CN107129963A - 一种df‑1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法 - Google Patents

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Abstract

一种DF‑1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法，属于兽用生物制品技术领域。该细胞培养液每1000ml PBS溶液中含有以下组分：红芪多糖10‑30 mg、柚皮素5‑15 mg、黄芪皂苷5‑15 mg、菟丝子提取物10‑20 mg、腐胺1‑10 mg和谷胱甘肽5‑20 mg。本发明具有以下有益效果：本发明所使用的DF‑1细胞培养液添加剂，大大减少了血清的使用量，降低了细胞培养的成本；提高DF‑1细胞生长速度；增强IBDV对DF‑1细胞的敏感性，提高了TCID50含量；由本发明所使用的DF‑1细胞培养液还可以大幅度提高鸡传染性法氏囊活疫苗免疫原性。

Description

一种DF-1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种DF-1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法。
背景技术
DF-1细胞来源于ELL鸡胚胎，是一种可传代的鸡成纤维细胞系，该细胞无禽白血病病毒，肉瘤病毒内源性基因，同时在形态上呈纤维状。DF-1细胞系还是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增殖的细胞系。目前已被广泛用于动物病毒研究、疫苗研制、癌症研究等诸多领域，是生命科学领域重要的病毒转染、培养生物材料。
在传统的DF-1细胞培养中，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS) 一直被作为细胞培养基添加剂，但其在使用中存在诸多缺点：具有批间差异、成分不明确、有抑制生长的成分、不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化、容易被病毒和支原体感染；价格昂贵，需要大量验证工作、使用不方便、货源紧张，来源不稳定等问题，还有随着来自动物保护组织的压力，因此，胎牛血清将逐步被无血清培养基取代，无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分，既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，因而无血清培养基得到了越来越普遍的应用。
无血清培养基是以合成培养基为基础加入不同剂量的生长因子、结合蛋白、激素、低分子量营养物质（维生素、微量元素、脂类等），起到替代动物血清支持细胞正常生长代谢的作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种DF-1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法的技术方案。
所述的一种DF-1细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：红芪多糖10-30 mg、柚皮素5-15 mg、黄芪皂苷5-15 mg、菟丝子提取物10-20 mg、腐胺1-10 mg和谷胱甘肽5-20 mg。
所述的一种DF-1细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：红芪多糖15-25 mg、柚皮素8-12 mg、黄芪皂苷8-12 mg、菟丝子提取物12-18 mg、腐胺2-8 mg和谷胱甘肽12-18 mg。
所述的一种DF-1细胞培养液添加剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将所述重量份的组分混合后，加入到盛有PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，即得。
所述的DF-1细胞培养液添加剂的使用方法，其特征在于按照药物混合液：DMEM/F12重量比=1:1~1:2将两者充分混合后使用。
本发明中中红芪多糖购买于：西安天瑞生物技术有限公司；柚皮素购买于：武汉易泰科技有限公司；黄芪皂苷购买于：海佰世凯化学科技有限公司；菟丝子提取物购买于：西安原生植物工程技术有限公司；腐胺购买于：Sigma；谷胱甘肽mg购买于：Sigma。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所制备的DF-1细胞培养液添加剂，可替代血清，大幅度降低生产成本，保证了疫苗的质量和安全性。
2、本发明所制备的DF-1细胞培养液添加剂，可以大大提高细胞的生长速度。
3、本发明所制备的DF-1细胞培养液添加剂，可以促进鸡传染性法氏囊病毒对DF-1细胞的感染敏感性，提高其病毒含量，从而提高鸡传染性法氏囊活疫苗的免疫原性。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：培养液添加剂的制备
红芪多糖：10 mg （购买于：西安天瑞生物技术有限公司）
柚皮素：5 mg （购买于：武汉易泰科技有限公司）
黄芪皂苷：5 mg（购买于：海佰世凯化学科技有限公司）
菟丝子提取物: 10 mg （购买于：西安原生植物工程技术有限公司）
腐胺：1 mg （购买于：Sigma）
谷胱甘肽: 5 mg （购买于：Sigma）
将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM/F12=1:1制备一种DF-1细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
实施例2：培养液添加剂的制备
红芪多糖：12 mg （购买于：西安天瑞生物技术有限公司）
柚皮素：8 mg （购买于：武汉易泰科技有限公司）
黄芪皂苷：6 mg（购买于：海佰世凯化学科技有限公司）
菟丝子提取物: 12 mg （购买于：西安原生植物工程技术有限公司）
腐胺：5 mg （购买于：Sigma）
谷胱甘肽：8 mg （购买于：Sigma）
将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM/F12=1:1.5制备一种DF-1细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
实施例3：培养液添加剂的制备
红芪多糖：30 mg （购买于：西安天瑞生物技术有限公司）
柚皮素：15 mg （购买于：武汉易泰科技有限公司）
黄芪皂苷：15 mg（购买于：海佰世凯化学科技有限公司）
菟丝子提取物：20 mg （购买于：西安原生植物工程技术有限公司）
腐胺：10 mg （购买于：Sigma）
谷胱甘肽:20 mg （购买于：Sigma）
将以上各种成分混合后，加入到盛有一定量的PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，按照药物混合液：DMEM/F12=1:2制备一种DF-1细胞培养液添加剂，两者充分混合，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
试验例1 本发明培养液添加剂的应用
1材料
1.1 DF-1细胞培养液添加剂
按本发明实施例1-3制得
1.2 DMEM/F12基础培养基、胎牛血清 购于GIBCO公司，
硫乙醇酸盐培养基(TG)、胰酪蛋白胨培养基（TSB）购于北京中海生物科技有限公司
1.3 DF-1细胞 购于ATCC，由浙江美保龙生物技术有限公司保存
1.4 鸡传染性法氏囊病毒（D78株/B87株）， 购于中国兽医药品监察所
1.5 试验鸡 14日龄SPF鸡60只，购于青岛易邦生物技术有限公司实验动 物中心
2 方法
2.1 培养基检验
2.1.1 无菌检验
将实施例1-3制备的DF-1细胞培养液添加剂，各取3个不同批次进行无菌检验，每个批次分别取1ml接种于2支50ml TG大管中，1支置于35-37℃培养，1支置于23-25℃培养，3d后各吸取培养物分别接种于10个 TG小管，再分别置于35-37℃和23-25℃培养，另外每个批次分别取0.2ml接种于TSB小管内，置于23-25℃培养，同时做阴性对照，均培养7日，观察结果。
2.1.2 内毒素测定
将实施例1-3制备的DF-1细胞培养液添加剂，各取3个不同批次进行内毒素检验，每个批次分别取1.7ml用鲎试剂盒分别进行检测，用酶标仪选择波长405nm测其OD值，同时做阴性对照。
2.2 细胞生长速度测定
由实施例1-3使用的DF-1细胞培养液添加剂，以及含8%、10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液分别将已消化好的DF-1细胞，稀释成3*104个/ml的细胞密度接种于24 孔培养板，每孔培养液体积为 2mL，每种培养基接种 1块 24 孔培养板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养2d后，用 0.25%(w/v) 的胰蛋白酶溶液消化用不同培养液培养的DF-1细胞细胞各 4 个培养孔，用 Cedex AS-20 细胞密度和活力自动分析仪计数细胞密度和活力。
2.3 病毒培养
用DMEM/F12基础培养基将鸡传染性法氏囊病毒（D78株/B87株）稀释成1500 TCID50/ml，分别接种于由2.2培养的5种细胞中，分别置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养90 h 之后进行收毒。
2.4 TCID50测定
分别将由实施例1-3制备的DF-1细胞培养液添加剂培养的细胞、含8%、10%FBS的DMEM/F12培养液培养的细胞，均稀释成105～106 个/m L，按 0. 2 m L /孔转入96孔培养板中，置于37℃，5%的培养箱中培养2d，弃掉培养液上清，将2.3收获的鸡传染性法氏囊病毒（D78株/B87株）分别用DMEM/F12基础培养基作连续的10倍稀释 ，按0.2 mL /孔接种，置于37℃，5%的培养箱中培养4d，每天观察细胞病变并记录，按Reed-Muench 法计算TCID50。
2.5 免疫原性测定
将2.3收获的五种病毒液经检验合格，加入佐剂后制作成疫苗成品测定疫苗的免疫原性。将60只14日龄的SPF鸡共分为6组，每组10只，第Ⅰ组采用经本发明实施例1制备的培养液添加剂，用于培养DF-1细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫；第Ⅱ组采用经本发明实施例2制备的培养液添加剂，用于培养DF-1细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫；第Ⅲ组采用经本发明实施例3制备的培养液添加剂，用于培养DF-1细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫；第Ⅳ组采用含10%FBS培养基，用于培养DF-1细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫；第Ⅴ组采用含8%FBS培养基，用于培养DF-1细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒，经加工处理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，进行胸肌注射免疫。第Ⅳ组，疫苗对照组，不进行免疫。各组均在免疫后第7d、14 d 、21d、28d、35 d、45d、49d分别翅静脉采血并分离血清，用ELISA方法进行测定IBDV的抗体水平。
3 结果
3.1 检验结果
表1 无菌检验结果
表2 内毒素检验结果（405nm）
由表1、表2可以看出，由实施例1、2、3制备的不同批次的培养基添加剂均既无菌生长又不含内毒素，该方法制备的培养基添加剂安全可靠。
3.2 细胞密度及活力测定结果
表3 细胞密度测定结果
由表3可以看出，由实施例1、2、3制备的培养基添加剂培养的DF-1细胞密度明显大于含FBS培养基培养的DF-1细胞。
表4 细胞活率测定结果
由表4可以看出，在相同的培养时间内，由实施例1、2、3制备的培养基添加剂培养的DF-1细胞存活率明显大于由含FBS培养基培养的DF-1细胞。
3.3 TCID50测定结果
表5 TCID50测定结果
由表5可以看出，由实施例1、2、3制备的培养基添加剂培养的DF-1细胞比由含FBS培养基培养的DF-1细胞更有利于IBDV的繁殖，敏感性更强。
3.4 免疫原性测定结果
表6 IBDV的抗体水平测定结果
由表6可以看出，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的抗体水平明显高于Ⅳ、Ⅴ组，由实施例1、2、3制备的添加剂培养的IBDV的免疫原性高于含FBS培养基培养的IBDV。
4 结论
综上所述，本发明所使用的DF-1细胞培养液添加剂，在可以大大提高细胞的生长速度的前提下，一方面能增强鸡传染性法氏囊病毒对DF-1细胞的敏感性，提高病毒的TCID50含量；另一方面，还可以增强鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的免疫原性。

Claims (4)

1.一种DF-1细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：红芪多糖10-30 mg、柚皮素5-15 mg、黄芪皂苷5-15 mg、菟丝子提取物10-20 mg、腐胺1-10 mg和谷胱甘肽5-20 mg。
2.如权利要求1所述的一种DF-1细胞培养液添加剂，其特征在于每1000ml PBS溶液中含有以下组分：红芪多糖15-25 mg、柚皮素8-12 mg、黄芪皂苷8-12 mg、菟丝子提取物12-18mg、腐胺2-8 mg和谷胱甘肽12-18 mg。
3.如权利要求1或2所述的一种DF-1细胞培养液添加剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将所述重量份的组分混合后，加入到盛有PBS溶液中，边加边搅拌，直至完全溶解，补PBS溶液至1000ml，即得。
4.如权利要求3制得的DF-1细胞培养液添加剂的使用方法，其特征在于按照药物混合液：DMEM/F12重量比=1:1~1:2将两者充分混合后使用。
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