CN113423819A - 用于改善哺乳动物胚胎的培养和植入的组合物、其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用包含使用科恩方法的人血浆分级分离的一种或更多种级分的组合物进行的哺乳动物胚胎的植入，其中在所述组合物中，人血清白蛋白(HSA)在所述组合物的总蛋白的90％与96％之间，α球蛋白和β球蛋白在所述组合物的总蛋白的3.5％与9.99％之间，且γ球蛋白在所述组合物的总蛋白的0.01％与0.5％之间。此外，本发明涉及所述组合物的制备方法以及所述组合物在哺乳动物胚胎的培养中的用途。

Description

用于改善哺乳动物胚胎的培养和植入的组合物、其制备方法 及其用途

描述

本发明涉及辅助生殖技术的领域。具体而言，本发明涉及用于改善哺乳动物胚胎的培养和植入(implantation)的组合物，所述组合物包含根据科恩(Cohn)方法的人血浆分级分离的富含人血清白蛋白(HSA)的一种或更多种级分。此外，本发明涉及所述组合物的制备方法及所述组合物在哺乳动物胚胎的培养中的用途。

现今，辅助生殖技术在大多数发达国家是可得的，且实践与早期所使用的实践有很大不同。实验室技术和临床实践的完善已允许体外受精(in vitro fertilization，IVF)发展成高效、安全、易于获得且相对负担得起的医疗程序。

IVF是在实验室培养皿中将女性的卵子和男性的精子相结合(joining)。体外意指在身体之外。受精意指精子附着于卵子并进入卵子。经受精的卵子(fertilized egg)为胚胎。胚胎发育包括一系列细胞分裂。培养并检查所述胚胎以确保其恰当地发育。

胚胎的培养是选择可存活且遗传上正常的胚胎的关键且重要的步骤。因此，经改善的哺乳动物胚胎的培养应能够实现胚胎转移并导致增加的植入率。尝试改善培养基可以说是促进体外胚胎发育的最常见的方法。

若干因素影响IVF的成功。具体而言，适当的胚胎培养条件和培养基配方(formulation)是两个必不可少的要求(Mauri等人，Clinical assisted reproduction:aprospective,randomized comparison of two commercial media for ICSI and embryoculture,J Assist Reprod Genet,2001；18(7):378-381；Summers和Biggers,Chemicallydefined media and the culture of mammalian preimplantation embryos:historicalperspective and current issues,Hum Reprod Update,2003；9(6):557-82；Hentemann和Bertheussen,New media for culture to blastocyst,Fertil Steril,2009；91(3):878-83；Paternot等人，Early embryo development in a sequential versus singlemedium:a randomized study,Reprod Biol Endocrinol,2010；8:83)。因此，为了获得成功植入到子宫中的哺乳动物胚胎，需要模仿生理条件的经改善的胚胎培养基。一般而言，现有技术中已经针对培养基考虑了两种可能的配方：一种是基于序贯式胚胎培养基(sequential embryo culture medium)且另一种是基于单一培养基。

序贯式胚胎培养基牵涉将胚胎序贯地转换至两种不同的培养基，第一种培养基可将胚胎从1-细胞阶段驱动至8-细胞阶段，第二种培养基将胚胎从8-细胞阶段驱动至胚泡(blastocyst)阶段。序贯式培养基尝试模仿胚胎首先在输卵管中且稍后在子宫中遇到的可变环境条件。

单一培养基提供了胚胎在不同发育阶段所需的全部成分，且因此不需要将胚胎转换至不同盘。目前，大多数辅助生殖中心中应用连续培养基。

当胚胎到达胚泡阶段时，它们的代谢要求与植入前胚胎不同。为了满足这些代谢需要并确保适当的胚胎发育，培养基必须具有较高的蛋白质浓度。

回到在IVF的最初几年，人血清被用于胚胎培养，但是人血清由于对来自供体的潜在感染的污染的安全性低而被抛弃(Blake等人,Protein supplementation of humanIVF,J Assist Reprod Genet,2002；19(3):137-43；Leveille等人，Effects of humansera and human serum albumin on mouse embryo culture,Genet,1992；9(1):45-52)。逐渐地，人血浆来源的白蛋白和重组白蛋白被用作蛋白补充剂。然而，补充单独的经纯化的白蛋白无法使胚胎发育超过胚泡阶段。如今，有许多允许使植入前胚胎(胚泡)过渡至它们的植入后体外发育的培养基。然而，这些培养基是实验性的，或者包括组分诸如激素、外源血清或人脐带血清，所述组分不确保GMP质量且因此不能被批准用于临床使用(Morris等人，Dynamics of previous-posterior axis formation in the developing mouseembryo,Nat Commun,2012；3:673；Ajduk和Zernicka-Goetz,Advances in embryoselection methods,F1000 Biol Rep,2012；4:11；Shahbazi等人，Self-organization ofthe human embryo in the absence of maternal tissues,Nat Cell Biol,2016；18(6):700-708；Bedzhov等人，In vitro culture of mouse blastocysts beyond theimplantation stages,Nat Protocol,2014；9(12):2732-9；Deglincerti等人，Self-organization of the in vitro-linked human embryo,Nature,2016；533(7602):251-4)。

在最近几年，辅助生殖技术已经历渐进式优化。然而，每个经转移的胚胎的怀孕率仍然低(约30％)。增加IVF的效率的基石是胚胎植入(Zhang等人,Physiological andmolecular determinants of embryo implantation,Mol Aspects Med,2013；34(5):939-80)。当前，不同方法(实验方法及临床方法二者)都尝试改善胚胎植入的效率，但成功率不高或较低。

成功的植入需要胚泡获得植入能力与子宫内膜的接受状态之间的同步(Dey等人,Molecular cues to implantation,Endocr Rev,2004；25(3)341-373；Tranguch等人，Molecular complexity in establishing uterine receptivity and implantation,Cell Mol Life Sci,2005；62(17)1964-1973；Wang和Dey,Roadmap to embryoimplantation:clues from mouse models,Nat Rev Genet,2006；7(3)185-199)。

使用包括内置显微镜的时差培育箱(time-lapse incubator)允许同时且不中断地观察胚胎，而无需将它们从培育箱取出。为了适应此装置，开发了允许胚胎从1细胞阶段培养至胚泡的单一培养基。这种胚胎培养基替换序贯式培养基，该序贯式培养基在胚胎培养的过程期间需要更换一次或两次培养基。尽管一些研究显示，单一不中断的培养可以在早期阶段期间改善培养效率，但在自桑椹胚至胚泡的后期阶段中，这种培养基的益处尚无统计学支持(Sciorio等人,Comparison of the development of human embryoscultured in either an EmbryoScope or benchtop incubator,J Assist ReprodGenet,2018；35(3):515-522)。回顾性研究表明，单一培养基培养可以总体改善体外培养的效率，亦改善植入率，但对怀孕率没有真正的显著的影响(Alhelou等人,Embryo cultureconditions are significantly improved during uninterrupted incubation:arandomized controlled trial,Reprod Biol,2018；18(1):40-45)。胚胎发育的时差追踪包括无扰培养及支持胚胎评估的视觉信息的应用。在时差培养中用于转移的胚胎的选择基于图像监测与用于胚胎选择的形态动力学(morphokinetic)算法的图像分析的组合。然而，这些算法的全面的统计评估指示(i)并非所有算法都是同等预测性的；外部参数，诸如(ii)胚胎的初始形态及(iii)母亲年龄在判定中具有较大影响。

此外，植入前遗传诊断(PGD)包括对培养中的胚胎进行活组织检查以得到少许细胞以便进行遗传分析。这是一种提供关于胚胎是否受单基因疾病和/或染色体损伤(非整倍体)影响的信息的侵入性方法。然而，PGD不提供关于胚胎植入能力的预测信息(Cimadomo等人,The impact of biopsy on human embryo developmental potential duringpreimplantation genetic diagnosis,Biomed Res Int,2016；2016:7193075)。此外，大多数植入前胚胎是遗传镶嵌的，意味着不同细胞具有不同遗传背景。这对于对早期胚胎(即8-细胞阶段)进行的活组织检查来说尤其如此。回顾性研究显示，PGD的使用不显著改善胚胎植入率(Geraedts和Sermon,Preimplantation genetic screening 2.0:the theory.MolHum Reprod,2016；22(8):839-44；Sermon等人,The why,the how and the when of PGS2.0:current practices and expert opinions of fertility specialists,molecularbiologists,and embryologists.Mol Hum Reprod,2016；22(8):845-57)。

总而言之，自合子阶段(一个细胞)至胚泡阶段的胚胎培养是经相对优化的。然而，在胚胎被转移到患者后，植入成功率仍相对较低。出于此原因，有必要开发出改善胚胎被转移到子宫后的植入能力或在转移阶段产生强壮胚胎的新颖的培养组分。

发明人已进行了密集且广泛的旨在使用具有人血浆级分的不同培养基的研究，并且他们惊讶地发现，通过使用包含科恩方法的一种或更多种级分的组合物，与在现有技术的条件下培养的胚胎相比，有可能改善体外胚胎培养并在它们的植入方面获得更好的结果，其中在所述组合物中，HSA在组合物的总蛋白的90％与96％之间，α球蛋白和β球蛋白在组合物的总蛋白的3.5％与9.99％之间，且γ球蛋白在组合物的总蛋白的0.01％与0.5％之间。例如，较高百分比的完全孵化成功的胚胎显示了这些较好的结果。

在本发明中，术语“科恩方法”意指Edwin J.Cohn(Cohn等人,Preparation andproperties of serum plasma proteins,IV.A system for the separation intofractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues andfluids,J.Am.Chem.Soc,1946；68:459-475)开发的分离血浆蛋白的方法或其任何变化形式。

本发明的组合物的另一个优点是它可以获自人血浆。

因此，本发明公开了一种用于哺乳动物胚胎的培养的组合物，使用所述组合物为辅助生殖技术专家产生了新治疗工具。使用通过本发明公开的方法获得的组合物的有效性基于使用科恩方法的富含HSA的一种或更多种级分，它们一起诱导胚胎黏附至培养盘，改善所述哺乳动物胚胎的植入。

在第一方面，本发明公开了一种用于改善哺乳动物胚胎的植入的组合物，所述组合物包含使用科恩方法的人血浆分级分离的一种或更多种级分，其中在所述组合物中，HAS在组合物的总蛋白的90％与96％之间，α球蛋白和β球蛋白在组合物的总蛋白的3.5％与9.99％之间，且γ球蛋白在组合物的总蛋白的0.01％与0.5％之间。

优选地，所述级分选自科恩方法的级分I、级分II+III、级分IV和级分V或者级分I的上清液、级分II+III的上清液、级分IV的上清液和级分V的上清液。优选地，所述级分是科恩方法的级分II+III的上清液和级分V。

在具体实施方案中，科恩方法的级分II+III的上清液可以被进一步加工。在获得级分II+III的上清液后，使其经历不同阶段直至获得最终产品。这些阶段通常包括：稀释、澄清、渗滤、纳米过滤、通过超滤浓缩、灭菌、填充至小瓶中并在将所述小瓶提交至γ辐照之前最终冻干所述小瓶或其组合。

在另一种具体实施方案中，科恩方法的级分V可以被进一步加工。在获得级分V后，将级分V重新悬浮于溶液中并使其经历不同阶段直至获得最终产品。这些阶段通常包括：渗滤、热处理、灭菌、填充至小瓶中并在将所述小瓶提交至检疫之前对所述小瓶进行最终巴氏杀菌(一般在30至32℃不少于14天的时间段期间，目标为确保最终产品无菌)或其组合。

在另一种具体实施方案中，将级分II+III的上清液和级分V以它们本身或作为进一步加工的生产中间物或最终产品提交至具有消除病原体的能力的一个或更多个生产步骤。

在本发明的组合物的具体实施方案中，所述HSA处于50mg/ml至250mg/ml的最终浓度。优选地，所述HSA以100mg/ml的最终浓度存在于组合物中。

此外，本发明公开了用于制备包含本发明的组合物的胚胎培养基的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用上文公开的方法获得本发明的组合物；

b)向通常用于哺乳动物胚胎培养的任何胚胎培养基添加10％至50％(v/v)的所述组合物。

优选地，本发明的组合物以20％存在于胚胎培养基中。

最后，本发明公开了如上文所述的组合物用于在哺乳动物胚胎植入之前培养该哺乳动物胚胎的用途。

在下文，参考实施例描述本发明，但是，实施例不意图限制本发明。

本发明将参考附图在下文进行描述，其中：

图1是显示与组合物I和组合物II相比，组合物III(本发明的组合物)在胚泡阶段对哺乳动物胚胎的培养的性能改善的结果的图。所述培养的改善被测量为从“囊泡(bleb)”序贯式进展至“半孵化”，直至它们到达完全“孵化”的胚胎的百分比。“停顿(arrested)”指被阻断在胚泡、未进一步发育的那些胚胎。

图2是在使用组合物I和组合物III的培养中使经孵化的胚胎黏附至培养盘表面的结果的图。

图3是使用组合物I和组合物III的胚胎在胶原蛋白水凝胶中植入的共聚焦显微镜图像的图解。

在下文，参考实施例描述本发明，但实施例不意图限制本发明。

实施例

实施例1：本发明的组合物和比较性组合物的制备及表征。

组合物I(表I)与组合物III的不同的处在于，组合物I具有较高量的白蛋白和较低量的α-1球蛋白。另一方面，组合物II与组合物III的不同的处在于，组合物II具有较低量的白蛋白和较低量的α-1球蛋白。

所述组合物的主要组分的组成在下表中示出：

	组合物I	组合物II	组合物III
				血清白蛋白(g/L)	198.1±0.4	22.7±1.8	107.6±1.5
α-1球蛋白(g/L)	2.3±0.2	1.3±0.2	6.4±0.4
				α-2球蛋白(g/L)	未检出	2.7±0.7	2.2±0.2
β球蛋白(g/L)	未检出	2.2±0.4	1.6±0.3
				γ球蛋白(g/L)	未检出	0.5±0.1	0.5±0.1

血清白蛋白(％)	98.9±0.1	77.1±2.2	91.0±0.5
				α-1球蛋白(％)	1.1±0.1	4.5±0.3	5.4±0.4
α-2球蛋白(％)	未检出	9.0±1.4	1.8±0.2
				β球蛋白(％)	未检出	7.5±0.7	1.3±0.2
γ球蛋白(％)	未检出	1.6±0.3	0.4±0.1

总蛋白(g/L)

200.3±0.3

29.5±3.2

118.3±1.1

表I：组合物I、组合物II和组合物III(本发明的组合物)的主要组分的组成。

实施例2：在存在本发明的组合物和比较性组合物的情况下小鼠胚胎的发育的评估(示于图1)。

为确定胚胎培养的效率，使用HSA的最终浓度作为参考，制备了不同的蛋白质制剂。将KSOMAA(Millipore；USA)用作基础培养基，其具有牛血清白蛋白(BSA，5mg/ml)以用于使小鼠胚胎培养物E0.5进入胚泡阶段(E3.5)。在到达胚泡阶段时，将一些胚胎保留在KSOMAA(BSA 5mg/ml)中作为对照，并将其余胚胎转移至不具有BSA且补充有以下的新KSOMAA培养基：

-第I组：基于使用科恩方法的人血浆分级分离的级分的组合物I，包含多于96％的HSA、少于3.5％的α球蛋白和β球蛋白及少于0.5％的γ球蛋白。级分应以22.5mg/ml HSA的最终浓度添加。

-第II组：基于使用科恩方法的人血浆分级分离的级分的组合物II，包含在70％与90％之间的HSA、在9.5％与28％之间的α球蛋白和β球蛋白及在0.5％与2％之间的γ球蛋白。级分应以5mg/ml HSA的最终浓度添加。

-第III组(组合物III，其为本发明的组合物)：使用科恩方法的人血浆分级分离的级分，包含在90％与96％之间的HSA、在3.5％与9.99％之间的α球蛋白和β球蛋白及在0.01％与0.5％之间的γ球蛋白。级分应以22.5mg/ml HSA的最终浓度添加。

将处于胚泡阶段(E3.5)的胚胎留在培养箱中培养直至E6.5天以允许完全孵化。通过照片每天记录它们的形态。在孵育期结束(E6.5)时，评估培养物中胚胎的发育阶段。

如图1所示，最高百分比的完全孵化成功的胚胎是在存在第III组的组合物的情况下培养的那些胚胎，第III组的组合物为本发明的组合物。具体而言，在存在第III组的组合物的情况下，62％的胚胎得以孵化，而在存在第I组的组合物的情况下，46.8％的胚胎得以孵化。在存在BSA(5mg/ml)的情况下或在存在第II组的组合物的情况下培养的胚胎分别以53.9％和37.2％的效率孵化。胚胎在不同发育阶段的分布显示，在存在第III组的组合物的情况下培养的胚胎具有两个优先阶段，它们或者仍处于胚泡形式，或者大多数直接进展至完全孵化。在这些条件下，几乎没有胚胎处于中间步骤，例如它们未被检测处于囊泡阶段。这些结果表明，与在其他条件下相比，本发明的组合物更有效地允许可存活的胚胎的发育的进展。

实施例3：培养物中孵化的胚胎的黏附的评估(示于图2)。

在此实施例中，如果孵化的小鼠胚胎在最佳条件下培养，它们能够黏附至培养盘并增殖。黏附包括附着至玻璃或塑料表面的胚胎滋养层的向外生长，胚胎滋养层不能通过用吸头冲洗来重新附着。在图2中，比较了在存在第I组的组合物的情况下从阶段E3.5培养至阶段E7.5的胚泡的黏附能力的测量值与用第III组的组合物培养的胚胎。结果显示，当在存在第III组的组合物的情况下培养时，孵化的胚泡的黏附存在令人惊讶的增加。具体而言，73.3％的在第III组的组合物中培养的胚胎黏附至盘，而在存在第I组的组合物的情况下至多1.3％的胚胎能够黏附。在另外两种条件下，仅很少百分比的胚胎或没有胚胎黏附至盘。

实施例4：胚胎在胶原蛋白水凝胶中的植入(示于图3)。

在初步研究中，将胚泡阶段的小鼠胚胎嵌入于胶原蛋白水凝胶中以允许它们的植入(US 20150305774 A1)。共聚焦显微镜允许在植入基质内在三维上观察转基因荧光胚胎。胶原蛋白纤维可以通过反射技术观察，且表现为以相对均匀的方式分布的去结构化的白色纤维网。如图3所示，在存在第III组的组合物的情况下培养的胚胎在与胚胎表面接触的某些区域中诱导纤维的一类显著的重塑。这种类型的基质重塑表明，如在体外细胞培养期间所记录的，胚胎通过强烈黏附并对基质施加力而植入基质中(Legant等人，Measurement ofmechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices,NatMethods,2010；7(12):969-71；Lesman等人,Cell tri-culture for cardiacvascularization,Methods Mol Biol,2014；1181:131-7)。然而，在存在第I组的组合物的情况下培养并转移至胶原蛋白基质的对照胚胎群体未能植入且胚胎没有进展。因为在胚胎嵌入后的第一小时期间发生胶原蛋白聚合，所以这些结果消除了当插入胚胎时由于胶原蛋白聚合的异质性而产生基质变形过程的可能性。相反，所述变形随时间推移逐渐发生，所以它们的存在表明胚胎的主动机械作用。亦令人惊讶的是，补充本发明的组合物不仅改善了胚胎的植入，还使它的寿命延长到至少第E9.5天。

Claims (11)

1.用于改善哺乳动物胚胎的植入的组合物，所述组合物包含使用科恩方法的人血浆分级分离的一种或更多种级分，其中在所述组合物中，人血清白蛋白(HSA)在所述组合物的总蛋白的90％与96％之间，α球蛋白和β球蛋白在所述组合物的总蛋白的3.5％与9.99％之间，且γ球蛋白在所述组合物的总蛋白的0.01％与0.5％之间。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述级分选自所述科恩方法的级分I、级分II+III、级分IV和级分V，或者级分I的上清液、级分II+III的上清液、级分IV的上清液和级分V的上清液。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述级分是所述科恩方法的所述级分II+III的上清液和所述级分V。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述科恩方法的所述级分II+III的上清液通过稀释、澄清、渗滤、纳米过滤、通过超滤浓缩、灭菌、填充至小瓶中并在将所述小瓶提交至γ辐照之前最终冻干所述小瓶或其组合来进一步加工。

5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述科恩方法的所述级分V通过渗滤、热处理、灭菌、填充至小瓶中并在将所述小瓶提交至检疫之前对所述小瓶进行最终巴氏杀菌或其组合来进一步加工。

6.根据权利要求3至5所述的组合物，其特征在于，所述级分II+III的上清液和所述级分V以它们本身或作为进一步加工的生产中间物或最终产品被提交至具有消除病原体的能力的一个或更多个生产步骤。

7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述HSA处于50mg/ml至250mg/ml的最终浓度。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述HSA处于100mg/ml的最终浓度。

9.用于制备包含本发明的组合物的胚胎培养基的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用下文公开的方法获得本发明的组合物；

b)将10％至50％(v/v)的所述组合物添加至通常用于哺乳动物胚胎培养的任何胚胎培养基。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述组合物以20％(v/v)存在于所述胚胎培养基中。

11.根据权利要求1至8所述的组合物用于在哺乳动物胚胎植入之前培养所述哺乳动物胚胎的用途。

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