CN102660496A - 包含来自Cohn分级分离阶段上清液的哺乳动物细胞培养基及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及哺乳动物细胞培养基，其包含来自根据Cohn法人血浆分级分离的一些级分的人上清液，更加具体而言是级分I和II+III的上清液。当所述上清液作为培养基添加物加入时，其提供用于所培养哺乳动物细胞有效维持和/或增殖的多种营养素和因子。而且，本发明涉及所述培养基的制备方法及其在哺乳动物细胞培养中的用途。

Description

包含来自Cohn分级分离阶段上清液的哺乳动物细胞培养基及其用途
本申请是2010年7月27日提交的、发明名称为“包含来自Cohn分级分离阶段上清液的哺乳动物细胞培养基及其用途”的中国专利申请201010240474.5的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于哺乳动物细胞培养基的补充物。所述补充物从去纤维蛋白的人血浆(基本上无纤维蛋白原和纤维蛋白)获得，当它作为补充物添加至培养基中时，其提供用于所培养细胞的令人满意的维持和/或增殖的不同营养素和因子。
背景技术
在生物技术工业中使用细胞培养主要是产生重组蛋白和单克隆抗体。然而，在最近，已经发展了培养用于联合或不联合基因治疗的细胞治疗中的不同类型的核心细胞的技术。
为了成功培养和维持不同细胞系，需要模拟这些细胞体内所存在于的内部介质的条件的培养基。通常，培养基可以由基础培养基组成，基础培养基提供pH、营养素和盐并且可以向基础培养基中加入一系列补充物以保证细胞增殖。最广泛使用的补充物之一是动物血清。由于血清是动物来源的，可能会严重地限制了其用于获得在人中使用的产品，原因在于动物来源的残基作为外来抗原被识别并且可在接受者中引起不良反应。此外，动物血清具有缺乏确定成分的缺点，这是因为由于使用不同动物品系使得不同生产商之间存在大的差异性。此外，由于获得它们的方法不同，在批次之间存在大的差异性，这意味着在生长能力和特定培养物的生产方面会发生广泛的变化。
在建立细胞系中的主要困难是获得能够替代天然培养基例如胚胎提取物、蛋白质水解物或血清的适宜营养培养基。第一组培养基，例如Eagle基础培养基(MEM)(Eagle，H.(1955)″The specific aminoacid requirements ofmammalian cells(strain L)in tissue culture″.J.Biol.Chem.214：839)和更复杂的Morgan等的199培养基(Morgan，J.G.，Morton，J.H.和Parker，R.C.(1950)″Nutrition of animal cells in tissue culture.I Initial studieson a synthetic medium″.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.73：1)是确定成分培养基，但是它们需要5％和20％之间的血清补充物。
为了消除成分不确定的复合培养基的作用，已经配制了更加复杂的培养基，例如NCTC 109(Evans，V.J.，Bryant，J.C.，Fioramonti，M.C.，McQuilkin，W.T.，Sanford，K.K.和Earle，W.R.(1956)″Studies of nutrient media fortissue C cells in vitro.I A protein-free chemically defined medium forcultivation of strain L cells″Cancer Res.16：77)、135(Evans，V.J.和Briant，J.C.(1965)″Advances in tissue culture at the National CancerInstitute in the United States of America″，在″Tissue culture″中，由C.V.Ramakrishnan，W.Junk编，The Hague，第145-167页)、Ham F10和F12((Ham，R.G.(1963).″An improved nutrient solution for diploid Chinese hamsterand human cell lines″.Exp.Cell Res.29：515，Ham，R.G.(1965)″Clonalgrowth of mammalian cells in a chemically defined synthetic medium″Proc.Natl.Sci.USA 53：288)、MCDB系列(Ham，R.G.和McKeehan，W.L.(1978)″Development of improved media and culture conditions forclonal growth of normal diploid cells″In vitro 14：11-22)和补充激素的Sato培养基(Barnes，D.和Sato，G.(1980)″Methods for growth of culturedcells in serum-free medium″Anal.Biochem.102：255-270)。
为建立确定成分培养基的推荐方法是以补充有高浓度血清(20％)的丰富培养基例如Ham F12开始，并且测试用于减少血清量的补充物直到血清可以减少或者去除。
在对培养基成分研究数年之后，对它们仍然是以经验为主进行选择。
所使用的主要培养基以及它们的应用为：
-Eagle基础培养基(EBM)。这是仅具有必需氨基酸的基础培养基。其总是需要补充10％胎牛血清。其用于小鼠成纤维细胞和HeLa细胞的生长。
-Eagle极限必需培养基(MEM)。这是最常用的培养基，其包含比EBM更高浓度的更多氨基酸。其用于几乎所有类型培养并且需要添加血清(10％)。
-R.P.M.I.1640。这是设计用于淋巴母细胞和白血病细胞系悬浮生长的培养基。添加适宜的补充物之后，其具有广泛的应用。
-Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)。其包含浓度4倍于EBM的氨基酸和维生素。其在补充HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷)或HT(次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷)后用于选择杂交瘤。
-Iscove改良DMEM(IMDM)。这是非常完全的培养基，具有除了其他成分之外还包括牛白蛋白、转铁蛋白和亚硒酸盐的配方。其在无血清培养基中的淋巴细胞培养中是十分有用的。其还用于其它细胞类型，但是在该情况下需要低浓度血清。
-McCoy 5a培养基。设计用于大鼠和人二倍体细胞系的生长。
-Leibovitz L-15培养基。用于病毒培养。
-Ham F-10培养基。其用于人细胞系生长并且必须补充蛋白质和激素。其包含金属，例如Fe、Cu和Zn。其用于羊水细胞培养。
-Ham F-12培养基。添加蛋白质补充物后，其用于细胞系生长。其与IMDM结合用作无血清培养基。
-培养基199。其极其广泛地用于未分化细胞的培养并且用于研究染色体病症。
所有培养基包含下列成分：
1.平衡盐溶液(BSS)。
2.氨基酸。
3.维生素。
4.具有低分子量的其它有机补充物(核苷、三羧酸循环中间体、丙酮酸、脂类)。
5.激素和生长因子(血清)。
6.污染物生长抑制剂(抗生素和抗真菌剂)。
在成分不确定培养基中，血清通常提供激素和生长因子。所使用的血清类型是小牛血清(CF)、胎牛血清(FCS)、马血清(HS)和人血清(HuS)。最广泛使用的是小牛血清，而胎牛血清用于要求更高的细胞系并且人血清用于人细胞系。
血清的使用是有疑问的，因为尽管血清成分部分地已知，但具有以不定量存在的、会明显影响培养的非常多的成分。此外，血清在批次与批次之间不同，这是由于获得血液的技术、获得血清的方法(血液凝固)和分离血清的条件的差异以及各血清来源之间的差异造成的。此外，血清批次的每一变化需要一系列冗长且昂贵的检查。此外，如果培养基产物不得不纯化的话，血清中不定成分的存在使得这些过程明显更加困难。
一些血清因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)，刺激成纤维细胞增殖，这在建立专门的原代培养中成为一个难题，特别是当它们的含量广泛变化时更是如此。
总体上看，在培养基中包含血清对于试验方案和细胞生产标准化而言是一个重大的缺点。因此，正投入巨大的精力来建立用于细胞生长的具有确定成分的培养基。除了所寻找的重现性之外，这还使得建立所需要的细胞类型在其中可以生长的选择性培养基。这些培养基的缺点是在许多情况下细胞生长更低并且细胞系的存活力仅保留了少数几代。
已经做出多种尝试以产生用于细胞培养基的、避免出现因当前使用血清所引起的问题的补充物。在其中，已经测试了来自人血浆的多个级分，并且在现有技术中对不同人血浆级分的有用性存在明显的矛盾。
一般而言，已经测试了源自使用Cohn法(Cohn E.J.等；J Am Chem Soc，1946)及其变化方法(Kistler和Friedli，Nischmann；Curling，JM编，Methodsof plasma fractionation，Academic Press 1980)的血浆分级分离的不同人血浆级分，所有这些测试均涉及使用在分级分离中获得的不同沉淀物，特别是该分级分离方法的不同的变化方法中的II+III、III、IV(IV1或IV4)和V级分或者它们的等效物。
分离上述级分(沉淀物)的最初目标是获得富含特定蛋白质的、作为用于所述蛋白质纯化的起始点的沉淀物，所述特定蛋白质例如对于II+III或III级分的γ-球蛋白和α和β-球蛋白、在IV级分中的α-球蛋白和转铁蛋白以及在V级分中的白蛋白。因此，这些级分通常具有单一类型的蛋白质，其他蛋白质作为杂质存在，通常以小得多的量存在。这些级分在细胞培养中的使用包括向培养基加入主要的蛋白质类型和作为杂质伴随的多种蛋白质，如果所述物质的使用是成功的，则在这当中一定存在在培养基中的细胞所需要的那些。时至今日，这还是补充细胞培养基的一个明显但无效率的方式。这一定是造成所获得结果存在差异的原因，因为对分级分离方法的小的改动不会明显影响主要蛋白质的回收，但是会在回收多种伴随蛋白质中带来巨大差异。例如，使用Cohn法在20％和25％之间的乙醇浓度、-5℃和6.9的pH下获得II+III级分。使用Nitschmann方法，以等效物质开始，其在19％的乙醇浓度、-5℃和5.8的pH下被沉淀。pH的这种改变使得所获得的级分具有不同的特性，特别是在γ-球蛋白和其它伴随蛋白质的含量上不同。
此外，与沉淀级分的使用相比，上清液的使用具有另外的优点，包括维持培养基中高白蛋白浓度，以及最重要的是避免成分(例如激素、细胞因子、脂质等)的损失，所述成分对于细胞生长是重要的，并且不会存在于沉淀物中或者在超过20％的醇浓度存在下失去它们的功能性(被失活)，例如用于在一定条件下(25％)沉淀II+III级分或者沉淀IV1+IV4和V级分所使用的浓度(40％乙醇)。
文献EP0143648(Macleod)描述了II+III、III、IV1和IV4级分作为代替动物血清的培养基补充物的用途。其还阐述了II级分和V级分皆不能用于该应用中。在所有情况中，该文献排他性地提到了Cohn分级分离或其变体中沉淀的级分。此外，该文献公开了用于从上述级分中获得适宜补充培养基的物质的方法。该方法基本上由在水中悬浮沉淀物并且将所述沉淀物匀化组成。接着，调节pH以达到更好的蛋白质溶解并产生细胞生长的生理条件。此外，该方法还考虑了通过以聚乙二醇沉淀消除存在的γ-球蛋白和通过分子排斥层析分离低分子量的物质。因此，以该方式制备的物质的有效性极其依赖于特定制备方法。
Macleod的另一篇文献(Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，Vol.37；1988)表明II、III和IV级分对细胞生长具有少的影响或者没有影响，这可能归因于生长抑制剂的存在，并且还将注意力集中在作为补充物培养基的理想物质的IV4级分。
EP 0 440 509(Macleod)描述了基于Cohn法IV级分或II+III级分的用于细胞培养基的补充物，以及用于获得它的方法。使用所述的方法，获得了基本上无免疫球蛋白、病毒灭活的和稳定的产物。免疫球蛋白通过聚乙二醇沉淀加以分离，并且病毒通过巴氏消毒法在作为稳定剂的山梨糖醇存在下灭活。该方法特别适用于IV(IV1或IV4)级分。
文献EP 0264748(Antoniades)描述了作为代替动物血清的细胞培养基补充物的Cohn V级分的上清液。根据该文献，该物质的优点是没有成本并且它可以加热至60℃达20小时。
V级分的上清液是来自Cohn分级分离的最终废物并且因此它们的使用显然没有经济成本，未减损所述分级分离的益处。该物质具有高乙醇含量(40％)，这具有高的毒性，并且该文献没有阐明的这一点必须被消除。此外，对于在60℃下的所述处理，所存在的蛋白质将必须被稳定化，但是该细节也从该文献省略了，使得该发明难以入所述产生。在该情况下如此高浓度乙醇的变性效应也不应该被低估。
WO 94/18310(Mankarious)描述了从Cohn IV4级分产生用于细胞培养基的补充物的方法。该方法考虑IV4级分的悬浮和随后的净化，并且还考虑通过巴氏消毒法和/或过滤灭活或消除病毒。
专利GB 2 166 756 A描述了用于培养生产干扰素的脾细胞的方法。该方法基于RPMI培养基，其补充有从已经除去纤维蛋白原并且特征在于前清蛋白和γ球蛋白已经被去除的血清或血浆获得的血清级分(第1页，第30-34行)。在优选实施方案中，该级分通过用10％和20％之间的醇在pH 5.85下沉淀来纯化(第1页，第37-38行)。在具体实施方案中(获得EPF级分)，用作培养基的上清液在19％的乙醇浓度和pH 5.85下获得(第2页，第44-45行)。透析所获得的上清液以除去乙醇，然后冻干以便保存。任选地，其被冻干而没有经过先前透析以及随后也没有去除乙醇。根据发明人所述，通过使用补充所述级分的培养基(RPMI)，获得了极好的干扰素生产。在血浆的醇沉淀中，必须仔细设置工艺条件(乙醇浓度、pH、培养基的离子强度、温度和蛋白质浓度)以维持溶液中的特定蛋白质并且使其他物质不溶解以便其他物质被沉淀并因此被分离。一个或一个以上所述条件的变化将使所获得的产物明显不同，其中乙醇浓度和pH是决定所获得的沉淀物和上清液组成的因素。
还做出了其它尝试以使用人来源的血清或血清级分代替胎牛血清来补充细胞培养基，如文献WO 2004/055174、EP 1820852或CA 1177424中所示。从全血或者从血浆获得的血清不能与明确确定成分的和表征的血浆级分相比，并且具有在不同批次之间缺乏再现性的缺点。此外，这些文献中没有一个在限定和表征所使用物质的确切组成成分中取得成功。因此，与使用动物来源血清相关的大多数问题继续出现。
Kwok等描述了来自孕妇的血浆代替胎牛血清用于培养特定细胞类型的用途，其效果被归因于未知因子的存在。他还假定人白蛋白在该类型培养中具有协同效应。本领域技术人员明白，使用来自孕妇的血浆目的是寻找与胎儿血清中的那些细胞生长因子相当的细胞生长因子的存在，但是该物质的同质性与来自成千上万的供体的血浆混合物不能相比，如下面所述。
如上面所述，对于作为细胞培养基补充物来替代动物血清已经做出众多尝试。这些尝试中的一些尝试了人血浆级分，特别是使用Cohn法的级分。尽管如此，当前动物血清继续广泛用作哺乳动物细胞培养基的补充物，而对使用人血浆衍生物替代它的尝试已经失败。
从上面所有情况可以推断出，在现有技术，没有这样的人源物质可利用，其可用于补充细胞培养基并且其就病原体传播而言是安全的、可以以可接受的成本和利润以工业规模获得、在各个批次之间具有足够的一致性以及具有药物级质量。
发明内容
发明人开展了旨在以人血浆级分替代动物来源血清作为培养基补充物的研究，并且令人惊奇的是他们已经发现，从Cohn分级分离上清液、特别是II+III级分上清液或者I级分上清液开始，能够补充细胞培养基并且就细胞生长而言得到优异的结果。该物质的使用解决了上述问题，因为它是人源的、使用具有可接受成本与利润的优良制造规范(GMP)工业获得的、显示了足够一致性和批次间再现性、以及具有药物级质量。此外，该物质可以通过避免病原体传播的方法处理。
用于制备这些衍生物的方法在下文描述。
首先，从健康供体获得人血浆，向血浆中以保证血浆不凝固的足够的量加入仅包含在本发明中优选使用的柠檬酸钠的抗凝剂溶液。为改善血细胞的保存而加入一些物质(例如碳水化合物如葡萄糖)不是必须的，因为在本发明中使用的血浆是基本上无细胞的，这已有可能通过抗凝剂存在下的血浆去除术获得，而不是通过全血捐赠。
抗凝剂的量和获得、储存和处理人血浆所必须满足的其他标准描述于公众可获得的影响人血浆分级分离工业的国际标准中，例如美国联邦法规、美国食品和药品管理局(FDA)和欧洲药品评价局(EMEA)的指令和标准、以及国际协调大会(ICH)和国际药典如欧洲、日本或美国药典的指令和标准以及称作现行优良制造规范(cGMP)的标准。在本文件的其余部分，所有这些标准将被称作“用于制药目的的影响人血浆分级分离的标准组”。该组标准也适用于下文所述的本发明的阶段。
一旦已经获得人血浆，按照用于制药目的的影响人血浆分级分离的标准组，并且在本发明的优选使用中尤其根据欧洲药典专著0853的要求，冷冻、储存和运输人血浆。分析每一血浆单位(捐赠物)以排除先前经过问卷和按照上述标准进行体格检查的供体中病毒感染标志物的存在。在本发明的优选应用中，不使用可能存在病毒感染标志物的供体的血浆，直到供体在六个月内经受两次评定过程，并且到那时供体变成了“合格供体”。
在本发明的优选应用中，分析从每一捐赠物获得的样品以排除感染标志物的存在，诸如例如人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒(HBV和HCV)以及对人为病原性的其他病毒。本发明的一部分是血浆捐赠物的受控储存达不少于60天、优选不少于90天的期间，这将允许如果先前健康的供体在捐赠后表现出被病原体或者其他健康危险因素感染征兆则撤出先前的捐赠。在本发明的优选应用中，来自每一捐赠物的样品在从可变数量，例如可在10和10,000之间、优选在90和2000之间并且更优选在100和1000之间变动的数量的捐赠物制备中试混合物(小池或中试池)之后重复分析一次或者一次以上。扩增病毒遗传物质的方法可以用于这些重复的分析，诸如例如聚合酶链式反应(PCR)或归属于核酸测试(NAT)的那些已知方法中的其他方法。
一旦所有分析和受控储存期(库存仓)完成，在通过分析排除了不适宜的单位之后，血浆可用于本发明的随后阶段。
下一个阶段由将编号不少于100个单位、优选超过1000个单位并且更优选超过4000个单位的捐赠物融化组成。在本发明的优选应用中，融化将在0℃和4℃之间的温度下进行。在融化过程中将捐赠物混合以产生血浆混合物(血浆库)。任选地，所沉淀物质可被分离，因为在融化过程中其是不稳定的。其通常描述为冷沉淀物并且富含von Willebrand因子(FVW)、VIII因子(FVIII)、纤维蛋白原(FBN)、纤连蛋白(FNC)和其他蛋白质。
接着，在本发明的优选使用中，向血浆加入96％的制药级乙醇一直到浓度近似8％(体积/体积)。为了保证蛋白质不会因为乙醇溶解于血浆的放热过程而变性，其以可控体积加入。同时地并且以相同的目标，血浆库的温度逐渐降低至近似-2℃。乙醇的存在保证血浆不冻结。在这些条件下，如果所述冷沉淀物在本发明应用中没有在加入醇之前分离，则纤维蛋白原极其丰富的并且包括在冷沉淀物中存在的大部分蛋白质的蛋白质级分被沉淀。该级分总称为Cohn级分I(Fr-I)，因为其通过基本上对应于Edwin J.Cohn(Cohn E.J.等；J Am Chem Soc，1946)所述的方法获得。当在该阶段获得的沉淀物被分离时，发现上清液级分基本上无纤维蛋白原，并且因此无纤维蛋白原在细胞培养中可导致的任何干扰，因此一旦所加入的醇因其具有细胞毒性而被去除后，这作为细胞培养基补充物适合本发明的目的。
在本发明的优选应用中，在较早描述的两种沉淀物(冷沉淀物和Fr-I)中任何一个已经分离或者均未分离之后，向现有的混合物加入96％的制药级乙醇至20％和25％(体积/体积)之间的浓度。为了避免因为乙醇溶解于血浆中的放热过程所致的蛋白质变性，加入以受控体积开展。同时地并且以相同的目标，血浆库的温度逐渐降低至近似-5℃。乙醇的存在保证血浆不冻结。在这些条件下，蛋白质级分被沉淀，在所述蛋白质级分中，先前描述的存在于冷沉淀物和Fr-I(如果其还没有被分离，如较早所述)的蛋白质极其丰富并且免疫球蛋白、主要是IgG和IgM也极其丰富。如果Cohn Fr-I级分没有先前分离的话，则该级分总称为I+II+III级分(Fr-I+II+III)，或者如果Cohn Fr-I先前已经被分离，则该级分总称为II+III级分(Fr-II+III)。当在该阶段获得的沉淀物被分离时，发现上清液级分基本上无纤维蛋白原和免疫球蛋白，并且因此无这些蛋白质在细胞培养中可导致的任何干扰，因此一旦所加入的醇因其具有细胞毒性而被去除后，这作为细胞培养基补充物适合本发明的目的。
在所述的阶段中，向生产血浆衍生物质的过程施加控制，以保证过程依照关于蛋白质浓度、pH、微生物计数等所需要的规范开展。
这些上清液通过基本上对应于Edwin J.Cohn所述的方法获得，尽管由于生产规模(捐赠物数量和血浆库体积)和根据本发明的过程与在那时应用的过程之间的变化导致在组成成分上可能不同。
从人血浆的工业分级分离(基于Cohn法)直接获得的这些上清液，除了去除它们所包含的乙醇(在I级分上清液中为近似8％并且在II+III级分上清液中为近似20％-25％)之外，不需要随后的纯化处理。
在这些上清液中包含的乙醇可以通过现有技术中已知的任何方法去除。优选地，其通过透析或渗滤或直接通过冷冻干燥、蒸发或干燥(例如喷雾干燥)开展，此类方法容易工业化。
获得完全稳定产物的有效制备方法由下列组成：以所述的任何上清液开始，和任选的以注射用水、生理盐水溶液或者缓冲液，在pH 7-8和2-8℃之间的温度下适当稀释它们。溶液通过不吸收蛋白质的纤维素板或深板净化，并且最后其经近似0.5微米的孔大小净化。然后使用近似10kDa额定分子量截留值的膜将产物对两倍或两倍以上体积的注射用水、生理盐水溶液或者缓冲液在近似7的优选pH下渗滤。优选地，渗滤交换体积的数量为近似5。
渗滤的溶液通过使用0.2至0.1微米孔大小的过滤梯度的绝对过滤净化。接着，产物可以经过近似35nm和20nm的孔大小，优选地在2-8℃的温度下和小于或等于1巴的跨膜压力下进行纳米过滤。所应用的加载优选是大约70升/m2具有较小孔大小的过滤面积。
所获得的产物可以通过超滤浓缩至与起始物质(上清液)相同的总蛋白浓度值，或者如果优选的话更大程度浓缩。
在任一情况中，所获得的物质计量装入玻璃管形瓶或容器中，并且优选储存于-30℃或者更低的温度下直至使用。在将上清液计量装入管形瓶内之前的步骤中，可以通过0.1和0.2微米之间的孔大小开展灭菌过滤。
冻结的产物也可以被冻干或者经受其他处理以提供干燥的产物。然后产物可以经受γ辐射并且可以以干燥状态优选在2至8℃下保存直至使用。
如果对起始物质(S/Fr-I或S/Fr-II+III或等效物)没有开展渗滤并且选择通过冷冻干燥法直接去除醇，则其被计量装入玻璃小瓶或容器中。在将上清液计量装入管形瓶中之前，可以通过0.1和0.2微米之间的孔大小开展灭菌过滤过程。所测量的物质优选在小于或等于-30℃的温度下冻结，并且使用已知技术使其经受冷冻干燥和γ辐射。
任选地，物质可以以用于消除/灭活病原体的方法处理。优选地，或者冻结或者冻干的物质以15和35千戈瑞之间的γ辐射被照射，其中使用25千戈瑞获得在成分稳定与病毒消除之间的最适条件。
冻干产物可以储存长时间段，优选在2-8℃之间。
至于细胞增殖，Fr-II+III上清液以冻干形式保存在冷冻机(2-8℃)保持稳定(增殖百分数等于(100±20)％或大于FCS)达至少168天。
在Ham F12培养基中重构的该物质在小于或等于-18℃的条件下保持稳定达至少113天(细胞增殖百分数等于或者大于时间零点)。
补充有50％S/Fr-II+III的Ham F12培养基在冷冻机中的稳定性是4天。
保存该物质直至其被使用的优选方式是在其最终包装内作为冻干物。以该方式，其可以直接计量成剂量并且乙醇可以在实际的冷冻干燥过程中去除。
将这些上清液加入至包含除了细胞生长所必需成分之外的无机盐、氨基酸和维生素的常规无血清培养基中，例如Ham F12培养基或Dulbecco改良培养基(DMEM)。
所获得的培养基可以用于培养广泛多种哺乳动物细胞。本领域技术人员已知的常规技术和培养条件以此目的使用。
冻干上清液可以在基础培养基例如Ham F12培养基或Dulbecco改良极限必需培养基(DMEM)中、在蒸馏水或去离子和无热源的水中、或者在细胞培养中常见的盐水溶液或缓冲液中重构。
在培养基中重构的上清液可以用于通过加入2％和50％(v/v)之间的重构上清液，例如：2ml的在培养基中重构的级分I上清液或级分II+III上清液与98ml基础培养基(2％)，来补充基础培养基。另一实例将是加入50ml在培养基中重构的级分I上清液或级分II+III上清液与50ml基础培养基(50％)。
推荐的是，在水、盐水溶液或者适宜细胞培养的缓冲液中重构的上清液以2％和20％(v/v)之间的浓度加入至基础培养基中，例如20ml重构上清液加入至80ml培养基中(20％)。如果需要50％(v/v)的浓度，重构的上清液将必须加入至双倍浓缩的基础培养基中(2×)，例如加入50ml水中的级分I上清液或级分II+III上清液至50ml的2×基础培养基中。
所补充的培养基可以用于通常的培养技术，并且该补充的培养基可以直接使用或者预先经0.22μm过滤。
保存的冻结物质(上清液)必须在加入基础培养基中之前融化。一旦融化，则推荐将其以2％和20％(v/v)的浓度加入至基础培养基中，例如20ml的重构级分II+III上清液加入至80ml培养基中(20％)。如果需要50％(v/v)的浓度，当补充培养基时，级分I或级分II+III上清液将必须加入至双倍浓缩的培养基(2×)中，例如加入50ml级分II+III上清液至50ml的2×基础培养基中。
所补充的培养基可以用于通常的培养技术，并且补充的培养基可以直接使用或者经0.22μm过滤后使用。
实施例1
级分I和II+III上清液的制备
通过血浆去除术产生的各个血浆捐赠物混合并融化，融化在反应器内于0℃和4℃之间的可控温度下开展。最后，获得3783kg血浆。
为了分离冷沉淀物，在9000和12000×g之间离心血浆，而保持离心温度在0℃和4℃之间。
为了分离级分I，检查了冷沉淀物上清液(C/S)的蛋白质浓度，其应该近似5％。如果其较高，则用注射用水稀释。pH也调整至近似7。
以C/S开始，加入乙醇至8％(体积/体积)的浓度。乙醇加入的速度必须缓慢(小于或等于2kg/分钟)并且适度搅拌以避免变性。在加入乙醇过程中，在沉淀反应器中上清液的温度逐渐降低直到其达到最终温度-2℃。最终pH必须近似7。
在大约2小时的反应之后，离心以分离级分I。该离心在9000和12000×g之间进行。所获得的上清液(S/Fr-I)以0℃和-4℃之间的温度保存。
在该点，或者在C/S中，凝血酶原复合物可以任选地通过离子交换层析(Curling，JM编；Methods of plasma fractionation，Academic Press 1980)提取。
为了分离级分II+III，S/Fr-I的pH调整至近似7并且加入乙醇至其近似20％(体积/体积)。加入乙醇的速度必须缓慢(小于或等于2kg/分钟)并且适度搅拌以避免变性。在加入乙醇的过程中，在沉淀反应器中上清液的温度逐渐降低至近似-5℃的终温度。最终pH应该大约7。
在该实施例中，在近似6小时的反应之后分离级分II+III。
在该点(级分II+III的上清液)，或者在C/S中，或者在S/FrI中，抗凝血酶可以任选地通过肝素亲和层析(Fernandez J.等，Sangre 41(增刊3)42(1996)提取。
实施例2
剂量测量和冷冻干燥
根据实施例1获得的级分II+III的上清液以注射用水稀释至pH 7-8并且温度在2℃和8℃之间直到达到8％的乙醇浓度。溶液通过可达0.5微米孔大小的纤维素板净化。接着，产物任选地使用10kDa额定分子量截留值的聚砜膜在注射用水存在下于pH 7下经受渗滤以去除乙醇。在渗滤过程中的交换体积数量是5。
溶液通过使用0.2微米至0.1微米孔大小的过滤梯度的绝对过滤净化。接着，产物可以任选地经过35nm和20nm的孔大小，使用铜-铵纤维素滤器于2℃和8℃之间的温度下和小于1巴的跨膜压力下进行纳米过滤，最多直到滤器被堵塞。
产物可以通过超滤浓缩至与起始物质相同的总蛋白浓度值，并且在通过0.2微米的孔大小灭菌过滤之后，计量装入玻璃管形瓶并且储存于-30℃下直至使用。
冻结的产物也可以被冻干以提供干燥的产物，所述干燥的产物经受γ辐射并且可以在2℃和8℃之间的温度下保存直至使用。
实施例3
根据实施例2获得的不同批次物质(在H2O中重构的冻干上清液)的主要成分与胎牛血清的主要成分比较示于下表：
Figure BDA00001667768600131
Figure BDA00001667768600141
  渗透压(mOsm/kg)   302.00±12.29   234.67±35.30   632.5
  浊度(NTU)   21.52±2.20   158-281   2753
  pH(1％)   7.39±0.03   8.42±0.14   9.44
  碳酸氢盐(mmol/L)   13.00±1.73   2-6   18±9
  氯化物(mmol/l)   106.00±1.00   71.80±3.12   182
  钾(mmol/l)   10.67±0.58   2.87±0.23   6
  钠(mmol/l)   137.33±3.21   130.33±4.93   252
  钙(mg/L)   139.90±8.03   53.07±6.45   65.70±0.87
  磷(mg/dL)   9.37±1.08   2.17±0.21   2.97±0.06
  锌(μg/L)   3162.67±523.64   611.50±24.75   1318
  铅(μg/L)   ＜5   ＜5   ＜5
*＝3个批次在被冻干前被分析。
ND＝未测定
Figure BDA00001667768600142
Figure BDA00001667768600143
Figure BDA00001667768600151
  碱性磷酸酶(U/g蛋白质)   0.03-1.14   0.78±0.10   1.06±0.19
  γ-谷氨酰胺转肽酶(GGT)(U/L)   9.67±0.58   14.67±2.08   16
  血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(SGOT)(U/L)   24.00±3.46   9.00±1.73   8
  乳酸脱氢酶(LDH)(U/L)   433.67±38.18   ＜50   ＜50
  基础胰岛素(μU/mL)   76.97±12.45   ＜2-2.53   12.23±1.78
  17-β雌二醇(pg/mL)   30.77±7.45   41.13±6.09   46.78±5.07
  孕酮(ng/mL)   ＜0.20-0.20   0.46-0.85   0.80±0.13
  总睾酮(ng/mL)   0.14±0.02   1.79±0.28   2.52±0.14
  游离睾酮(pg/mL)   ＜0.03-0.17   3.69±0.49   3.98
  总甲状腺素(T4)(μg/dL)   13.07±0.47   4.12±0.34   6.51±0.38
  游离T4(ng/dL)   3.00-＞6   0.99±0.09   1.17±0.10
  甘油三酯(mg/dL)   59±6.56   18.67±0.58   117.25±8.54
  胆固醇(mg/dL)   34±4.36   31±4.58   137.50±4.12
  HDL-胆固醇(mg/dL)   9.67±1.53   9.33±2.08   6-14
  LDL-胆固醇(mg/dL)   10-17   17.67±3.06   105.25±2.22
  VLDL-胆固醇(mg/dL)   11.67±1.53   4   23.50±1.73
  游离脂肪酸(mEq/L)   ＜0.10   0.19±0.03   0.30±0.1
  总磷脂(mg/dL)   44.33±4.04   57±5.00   152.50±38.39
*＝3个批次在被冻干前被分析。
Figure BDA00001667768600152
*＝3个批次在被冻干前被分析。
实施例4
使用以级分I上清液补充的培养基对CHO细胞系开展细胞增殖试验
CHO细胞系由具有上皮形态学和黏附性生长的中国仓鼠卵巢细胞构成。所使用的培养物来自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，目录号为85050302。
如上所述，级分I上清液用Ham F12培养基重构。
不同浓度(体积/体积)的级分I加入到培养基(20％；40％；60％；80％和100％)中，以及补充有20％(v/v)胎牛血清(FCS)的培养基中和未补充的培养基中。
以每孔50μl CHO细胞悬浮液、在未补充培养基中5×105和1×106个细胞/ml之间的浓度接种于96孔板。
待试验的每孔50μl的培养基加入到板的每一列中，以致于最终稀释度将给出未补充的培养基、补充有10％FCS和补充有10％、20％、30％、40％和50％的级分I上清液。
将96孔板在37℃下、含8％CO2的大气下以及高的相对湿度下(细胞培养箱)孵育48小时。
100μl未补充培养基加入到一列中作为对照样品。
在孵育48小时之后，向每一孔加入10μl的WST-1/ECS试剂，该试剂来自商业可获得的Millipore细胞增殖测定试剂盒，目录号2210。
在用于细胞系的通常培养条件下(37℃；8％CO2)孵育2至4小时之后，将板摇动1分钟并且在微孔板读数器内于420-480nm波长下测量吸收性，参照波长读取为大于600nm(通常使用用于读取和数据分析以检查仪器的Magellan软件V 6.3，在Tecan SUNRISE读数器中在450nm波长和620nm的参照波长下读取板)。
高于对照样品加上其两倍标准差的吸收值被认为对于该技术是阳性的。
在接下来的步骤中，对照样品的平均值从板中剩余孔的数值中扣除。
计算每一列中孔的平均值(一旦对于该技术的对照样品已经被扣除)，将每一列的平均值分别与未补充培养基平均值和补充FCS或不同浓度级分I上清液的培养基平均值比较。
在未补充培养基中的细胞被认为没有增殖(0％)并且因此在该列中的平均吸收值从所有列的全部平均值中扣除。
参照培养基(补充有10％FCS的Ham F12培养基)的吸收值被认为是100％的增殖数值，并且因此，一旦未补充培养基的数值已经被扣除，则来自先前点的所有平均值与该数值相除获得相对于参照培养基的增殖百分数。
作为一般规则，对于补充20％和50％之间的级分I上清液的培养基，所获得的增殖百分数类似于参照培养基(含10％胎牛血清的培养基)或者高得多(含50％级分I上清液的培养基)。
增殖结果作为百分数示于下面。
CHO细胞在补充有FCS或S/Fr I的Ham F12培养基中的增殖(％)
Figure BDA00001667768600171
S/S：不含补充物；FCS：胎牛血清；alb：白蛋白
实施例5
使用补充有级分II+III上清液的培养基对CHO细胞系的细胞增殖试验
所开展的试验与前面的试验相同，只是以级分II+III上清液代替级分I上清液来补充培养基。
至于增殖结果，使用20％级分II+III上清液补充培养基的结果类似于使用参照培养基(补充有10％FCS)所获得的那些结果，并且当使用补充有50％级分II+III上清液的培养基时，增殖结果大于使用参照培养基所获得的那些结果。
增殖结果作为百分数示于下面。
CHO细胞在补充有FCS和S/Fr-II+III(n＝4)的Ham F12培养基中的增殖(％)
Figure BDA00001667768600181
S/S：不含补充物；FCS：胎牛血清；alb：白蛋白
实施例6
使用补充有γ照射的级分II+III上清液的培养基对CHO细胞系的细胞增殖试验
所开展的试验与前面的试验相同，只是以剂量25和35kGy(千戈瑞)进行γ照射的级分II+III上清液补充培养基。
至于增殖结果，在使用没有照射的级分II+III上清液和以25和35kGy照射的级分II+III上清液所获得的结果之间不存在显著性差异。
增殖结果作为百分数示于下面。
CHO细胞在补充有FCS、S/Fr-II+III或γ照射的S/Fr-II+III的Ham F12培养基中的增殖(％)
  S/S   10％FCS   50％S/Fr.II+III[G3]   50％S/Fr.II+III 25kGy   50％S/Fr.II+III 35kGy
  0   100   155   150   142
S/S：不含补充物；FCS：胎牛血清；kGy：千戈瑞
实施例7
使用补充有γ照射的级分II+III上清液(25kGy)的培养基对Vero细胞系的细胞增殖试验
所开展的试验与在实施例1中的试验相同，只是使用基础培养基、Dulbecco改良极限必需培养基(DMEM)以及代替CHO细胞系的Vero细胞系。
Vero细胞系由非洲绿猴的肾细胞构成，这些细胞的形态学类似于具有黏附生长习性的成纤维细胞(成纤维细胞样)。所使用的培养物来自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，目录号84113001。
所获得的增殖结果显示十分类似于或者大于用γ照射级分II+III上清液以超过30％补充的参照培养基所获得的结果。以20％的γ照射级分II+III上清液补充的培养基获得与参照培养基(补充有10％FCS的基础培养基)极其相似的结果。
增殖结果作为百分数示于下面。
Vero细胞在补充有FCS或γ照射的S/Fr-II+III(n＝8)的DMEM培养基中的增殖(％)
Figure BDA00001667768600191
S/S：不含补充物；FCS：胎牛血清；alb：白蛋白；kGy：千戈瑞
实施例8
使用补充有50％级分II+III上清液(25kGy)的
Ham F12培养基对CHO细胞系的亚培养
使用CHO细胞培养物大致接近汇合的瓶。
轻轻倒出培养基。
使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)以近似10ml/25cm2于20℃和37℃之间的温度下洗涤细胞单层并且轻轻倒出。
以2ml/25cm2培养表面积加入包含胰蛋白酶0.05％/EDTA 0.02％的溶液(胰蛋白酶可以是重组的或者动物来源的)。将溶液散布于整个表面，以致于其形成一薄膜并且轻轻倒出多余的溶液。
将瓶置于20℃和37℃之间的温度下直到细胞从表面分离。
补充有50％级分II+III上清液(25kGy)的Ham F12培养基以每一培养瓶5ml和15ml之间加入。
通过摇晃瓶子或者吹吸将细胞分离并且将细胞计数。
将它们以1∶3和1∶10之间的比例分散到新的培养瓶内。
在新培养瓶中的补充有50％级分II+III上清液(25kGy)的Ham F12培养基的总体积应该是0.2至0.3ml/cm2培养表面。
瓶在细胞培养箱中于37℃、高的相对湿度以及对于所使用培养基适宜的CO2浓度(在该例中为8％)下培养。
培养基必须每一至三天更换一次。
在使用补充有50％S/Fr-II+III(25kGy)的培养基多次传代之后，观察到培养物仍然能存活并且具有生长能力。
在75cm2表面上监测生存力、群体倍增时间(PDT)和细胞总数达16次连续传代，其中平均生存力为92.79％，平均PDT为73.8小时，并且平均细胞总数为4.34×106个细胞/75cm2。在9次连续传代过程中使用参照培养基获得的结果为97.81％的平均生存力、27.49小时的平均PDT和1.28×107个细胞/75cm2的平均细胞总数。
在第二个试验中，在使用50％、20％和10％S/Fr-II+III培养的CHO细胞中，在3至7次传代过程中监测相同的参数。对于在补充有50％S/Fr-II+III的培养基中培养的细胞，得到的PDT为103.22，生存力为90.21％和细胞总数为6.14×106个细胞/75cm2。对于在补充有20％S/Fr-II+III的培养基中培养的细胞，得到PDT为70.45，生存力为94.89％和细胞总数为7.72×106个细胞/75cm2。对于在补充有10％S/Fr-II+III的培养基中培养的细胞，得到PDT为83.04，生存力为91.07％和细胞总数为5.87×106个细胞/75cm2。
实施例9
使用补充有20％级分II+III上清液(25kGy)的Ham F12培养基对CHO细胞系的亚培养
以与上面实施例相同的方式开展亚培养，只是使用补充有20％级分II+III上清液(25kGy)的Ham F12培养基代替补充有50％级分II+III上清液(25kGy)的Ham F12培养基。
在使用补充有20％S/Fr-II+III(25kGy)的培养基多次传代之后，观察到培养物仍然能存活并且具有生长能力。
在该例中，在6次连续传代过程中监测了生存力、PDT和75cm2上的细胞总数，其中平均生存力为97.13％，平均PDT为86.32小时，并且平均细胞总数为5.96×106个细胞/75cm2。
实施例10
Fr-II+III上清液的稳定性测量为补充有在Ham F12中重构的50％Fr-II+III上清液的培养基与补充有10％胎牛血清的培养基相比的CHO细胞增殖百分数。
表1
在4℃下的冻干稳定性
Figure BDA00001667768600211
Fr-II+III上清液以冻干形式储存在冷冻机(2℃-8℃)中保持稳定(增殖百分数等于(100±20)％或大于FCS)至少168天。
表2
重构稳定性≤-18℃
  批次1   T＝0   T＝98天   T＝105天   T＝113天
  板1   129.69   111.36   136.82   136.53
  板2   138.75   118.08   75.27   154.03
  平均   134.22   114.72   106.05   145.28
  批次2   T＝0   T＝28天   T＝91天   T＝98天
  板1   79.52   159.77   76.00   132.29
  板2   87.40   184.16   171.67   133.30
  平均   83.46   171.96   123.84   132.79
在Ham F12培养基中重构的该物质在小于或等于-18℃的温度下保持稳定至少113天(细胞增殖百分数等于或大于时间零点)。

Claims (10)

1.用于培养哺乳动物细胞的培养基，特征在于除了用于哺乳动物细胞培养的基础培养基中的通常营养素之外，其包含Cohn法级分II+III的上清液。
2.根据权利要求1的培养基，特征在于Cohn法级分II+III的上清液从来自至少1000个人供体的混合物获得。
3.根据权利要求1或2的培养基，特征在于Cohn法级分II+III的上清液被干燥。
4.根据权利要求1或2的培养基，特征在于Cohn法级分II+III的上清液被冻结。
5.根据权利要求3的培养基，特征在于Cohn法级分II+III的上清液被冻结。
6.根据权利要求1至5任一项的哺乳动物细胞培养基的制备方法，特征在于所述Cohn法级分II+III的上清液的制备包括阶段
-使用乙醇沉淀
-分离上清液
-冻结或干燥
和任选的阶段
-稀释和/或
-透析或渗滤和/或
-去除病原体；
并且随后将如此制备的上清液加入至基础培养基中。
7.根据权利要求6的方法，特征在于干燥的上清液在基础培养基中、在蒸馏水或去离子和无热源的水中、或者在细胞培养中常用的盐水溶液或缓冲液中重构。
8.根据权利要求6的方法，特征在于干燥的上清液在基础培养基中重构。
9.根据权利要求6至8的方法，特征在于人血浆从来自至少1000个人供体的混合物(库)获得。
10.包含根据权利要求1至5的培养基在培养哺乳动物细胞中的用途。
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