/羽。
也可以按上述方法构建表达能降低重组鸡痘病毒(rFPV)增重减缓等副反应的其它细胞因子的重组鸡痘病毒(rFPV)，比如表达鸡I型干扰素、IL-2、IL-12等的重组鸡痘病毒(rFPV)，与表达病原体保护性抗原基因的rFPV组合成疫苗，表达鸡细胞因子的重组鸡痘病毒(rFPV)的含量为103～106PFU/羽。
以103～106PFU表达cIFN-II基因的重组鸡痘病毒(rFPV)与作为疫苗用量的表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒(rFPV)组合成疫苗，不降低重组鸡痘病毒(rFPV)疫苗的免疫效力，有时甚至可增强免疫保护效力，但降低了鸡痘病毒疫苗免疫常见的增重减缓和产生免疫抑制的副作用，免疫鸡与健康对照鸡保持相同的增重水平和免疫应答能力。以FPV TK基因作为插入外源基因的部位构建重组鸡痘病毒(rFPV)，虽可降低重组鸡痘病毒(rFPV)的毒性，但插入的外源基因的表达并不稳定，易在重组病毒传代过程中导致外源基因的缺失。以共表达鸡干扰素基因和病原体保护性抗原基因的方法构建重组鸡痘病毒(rFPV)，虽可起到降低rFPV副反应的作用，但也同时降低了重组病毒的免疫保护效力。通过调节cIFN-II的表达获得共表达的重组鸡痘病毒(rFPV)虽可达到相同目的，但需针对个案处理，不如直接以不同剂量的重组cIFN-II与表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒(rFPV)组合方便。
附图说明
图1显示鸡IFN-II cDNA的RT-PCR扩增产物电泳图谱。A、B：RT-PCR产物，C：x174 DNA/Hae III Marker。
图2显示重组质粒pIFN的酶切鉴定电泳图谱。A：λDNA EcoR I/HindIIIMarker，B：pIFN+Hind III+Sal I。
图3显示实施例1得到的鸡II型干扰素基因的全序列。
图4(A，B)显示构建含鸡II型干扰素基因的FPV转移载体(1175IFN)的策略图。
图5显示重组质粒AIFN的酶切鉴定电泳图谱。A：AIFN+HindIII+Sal I，B：λDNA EcoR I/HindIII Marker。
图6显示包含启动子PE/L的鸡IFN-II基因片段的PCR扩增产物电泳图谱。A、B：RT-PCR产物，C：λDNA EcoR I/HindIII Marker。
图7显示重组质粒TIFNII的酶切鉴定电泳图谱。A：TIFNII+EcoR I，B：λDNA EcoR I/HindIII Marker。
图8显示重组质粒SKIFN中外源片段插入方向的酶切鉴定。A：λDNA EcoRI/HindIII Marker， B：SKIFNII+Sma I
图9显示重组质粒1175IFN的酶切鉴定。A：1175IFN+EcoR I，B：λDNA EcoRI/HindIII Marker。
图10显示纯化重组病毒rFPV-IFN-II感染CEF后形成的蓝色蚀斑。
具体实施方式
以下将结合实施例与附图具体说明，但是下列实施例旨在进一步解释而不是限制本发明。
实施例1鸡II型干扰素基因的扩增、克隆及序列分析
鸡脾淋巴细胞的培养
按常规方法无菌取鸡脾脏，置于5ml PBS中，挤压收集脾细胞，于含脾细胞的PBS液面下加入等量的淋巴细胞的分层液，室温下1500rpm离心20min，收集位于界面的淋巴细胞，计数后添加培养基(含5％犊牛血清的DMEM，含2mmol/L的谷氨酰胺，10mmol/L HEPES，5μg/L的刀豆素A(ConA))，调整脾细胞浓度至107个/ml，置于41℃，5％CO2条件下培养16h。
含干扰素mRNA的总RNA的提取
取1ml上述培养的鸡脾淋巴细胞(约107个细胞)，置于1.5ml离心管中，4℃条件下2500rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀细胞中加入1ml的TRIzolReagent，悬浮后于15-30℃水浴中作用3min，4℃ 12000rpm离心10min，使液体分层，将上层水相移入另一离心管中，向其中加入0.5ml的异丙醇，混匀后置于15-30℃水浴中3min，4℃12000rpm离心10min，沉淀RNA，75％冷乙醇洗涤一次后风干，干燥后的RNA以适量的无RNA酶的超纯水溶解。
鸡II型干扰素的扩增、克隆及序列分析
根据已发表的cIFN-II基因的序列，设计一对引物，开始于起始密码子，结束于终止密码子，包含cIFN-II基因的整个阅读框架，并分别在P1和P2的5’端加SalI和HindIII酶切位点，引物序列为
p1：5’GTA
GAC GTC ATG ACT TGC CAG ACT TAC AAC 3’
P2：5’GCG
AAG CTT CAT TAG CAA TTG CAT CTC CTC 3’
在一经DEPC处理的无菌指形管中混合上述提取的总RNA 2μg和引物P2 400ng，65℃变性5min，迅速冷却至0℃，再于25℃温育15min，使RNA与引物退火，再依次加入5×AMV源反转录酶反应缓冲液，2μl的10mmol/L dNTP，25单位的RNasin和15单位的AMV源反转录酶，最后补加DEPC处理的超纯水至25μl，于42℃温育1.5h，再以95℃作用5min灭活反转录酶。
取上述反转录产物5μl，依次加入5μl的10×PCR反应缓冲液，1μl的10mmol/L dNTP，引物P1 400ng、引物P2 200ng，1μl的25mmol/L Mgcl2，补加超纯水至50μl，并在水层上覆盖液体石蜡，95℃变性5min后，再加入0.5μl的Taq DNA聚合酶，按下述条件扩增30个循环：94℃变性45sec，54℃退火1min，72℃延伸1min 30sec。扩增完毕后72℃延伸10min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析(图1)，大小为0.5kb。
取上述PCR产物经限制性内切酶SalI和HindIII酶切消化，电泳后以琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收，与同样经SalI、HindIII酶切消化的质粒pUC18连接，连接产物转化感受态菌TG1，以转化的TG1涂布含Amp、IPTG、X-gal的LB平板，37℃培养18-20h后挑选白色转化菌，扩增后小量提取质粒，酶切鉴定插入外源片段大小与预期相符的阳性重组质粒(pIFN)(图2)。经自动测序仪测序，得到的鸡II型干扰素基因全序列见图3。
实施例2含cIFN-II基因的FPV转移载体(1175IFN)的构建
含cIFN-II基因的FPV转移载体1175IFN构建策略如图4。
经过上述实施例1的步骤之后，为了能在cIFN-II基因序列前添加FPV早晚期启动子，并能顺利连接到FPV插入载体1175当中去，进行了以下四步转换。
首先，将pIFN以SalI和HindIII酶切回收cIFN-II基因片段插入到SalI、HindIII消化的含PE/L的pAF09中，获得重组质粒(AIFN)，在AIFN中，cIFN-II位于痘苗病毒早晚期启动子PE/L的下游(图5)；其次以AIFN质粒为模板，设计一对引物
P3：5’CCT
GTC GAC AGC CAT TTA AGT ATC CCT AA 3’
P4：5’GCG
GTC GAC AAA AAA AAC TAT TAG CAA TTG CAT CTC CTC 3’)，于P3、P4 5’端各加一个SalI酶切位点，并在P4酶切位点的下游加一痘苗病毒早期转录终止信号，用PCR法扩增包含PE/L在内的全长cIFN-II基因(图6)，扩增片段插入pGEM-T中，构建成TIFN II(图7)；再以EcoRI消化，回收0.6kb的PF/L-cIFN-II基因盒，插入到经EcoR1酶切的SK载体中构建成重组质粒SKIFN(图8)；最后，以Xhol酶切补平，再以PstI酶切消化SKIFN，回收0.6kb的PF/L-cIFNII基因盒，插入到SalI酶切补平，并以PstI酶切消化的鸡痘毒插入载体1175，构建成转移载体1175IFN，即表达免疫调节因子的rFPV。酶切鉴定证明插入的正确性(图9)。
实施例3转染与纯化
按碱裂解法大量提取经实施例2得到的1175IFN质粒，以PEG法纯化质粒，OD260测定DNA含量后以超纯水分装成1μg/ml备用。以含4％犊牛血清的DMEM按107个细胞/ml制备CEF，每个100ml方瓶中加5ml上述细胞液，37℃培养18h；再以0.1 MOI的感染量加入wtFPV，37℃吸附3h；以无血清DMEM洗涤CEF单层两次，再加入2ml无血清DMEM备用。分别在两个1.5ml指形管中稀释50μg脂质体转染试剂(Dosper Lipofectin，Roche公司)和10μg 1175IFN至50μl，按脂质体和质粒DNA的重量比为5∶1，将上述两管物质混合，轻轻混匀，室温静置15min。再将上述脂质体和质粒混合物滴加并均匀分散于感染FPV的CEF的无血清培养基中，37℃培养6h后，以5ml DMEM生长液替换无血清培养基，继续培养至细胞产生完全病变后收获病毒，-20℃反复冻融三次，低速离心除去细胞碎片，上清即可用于表达cIFN-II基因的rFPV的筛选。
于60mm细胞培养皿上制成次代CEF，形成单层后，接种1∶10稀释的上述含病毒的上清5μl，待出现单个分散比较完全的FPV蚀斑时，吸出培养液，加入40℃、含终浓度为200μg/ml X-gal的0.8％营养琼脂，凝固后翻转培养皿，于37℃继续培养，待出现明显的蓝色FPV蚀斑后，吸出该蚀斑的病毒细胞置于1mlDMEM维持液中，-20℃冻融三次，低速离心除去细胞碎片，上清继续纯化，稀释接种于24孔和96孔细胞培养板的次代CEF上，分别以同样方法纯化3次(图10)，增殖病毒后可用于表达产物rFPV-IFN-II的生物活性测定。
实施例4表达cIFN-II基因的rFPV(rFPV-IFN-II)的鸡II型干扰素的抗病毒活性效价的测定
将0.01 MOI的实施例3得到的rFPV-IFN-II接种于CEF单层上，37℃，5％CO2条件下培养72h后，收获上清，以0.22μm的微孔滤膜过滤，除去FPV粒子。以下述的病毒抑制法测定过滤后的培养上清中的cIFN-II的滴度：向生长于96孔上的次代CEF单层上加入经倍比稀释的培养上清100μl，37℃作用24h。吸去上清，接种水泡性口炎病毒(VSV)100μl，剂量为100TCID50/孔，继续培养48h，观察VSV引起的细胞病变，将能完全抑制VSV诱生的细胞病变的样品的最高稀释度定义为1单位IFN，感染rFPV-IFN-II的CEF培养72小时后，细胞培养上清的效价为1280U/ml。
关于表达MDV gB、NDV F/HN、AIV HA的rFPV的构建。以FPV为载体表达病原体保护性抗原基因构建rFPV基因工程疫苗的报道很多。现有技术中，如表达MDV糖蛋白B的rFPV的构建及其免疫效力试验(Yanagida等人，Yanagida等人，Yanagida N，Ogawa R，Li Y et al.Recombinant fowlpox viruses expressingthe glycoprotein B homolog and the pp38 gene of Marek’s di sease virus.JVirol，1992，66(3)：1402-1408.；Yoshida等人，Yoshida S，Lee LF，Yanagidaet al.The glycoprotein B genes of Marek’s disease virus serotypes 2 and3：identification and expression by recombinant fowlpox viruses.Virology，1994，200(2)：484-493，Omar等人，Omar AR，Schat KA，Lee LF et al.Cytotoxic T lymphocyte response in chickens immunized with a recombinantfowlpox virus expressing Marek’s disease herpesvirus glycoprotein B.VetImmunol Immnopathol，1998，62(1)：73 82；Liu等人，Liu X，Peng D，Wu Xet al.A recombinant fowlpox virus vaccine expressing glycoprotein B genefrom CVI988/Rispens strain of MDV：protection studies in differentchickens.Acta Virol，1999，43(2-3)：201-204))；如表达NDV融合蛋白、血凝素神经氨酸酶基因的rFPV的构建及其免疫效力试验(Taylor等，1996；Taylor J，Christensen L，Gettig R et al.Efficacy of a recombinant fowl pox-basedNewcastle disease virus vaccine candidate against velogenic andrespiratory challenge.Avian Dis，1996，40(1)：173-180；Nagy等人，NagyE，Krell PJ，Heckert RA et al.Vaccination of chickens with a recombinantfowlpox virus containing the hemagglutinin-neuraminidase gene ofNewcastle disease virus under the control of the fowlpox virus thymidinekinase promoter.Can J Vet Res，1994，58(4)：306-308；Wu等人，Wu YT，PengDX，Liu XF et al.A recombinant fowlpox virus expressing the fusion proteinof Newcastle disease virus strain F48E8 and its protective efficacy.ChinesJournal of Biotechnology，2000，16(5)：591-594.)；如表达AIV血凝素基因的rFPV的构建及其免疫效力试验(Tripatby等人，Tripathy DN，Schnitzlein WM.Expression of avian influenza virus hemagglutinin by recombinant fowlpoxvirus.Avian Dis，1991，35(1)：186-191.；Boyle等人，Boyle DB，Selleck P，Heine HG.Vaccinating chickens against avian influenza with fowlpoxrecombinants expressing the H7 haemagglutinin.Aust Vet J，2000，78(1)：44-48；Swayne等人，Swayne DE，Garcia M，Beck JR et al.Protection against diverse highly pathogenic H5 avian influenza virusesin chickens immunized with a recombinant fowlpox vaccine containing an H5avian influenza hemagglutinin gene insert.Vaccine，2000，18(11-12)：1088-1095；)。
上述的rFPV均可免疫鸡使其产生针对相应疾病的免疫保护作用，同时也均存在免疫鸡增重减缓的副反应，可作为表达cIFN-II基因的rFPV组合疫苗中的另一组份。
实验例1rFPV-IFN-II体内cIFN-II对雏鸡体重增长的影响
1日龄SPF雏鸡随机分为3组，20只/组，于颈部皮下分别接种剂量为106PFU的，经上述实施例得到的rFPV-IFN-II和wtFPV，另一组鸡接种PBS作空白对照。
接种后7天、14天称重，并按SPSS软件中方差分析对各组鸡的体重数据作统计学分析(表1)，试验表明，接种7天、14天后rFPV-IFN-II免疫鸡的体重显著高于wtFPV免疫鸡，与空白对照组的增重趋势一致，证明rPFV-IFN-II在体内表达的cIFN-II能减轻rFPV对雏鸡增重的抑制作用。
表1：rFPV-cIFN-II表达的cIFN-II对SPF雏鸡增重的影响
| 组别 | 鸡数 | 免疫后7天雏鸡体重(g) | 免疫后14天雏鸡体重(g) |
| Wt-FPV | 20 | 62.8+7.3a | 98.8+1 3.5a |
| rFPV-cIFN-II | 20 | 70.8±6.2b | 117.2±11.9b |
| 健康对照 | 20 | 68.6±8.4b | 125.5±18.2b |
数据：平均体重标准差a、b有显著性差异(P＜0.05)
实验例2rFPV对免疫鸡的体重影响
将SPF鸡随机分组，每组8只，1日龄称重后，按翅膀、皮下、腹腔分别接种表达MDV gB的rFPV(rFPV-gB)，20日龄称体重。试验结果表明，rFPV-gB以不同途径稀释接种1日龄SPF鸡，翅膀、腹腔、颈部皮下注射105、106PFU rFPV-gB和皮下注射106PFU FPV一样可减缓免疫鸡的增重，与健康对照组鸡的体重差异明显(表2)
表2rFPV-gB经不同免疫途径接种SPF鸡对体重的影响
| 组别 | 接种途径 | 接种剂量 | 存活率 | 1日龄体重(g) | 20日龄体重(g)* |
| 1 | 刺种 | 106 | 8/8 | 33.0 | 128.6a |
| 2 | 刺种 | 105 | 8/8 | 32.6 | 128.6a |
| 3 | 皮下 | 106 | 8/8 | 33.3 | 125.0a |
| 4 | 皮下 | 105 | 7/7 | 32.5 | 122.5a |
| 5 | 腹腔 | 106 | 8/8 | 33.4 | 118.0a |
| 6 | 腹腔 | 105 | 8/8 | 33.2 | 124.3a |
| FPV | 皮下 | 106 | 8/8 | 33.0 | 126.0a |
| 健康对照 | - | - | 8/8 | 32.7 | 142.0b |
*数字后的字母不同代表差异显著(P＜0.05)
实验例3不同剂量的表达cIFN-II基因的rFPV(rFPV-cIFN-II)与rFPV-gB组合疫苗对免疫鸡的增重影响和免疫效力影响
将SPF鸡随机分组，1日龄称重后，将本发明所述的疫苗颈部皮下接种，2种或2种以上病毒疫苗为混合疫苗一次注射。8日龄称体重后用Md5和RB1B各500PFU混合腹腔注射攻毒，试验鸡观察至攻毒后66天。观察记录死亡鸡和扑杀存活鸡的大体病变。试验结果表明，106或105PFU rFPV-cIFN-II和106PFU rFPV-gB配合接种鸡8日龄体重和健康对照组一样，而rFPV-gB及rFPV-gB和104PFUrFPV-cIFN-II配合接种鸡的8日龄体重与wtFPV一样，均显著低于健康对照组的体重(表3)。在观察不同剂量rFPV-cIFN-II对rFPV-gB的免疫效力的影响时可见，106PFU rFPV-cIFN-II和106PFU rFPV-gB接种的保护指数(PI)为56.7，而当rFPV-cIFN-II降至105PFU时PI为85.6 rFPV-cIFN-II降至104PFU时则PI为64.0，当106PFU的rFPV-gB、105PFU的rFPV-cIFN-II和4000PFU HVT配合成三价疫苗时，PI为100.0，为所有疫苗组中保护效力最高(表4)，说明105PFU的rFPV-cIFN-II在组合疫苗中不仅能降低rFPV免疫鸡减缓增重的副反应，还具有增强免疫效力的作用。
表3不同剂量的rFPV-cIFN-II和rFPV-gB组合疫苗免疫SPF鸡对增重的影响
| 疫苗 | 剂量(PFU) | 1日龄体重(g) | 8日龄体重(g) |
| rFPV-gB | 106 | 35.8 | 71.84a* |
| rFPV-gB+rIFN** | 106+106 | 35.2 | 79.88b |
| rFPV-gB+rIFN | 106+105 | 36.8 | 78.56b |
| rFPV-gB+rIFN | 106+104 | 36.2 | 72.76a |
| rFPV-gB+rIFN+HVT | 106+105+4000 | 35.0 | 78.40b |
| rFPV-gB+HVT | 106+4000 | 35.4 | 68.48a |
| rIFN | 106 | 36.4 | 79.32b |
| CVI988 | 5000 | 35.4 | 83.56b |
| HVT | 4000 | 35.2 | 79.16b |
| FPV(wt) | 106 | 36.6 | 71.08a |
| 健康对照 | - | 35.2 | 80.44b |
*数字后的字母不同代表差异显著(P＜0.05)
**表中rIFN＝rFPV-cIFN-II
表4不同剂量的rFPV-cIFN-II和rFPV-gB组合疫苗免疫SPF鸡对免疫效力的影响
| 疫苗 | 剂量(PFU) | MD阳性率 | PI* |
| rFPV-gB | 106 | 3/19 | 81.0bcde |
| rFPV-gB+r IFN** | 106+106 | 9/25 | 56.7b |
| RFPV-gB+rIFN | 106+105 | 3/25 | 85.6bcde |
| RFPV-gB+rIFN | 106+104 | 7/23 | 64.0bc |
| rFPV-gB-IFN+HVT | 106+4000 | 1/25 | 95.2de |
| rFPV-gB+rIFN+HVT | 106+105+4000 | 0/23 | 100.0e |
| rFPV-gB+HVT | 106+4000 | 1/25 | 95.2de |
| rIFN | 106 | 18/23 | 6.1a |
| CVI988 | 5000 | 2/24 | 90.0cde |
| HVT | 4000 | 5/25 | 76.0bc |
| FPV(wt) | 106 | 20/24 | - |
| 攻毒对照 | - | 20/24 | - |
| 健康对照 | - | 0/16 | - |
*数字后的字母不同代表差异显著(P＜0.05)
**表中rIFN＝rFPV-cIFN-II
实验例4rFPV-cIFN-II与rFPV-gB配合免疫鸡对ND血凝抑抗体
产生的影响
将SPF鸡随机分组，1日龄称重后，疫苗颈部皮下接种，2种或2种以上病毒疫苗为混合疫苗一次注射。3日龄进行新城疫疫苗的免疫，于免疫后7、11、16天采血，按β微量法测定ND的血凝抑制抗体(HI)。结果表明，rFPV-gB免疫鸡的ND HI抗体与FPV免疫鸡的一致，均比其余组的略低，而不同剂量的rFPV-cIFN-II与rFPV-gB组合免疫鸡的ND HI抗体与健康对照一致，rFPV-cIFN-II免疫组的NDHI抗体最高(表5)。说明rFPV-cIFN-II在rFPV组合疫苗中还能降低rFPV的免疫抑制作用。
表5不同剂量rFPV-cIFN-II和rFPV-gB组合疫苗免疫SPF鸡对ND HI抗体滴度(log2)的影响
| 疫苗 | 剂量(PFU) | ND免疫后天数 | ||
| 7 | 11 | 16 | ||
| rFPV-gB | 106 | 0.00 | 2.40 | 4.38 |
| rFPV-gB+rIFN* | 106+106 | 0.83 | 3.20 | 4.63 |
| rFPV-gB+rIFN | 106+105 | 0.83 | 3.40 | 4.63 |
| rFPV-gB+rIFN | 106+104 | 0.67 | 3.20 | 5.37 |
| rIFN | 106 | 1.16 | 3.60 | 5.50 |
| CVI988 | 5000 | 1.00 | 3.40 | 4.75 |
| FPV(wt) | 106 | 0.00 | 2.60 | 4.25 |
| 攻毒对照 | - | 0.67 | 3.60 | 4.87 |
| 健康对照 | - | 0.50 | 3.60 | 4.75 |
*表中rIFN＝rFPV-cIFN-II
Claims (12)
1、一种由表达选自鸡干扰素、鸡白细胞介素2或鸡白细胞介素12的免疫调节因子基因的重组鸡痘病毒和作为疫苗使用量的表达马立克氏病病毒糖蛋白B的病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒组成的疫苗，其中表达免疫调节因子基因的重组鸡痘病毒的剂量范围为103-105PFU/羽，作为疫苗使用量的表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒的剂量范围为104-106PFU/羽。
2、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的重组鸡痘病毒中的免疫调节因子为鸡的细胞因子。
3、根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述的鸡的细胞因子为鸡II型干扰素、鸡自细胞介素2或鸡白细胞介素12。
4、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的免疫调节因子是在同源启动子、异源病毒或人工合成启动子调控下表达出的免疫调节因子。
5、根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于所述的启动子为鸡痘病毒早晚期启动子。
6、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的表达免疫调节因子的重组鸡痘病毒为表达II型干扰素的重组鸡痘病毒。
7、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的病原体保护性抗原基因是引起禽类疾病的病原体的保护性抗原基因。
8、根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于所述的表达马立克氏病病毒糖蛋白B的病原体保护性抗原基因被下述基因中的任选一种、二种或二种以上替代：新城疫病毒融合蛋白基因或血凝素神经氨酸酶基因，传染性法氏囊病毒VP2蛋白基因，传染性喉气管炎病毒糖蛋白B基因，禽流感病毒血凝素基因，传染性支气管炎病毒S蛋白基因，鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白基因，并表达相应的病原体保护性抗原蛋白。
9、一种制备权利要求1中所述疫苗的方法，其特征在于将表达免疫调节因子的重组鸡痘病毒与作为疫苗使用量的表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒分别按剂量范围为103-105PFU/羽和剂量范围为104-106PFU/羽的比例混合。
10、根据权利要求9所述的方法，其中表达免疫调节因子的重组鸡痘病毒与作为疫苗使用量的表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒在配苗时混合。
11、根据权利要求9所述的方法，其中表达免疫调节因子的重组鸡痘病毒与作为疫苗使用量的表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒在使用时混合。
12、根据权利要求9所述的方法，其步骤包括：
①获得含cIFN-II基因、MDV gB基因、AIV HA基因、NDV F基因整个阅读框架的基因；
②将上述基因置于合适启动子下游，插入到含鸡痘病毒复制非必需片段和报告基因LacZ的插入载体中构建成转移载体；
③用转移载体转染已感染野生型鸡痘病毒的鸡胚成纤维细胞，通过同源重组获得表达免疫调节因子基因或病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒并进行纯化；
④分别增殖和收获表达免疫调节因子基因和表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒，进行病毒蚀斑测定，最后将表达免疫调节因子基因的重组鸡痘病毒和作为痘苗使用量的表达病原体保护性抗原基因的重组鸡痘病毒分别按剂量范围为103-105PFU/羽和剂量范围为104-106PFU/羽的比例混合。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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Granted publication date: 20070808 Termination date: 20120930 |