KR20210128405A - 포유류 배아의 배양 및 착상을 개선하기 위한 조성물, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콘 방법을 사용한 인간 혈장 분획 중 하나 이상의 분획을 포함하는 포유류 배아의 착상과 관련되어 있고 상기 조성물 HSA는 조성물 내 총 단백질의 90 % 내지 96 % 이고, 알파 및 베타 글로불린은 조성물 내 총 단백질의 3.5 % 내지 9.99 % 이고, 감마 글로불린은 조성물 내 총 단백질의 0.01 % 내지 0.5 % 이다. 또한 본 발명은 포유류 배아의 배양에서 상기 조성물의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

포유류 배아의 배양 및 착상을 개선하기 위한 조성물, 이의 제조 방법 및 용도

본 발명은 보조 생식 기술 분야에 관한 것이다. 특히, 인간 혈청 알부민(HSA)이 풍부한 콘 방법(Cohn method)에 의한 인간 혈장 분획의 분획 중 하나 이상을 포함하는 포유류 배아의 배양 및 착상을 개선하기 위한 조성물에 대한 것이다. 게다가, 본 발명은 포유류 배아의 배양에서 상기 조성물의 제조 방법 및 용도에 대한 것이다.

오늘날 보조 생식 기술은 대부분의 선진국에서 사용할 수 있고 그 실행은 초기에 사용된 것과 크게 다르다. 실험실 기술과 임상 실험의 개선은 체외 수정(In Vitro Fertilization; IVF)이 효율적이고 안전하고 쉽게 접근할 수 있고 비교적 저렴한 의료 절차로 발전할 수 있게 하였다.

IVF는 샬레에서 여성의 난자와 남성의 정자를 결합한다. In vitro는 신체 외부를 의미한다. 수정이란 정자가 난자에 부착되어 난자에 들어가는 것을 의미한다. 수정란은 배아이다. 배아 발달에는 일련의 세포분열이 포함된다. 상기 배아는 배양되고 적절하게 발달되고 있는지 확인된다.

배아의 배양은 생존가능하고 유전적으로 정상적인 배아를 선택하기 위한 핵심적이고 중요한 단계이다. 따라서, 개선된 포유류 배아의 배양은 배아의 착상을 가능하게 하고 결과적으로 증가된 착상률을 가져와야 한다. 배양 배지를 개선하려는 시도는 틀림없이 시험관내 배아 발달을 촉진하는 가장 일반적인 접근이다.

몇몇의 요인이 IVF의 성공에 영향을 미친다. 적절한 배아 배양 조건과 배지 제형은 특히 두 가지의 필수요건이다(Mauri et al., Clinical assisted reproduction: a prospective, randomized comparison of two commercial media for ICSI and embryo culture, J Assist Reprod Genet, 2001;18(7):378-381; Summers and Biggers, Chemically defined media and the culture of mammalian preimplantation embryos: historical perspective and current issues, Hum Reprod Update, 2003;9(6):557-82; Hentemann and Bertheussen, New media for culture to blastocyst, Fertil Steril, 2009;91(3):878-83; Paternot et al., Early embryo development in a sequential versus single medium: a randomized study, Reprod Biol Endocrinol, 2010;8:83). 따라서, 성공적으로 자궁에 착상되는 포유류 배아를 얻기 위해서는 생리학적 조건을 모방하는 개선된 배아 배양 배지가 필요하다. 일반적으로 배양 배지에 대한 배양 배지에 대한 두 가지 가능한 제형이 선행기술에서 고려되었다: 하나는 순차적 배아 배양 비지를 기반으로 하고 다른 하나는 단일 배양 배지를 기반으로 한다.

순차적 배아 배양 배지는 배아를 2개의 다른 배지에 순차적으로 전환하는 것을 포함하며, 첫번째는 배아를 1-세포단계에서 8-세포단계까지, 두번째 배아를 -세포에서 배반포 단계로 유도할 수 있다. 순차 배지는 배아가 처음에는 나팔관에서, 나중에는 자궁에서 만나는 다양한 환경 조건을 모방하려 시도한다.

단일 배양 배지는 다양한 발달 단계에서 필요한 모든 성분을 배아에 제공하므로 배아를 다른 플레이트로 전환할 필요가 없다. 현재, 연속 배지는 대부분의 보조 생식 센터에서 시행된다.

배아가 배반포 단계에 도달하면 대사 요건이 착상 전 배아와 다르다. 이러한 대사 요건을 충족하고 적절한 배아 발달을 보장하려면 배양 배지의 단백질 농도가 더 높아야 한다.

IVF 초기에는, 인간 혈청이 배아 배양에 사용되었으나 기증자의 감염 가능성으로 인한 오염에 대한 낮은 안정성으로 인해 폐기되었다(Blake et al., Protein supplementation of human IVF, J Assist Reprod Genet, 2002;19(3):137-43; Leveille et al., Effects of human sera and human serum albumin on mouse embryo culture, Genet, 1992;9(1):45-52). 점진적으로 인간 혈장 유래 및 재조합 알부민이 모두 단백질 보충제로 사용되었다. 하지만 정제된 알부민만을 보충하는 것은 배아의 배반포 단계를 넘은 성장을 허용하지 않았다. 요즘에는, 착상 전 배아(배반포)를 착상 후 시험관내 발달로 전환할 수 있는 많은 배양 배지가 있다. 하지만 이러한 배양 배지는 실험적이거나 GMP 품질을 보장하지 않는 호르몬, 생체 이물 혈청 또는 인간 탯줄 혈청과 같은 구성성분을 포함하므로 임상 사용을 승인할 수 없다(Morris et al., Dynamics of previous-posterior axis formation in the developing mouse embryo, Nat Commun： 2012;3:673, Ajduk and Zermicka-Goetz, Advances in embryo selection methods, F1000 Biol Rep, 2012;4:11; Shahbazi et al., Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues, Nat Cell Biol, 2016;18(6):700-708; Bedzhov et al., In vitro culture of mouse blastocysts beyond the implantation stages, Nat Protocol, 2014;9(12):2732-9; Deglincerti et al”Self-organization of the in vitro-linked human embryo, Nature, 2016;533(7602):251 -4).

지난 몇 년간, 보조 생식 기술은 점진적인 최적화를 거쳤다. 하지만 착상된 배아당 임신율은 여전히 낮았다(~30 %). IVF의 효율을 증가시키기 위한 초석은 배아 착상이다(Zhang et al., Physiological and molecular determinants of embryo implantation, Mol Aspects Med, 2013;34(5):939-80). 현재 배아 착상의 효율성을 개선하기 위한 실험적 및 임상적 방법 모두 매우 보통이거나 낮은 성공을 거두고 있다.

성공적인 착상은 배반포에 의한 착상 능력의 획득과 자궁 내막 수용 상태 사이의 동기화를 필요로 한다(Dey et al., Molecular cues to implantation, Endocr Rev, 2004;25(3)341-373; Tranguch et al., Molecular complexity in establishing uterine receptivity and implantation, Cell Mol Life Sci, 2005;62(17)1964-1973; Wang and Dey, Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models, Nat Rev Genet, 2006;7(3)185-199).

현미경이 내장된 타임랩스 인큐베이터 사용은 인큐베이터에서 배아를 제거할 필요 없이 배아를 연속적이고 동시에 관찰할 수 있게 하였다. 이런 설정을 수용하기 위해, 단일 배양 배지가 개발되었고, 이는 1-세포 단계에서 배반포까지 배아의 배양을 허용한다. 이 배아 배양 배지는 배아 배양 과정에서 배지의 한번 또는 두번의 교체가 필요한 순차 배양 배지를 대체한다. 비록 일부 연구는 연속된 단일 배양이 초기 단계에서 배양 효율성을 향상시킬 수 있음을 보여주었으나 상실배에서 배반포에 이르는 후기 단계에서 이 배지의 이점은 통계적 근거가 없다(Sciorio et al., Comparison of the development of human embryos cultured in either an EmbryoScope or benchtop incubator, J Assist Reprod Genet, 2018;35(3):515-522). 후향 연구에 따르면 단일 배지 배양은 체외 배양의 효율성을 전반적으로 향상시킬 수 있고, 또한 착상율을 개선시킬 수 있으나, 임신율에 실질적이고, 상당한 영향을 미치지 않는다(Alhelou et al., Embryo culture conditions are significantly improved during uninterrupted incubation: a randomized controlled trial, Reprod Biol, 2018;18(1):40-45). 배아발달의 타임랩스 추적은 방해받지 않은 배양과 배아 평가를 지원하기 위한 시각 정보의 적용으로 구성된다. 타임랩스 배양에서 전환을 위한 배아의 선택은 배아선택을 위한 형태운동 알고리즘의 이미지 분석이 결합된 이미지 모니터링을 기반으로 한다. 그러나 이러한 알고리즘에 대한 철저한 통계적 평가는 (i) 모든 알고리즘이 동일하게 예측 가능한 것은 아니고; (ii) 배아의 초기 형태 및 (iii) 산모의 나이와 같은 외부 매개변수가 결정에 더 큰 영향을 미침을 나타낸다.

게다가, 착상전 유전자 진단(PGD)은 유전자 분석을 수행하기 위한 적은 수의 세포를 얻기 위해 배양된 세포를 생체 검사하는 것을 포함한다. 이것은 배아가 단일 유전자 질환 및/또는 염색체 손상(이수성)에 의해 영향을 받는지 여부에 대한 관혈적 방법이다. 하지만 PGD는 배아의 착상 능력에 대한 예측 정보를 제공하진 않는다(Cimadomo et al., The impact of biopsy on human embryo developmental potential during preimplantation genetic diagnosis, Biomed Res Int, 2016;2016:7193075). 게다가, 대부분의 착상 전 배아는 유전적으로 모자이크 처리되어 있어, 세포마다 유전적 배경이 다르다. 이것은 특히 초기 배아(즉, 8-세포 단계)에서 수행된 생체검사에 해당한다. 후행 연구는 PGD의 사용이 배아 착상율을 크게 향상시키지 않음을 보여준다(Geraedts and Sermon, Preimplantation genetic screening 2.0: the theory. Mol Hum Reprod, 2016;22(8):839-44; Sermon et al., The why, the how and the when of PGS 2.0: current practices and expert opinions of fertility specialists, molecular biologists, and embryologists. Mol Hum Reprod, 2016;22(8):845-57).

요약하면, 접합자 단계(하나의 세포)에서 배반포 단계까지의 배아 배양은 상대적으로 최적화 된다. 하지만, 배아가 환자에게 착상되면, 착상 성공률은 여전히 상대적으로 낮다. 이러한 이유로, 일단 자궁으로 전달된 배아가 착상되는 능력을 향상시키거나 착상 단계에서 강력한 배아를 생성하는 새로운 배양 성분의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 인간 혈장 분획과 다른 배양 배지를 사용하는 것을 목표로 집중적이고 광범위한 연구를 수행하였고, 놀랍게도, 콘 방법을 통한 하나 이상의 분획을 포함하는 조성물을 사용함으로써 시험관 내 배아 배양을 개선하고 선행 기술의 조건에서 배양된 배아와 비교하여 착상에서 더 나은 결과를 얻을 수 있었다. 이때 상기 조성물에서 HSA가 조성물 내 총 단백질의 90 % 내지 96 %, 알파 및 베타 글로불린은 조성물 내 총 단백질의 3.5 % 내지 9.99 % 이고 감마 글로불린은 조성물 내 총 단백질의 0.01 % 내지 0.5 % 이다. 예를 들어, 이러한 더 나은 결과는 완전한 부화 성공율이 높은 배아에서 나타난다.

본 발명에서 “콘 방법(Cohn method)”이란 용어는 Edwin J. Cohn에 의해 개발된 혈장 단백질을 분리하는 방법(Cohn et al., Preparation and properties of serum plasma proteins, IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids, J. Am. Chem. Soc, 1946;68:459-475) 또는 임의의 이의 변이체를 의미한다.

본 발명 조성물의 또 다른 이점은 이것을 인간 혈장으로부터 얻을 수 있다는 것이다.

그러므로, 본 발명은 보조 생식 기술 전문가를 위한 새로운 치료 도구를 제공하는 포유류 배아의 배양을 위한 조성물을 개시한다. 본 발명에 개시된 방법에 의해 얻은 조성물 사용의 유효성은 배아의 배양 플레이트에 대한 부착을 유발하여 상기 포유류 배아의 착상을 함께 개선시키는 HSA가 풍부한 콘 방법의 분획중 하나 이상의 사용에 기초한다.

첫번째 측면에서, 본 발명은 콘 방법을 사용하여 인간 혈장 분획 중 하나 이상의 분획을 포함하는 포유류 배아의 착상을 개선하기 위한 조성물을 개시하며, 여기서 상기 조성물 HSA는 조성물 내 총 단백질의 90 % 내지 96 % 이고, 알파 및 베타 글로불린은 조성물 내 총 단백질의 3.5 % 내지 9.99 % 이고, 감마 글로불린은 조성물 내 총 단백질의 0.01 % 내지 0.5 % 이다.

바람직하게, 상기 분획은 콘 방법의 분획Ⅰ, 분획Ⅱ+Ⅲ, 분획 Ⅳ 및 분획 Ⅴ 또는 분획 Ⅰ의 상청액, 분획Ⅱ+Ⅲ 의 상청액, 분획 Ⅳ 의 상청액 및 분획 Ⅴ 의 상청액으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 분획은 콘 방법의 분획Ⅱ+Ⅲ 의 상청액 및 분획 Ⅴ 이다.

특정 실시예에서, 콘 방법의 분획Ⅱ+Ⅲ 의 상청액을 추가로 처리할 수 있다. 분획Ⅱ+Ⅲ 의 상청액이 얻어지면, 최종 생성물이 얻어질 때까지 여러 단계를 거친다. 이러한 단계는 일반적으로 희석, 정화, 정용여과, 나노여과, 한외여과에 의한 농축, 멸균, 바이알에 충전 및 상기 바이알을 감마선 조사에 노출하기 전 상기 바이알의 최종 동결건조 또는 이들의 조합을 포함한다.

또 다른 특정 실시예에서, 콘 방법의 분획 Ⅴ 가 추가로 처리될 수 있다. 분획 Ⅴ 가 얻어지면, 후자는 용액에 재현탁되고 최종 제품이 얻어질 때까지 다른 단계를 거친다. 이러한 단계는 일반적으로 투석여과, 열처리, 멸균, 바이알에의 충전 및 일반적으로 30-32 ℃ 에서 적어도 14 일 동안 최종 제품의 멸균율을 보장하기 위해 상기 바이알의 격리 전의 최종 저온살균 또는 이들의 조합을 포함한다.

또 다른 특정 실시예에서, 분획 Ⅱ+Ⅲ의 상청액 및 분획 Ⅴ 는 그 자체로서 또는 추가로 처리된 생산 중간체 또는 최종 생성물로서 병원체를 제거할 수 있는 능력을 갖는 하나 이상의 생산 단계에 제공된다.

본 발명의 조성물의 특정 실시예에서, 상기 HSA는 50 mg/ml 내지 250 mg/ml의 최종 농도를 가진다. 바람직하게, 상기 HSA는 100 mg/ml의 최종 농도로 조성물에 존재한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 본 발명의 조성물을 포함하는 배아 배양 배지의 제조방법을 개시한다:

a) 상기 개시된 방법으로 본 발명의 조성물을 얻는 단계;

b) 포유류 배아 배양에 통상적으로 사용되는 임의의 배아 배양 배지에 상기 조성물의 10-50 % (v/v) 를 첨가하는 단계.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 배아 배양 배지에 20 % 로 존재한다.

마지막으로, 본 발명은 착상 전에 포유류 배아의 배양을 위한 상기 기재된 바와 같은 조성물의 용도를 개시한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만, 이는 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

이하 본 발명을 도면을 참조하여 설명한다:
도 1은 조성물 Ⅰ 및 조성물 Ⅱ 와 비교하여 배반포 단게에서 포유류 배아의 배양에 대한 조성물 Ⅲ (본 발명의 조성물)의 개선된 성능을 나타내는 결과의 그래프이다. 상기 배양물의 개선은 완전한 “부화”에 도달할 때까지 “수포”에서 “반 부화”로 순차적으로 진행되는 배아의 백분율로 측정되었다. “저지”란 배판포에서 차단되어 더 이상 발달하지 않는 배아를 의미한다.
도 2는 조성물 Ⅰ 및 조성물 Ⅲ을 사용한 배양물에서 배양 플레이트 표면에 부화한 배아의 부착 결과에 대한 그래프이다.
도 3은 조성물 Ⅰ 및 조성물 Ⅲ을 사용하여 콜라겐 하이드로겔에 배아를 착상하는 공초점 현미경 이미지이다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만, 이는 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예

실시예1: 본 발명의 조성물 및 비교 조성물의 제조 및 특성화.

조성물 Ⅰ (표 1) 은 더 많은 양의 알부민 및 더 적은 양의 알파-1 글로불린을 갖는다는 점에서 조성물 Ⅲ와 다르다. 반면, 조성물 II 는 더 적은 양의 알부민 및 더 적은 양의 알파-1글로불린을 갖는다는 점에서 조성물 Ⅲ과 다르다.

상기 조성물의 주요 성분의 조성은 하기 표에 제시되어 있다:

	조성물 I n=3 (x±SD)	조성물 II n=4 (x±SD)	조성물 III (본 발명) n=3 (x±SD)
혈청 알부민 (g/L)	198.1±0.4	22.7±1.8	107.6±1.5
알파-1 글로불린 (g/L)	2.3±0.2	1.3±0.2	6.4±0.4
알파-2 글로불린 (g/L)	미검출	2.7±0.7	2.2±0.2
베타 글로불린 (g/L)	미검출	2.2±0.4	1.6±0.3
감마 글로불린 (g/L)	미검출	0.5±0.1	0.5±0.1
혈청 알부민 (%)	98.9±0.1	77.1±2.2	91.0±0.5
알파-1 글로불린 (%)	1.1±0.1	4.5±0.3	5.4±0.4
알파-2 글로불린 (%)	미검출	9.0±1.4	1.8±0.2
베타 글로불린 (%)	미검출	7.5±0.7	1.3±0.2
감마 글로불린 (%)	미검출	1.6±0.3	0.4±0.1
전체 단백질 (g/L)	200.3±0.3	29.5±3.2	118.3±1.1

표 1: 조성물 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ(본 발명의 조성물) 의 주요 성분의 조성.

실시예2: 본 발명의 조성물 및 비교 조성물의 존재하에서 쥐 배아의 발달 평가(도 1 참조)

배아 배양의 효율성을 결정하기 위해, HSA의 최종 농도를 기준으로 사용하여 다른 단백질 제형을 제조한다. KSOMAA (Millipore; USA)는 쥐 배아 배양 E0.5를 배반포 단계(E3.5)로 이끌기 위해 소 혈청 알부민(BSA, 5 mg/ml)과 함께 배지로 사용된다. 배반포 단계에 도달했을 때 일부 배아는 KSOMAA(BSA, 5 mg/ml)에서 대조군으로 남아 있고 나머지 배아는 BSA가 없는 새로운 KSOMAA 배지로 옮겨지고 다음 그룹으로 보충된다.

-그룹Ⅰ : 96 % 이상의 HSA, 3.5 % 미만의 알파 및 베타 글로불린 및 0.5 % 미만의 감마 글로불린을 포함하는 콘 방법을 사용하는 인간 혈 장 분획을 기반으로 하는 조성물 Ⅰ. 분획은 HSA 22.5 mg/ml의 최종 농도로 추가되어야 한다.

-그룹Ⅱ : 70 % 내지 90 %의 HSA, 9.5 % 내지 28 %의 알파 및 베타 글 로분린 및 0.5 % 내지 2 %의 감마 글로불린을 포함하는 콘 방법을 사 용하는 인간 혈장 분획을 기반으로 하는 조성물 Ⅰ. 분획은 HSA 5 mg/ml의 최종 농도로 추가되어야 한다.

-그룹 Ⅲ(본 발명의 조성물인 조성물 Ⅲ): 90 % 내지 96 %의 HSA, 3.5 % 내지 9.99 %의 알파 및 베타 글로분린 및 0.01 % 내지 0.5 %의 감마 글로불린을 포함하는 콘 방법을 사용하는 인간 혈장 분획을 기반 으로 하는 조성물 Ⅰ. 분획은 HSA 22.5 mg/ml의 최종 농도로 추가되어 야 한다.

배반포 단계(E3.5)의 배아를 E6.5 날까지 인큐베이터에서 배양하여 완전 부화를 가능하게 한다. 그들의 형태는 사진을 통해 매일 기록된다. 배양 기간이 끝날 때(E6.5), 배양 중 배아의 발달 단계를 평가한다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물인 그룹 Ⅲ 조성물 존재 하에서 완전히 부화를 성공한 배아의 비율이 가장 높다. 구체적으로, 그룹 Ⅲ 조성물 존재 하에서는 배아의 62 %가 부화에 성공한 반면, 그룹 Ⅰ 조성물 존재 하에서는 46.8 %가 부화했다. BSA (5 mg/ml) 또는 그룹 Ⅱ 조성물 존재 하에서 배양된 배아는 각각 53.9 % 및 37.2 %의 효율로 부화했다. 다양한 발달 단계에서 배아의 분포는 그룹 Ⅲ 조성물의 존재 하에서 성장한 배아가 배반포 단계 또는 대부분이 완전히 부화한 단계의 두 가지 우선적인 단계를 가지고 있음을 보여준다. 이러한 조건에서 중간 단계에 있는 배아는 거의 없다. 예를 들어 이들은 수포 단계에서 발견되지 않는다. 이러한 결과는 본 발명의 조성물이 다른 조건보다 더 효율적으로 생존 가능한 배아의 발달을 진행시킬 수 있음을 시사한다.

실시예3: 배양물에서 부화한 배아의 부착력 평가(도 2 참조)

이 실시예에서 부화한 쥐 배아는 최적의 조건에서 성장하는 경우 배양 플레이트에 부착하고 성장할 수 있다. 부착은 유리나 플라스틱 표면에 부착된 배아 세포영양막의 결과물이 포함되며, 이는 피펫으로 세정하여 다시 부착할 수 없다. 도 2에서 그룹 Ⅰ의 조성물이 있는 상태에서 E3.5에서 E7.5단계까지 배양된 배반포의 부착력을 그룹 Ⅲ의 조성물로 배양된 배아와 비교하였다. 결과는 부화한 배반포가 그룹 Ⅲ 조성물의 존재하에서 배양될 때 부착력이 놀랍게 증가하였음을 보여준다. 구체적으로 그룹 Ⅲ 조성물에서 배양된 배아의 73.3 %가 플레이트에 부착한 반면, 그룹 Ⅰ 조성물에서 배양된 배아는 최대 1.3 %의 배아가 플레이트에 부착할 수 있다. 다른 두 조건에서는 극소량 또는 0 % 가 플레이트에 부착된다.

실시예 4: 콜라겐 하이드로겔에서 배아의 착상(도 3 참조)

예비 연구에서, 쥐 배아는 착상이 되기 위해 배반포 단게에서 콜라겐 하이드로겔에 포매되었다 (US 20150305774 A1). 공초점 현미경은 착상 기질내에서 3차원으로 유전자 착상 형광 배아를 관찰할 수 있게 한다. 콜라겐 섬유는 반사 기법에 의해 관찰될 수 있으며, 상대적으로 균일한 방식으로 분포된 백색 섬유의 파괴된 메쉬로 나타난다. 도 3에 나타난 바와 같이, 그룹 Ⅲ 조성물의 존재하에서 배양된 배아는 배아의 표면과 접촉하는 특정 영역에서 섬유의 극적인 리모델링의 유형을 유도한다. 이러한 유형의 기질 리모델링은 시험관 내 세포 배양 동안 문서화된 바와 같이 배아가 기질에 강하게 부착되고 힘을 가함으로써 기질에 착상됨을 시사한다(Legant et al., Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices, Nat Methods, 2010;7(12):969-71; Lesman et al., Cell tri-culture for cardiac vascularization, Methods Mol Biol, 2014;1181:131-7). 그러나 그룹 Ⅰ 조성물의 존재하에서 배양되고 콜라겐 기질로 이동된 배아의 대조군 집단은 착상되는데 실패하고 배아가 진행되지 않았다. 콜라겐 중합은 배아 포매 후 첫 1시간 동안 발생하기 때문에, 이러한 결과는 배아가 삽입될 때 콜라겐 중합의 이질성에 의해 기질의 변형과정이 발생할 가능성을 없앤다. 반대로, 상기 변형은 시간이 지남에 따라 점진적으로 발생하므로, 이러한 존재는 배아의 활발한 기계적 활동을 암시한다. 또한 본 발명의 조성물에 의한 보충이 배아의 착상을 개선할 뿐 아니라 E9.5 일 까지 그 수명을 연장시킨다는 것은 놀랍다.

Claims (11)

1. 콘 방법을 사용한 인간 혈장 분획의 분획 하나 이상을 포함하는 포유류 배아의 착상을 개선하기 위한 조성물로, 상기 조성물이 인간 혈청 알부민(HSA)을 조성물 내 전체 단백질의 90 % 내지 96 %로 포함하고 알파 및 베타 글로불린을 조성물 내 전체 단백질의 3.5 % 내지 9.99 %로 포함하고 감마 글로불린을 조성물 내 전체 단백질의 0.01 % 내지 0.5 %로 포함하는 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 분획이 콘 방법에 의한 분획Ⅰ, 분획 Ⅱ+Ⅲ, 분획 Ⅳ 및 분획 Ⅴ 또는 분획Ⅰ의 상청액, 분획 Ⅱ+Ⅲ의 상청액, 분획 Ⅳ의 상청액 및 분획 Ⅴ의 상청액에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 분획이 콘 방법에 의한 분획 Ⅱ+Ⅲ의 상청액 및 분획 Ⅴ인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 콘 방법에 의한 분획 Ⅱ+Ⅲ 의 상청액이 희석, 정화, 정용여과, 나노여과, 한외여과에 의한 농축, 멸균, 바이알에 충전 및 상기 바이알의 감마선 조사 노출 이전의 최종 동결건조, 또는 이들의 조합으로 추가 처리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 3항에 있어서, 상기 콘 방법에 의한 분획 Ⅴ 가 정용여과, 열처리, 멸균, 바이알의 충전 및 상기 바이알의 격리 이전의 최종 저온 살균, 또는 이들의 조합으로 추가 처리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 3 항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 분획 Ⅱ+Ⅲ 의 상청액 및 분획 Ⅴ 가 그대로 또는 추가 가공된 생산 중간체 또는 최종 생성물로서 병원체를 제거할 수 있는 능력을 갖는 하나 이상의 생산 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HSA가 50 mg/ml 내지 250 mg/ml의 최종 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HSA가 100 mg/ml 의 최종 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 하기 단계를 포함하고 본 발명의 조성물을 포함하는 배아 배양 배지의 제조방법:
   a) 하기에 개시된 방법으로 본 발명의 조성물을 얻는 단계;
   b) 포유류 배아 배양에 통상적으로 사용되는 임의의 배아 배양 배지에 상기 조성물의 10-50 % (v/v) 를 첨가하는 단계.
10. 제 9 항에 있어서, 조성물이 배아 배양 배지에 20 % (v/v)로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
11. 포유류 배아의 착상 전 그의 배양에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.

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