KR101335884B1 - 망막 줄기 세포로부터 유래한 합성 각막 - Google Patents

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Abstract

본 발명에는, 단위발생적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 유래한 망막 줄기 세포(rSC)로부터 분화되는 합성 각막의 제조 방법이 개시되어 있으며, 여기서 그러한 합성 각막은 3-D 스캐폴드의 부재 하에서 생산된다. 또한, 본 발명에는 그 개시된 방법에 의해 생산되는 분리된 각막이 기재되어 있다.

Description

망막 줄기 세포로부터 유래한 합성 각막{SYNTHETIC CORNEA FROM RETINAL STEM CELLS}
본 발명은 일반적으로 배아 줄기 세포(ES), 더욱 구체적으로는 합성 각막을 얻는 방법에 관한 것이다.
인간 배아 줄기 세포(hES)는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 세포이다. 배아 줄기 세포를 면역 결핍 마우스에게 주입하면, 이 세포가 분화된 종양(기형종)을 형성한다. 그러나, 시험관 내에서 배상체(EB)를 형성하도록 유래한 배아 줄기 세포는 일정한 성장 조건 하에 몇몇 조직의 특징을 나타내는 복수의 세포 유형으로 분화될 수 있는 배아 줄기 세포주의 공급원을 제공한다. 예를 들어, hES는 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유도체로 분화된다.
인간 ES 세포와 이의 분화된 자손은 치료학적 이식과 약물 시험 및 개발을 위한 중요한 인간 세포 공급원이다. 이들 양자의 목표를 위해서는 환자의 요구와 적당한 약리 시험에 적합한 조직형으로 분화되는 충분한 세포를 공급하는 것이 필요하다. 이와 관련하여, 배아 줄기 세포로부터 분화된 세포를 생성하는 효과적이고 확실한 방법이 필요하다.
hES 및 hEG 세포는, 더욱 특화된 세포 또는 조직을 형성할 잠재력을 비롯하 여 주목할 만큼 과학적이고 치료학적인 가능성을 제공한다. 그러나, hES 및 hEG 세포의 공급원에 관한 윤리적 문제와 연구를 위한 핵 이식(NT)의 사용이 인간을 생성하기 위한 NT 사용으로 이어질 수 있다는 우려는 상당량의 공중의 논의와 논쟁을 불러일으켰다.
포유동물 난모세포의 단위생식 활성화를 정자/NT에 의한 수정의 대안으로 이용하여 배아 줄기 세포 형성을 위한 난모세포를 준비할 수 있다. 단위생식 활성화란 웅성 배우체로부터의 어떠한 관여도 없이 자성배우체로부터, 결국 성체로 발생하는지 여부와 무관하게, 배아 줄기 세포를 생성하는 것이다.
현재, 줄기 세포 연구는 천연 신체 조직을 대체할 인공 보철물, 재활 기기 또는 인공 장기의 개발에 중점을 두고 있다. 이러한 개발은 일반적으로 팽창/분화를 조절하기 위한 줄기 세포 조작용 생적합성 재료의 사용, 즉 증식을 위한 기계적 지지체를 제공함으로써 조직 유사 기능을 모방하는 장치를 형성하기 위한 3D 스캐폴드(예, PLG 스캐폴드, 키토산 스캐폴드, PCL/PEG 스캐폴드)의 사용을 포함한다.
대안적으로, 배양된 줄기 세포 또는 분화된 줄기 세포의 이식이 치료 방법으로서 고려된다. 이들 방법은 일반적으로 생체내 조직 공학 또는 동일계 생성으로서 알려져 있다. 이들 분야의 많은 연구에서는 배양된 세포의 직접 이식이 의도되고 있지만, 실제로는 이러한 방법에서는 종종 다공성 스캐폴드 생재료 내에 분화된 줄기 세포를 시딩해야 한다(예, 줄기 세포 유래의 심근세포 및 겔 또는 다공성 알기네이트).
발명의 개요
본 발명은 단위생식적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 유래한 줄기 세포에서 얻은 3차원 감각계 기관을 생성하는 발생적 방법의 발견에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 외부 스캐폴드의 사용을 필요로 하지 않는다. 일 구체예에서 개시한 바와 같이, 감각 기관은 합성 각막이다.
일 구체예에서, 분리된 망막 줄기 세포로부터 유래한 합성 각막이 개시된다. 관련 측면에서, 망막 줄기 세포는 단위발생적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 얻어진다. 또 다른 관련 측면에서, 각막은 최종 분화된 것이다. 또 다른 측면에서, 각막이 동형상태(homoplasmic) 미토콘드리아 DNA를 포함한다는 것을 비롯하여 각막은 난모세포 도너와 조직적합성이고, 인간에게 이식가능하다.
또 다른 구체예에서는, 인간 난모세포를 단위발생적으로 활성화하는 단계로서, 활성화는 난모세포를 높은 O2 분압 하에 이온운반체(ionophore)와 접촉시키고 이 난모세포를 낮은 O2 분압 하에 세린-트레오닌 키나제 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는 단계, 배반포가 형성될 때까지 상기 활성화된 난모세포를 낮은 O2 분압 하에 배양하는 단계, 상기 배반포를 영양공급세포(feeder cell)층으로 옮기는 단계, 높은 O2 분압 하에 옮겨진 배반포를 배양하는 단계, 상기 배반포의 영양외배엽으로부터 내부 세포괴(ICM)를 기계적으로 분리하는 단계, 및 높은 O2 분압 하에 영양공급세포층 상에서 ICM 세포를 배양하는 단계로서, 인간 배아 줄기 세포(hES) 마커 및 뉴런 특이적 마커에 의해 배양물에서 망막 줄기 세포를 확인할 수 있으며, 확인된 망막 줄기 세포를 경우에 따라 분리하는 단계, DNA 합성 억제제로 처리한 섬유아세포 영양공급층에서 혈청 대체물, 플라즈마네이트 및 gp130/STAT 경로 및/또는 MAP 키나제 경로를 활성화하는 하나 이상의 미토젠을 포함하는 배지(M/SR) 중에서 상기 분리된 줄기 세포를 배양하는 단계, 미토젠 처리된 세포를, 미토젠을 첨가하지 않은 채 플라즈마네이트를 포함하는 M/SR(M/SRP)에서, 거의 포화상태(confluence)가 되도록 배양하는 단계로서, 거의 포화상태인 세포가 색소침착 및 돔형 외관을 나타낼 때까지 M/SRP의 약 1/2 부피를 주기적으로 M/SR로 교체하는 단계, 및 M/SR 중의 색소침착된 세포를 젤라틴 코딩된 기층으로 옮기는 단계로서, 합성 각막이 발생될 때까지 M/SR의 약 1/2 부피를 주기적으로 M/SR로 교체하는 단계를 포함하는, 합성 각막 생성 방법이 개시되어 있다. 선택적으로, 분리된 세포 집단보다는 농축된 세포 집단으로서 망막 세포를 배양할 수 있다.
일 측면에서, 미토젠은 백혈병 억제 인자(LIF), bFGF 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, DNA 합성 억제제는 비제한적인 예로서 미토마이신 C를 비롯한 알킬화제이다. 관련 측면에서, 영양공급세포는 인간 유래이다.
일 구체예에서, 피험체의 각막을 합성 각막으로 교체하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 피험체를 치료하는 방법이 개시된다. 일 측면에서, 피험체에게는 각막염, 각막 궤양, 각막 찰과상, 설맹, 광각막염(arc eye), 타이제슨(Thygeson) 표층 점상 각막병증, 푸크스 이영양증, 원추각막, 건성 각결막염, 각막 감염, 또는 각막 이영양증과 같이 각막에 영향을 주는 질병이 있다. 또 다른 측면에서, 피험체는 각막이 손상되어 있다.
또 다른 구체예에서, 망막 줄기 세포 유래의 합성 각막을 물질과 접촉시키는 단계, 및 상기 물질의 존재 및 부재 하에 각막에 대한 변화를 관찰하는 단계로서, 각막에 대한 변화가 각막에 영향을 주는 물질임을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 안구 각막에 영향을 주는 물질을 확인하는 방법이 개시된다.
일 측면에서, 물질은 각막에 대한 치료 효과를 나타낸다. 또 다른 측면에서, 물질은 각막에 대한 유해한 효과를 나타낸다. 관련 측면에서, 각막에 대한 변화는 유전자 발현 조절, 단백질 발현 조절, 혼탁도 변화, 가소성 변화, 경도 변화, 광 위상 속도 변화 및 형상 변화를 포함한다.
일 구체예에서, 눈으로부터 각막을 수술로 절제하는 단계, 합성 각막을 제거된 각막 부위에 삽입하는 단계 및 합성 각막을 절제부 아래의 조직과 접합시켜 합성 각막을 눈에 고정하는 단계를 포함하는, 눈의 각막을 합성 각막으로 교체하는 방법이 개시된다.
관련 측면에서, 이 방법은 각막의 외면의 일부를 분리하여 각막 절편과 각막층(corneal bed)을 형성하는 단계로서, 상기 각막 절편은 전면과 후면을 가지고, 각막층은 형상화된 전면을 가지는 단계, 전면과 후면을 가지는 합성 각막을 각막층 상에 이식하는 단계, 및 분리된 각막 일부분을 교체하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에서, 피험체의 눈에 유효량의 물질을 전달하는 방법으로서, 합성 각막을 포함하는 세포의 적어도 일부를, 상기 물질을 코딩하는 핵산 비히클로 형질전환시키는 단계, 핵산이 코딩하는 물질을 발현하는 합성 각막을 포함하는 세포 집단을 확인하는 단계, 및 피험체의 각막 세포를 형질전환된 합성 각막 세포로 교체하는 단계로서, 상기 교체된 세포는 상기 물질을 피험체의 눈으로 전달하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
관련 측면에서, 교체 단계는 피험체의 각막을 합성 각막으로 교체하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 예시적 방법 및 조성물은 하기에 상세히 설명되어 있다.
도면의 간단한 설명
도 1A는 단위생식으로 유래한 hES 세포에 대한 알칼리 포스파타제의 표면 마커 발현 결과를 나타내는 현미경사진을 도시한다.
도 1B는 표면 마커 Oct4에 대한 발현 결과를 나타내는 현미경사진을 도시한다다.
도 1C는 표면 마커 SSEA-1에 대한 발현 결과를 나타내는 현미경사진을 도시한다다.
도 1D는 표면 마커 SSEA-3에 대한 발현 결과를 나타내는 현미경사진을 도시한다다.
도 1E는 표면 마커 SSEA-3에 대한 발현 결과를 나타내는 현미경사진을 도시한다다.
도 1F는 표면 마커 TRA-1-60에 대한 발현 결과를 나타내는 현미경사진을 도시한다다.
도 1G는 표면 마커 TRA-1-81에 대한 발현 결과를 나타내는 현미경사진을 도시한다다.
도 2A는 단위생식으로 유래한 hES 세포에 대한 텔로머라제 활성 분석 결과를 도시한다. 500, 1000 및 10000(단위)의 추출물을 사용하여 분석을 실시하였다. ΔH-열 처리된 시험 추출물(음성 대조군); 양성 대조군-텔로머라제 양성 세포; CHAPS-세포용해 완충액; TSR8-대조군 주형.
도 2B는 단위생식으로 유래한 hES 세포로부터 형성된, 9일 동안 배양한 배상체의 현미경사진을 도시한다.
도 2C는 단위생식으로 유래한 hES 세포로부터 형성된, 10일 동안 배양한 배상체의 현미경사진을 도시한다.
도 2D는 단위생식으로 유래한 hES의 핵형을 예시한다.
도 2E는 단위생식으로 유래한 hES 세포의 DNA 핑거 프린팅 분석으로부터 얻은 결과를 도시한다. 1- 난모세포 도너의 혈액으로부터 얻은 DNA; 2- 동일한 도너로부터 유래한 단위생식 hES 세포로부터 얻은 DNA; 3- 인간 영양공급 섬유아세포로부터 얻은 DNA.
도 3은 게놈 임프린팅과 관련된 유전자 발현을 특성규명하기 위한 노던 블롯 결과를 도시한다. DNA 프로브: SNRPN, Peg1_2, Peg1_A, H19, 및 GAPDH(내부 대조군). NSF, 신생아 피부 섬유아세포; hES, 수정된 난모세포로부터 유래한 인간 배아 줄기 세포주; 1, phESC-1; 2, phESC-3; 3, phESC-4; 4, phESC-5; 5, phESC-6; 6 phESC-7. NSF RT-, hES RT-, 1 RT-는 음성 대조군이다.
도 4는 3가지 배엽 전부의 유도체로의 phESC의 분화를 도시한다. 외배엽 분화는 뉴런 특이적 마커 68(A), NCAM(B), 베타 III-튜불린(C) 및 신경교 세포 마커 GFAP(D, M)에 대한 양성 면역세포화학 염색법으로 나타난다. 분화된 세포는 중배엽 마커: 근육 특이적 알파 액티닌(G) 및 데스민(J), 내피 마커 PECAM-1(E) 및 VE-카드헤린(F)에 대해서 양성이었다. 내배엽 분화는 알파-펙토단백질(H, L)에 대한 양성 염색에 의해 나타난다. phESC는 색소침착된 상피 유사 세포(I, K)를 생성한다. 확대율 (I) x 100; (A-H, J-M) x 400.
도 5는 특이적 마커에 대한 phESC 세포주의 특성을 도시한다. 인간 영양공급층 세포상의 phESC의 미분화된 콜로니(A-F), SSEA-1에 대한 음성 염색(G-L), 세포 표면 마커 SSEA-3(M-R), SSEA-4(S-X)의 발현. 확대율 (A) 내지 (E) x 100; (F) x 200; (G) 내지 (X) x 400. 영양공급세포(A-F), OCT-4(G-L), TRA-1-60(K-R) 및 TRA-1-81(S-X) 상의 phESC 콜로니의 알칼리 포스파타제 양성 염색. 확대율 (A, B, O, R) x 100; (C-F, M, S, X) x 200; (G-L, N, P, Q, T-W) x 400.
도 6은 phESC 세포가 양성 대조군 세포와 비교하여 높은 텔로머라제 활성도를 보유한다는 것을 입증한다: "+" - 500 세포로부터의 추출물; "-" - 불활성화된 텔로머라제를 포함하는 열 처리된 세포 추출물; "대조군 +" - 텔로머라제 양성 세포 추출물(TRAPEZE 키트를 이용하여 적용); "B"-CHAPS 세포용해 완충액, 프라이머-이량체/PCR 오염 대조군; TSR8-텔로머라제 정량적 대조군 주형(0.1 및 0.2 amole/㎕); "M"-마커, DNA 래더.
도 7은 phESC 세포주의 G-밴드 핵형을 도시한다. phESC-1(A), phESC-3(B), phESC-4(C), phESC-5(D) 및 phESC-6(E) 세포주는 정상적인 46, XX 핵형을 가진다. phESC-7 세포주는 47, XXX 핵형을 가진다(F).
도 8은 단위발생적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 유래한 줄기 세포에서 얻은 합성 각막을 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 조성물, 방법 및 배양법을 개시하기에 앞서, 본 발명이 개시된 특정 조성물, 방법 및 실험 조건에 한정되지 않으며, 따라서 조성물, 방법 및 실험 조건을 변화시킬 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 하기 특허청구범위에서만 한정될 것이기 때문에 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구체예들을 개시하기 위한 것이며 제한하려는 것은 아님도 이해해야 한다.
본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥에서 분명하게 달리 언급하지 않는 한 복수 의미도 포함하는 것이다. 따라서, 예를 들어, "방법"이라고 하면, 본 개시내용을 볼 때 당업자에게 명백해질 하나 이상의 방법, 및/또는 본원에 개시된 종류의 단계들을 포함한다.
달리 정의하지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 보통 기술자들이 공통으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다. 변형예 및 변화예가 본 개시내용의 정신 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해되므로, 본원에 개시된 것들와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있다. 본원에 언급된 모든 공개문헌은 그 전문이 참고로 포함된다.
"분화(differentiation)"란 세포가 어떤 특화된 기능을 맡게 되고 어떤 다른 특화된 기능 단위로의 변화능을 상실하게 되는 세포에서 발생하는 변화를 의미한다. 분화 가능한 세포는 전능성, 다능성 또는 만능성 세포 중 임의의 것일 수 있다. 분화는 성숙한 성체 세포에 대하여 부분적 또는 전체적일 수 있다.
자성발생(gynogenesis)이란 모든 자성 기원의 포유동물 DNA, 바람직하게는 인간 자성 기원 DNA, 예컨대 인간 또는 비인간 영장류 난모세포 DNA를 포함하는 세포, 예컨대 난모세포 또는 기타 배아 세포형의 활성화시 생기는 구별가능한 영양외배엽 및 내부 세포괴를 함유하는 배아를 생성하는 것을 의미한다. 이러한 자성 포유동물 DNA를, 예컨대 하나 이상의 DNA 서열의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 유전자적으로 변형시키거나, 또는 변형시키지 않을 수 있다. 예를 들어, 목적하는 코딩 서열, 또는 배발생을 촉진 또는 억제하는 서열의 삽입 또는 결실로 DNA를 변형시킬 수 있다. 통상적으로, 모든 자성 기원의 DNA를 포함하는 난모세포의 시험관내 활성화로 그러한 배아를 얻을 수 있다. 또한, 자성발생은 하기 정의된 단위생식을 포함한다. 또한, 정자 DNA가 활성화된 난모세포 내의 DNA에는 관여하지 않는 활성화 방법을 포함한다.
관련 측면에서, IVF를 위해 준비된 피험체를 과배란시켜 난모세포를 얻는다. IVF에서 사용되는 "과배란(superovulation)" 방법, 예컨대 호르몬을 이용한 자성 피험체 처리법은 난소를 자극하여 자연 주기에서와 같은 보통 하나의 난자(난모세포)가 아니라 여러개의 난자(난모세포)를 생성하도록 고안된다.
난자 생성을 증가시키는데 필요한 의약은, 루프론(성선자극호르몬 방출 호르몬-작용제), 오르갈루트란, 안타곤 또는 세트로타이드(성선자극호르몬 방출 호르몬-길항제), 폴리스팀, 브라벨레 또는 고날-F (FSH, 난포 자극 호르몬), 레프로넥스(FSH 및 LH, 황체형성호르몬의 조합), 및 프레그닐 또는 노바렐(hCG, 융모 성선자극호르몬)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
관련 측면에서, 경질 초음파 유도 하에 난자를 수집할 수 있다. 이를 실현하기 위해서, 각 난포의 위치를 알아내는 초음파를 이용하여 질벽을 통해 난소로 (예컨대, IV 진정작용 하에) 바늘을 삽입한다. 난포액을 시험관으로 채취하여 난자를 얻는다.
"단위생식"("단위생식적으로(parthenogenically) 활성화된" 및 "단위발생적으로(parthenogenetically) 활성화된"은 혼용됨)은 난모세포의 활성화가 정자 침투 없이 일어나는 과정이며, 모든 자성 기원의 DNA를 포함하는 난모세포 또는 배아 세포, 예컨대 난할구의 활성화에 의해 얻어지는 내부 세포괴와 영양외배엽을 포함하는 초기 단계의 배아 발생을 의미한다. 관련 측면에서, "반수성체"는 그러한 활성화로 얻은 생성된 세포를 의미한다. 또 다른 관련 측면에서, "배반포"는 영양외배엽과 내부 세포괴(ICM)로 이루어진 속이 빈 구형의 세포를 포함하는 분할 단계의 수정된 또는 활성화된 난모세포를 의미한다. 추가의 관련 측면에서, "배반포 형성"은 난모세포 수정 또는 활성화 후에, 영양외배엽 세포 및 ICM으로 이루어진 속이 빈 구형의 세포로 발생하기에 충분한 시간(예, 5∼6일) 동안 배지에서 난모세포를 후속 배양하는 과정을 의미한다.
"다능성 세포(pluripotent cell)"는 상이한 분화 조직형, 즉 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 발생될 수 있는 미분화된 상태로 장기간, 이론적으로는 무한한 기간 동안 시험관 내에서 유지될 수 있는 모든 자성 또는 웅성 기원의 DNA를 함유하는 세포의 활성화로 생성한 배아로부터 유래한 세포를 의미한다. 웅성발생법 또는 자성발생법으로 생성된 배아의 내부 세포괴로부터 유래한 세포 또는 내부 세포괴를 적당한 조건 하에 배양하여, 예를 들어 섬유아세포 영양공급층 또는 또 다른 영양공급층 또는 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함하는 배양물에서 배양하여 세포의 다능성 상태를 유지하는 것이 바람직하다. 배양된 세포의 다능성 상태는 각종 방법, 예를 들어 (i) 다능성 세포에 특징적인 마커의 발현 확인; (ii) 다능성 세포의 유전자형을 발현하는 세포를 포함하는 키메라 동물의 생성; (iii) 세포를 동물, 예컨대 SCID 마우스에게 주입하여 생체 내에서 상이한 분화 세포형 생성; 및 (iv) (예컨대 영양공급층 또는 LIF 부재 하에 배양시) 시험관 내에서 배상체 및 기타 분화 세포형으로의 세포 분화 관찰로 확인할 수 있다.
"이배체 세포(diploid cell)"는 모든 웅성 또는 자성 기원의 이배체 DNA 함유물을 가지는 세포, 예컨대 난모세포 또는 난할구를 의미한다.
"반수체 세포(haploid cell)"는 모든 웅성 또는 자성 기원의 반수체 DNA 함유물을 가지는 세포, 예컨대 난모세포 또는 할구를 의미한다.
"활성화(activation)"는, 비제한적인 예로서 감수분열 중기 II에서의 수정 또는 미수정 난모세포가 전형적으로 염색분체쌍의 분리, 제2 극체 방출을 포함하는 과정을 진행하여 염색체의 반수를 가지고 각각 하나의 염색분체를 가지는 난모세포를 생성하는 과정을 의미한다. 활성화는, 모든 웅성 또는 자성 기원의 DNA를 함유하는 세포가, 다능성 세포를 생성하는데 유용하지만 그 자체는 생존 가능한 자손으로 발생될 수 없을 것 같은, 구별가능한 내부 세포괴 및 영양외배엽을 가지는 배아로 발생하도록 유도하는 방법을 포함한다. 활성화는, 예를 들어 (i) 제2 극체 방출을 유발하지 않는 조건; (ii) 극체 방출을 일으키나 극체 방출이 억제되는 조건; 또는 (iii) 반수체 난모세포의 1차 세포 분열을 억제하는 조건 중 하나의 조건 하에 실시할 수 있다.
"중기 II(metaphase II)"는 세포의 DNA 함유물이 반수의 염색체로 이루어지고 각 염색체에는 2개의 염색분체가 나타나는 세포 발생 단계를 의미한다.
일 구체예에서, 각종 O2 분압 가스 환경에서 난모세포를 배양하여 중기 II 난모세포를 활성화/배양한다. 관련 측면에서, 약 2%, 3%, 4%, 또는 5%의 O2 농도를 포함하는 기체 혼합물로 낮은 O2 분압 기체 환경을 만든다. 추가의 관련 측면에서, 기체 혼합물은 약 5% CO2를 포함한다. 또한, 기체 혼합물은 약 90% N2, 91% N2, 또는 93% N2를 포함한다. 이 기체 혼합물은, 대략적으로 약 5% CO2, 20% O2 및 75% N2인 약 5% CO2 대기와 구별되어야 한다.
"O2 분압(02 tension)"은 유체(즉, 액체 또는 기체) 중의 산소의 분압(기체 혼합물 중 단일 성분에 의해 나타나는 압력)을 의미한다. 낮은 분압은 산소의 분압(pO2)이 낮을 때이고, 높은 분압은 pO2가 높을 때이다.
"규명 배지 조건(defined-medium condition)"은 최적 성장을 위해 필요한 배지 내 성분의 농도가 상세히 알려진 세포 배양 환경을 의미한다. 예를 들어, 세포의 용도(예, 치료적 용도)에 따라서, 이종 단백질을 포함하는 조건으로부터 세포를 제거하는 것이 중요하다. 즉, 배양 조건은 동물성 성분 무함유 조건 또는 인간 이외의 동물성 단백질 무함유 조건이다. 관련 측면에서, "시험관내 수정(IVF) 배지"는 화학적으로 규명된 물질을 함유하거나, 또는 수정된 난모세포가 성장할 수 있는 영양계를 의미한다.
"세포외 기질(ECM) 기층(exracellular matrix substrate)"은 최적의 성장을 지원하는 세포 아래의 표면을 의미한다. 예를 들어, 그러한 ECM 기층은 매트리겔, 라미닌, 젤라틴 및 피브로넥틴 기층을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 관련 측면에서, 그러한 기층은 콜라겐 IV, 엔탁틴, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸을 포함할 수 있고, 각종 성장 인자(예, bFGF, 표피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자-1, 혈소판 유도 성장 인자, 신경 성장 인자 및 TFG-β-1)를 포함한다.
"배아(embryo)"는, 경우에 따라 변형될 수 있는, 모든 웅성 또는 자성 기원의 DNA를 함유하는 세포, 예컨대 난모세포 또는 다른 배아 세포의 활성화시 생기는 배아로서, 구별가능한 영양외배엽과 내부 세포괴를 포함하고, 생존 가능한 자손으로 발생할 수 없으며, DNA는 모든 웅성 및 자성 기원의 것인 배아를 의미한다. 내부 세포괴 또는 그 내부에 포함된 세포는 상기 정의한 바와 같은 다능성 세포를 생성하는 데 유용하다.
"내부 세포괴(ICM: inner cell mass)"는 태아 조직으로 발생하는 배아의 내부 부분을 의미한다. 여기서, 이들 세포는 시험관 내에서 다능성 세포의 연속 공급원을 제공하는데 사용된다. 또한, ICM은 웅성발생 또는 자성발생으로 생긴 배아, 즉 모든 웅성 또는 자성 기원의 DNA를 함유하는 세포의 활성화로 생긴 배아의 내부 부분을 포함한다. 이러한 DNA는, 예를 들어 인간 DNA, 예컨대 인간 난모세포 또는 정자 DNA이며, 유전자적으로 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다.
"영양외배엽(trophectoderm)"은 웅성발생 또는 자성발생으로 생긴 배아, 즉 모든 웅성 또는 자성 기원의 DNA를 함유하는 세포, 예컨대 인간 난자 또는 정자의 활성화로 생긴 배아의 조직을 비롯하여, 태반 조직으로 발생하는 초기 단계의 배아의 또 다른 부분을 의미한다.
"분화 세포(differentiated cell)"는 특정한 분화 상태, 즉 비-배아 상태를 가지는 비-배아 세포를 의미한다. 3가지의 최초 분화 세포형은 내배엽, 중배엽 및 외배엽이다.
"실질적으로 동일한(substantially identical)"은 (예컨대, HLA 유형 검사, SNP 분석 등에 의한) 차이 측정능 내에서 특정 성질이 매우 근접하여 본질적으로 동일한 것으로 간주되는 동일성을 의미한다.
"조직적합성(histocompatible)"은 유기체의 외래 조직 이식편에 대한 내성 정도를 나타낸다.
"게놈 임프린팅(genomic imprinting)"은 게놈의 다수의 유전자가 어비이 기원에 따라 단일대립유전자적으로 발현되는 메카니즘을 의미한다.
"합성(synthetic)"은 규명된 인공 조작으로 제조한 대상체의 특징을 나타낸다.
"동형상태(homoplasmy)"는, 그 문법적인 어미변화를 포함하여, 세포 또는 개체 내에 동일한 종류의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)가 존재함을 의미한다.
"이형상태(heteroplasmy)"는, 그 문법적인 어미변화를 포함하여, 세포 또는 개체 내에 한 종류보다 많은 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 혼합물이 존재함을 의미한다.
"일측부모(uniparental)"는 세포 또는 개체로부터 또 다른 것이 발생하여 종속적으로 남는 하나 이상의 세포 또는 개체를 의미한다.
"기계적(으로) 분리(mechanical isolating)"는 물리적 힘에 의해 세포 응집물을 분리하는 과정을 의미한다. 예를 들어, 이러한 과정은 인간 이외의 물질을 포함하는 효소(또는 다른 세포 분해 생성물)의 사용을 배제한다.
일 구체예에서, 줄기 세포는 당업계에 공지된 방법, 비제한적인 예로서 Thomson(예컨대, 미국 특허 7,029,913호; 미국 특허 6,200,806호; 미국 특허 6,887,706호; 미국 특허 5,843,780호 참조), Uchida(예컨대, 미국 특허 7,083,977호; 미국 특허 7,049,141호 참조), Carpenter(예컨대, 미국 특허 6,777,233호 참조), Anderson 등(예컨대, 미국 특허 5,589,376호 참조), Hogan(예컨대, 미국 특허 5,453,357호 참조), Naktsuji 등(예컨대, 미국 특허 7,083,977호 참조), 및 Khilian(예컨대, 미국 특허 5,449,620호 참조)이 개시한 방법으로 형성할 수 있으며, 상기 문헌들은 참고로 본원에 포함된다. 일 측면에서, 당업계에 공지된 방법으로 망막 줄기 세포를 얻는다(예컨대, 미국 특허 6,117,675호 참조).
또 다른 구체예에서, 단위발생적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 줄기 세포를 형성한다. 일 측면에서, 단위발생적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 유래한 줄기 세포에서 분화된 망막 줄기 세포로부터 합성 각막을 얻는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 합성 각막을 굴절 이상 피험체, 예컨대 근시, 원시 또는 난시 피험체용 대체물로서 사용할 수 있다. 굴절 이상은 각막 곡면이 불규칙한 형상인 경우(지나치게 경사지거나 또는 지나치게 편평한 경우)에 생긴다.
각막은 홍채, 동공 및 전방을 덮고 있는 유일한 투명 구조물로서, 안구의 광 출력(optical power)의 대부분을 제공한다. 각막은 수정체와 함께 빛을 굴절시키고, 그 결과 초점을 맞추는 데 도움을 준다. 각막은 수정체보다 전체 굴절량에 더욱 많이 기여하지만, 수정체의 곡률반경은 "조율" 초점으로 조정할 수 있지만 각막의 곡률반경은 고정되어 있다. 각막에는 혈관이 없어서, 누액, 방수 및 분포된 신경섬유에 의해 공급되는 뉴로트로핀으로부터의 확산을 통해 양분을 얻는다. 따라서, 예를 들어 이들 체액의 순환 장애 또는 염증 과정은 각막 이상의 발병에 지대한 역할을 한다.
각막은 대개 치밀한 결합 조직으로 이루어진다. 그런데, 콜라겐 섬유는 평행 패턴으로 배열되기 때문에, 광파를 구조적으로 간섭하여, 빛이 비교적 억제되지 않고 통과하게 된다.
각막의 노화와 관련된 변화는 혼탁도 증가, 전면 곡률반경 증가, 및 가능하게는 굴절률 분포 변화를 포함한다. 각종 굴절 안구 수술법은 각막의 형상을 변화시켜 교정 렌즈의 필요성을 줄이거나, 또는 안구의 굴절 상태를 향상시킨다. 여러 기법에서, 엑시머 레이저를 사용하여 각막의 광절삭으로 각막을 재성형한다.
각막 스트로마가 외관상 유의적인 불투명, 불규칙 또는 부종을 형성하는 경우, 사후 기증자의 각막을 이식할 수 있다. 각막에는 혈관이 없기 때문에, 면역 반응이 상대적으로 차단되어, 기증된 각막의 거부반응 발생율이 비교적 낮다(약 20%).
합성 각막(인공 각막(keratoprotheses))도 있지만, 이들 각막은 통상적으로 플라스틱 삽입물이거나, 또는 조직이 합성 각막으로 성장하게 하여 생유착을 촉진하는 생적합성 합성 재료로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 각막교정술에서는 특수한 하드 또는 경질 가스 투과 콘택트 렌즈를 사용하여 각막을 일시적으로 재성형하여 안구의 굴절 상태를 개선하거나 또는 안경 및 콘택트렌즈의 필요성을 줄인다.
각막은 접촉, 온도 및 화학물질에 민감한 무수 신경 종말을 가지며, 각막을 만지면 불수의적 반사로서 눈꺼풀이 감기게 된다. 투명성이 가장 중요하기 때문에, 각막에는 혈관이 없다; 외부에서는 누액으로부터, 내부에서는 방수로부터, 그리고 분포된 신경 섬유에 의해 공급되는 뉴로트로핀으로부터의 확산으로 양분을 공급받는다. 인간의 경우, 각막은 직경이 약 11.5 mm이고 중심 두께가 0.5 mm∼0.6 mm이며, 주변 두께가 0.6 mm∼0.8 mm이다. 인간의 경우, 각막의 굴절력은 약 43 디옵터로서, 안구의 총 굴절력의 대략 3/4이다. 투명성, 무혈관성 및 면역학적 특권이 각막을 특별한 조직으로 만든다.
각막 조직은 5개의 기본층, 즉 상피, 보우만층, 스트로마, 데스메막 및 내피로 배열되어 있고, 각각은 별도의 기능을 가진다. 상피는 각막의 최외층이며, 조직 두께의 약 10%를 차지한다. 상피는 (1) 외래 물질, 예컨대 먼저, 물 및 박테리아의 안구 및 각막의 다른 층으로의 통과를 차단하고; (2) 눈물로부터 산소 및 세포 양분을 흡수한 다음, 이들 양분을 각막의 나머지 부분으로 분배하는 평할 표면을 제공하는 기능을 주로 담당한다. 상피는 각막을 비비거나 각막이 긁혔을 때 통증에 매우 민감하게 하는 수많은 미세한 신경 종말로 채워져있다. 상피 세포가 고정되고 그 자체를 조직화하는 기초로서 작용하는 상피 부분을 기저막이라고 한다.
상피 기저막 바로 아래에 보우만층이라고 알려진 투명 시트가 위치한다. 이는 강한 층상 단백질(콜라겐) 섬유로 이루어져있다. 보우만층은, 일단 손상되면, 치유되면서 반흔을 형성할 수 있다. 이들 반흔이 크거나 중심에 위치하면, 일부 시력 상실이 일어날 수 있다.
보우만층 아래에는 스트로마가 있는데, 이 스트로마는 각막 두께의 90%를 차지한다. 스트로마는 주로 물(78%) 및 콜라겐(16%)으로 이루어져 있고, 어떤 혈관도 포함하지 않는다. 콜라겐이 각막에 강도, 탄성 및 형태를 제공한다. 콜라겐의 고유 형상, 배열 및 공간적 배치는 각막의 광전도 투명성을 형성하는 데 필수적이다.
스트로마 밑에는, 감염 및 손상에 대한 보호 장벽으로서 작용하는 얇지만 강한 시트형 조직인 데스메막이 있다. 데스메막은 (스트로마의 콜라겐 섬유와는 다른) 콜라겐 섬유로 이루어지고, 그 아래에 놓여진 내피 세포에 의해 만들어진다. 데스메막은 손상 후에 쉽게 재생된다.
내피는 매우 얇으며 각막의 최내층이다. 내피 세포는 각막을 투명하게 유지하는 데 필수적이다. 정상적으로, 유체는 안구 내부로부터 중간 각막층(스트로마)으로 서서히 누출된다. 내피의 주요 업무는 이 특수액을 스트로마 밖으로 펌핑하는 것이다. 이 펌핑 작용이 없으면, 스트로마가 물로 팽창되어 혼탁해지고, 결국 불투명해진다. 질병 또는 외상에 의해 내피 세포가 한번 파괴되면, 영원히 잃게 된다. 너무 많은 내피 세포가 파괴되면, 각막 부종 및 실명이 수반되어, 이용가능한 치료법은 각막 이식뿐이다.
인간 각막 단백체(proteome)는 특성규명된 바 있다. 각막 세포외 단백질의 약 52%(28/54)는, 확인된 면역글로불린 쇄 및 보체 C3이 포함된 경우, 공통의 혈장 단백질이다. 이러한 군의 각막 단백질은 또한 상이한 세르핀류(α-1-안티키모트립신, α-1-안티트립신 및 안티트롬빈 III), α-1-마이크로글로불린, 상이한 아포지질단백질, 섬유소원, 합토글로빈, 헤모펙신, 알부민, 아밀로이드 P-성분, 테트라넥틴, 트랜스페린, 트랜스씨레틴 및 비타민 D-결합 단백질을 포함한다. 따라서, 이들 단백질은 각막 세포에 의해 합성되거나, 또는 혈액으로부터 생기며, 각공막윤부에 위치한 모양체 동맥으로부터 벌크 유동으로 각막으로 들어간다.
각막이 지나치게 많이 만곡되어 있으면, 망막 앞에 초점이 맞기 때문에 멀리 있는 사물이 흐릿하게 보인다: 즉 근시 또는 근시안. 모든 성인의 25% 이상이 근시이다. 원시 또는 원시안은 근시의 반대개념이다. 멀리 있는 사물은 선명하고, 가까이 있는 사물은 흐릿하게 보인다(즉, 망막 뒤의 지점에 상 초점이 생긴다). 난시는, 편평하지 않은 각막의 곡률반경으로 인해 먼거리 또는 근거리 사물이 모두 흐릿하고 일그러져 보이는 증상이다. 난시에서의 각막은 숟가락의 뒷면과 같은 형상으로, 다른쪽 방향에서보다 한쪽 방향에서 더 만곡되어 있다. 이로 인해 광선의 초점이 하나보다 많아지게 되고, 망막의 2개의 다른 영역에 초점이 생겨서, 시각 이미지가 왜곡된다. 근시가 있는 성인 3명중 2명은 또한 난시를 나타낸다.
굴절 이상은 일반적으로 안경이나 콘택트렌즈로 교정되지만, 굴절 수술이 더욱 대중적인 선택사항이 되고 있다.
각막에 영향을 주는 추가의 질병은 알러지, 결막염, 각막 감염, 건성안, 푸크스 이영양증, 대상포진, 홍채각막 내피 증후군, 원추각막, 격자형 이영양증, 무늬각막 이영양증, 눈의 포진, 스티븐-존슨 증후군, 익상편, 각막염, 각막 궤양, 각막 찰과상, 설맹, 광각막염, 타이제슨 표층점상각막병증 및 건성 각결막염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 개시된 바와 같이, "각막 이식(corneal transplant)", "각막 이식편(corneal graft)" 또는 "전층각막이식(penetrating keratoplasty)"이란 손상되거나 질병에 걸린 각막을 각막 조직으로 교체하는 수술 절차를 의미한다. 각막 이식 수술에서, 외과의는 병에 걸린 또는 손상된 각막의 중심부를 제거하여, 깨끗한 각막으로 교체한다. 새로운 각막을 열림부에 두고, 안구에 봉합한다(예컨대 Rapuano 등, Anterior Segment, The Requisites (Requisites in Ophthalmology), 1999, Mosby, Inc., Philadelphia, PA 참조). 각막 이식 환자 중 약 20%는 도너의 각막에 거부반응을 나타낸다. 본 발명의 일 측면에서, 합성 각막 수여자는 각막이 유래한 난모세포의 도너이다. 따라서, 조직 거부반응 가능성이 최소화된다.
일 구체예에서, 합성 각막을 사용하여 안구의 각막을 교체하는 방법은 안구로부터 각막을 수술로 절제하는 단계, 합성 각막을 제거된 각막 부위에 삽입하는 단계, 및 합성 각막을 절제부 아래의 조직과 접합시켜 합성 각막을 안구에 고정시키는 단계를 포함한다.
관련 측면에서, 이 방법은 각막의 외면의 일부를 분리하여 각막 절편과 각막층을 형성하는 단계로서, 상기 각막 절편은 전면과 후면을 가지고, 각막층은 형상화된 전면을 가지는 단계, 전면과 후면을 가지는 합성 각막을 각막층 상에 이식하는 단계, 및 분리된 각막 일부분을 교체하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 합성 각막을 이용하여 피험체의 눈에 유효량의 물질을 전달하는 방법은 합성 각막을 구성하는 적어도 일부분의 세포를, 상기 물질을 코딩하는 핵산 비히클로 형질전환시키는 단계, 핵산이 코딩하는 물질을 발현하는 합성 각막을 포함하는 세포 집단을 확인하는 단계, 및 피험체의 각막 세포를 형질전환된 합성 각막 세포로 교체하는 단계로서, 상기 교체된 세포는 상기 물질을 피험체의 눈에 전달하는 단계를 포함한다.
관련 측면에서, 교체 단계는 피험체의 각막을 합성 각막으로 교체하는 것을 포함한다. 추가의 관련 측면에서, 피험체는 고양이와 개를 포함하는 가축이다. 또한, 피험체는 인간일 수 있다.
자연 환경에서, 난소로부터의 미성숙 난모세포(난자)는 감수분열을 통해 감수분열 중기 II로 진행하는 성숙 과정을 겪게 된다. 그 다음 난모세포는 중기 II에서 정지한다. 중기 II에서 세포의 DNA 함유물은 반수의 염색체로 이루어지며, 각 염색체는 2개의 염색분체를 나타낸다.
이러한 난모세포는, 비제한적인 예로서 당류를 미세주입하여 냉동보존으로 무한히 유지될 수 있다.
일 구체예에서, 냉동보존된 난모세포로부터 인간 줄기 세포를 생성하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 난모세포의 세포질로 냉동보존제를 주입하는 단계, 난모세포를 극저온으로 동결시켜 세포가 휴지 상태로 진입하게 하는 단계, 휴지 상태의 난모세포를 저장하는 단계, 난모세포를 해동하는 단계, 높은 O2 분압에서 난모세포를 단위생식적으로 활성화하는 단계, 활성화된 난모세포로부터 내부 세포괴(ICM)를 분리하는 단계, 인간 영양공급세포층에서 ICM 세포를, 낮은 O2 분압 하에 배양하는 단계를 포함한다.
일 측면에서, 개시된 바와 같이 얻은 난모세포를 배아-시험 미네랄 오일(시그마)로 피복된 변성의 등장성 IVF, 또는 임의의 다른 적절한 배지로 옮긴다. 필요에 따라서, 미세주입을 위해 계획된 양과 동일한 농도로 세포외 당류와 함께 난모세포를 항온처리할 수 있다. 예를 들어, 0.1M 당류를 주입하기 위해서 난모세포는 0.1M 당류를 포함하는 DMEM/F-12에서 평형을 이룰 수 있다. 일 측면에서, 냉동보존제는 표준 DMEM보다 더 낮은 Na+ 농도를 포함한다(즉, Na+ 저 농도 배지). 관련 측면에서, 냉동보존제는 표준 DMEM보다 더 높은 K+ 농도를 포함한다(즉, K+ 고 농도 배지). 추가의 관련 측면에서, 냉동 보존제는 표준 DMEM보다 더 낮은 Na+ 농도 및 더 높은 K+ 농도를 포함한다(즉, Na+ 저 농도/K+ 고 농도 배지). 일 측면에서, 냉동보존제는 유기 완충액, 비제한적인 예로서 HEPES를 포함한다. 또 다른 측면에서, 냉동보존제는 아폽토시스 단백질(예, 카파제)을 억제하는 부분을 포함한다.
대안적으로, 난모세포를 실질적으로 비투과성인 임의의 다른 용질, 예컨대 NaCl로 선택적으로 평형화하여 미세주입 전에 세포 부피를 줄일 수 있다. 초기의 세포 부피 감소는 미세주입 이전에 고장성 배지에서 항온처리되지 않은 난모세포와 비교하여 미세주입된 난모세포의 최종 부피를 더 작게 할 수 있다. 최종 부피가 작아지면 난모세포의 팽창으로부터 생기는 임의의 잠재적 부작용을 최소화할 수 있다. 미세주입용 세포를 준비하기 위한 이 일반적인 절차는 다른 세포형(예, 활성화된 난모세포, hES 세포 등)에도 이용할 수 있다.
그 다음 난모세포에 냉동보존제를 미세주입한다. 미세주입 장치 및 절차는 당업계에 잘 특성화되어 있으며, 소형 분자의 세포로의 주입에 사용하는 것으로 알려진 미세주입 장치를 본 발명에서 이용할 수 있다. 예시적인 미세주입 단계에서, 30 밀리초 동안 10 psi 압력에서 난모세포에 미세주입할 수 있다. 표준 미세주입법의 또 다른 예는 Nakayama 및 Yanagimachi의 문헌(Nature Biotech. 16:639-642, 1998)에 기술된 방법이다.
본 과정에 유용한 냉동보존제는 냉동보존성을 가지고 일반적으로 비투과성인 임의의 화학물질을 포함한다. 특히, 냉동보존제는 단독 또는 다른 전형적인 냉동보존제와 함께 혼합된 당류를 포함할 수 있다. 탄수화물 당류, 예컨대 트레할로스, 수크로스, 프럭토스 및 라피노스를 약 1.0 M 이하의 농도, 더욱 바람직하게는 약 0.4 M 이하의 농도로 미세주입할 수 있다. 일 측면에서, 농도는 0.05∼0.20 M(경계값 포함)이다. 또한, 세포외 당류 또는 전형적인 냉동보존제를 저장 전에 첨가할 수 있다. 미세주입 전에 고장성 용액에서 세포를 항온처리한 경우, 실질적으로 비투과성인 용질은 미세주입 후에 배지 중에 남거나, 또는 더 낮은 농도의 용질을 함유하거나 용질을 함유하지 않는 배지로 세포를 세척하여 배지로부터 제거될 수 있다.
막을 통과하기에는 너무 커서 보통 세포막을 투과하지 않는 일부 당류 또는 다당류는 냉동보존 목적으로 우수한 생리화학적 및 생물학적 성질을 가진다. 일반적으로 이들 당류는 스스로 세포막을 투과하지 않지만, 개시된 방법을 이용하여, 이들 보통의 비투과성 당류를 세포 내로 미세주입하여 유리한 효과를 얻을 수 있다.
세포에 대한 안정화 효과 또는 보존 효과를 나타내고, 본 발명의 방법에서 냉동보존제로서 특히 유용한 비투과성 당류는 수크로스, 트레할로스, 프럭토스, 덱스트란 및 라피노스를 포함한다. 이들 당류 중에서, 글루코스의 비환원성 이당류인 트레할로스가 낮은 농도에서 세포 구조물을 안정화시키는데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 또한, 세포외 당지질 또는 당단백질을 첨가하면 세포막을 안정화시킬 수 있다.
냉동보존제의 미세주입 후에, 저장을 위한 세포를 준비한다. 동결 및/또는 건조를 위한 각종 방법을 이용하여 저장용 세포를 준비할 수 있다. 특히, 본원에는 3가지 방법을 개시한다: 진공 또는 공기 건조, 동결 건조, 및 동결-해동 프로토콜. 건조법은 안정화된 생물학적 물질을 상온에서 이송 및 저장할 수 있다는 점에서 유리하다.
통상적으로, 1∼2M DMSO와 함께 넣은 난모세포를 매우 느린 냉각 속도(0.3∼0.5℃/분)로 중간 온도(-60℃∼-80℃)로 냉각한 다음, 저장용 액체 질소에 넣는다. 그 다음 이 온도에서 샘플을 저장할 수 있다.
예를 들어 원하는 시간 동안 액체 질소(LN2) 중에 병을 두어, 냉동보존 온도에서 현탁된 물질을 저장할 수 있다.
단백질의 동결 건조 및 진공 또는 공기 건조 프로토콜은 당업계에 잘 특성화되어 있으며(Franks 등, "Materials Science and the Production of Shelf-Stable Biologicals," BioPharm, October 1991, p. 39; Shalaev 등, "Changes in the Physical State of Model Mixtures during Freezing and Drying: Impact on Product Quality," Cryobiol. 33, 14-26 (1996)), 이러한 프로토콜을 사용하여 개시된 바와 같은 방법으로 저장용 세포 현탁액을 준비할 수 있다. 공기 건조 외에, 세포 현탁액으로부터 수분을 제거하는데 사용할 수 있는 다른 대류 건조법은 질소 또는 기타 기체를 대류시키는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 예시적인 증발 진공 건조 프로토콜은 12웰 플레이트의 각 웰에 20 ㎕를 두고 상온에서 2 시간 동안 진공 건조시키는 것을 포함할 수 있다. 물론, 병에서 세포를 건조시키는 것을 비롯한 다른 건조법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로 준비된 세포를 무수 상태로 저장하고, DMEM 또는 임의의 다른 적절한 배지에서 희석하여 재수화시킬 수 있다.
동결 건조를 이용하여 저장용 세포를 준비하는 본 발명의 방법은 세포 현탁액을 동결시키는 것으로 시작한다. 종래의 동결법을 사용할 수 있지만, 동결-해동법을 위해 본원에 개시된 단순한 침지 동결법(simple plunge freezing)도 동결 건조 프로토콜의 동결 단계에 사용할 수 있다.
동결시킨 후, 2단계 건조법을 사용할 수 있다. 제1 단계에서는, 승화 에너지를 가하여 동결된 물을 기화시킨다. 샘플 내 순수한 결정질 얼음이 승화된 후에 제2 단계의 건조를 수행한다. 동결 건조된 세포를 진공 건조에 대해 상기 개시한 바와 동일한 방식으로 저장 및 수화시킬 수 있다. 이 후, 생존 가능한 세포를 회수할 수 있다.
동결 또는 건조된 상태로부터 세포를 회수한 후에, 선택적으로 임의의 외부 냉동보존제를 배양 배지로부터 제거할 수 있다. 예를 들어, 더 낮은 농도의 냉동보존제를 포함하는 상응하는 배지를 첨가하여 배지를 희석할 수 있다. 예를 들어, 세포 저장에 사용된 것보다 낮은 농도로 당류를 포함하는 배지에서 약 5분 동안 회수된 세포를 항온처리할 수 있다. 이 항온처리 과정에서, 배지는 냉동보존제로서 사용된 동일한 당류; 다른 냉동보존제, 예컨대 갈락토스; 또는 실질적으로 비투과성인 임의의 다른 용질을 포함할 수 있다. 배지의 삼투성 감소로 유도된 임의의 삼투압 충격을 최소화하기 위해서, 희석 단계를 복수회 실시하고 각 회의 희석 단계에서는 더 낮은 농도의 냉동보존제를 이용하여 세포외 냉동보존제의 농도를 서서히 감소시킬 수 있다. 이들 희석 단계는, 세포외 냉동보존제가 존재하지 않을 때까지 또는 배지의 삼투성 또는 냉동보존제의 농도가 원하는 수준으로 감소할 때까지 반복할 수 있다.
단위발생적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM 및 자가 줄기 세포를, 추후 필요에 따라 세포를 재생시킬 수 있는 방식으로 저장 또는 "보관(bank)"할 수 있다. 단위발생적으로 활성화된 난모세포 및 자가 줄기 세포의 분액을 임의 시점에서 분리하여 다수의 미분화 세포의 배양물로 배양하고, 이후 특정 세포형 또는 조직형으로 분화시킬 수 있으며, 피험체의 기능부전 조직을 대체하거나 질병을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 도너로부터 세포가 단위발생적으로 유래하기 때문에, 개체 또는 밀접한 관련자가 장기간 동안 세포를 입수할 수 있도록 세포를 저장할 수 있다.
일 구체예에서, 단위발생적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM 및/또는 자가 줄기 세포 샘플을 저장하기 위한 세포 은행이 제공된다. 또 다른 구체예에서, 그러한 세포 은행의 운영 방법이 제공된다. 공개된 미국 특허 출원 20030215942호에는 줄기 세포 은행 시스템의 일례가 제공되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
상기 개시된 것과 같은 방법을 이용하여, 단위발생적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM 및 자가 줄기 세포 샘플을 분리 및 시험관내 증식시키고, 이를 냉동보존하면, 이식가능한 인간 줄기 세포의 "은행" 확립이 용이해진다. 더 작은 분액의 세포를 저장할 수 있기 때문에, 보관 절차에는 비교적 작은 공간이 필요하다, 따라서, 다수의 개체의 샘플을 단기간 또는 장기간 동안 비교적 저렴한 비용으로 저장 또는 "보관"할 수 있다.
일 구체예에서, 샘플의 일부분은 처리 및 저장 전 또는 후에 시험을 위해 이용된다.
본 발명은 또한, 샘플의 위치를 파악할 필요가 있을 때 샘플을 용이하게 검색할 수 있도록, 단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM, 및/또는 자가 줄기 세포 샘플의 기록 방법을 제공한다. 이러한 목적은 임의의 색인 시스템 및 검색 시스템을 사용하여 달성할 수 있다. 임의의 적당한 유형의 저장 시스템을 사용하여, 단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM, 및/또는 자가 줄기 세포를 저장할 수 있다. 샘플은 개개의 샘플을 저장하도록 설계되거나 또는 수백, 수천 및 심지어 수백만의 상이한 세포 샘플을 저장하도록 설계될 수 있다.
저장된 단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM, 및/또는 자가 줄기 세포 샘플은 신뢰성 있고 정확한 검색을 위하여 색인화될 수 있다. 예컨대, 각 샘플은 문자숫자식 코드, 바코드 또는 임의의 다른 방법 또는 이들의 조합으로 표시될 수 있다. 또한, 각 단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM, 및/또는 자가 줄기 세포 샘플의 확인 및 은행에서의 그 위치의 확인을 가능하게 하고 세포 샘플의 공급원 및/또는 유형의 확인을 가능하게 하는 정보의 액세스 및 판독이 가능한, 은행 외부에 있는 목록이 존재할 수도 있다. 이러한 색인 시스템은 업계에 공지된 임의의 방식으로, 예컨대 수동으로 또는 비수동으로 관리될 수 있으며, 예컨대 컴퓨터 및 종래의 소프트웨어가 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 새포 샘플은 필요할 때마다 도너의 사용을 위해 이용가능하도록 색인 시스템을 사용하여 조직화된다. 다른 실시양태에서, 세포 샘플은 본래의 도너와 관계가 있는 개인에 의하여 이용될 수 있다. 색인 시스템에 기록되면, 세포 샘플은 매칭 목적으로 이용될 수 있도록 제조될 수 있는데, 예컨대 매칭 프로그램은 매칭 유형 정보로 개인을 확인하게 되며 개인은 매칭 샘플을 제공받을 수 있는 옵션을 갖게 된다.
저장 은행 시스템은 복수의 개인 및 복수의 세포 샘플과 관련된 복수의 기록을 저장하기 위한 시스템을 포함할 수 있다. 각 기록은 세포 샘플 또는 특정 개인과 관련된 유형 정보, 유전자형 정보 또는 표현형 정보를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 시스템은 샘플을 받고자 하는 개인의 유형과 샘플의 유형을 매칭하는 상호 매칭 표를 포함한다.
한 실시양태에서, 데이터베이스 시스템은 은행에 각 단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM, 및/또는 자가 줄기 세포 샘플에 대한 정보를 저장한다. 어떤 정보는 각 샘플과 연관지어 저장된다. 상기 정보는 특정 도너, 예컨대 도너의 신원 및 도너의 의학적 병력과 연관될 수 있다. 예컨대, 각 샘플은 HLA 유형일 수 있고, 상기 HLA 유형 정보는 각 샘플과 연관지어 저장될 수 있다. 저장된 정보는 또한 이용가능성 정보일 수도 있다. 각 샘플과 함께 저장된 정보는 서치 가능하고 위치를 파악하여 의뢰자에게 즉시 공급될 수 있는 방식으로 샘플을 확인한다.
따라서, 본 발명의 실시양태는 도너, 제출일, 제출된 세포의 유형, 존재하는 세포 표면 마커의 유형, 도너와 관련된 유전자 정보 또는 다른 관련 정보, 및 저장 샘플의 위치 및 유지 기록과 같은 저장 상세 정보 및 기타 유용한 정보를 포함하는 컴퓨터 기초 시스템을 이용한다.
"컴퓨터 기초 시스템(computer-based system)"은 저장된 세포에 대한 정보의 저장, 서치 및 검색에 사용되는 하드웨어, 소프트웨어 및 임의의 데이터베이스를 의미한다. 컴퓨터 기초 시스템은 바람직하게는 상기 개시한 저장 매체 및 데이터에 액세스하여 데이터를 처리하기 위한 프로세서를 포함한다. 이러한 실시양태의 컴퓨터 기초 시스템의 하드웨어는 중앙 처리 장치(CPU) 및 데이터베이스를 포함한다. 당업자는 현재 이용 가능한 컴퓨터 기초 시스템 중 어떤 하나가 적당하다고 용이하게 알 수 있다.
한 실시양태에서, 컴퓨터 시스템은 주 메모리(바람직하게는 RAM으로서 실행됨) 및 다수의 부차적 저장 장치, 예컨대, 하드 드라이브 및 분리 가능한 매체 저장 장치에 연결되어 있는 부스와 연결된 프로세서를 포함한다. 분리 가능한 매체 저장 장치는 예컨대 플로피 디스크 드라이브, DVD 드라이브, 광디스크 드라이브, 콤팩트 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브 등일 수 있다. 제어 로직 및/또는 여기에 기록된 데이터를 갖는 플로피 디스크, 콤팩트 디스크, 자기 테이프 등과 같은 분리 가능한 저장 매체를 분리 가능한 저장 장치에 삽입할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 분리 가능한 매체 저장 장치에 삽입되었을 때 분리 가능한 매체 저장 장치로부터 제어 로직 및/또는 데이터를 판독하기 위한 적절한 소프트웨어를 포함한다. 단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM, 및/또는 자가 줄기 세포에 관한 정보는 주 메모리, 임의의 부차적 저장 장치 및/또는 분리 가능한 저장 매체에 널리 공지된 방식으로 저장될 수 있다. 이들 데이터에 액세스하여 이들 데이터를 처리하기 위한 소프트웨어(예컨대, 서치 툴, 비교 툴 등)는 실행 동안 주 메모리에 있다.
본원에서 사용될 때, "데이터베이스(database)"는 단위생식적으로 활성화된 난모세포 및/또는 자가 줄기 세포 콜렉션 및 도너에 관한 임의의 유용한 정보를 저장할 수 있는 메모리를 의미한다.
저장된 단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM, 및/또는 자가 줄기 세포에 관한 데이터는 다양한 데이터 프로세서 프로그램에 다양한 포맷으로 저장되고 조작될 수 있다. 예컨대, 데이터는 DB2, SYBASE 또는 ORACLE과 같은 당업자에게 익숙한 다양한 데이터베이스 프로그램에서 Microsoft WORD 또는 WORDPERFECT, ASCII 파일, html 파일, 또는 pdf 파일과 같은 워드 프로세싱 파일에 텍스트로서 저장될 수 있다.
"서치 프로그램(search program)"은 데이터베이스내 저온 보존된 샘플에 관한 정보를 상세히 서치하거나 비교하기 위한 컴퓨터 기초 시스템에서 실행되는 하나 이상의 프로그램을 의미한다. "검색 프로그램(retrieval program)"은 데이터베이스 내에서 대상 파라미터를 확인하기 위하여 컴퓨터 기초 시스템에서 실행될 수 있는 하나 이상의 프로그램을 의미한다. 예컨대, 검색 프로그램을 사용하여 특정 프로파일에 맞는 샘플, 특정 마커 또는 DNA 서열을 갖는 샘플을 발견하거나 또는 특정 개인에 해당하는 샘플의 위치를 발견할 수 있다.
하나의 세포 은행에 저장될 수 있는 세포 샘플의 수에는 상한이 없다. 한 실시양태에서는, 다른 개인으로부터의 수백의 생성물을 하나의 은행 또는 저장 시설에 저장한다. 또다른 실시양태에서는, 수백만 이하의 생성물을 하나의 저장 시설에 저장할 수 있다. 하나의 저장 시설을 사용하여 단위생식적으로 활성화된 난모세포 및/또는 자가 줄기 세포 샘플을 저장하거나 또는 다수의 저장 시설을 이용할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 저장 시설은 예컨대 자동화된 로봇 검색 메카니즘 및 세포 샘플 조작 메카니즘과 같은, 저장된 세포 샘플을 조직화 및 색인화하는 임의의 방법을 위한 수단을 가질 수 있다. 상기 시설은 세포 샘플을 처리하기 위한 조작 장치를 포함할 수 있다. 세포 샘플의 효율적인 저장 및 검색을 위해 공지된 종래의 기술을 사용할 수 있다. 예시적인 기술은 머신 비젼(Machine Vision), 로보틱스(Robotics), 자동화 가이드 비이클 시스템(Automated Guided Vehicle System), 자동화 저장 및 검색 시스템(Automated Storage and Retrieval Systems), 컴퓨터 통합 제조 기술(Computer Integrated Manufacturing), 컴퓨터 보조 처리 계획(Computer Aided Process Planning), 통계학적 처리 제어 기술(Statistical Process Control) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
샘플을 필요로 하는 개인과 연관된 유형 정보 또는 기타 정보는 예컨대 데이터베이스 시스템, 색인 시스템 등과 같이 적절한 매칭 생성물을 확인하는 데 사용될 수 있는 시스템에 기록될 수 있다. 상기 시스템에 기록되면, 개인의 유형 및 도너 세포 샘플 간에 매칭이 이루어질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 도너 샘플은 샘플을 필요로 하는 개인과 동일한 개인에서 유래한다. 그러나, 유사하지만 동일하지 않은 도너/리시피언트 매치도 또한 사용될 수 있다. 매칭 샘플은 매칭 유형 식별자를 보유하는 개인에 사용할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 개인의 신원 정보는 세포 샘플과 관련하여 저장된다. 일부 실시양태에서, 매칭 프로세스는 대략 샘플의 회수 즈음에 일어나거나 또는 프로세싱, 저장 동안 또는 필요에 따라 어느 때라도 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 매칭 프로세스는 개인이 세포 샘플을 실제로 필요로 하기 전에 일어난다.
개인이 단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM, 및/또는 자가 줄기 세포 샘플을 필요로 할 경우, 상기 샘플은 검색되어 수분 이내에 연구, 이식 또는 필요에 따라 다른 목적을 위해 이용될 수 있다. 샘플은 또한 이식 또는 다른 필요에 대한 준비를 위해 더 처리될 수도 있다.
통상적으로, 난모세포는 이 단계에서 배란되어 정자에 의하여 수정된다. 정자는 활성화라 불리는 과정에서 감수 분열의 완성을 개시한다. 활성화 동안, 염색분체의 쌍이 분열하고, 제2 극체가 방출되며, 난모세포는 각각 하나의 염색분체를 갖는 반수 염색체를 보유한다. 정자는 다른 반수 염색체 보체를 제공하여 단일의 염색분체를 갖는 완전한 배수 염색체 세포를 만든다. 상기 염색체는 이후 제1 세포 주기 동안 DNA 합성을 통해 진행된다. 이들 세포는 이후 배아로 발달된다.
대조적으로, 본원에 개시된 배아는 모든 수컷 또는 암컷 기원의 DNA를 함유하는 세포, 일반적으로 포유동물 난모세포 또는 할구의 인위적인 활성화에 의하여 발달된다. 본 발명의 배경기술에 개시된 바와 같이, 수정되지 않은 난모세포의 인위적인 활성화를 위한 다수의 방법이 문헌에 보고되었다. 이러한 방법에는 물리적 방법, 예컨대 배양액 중 난모세포를 단자(pricking)하거나 또는 조작하는 방법, 열에 의한 방법, 예컨대 냉각 및 가열하는 방법, 반복적으로 전기 자극을 주는 방법, 효소, 예컨대 트립신, 프로나제, 히알루로니다제로 처리하는 방법, 삼투압 처리 방법, 이온 처리 방법, 예컨대, 2가 양이온 및 칼슘 이온운반체, 예컨대 이오노마이신 및 A23187에 의한 처리 방법, 마취제를 사용하는 방법, 예컨대, 에테르, 에탄올, 테트라카인, 리그노카인, 프로카인, 페노티아진을 사용하는 방법, 안정제를 사용하는 방법, 예컨대, 티오리다진, 트리플루오페라진, 플루페나진, 클로르프로마진을 사용하는 방법, 단백질 합성 억제제를 사용하는 방법, 예컨대, 사이클로헥시미드, 퓨로마이신을 사용하는 방법, 인산화 억제제를 사용하는 방법, 예컨대, 단백질 키나제 억제제(예, 스타우로스포린, 2-아미노퓨린, 스핑고신과 DMAP, 및 이들의 혼합물)을 사용하는 방법, 및 기타 방법들을 포함한다.
이러한 활성화 방법은 업계에 널리 공지되어 있으며 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 미국 특허 5,945,577호에 개시되어 있다.
한 실시양태에서는, 중기 II의 인간 세포, 일반적으로 모든 수컷 또는 암컷 기원의 DNA를 포함하는 난모세포 또는 할구를 인위적으로 활성화하여 난모세포를 인위적으로 활성화한다.
관련된 측면에서는, 배수 염색체인 활성화된 세포(예컨대, 난모세포)는 영양외배엽 및 내부 세포괴를 포함하는 배아로 발달되게 한다. 이것은 배반포 발달을 촉진하는 공지된 방법 및 배양 배지를 사용하여 실시할 수 있다.
자성발생성 배아를 배양하여 식별 가능한 영양외배엽 및 내부 세포괴를 생성시킨 후, 이어서 내부 세포괴의 세포를 이용하여 소정의 다능성 세포주를 생성한다. 이것은 내부 세포괴로부터 유래한 세포 또는 전체 내부 세포괴를 분화를 억제하는 배양액으로 옮겨서 실시할 수 있다. 이 과정은 내부 세포괴를 이루는 세포, 예컨대 섬유아세포 또는 상피 세포, 예컨대 출산 직후 인간 조직 등으로부터 유래하는 섬유아세포, 또는 LIF를 생성하는 기타 세포를, 분화를 억제하는 영양공급층으로 옮김으로써 이루어질 수 있다. 세포를 미분화 상태로 유지시키는데 적당한 배양 조건을 제공하기 위하여, 기타 인자/성분을 사용할 수 있으며, 여기에는 예컨대 상태조절된 배지(Amit외 다수, Developmental Biol (2000) 227:271-278), bFGF 및 TGF-β1(LIF 포함 또는 불포함)(Amit외 다수, Biol Reprod (2004) 70:837-845), gp130/STAT3 경로를 활성화하는 인자(Hoffman and Carpenter, Nature Biotech (2005) 23(6):699-708), PI3K/Akt, PKB 경로를 활성화하는 인자(Kim외 다수, FEBS Lett (2005) 579:534-540), 골 형태 형성 단백질(BMP) 상과의 일원인 인자(Hoffman and Carpenter (2005), 상동), 그리고 정규의/β-카테닌 Wnt 신호 전달 경로를 활성화하는 인자(예컨대, GSK-3-특이 억제 인자; Sato외 다수, Nat Med (2004) 10:55-63)의 첨가가 포함되자 이에 한정되지 않는다. 관련 측면에서, 이러한 인자들은 영양공급세포 및/또는 ECM 기층을 포함하는 배양 조건을 포함할 수 있다[Hoffman and Carpenter (2005), 상동].
한 측면에서, 내부 세포괴를 이루는 세포는 인간의 출산 직후 포피 또는 진피 섬유아세포의 세포, 또는 백혈병 억제 인자를 생성하는 기타 세포상에서, 또는 백혈병 억제 인자의 존재 하에 배양된다. 관련 측면에서, 영양공급세포는 ICM을 접종하기 이전에 불활성화된다. 예컨대 영양공급세포의 유사 분열은 항생제를 사용하여 불활성화할 수 있다. 관련 측면에서, 항생제는 미토마이신 C일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양은 세포를 미분화된 다능성 상태로서, 장시간 동안(이론적으로는 무한정) 유지하는 조건 하에서 이루어질 것이다. 한 실시양태에서, 난모세포는 높은 O2 분압 하에서 칼슘 이온운반체로 단위생식적으로 활성화되며, 이후, 상기 난모세포는 낮은 O2 분압 하에서 세린-트레오닌 키나제 억제제와 접촉된다. 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 생성된 ICM은 높은 O2 분압 하에서 배양되는데, 이때, 이 세포는, 예컨대 20%의 O2를 포함하는 혼합 기체를 사용하여 유지시킨다. 한 측면에서, 배양 가능하다는 의미는, 배양될 수 있거나 또는 배양에 적합한 상태를 말한다. 관련 측면에서, ICM은 배반포 배양 4일 후에 기계적으로 분리되는데, 이때, 배양은 영양공급세포 상에서 이루어진다. 예컨대 이와 같은 배양을 통하여, 면역 절제술의 경우에서와 마찬가지로, 동물성 공급원으로부터 유래하는 물질을 사용할 필요가 없어지게 된다.
관련 측면에서, ICM용 배양 배지는 인간 제대 혈청을 포함하나 이에 한정되지 않는 비-동물성 혈청으로 보충되는데, 여기서 상기 혈청은 규명 배지[예컨대, IVF(MediCult A/S, Denmark; Vitrolife, Sweden; 또는 Zander IVF, Inc.(Vero Beach, FL)] 중에 존재한다. 또다른 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 배지와 처리 과정에는 동물성 생성물을 사용하지 않는다. 관련 측면에서, 동물성 생성물로서는 인간이 아닌 공급원으로부터 유래하는 것, 예컨대 혈청, 인터페론, 케모카인, 시토카인, 호르몬 및 성장 인자가 있다.
본 발명에 의하여 생성된 세포의 다능성 상태는 다양한 방법에 의하여 확인될 수 있다. 예컨대 세포는 특징적인 ES 세포 마커가 존재하는지 여부에 대해 테스트될 수 있다. 인간 ES 세포의 경우, 이와 같은 마커의 예로서는 상기 정의한 바와 같은 것들이 있으며, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60 및 TRA-1-81이 업계에 공지되어 있다.
또한 다능성은 적당한 동물, 예컨대 SCID 마우스에 세포를 주입하고, 분화된 세포 및 조직의 생성을 관찰함으로써 확인할 수 있다. 다능성을 확인하는 또 다른 방법으로서는 상기 다능성 세포를 사용하여 키메라 동물을 생성하고, 상기 도입된 세포가 세포 유형의 분화에 기여하는지 여부를 관찰하는 방법이 있다. 키메라 동물을 생성하는 방법에 관하여는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에 참고 문헌으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,642,433호에 개시되어 있다.
다능성을 확인하는 또 다른 방법으로서는, 분화를 촉진하는 조건(예컨대, 섬유아세포 영양공급층을 제거한 조건) 하에서 배양될 때, ES 세포가 배상체 및 기타 분화된 세포 유형으로 분화하는지 여부를 관찰하는 방법이 있다. 이 방법을 사용하여, 상기 다능성 세포가 조직 배양액 중에서 배상체 및 상이한 분화 세포 유형으로 발생함을 확인하였다.
결과로 생성된 다능성 세포 및 세포주, 바람직하게는 인간의 다능성 세포 및 세포주(전부가 암컷 기원인 DNA로부터 유래하는 세포 및 세포주)는 다양한 치료 분야 및 진단 분야에서 사용된다. 이와 같은 다능성 세포는 다양한 질병 상태의 치료에 있어서, 세포 이식 요법 또는 유전자 요법(유전자 변형되었을 경우)에 사용될 수 있다.
이러한 관점에서, 마우스의 배아 줄기(ES) 세포는 거의 모든 세포 유형(예컨대, 조혈모 줄기 세포)으로 분화할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하여 생성된 인간의 다능성(ES) 세포들은 유사한 분화 능을 보유할 것이다. 본 발명에 의한 다능성 세포는 공지의 방법에 따라서 원하는 세포 유형으로 분화하도록 유도될 것이다. 예컨대 본 발명에 의하여 생성된 인간의 ES 세포는, 세포를 분화시키는 조건 하에 분화 배지 중에서 이 세포를 배양함으로써, 조혈모 줄기 세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 췌도 세포, 망막 세포, 연골 세포, 상피 세포, 요로 세포 등으로 분화하도록 유도될 수 있다. ES 세포를 분화시키는 배지 및 방법은 당 업계에 적당한 배양 조건인 것으로 공지되어 있다.
예컨대, 문헌[Palacios외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7530-7537 (1995)]에는, 줄기 세포를 유도 과정에 도입함으로써 배아 세포주로부터 조혈 모 줄기 세포를 생성하는 방법에 관하여 개시되어 있는데, 여기서 상기 유도 과정은, 우선 이러한 세포의 응집체를 레티논산이 결여된 현탁 배양 배지 중에서 배양한 후, 다시 레티논산을 함유하는 동일한 배지 중에서 배양하고, 이후에 세포 응집체를 세포 부착용 기층에 옮기는 단계를 포함한다.
또한, 문헌[Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6:543-552 (1994)]은, 배아 줄기 세포를 시험관 내 분화하여, 조혈모 세포, 근육 세포, 심근 세포 및 신경 세포 등을 포함하는 다양한 분화 세포 유형을 생성하는 방법에 관하여 개시하고 있는 다양한 논문들을 인용한 고찰 논문이다.
또한, 문헌[Bain외 다수, Dev. Biol., 168:342-357 (1995)]에는, 배아 줄기 세포를 시험관 내에서 분화시켜, 뉴런의 특성을 갖는 신경 세포를 생성하는 방법에 관하여 개시되어 있다. 이와 같은 참고 문헌에는 배아 세포나 줄기 세포로부터 분화된 세포를 얻는 대표적인 방법이 개시되어 있다. 이와 같이 배아 줄기 세포를 분화하는 방법에 관한 참고 문헌, 특히 이 문헌에 개시된 사항들은 본원에 그 전체가 참고문헌으로 인용되어 있다. 따라서, 공지의 방법과 배양 배지를 사용함으로써, 당 업자는 목적 ES 세포, 예컨대 유전자 조작된 ES 세포 또는 트랜스게닉 ES 세포를 배양하여, 원하는 분화 세포 유형, 예컨대 신경 세포, 근육 세포, 조혈 모 세포 등을 얻을 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 다능성 세포는 원하는 임의의 분화 세포 유형을 얻는데 사용될 수 있다. 분화된 인간 세포를 치료용으로 사용할 수 있음은 더할 나위 없다. 예컨대 인간의 조혈모 줄기 세포는 골수 이식이 필요한 의학적 치료에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 질병, 예컨대 말기 암, 예컨대 난소암 및 백혈병뿐만 아니라, 면역계를 약화시키는 질병, 예컨대 AIDS를 치료하는데 사용된다. 조혈 모 줄기 세포는, 예컨대 남성 또는 여성 암 또는 AIDS 환자로부터 유래하는 남성 또는 여성 DNA를 제핵 난모세포와 통합하고, 전술한 바와 같이 다능성 세포를 얻어내어, 분화를 촉진하는 조건 하에서 조혈 모 줄기 세포가 얻어질 때까지 상기 세포를 배양함으로써 얻어질 수 있다. 이와 같은 조혈 모 세포는 질병, 예컨대 암과 AIDS의 치료에 사용될 수 있다.
대안적으로, 상기 다능성 세포는, 신경 세포주를 생성하는 분화 조건 하에서 이 세포를 배양함으로써, 신경학적 질환이 발병한 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 이와 같이 인간의 신경 세포를 이식함으로써 치료될 수 있는 구체적인 질병으로서는, 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병, ALS 및 뇌성 마비 등을 포함한다. 파킨슨병과 같은 구체적인 경우에 있어서, 이식된 태아의 뇌 신경 세포는 주위 세포와 적당히 연계되어 도파민을 생성한다는 사실이 입증된 바 있다. 이로써, 파킨슨병의 증상들을 장기간 동안 억제할 수 있다.
본 발명의 하나의 목적은 난모세포 도너에 대한 자기 이식에 적합한 분화 세포를 생성하는데 사용될 수 있는, 인간의 다능성 세포를 본질적으로 무한정 제공하는 것에 있다. 불임 처리 후에 잔류하는 배반포로부터 유래하거나, NT를 사용하여 생성된 인간 배아 줄기 세포와 이것의 분화된 자손은, 동종의 세포 이식 요법에 사용될 때 리시피언트의 면역계에 의해 거부될 것이다. 단위생식적으로 유래된 줄기 세포는 현재의 이식법과 관련된 심각한 문제점 즉, 난모세포 도너에 대한 숙주-대-이식편 또는 이식편-대-숙주 거부 현상으로 인해 발생할 수 있는, 이식된 조직의 거부 현상을 경감시킬 수 있었던 분화 세포가 될 수 있다. 통상적으로, 거부 현상은 항-거부 약물(anti-rejection drug), 예컨대 시클로스포린을 투여함으로써 예방 또는 경감된다. 그러나, 이러한 약물은 심각한 부작용, 예컨대 면역 억제 현상 및 발암 위험성을 가지며, 또한 매우 비싸다는 단점이 있다. 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생성된 세포는 난모세포 도너에 대하여, 항-거부 약물을 투여할 필요성을 없애거나, 아니면 적어도 이러한 필요성을 상당 수준 줄일 수 있어야 한다.
본 발명의 다른 목적은, 난모세포 도너의 가족 구성원에게 동종 이식하기 적합한 분화 세포를 생성하는데 사용될 수 있는, 인간의 다능성 세포를 본질적으로 무한정 공급하는 것에 있다. 이 경우 세포는 난모세포 도너의 직계 가족 구성원의 세포와 면역학적으로나 유전적으로 유사하므로, 도너의 가족 구성원에 의해 거부될 가능성은 줄어들 것이다.
본 방법의 다른 목적은, SCNT에 비하여 비교적 간단한 과정인 포유동물 난모세포의 단위생식적 활성화를 통하여, 세포 조작 단계 수를 줄여서 줄기 세포를 간단하게 생성함에 있다.
포유동물 난모세포의 단위생식적 활성화는 줄기 세포를 생성함에 있어서, 배반포의 난모세포를 물리적으로 조작할 필요가 있는 방법에 비하여 더욱 효율적인 것으로 생각된다.
SCNT의 한 가지 단점은, 미토콘드리아 호흡 연쇄 활성이 결핍된 피험체가 SCNT 태아와 자손에서 일반적으로 발생할 수 있는 이상 현상과 거의 유사한 표현형을 나타낸다는 점이다[Hiendleder외 다수, Repro Fertil Dev (2005) 17(1-2):69-83]. 세포는 일반적으로 한가지 종류의 미토콘드리아 DNA(mtDNA, 동형상태라고도 칭함)만을 함유하지만, 일반적으로 이형상태도 또한 돌연 변이체 및 야생형 mtDNA 분자의 조합체로서 존재하거나 또는 야생형 변이체의 조합체의 형태로서 존재하기도 한다[Spikings외 다수, Hum Repro Update (2006) 12(4):401-415]. 이형상태는 미토콘드리아 관련 질병을 일으킬 수 있으며, 다양한 기전들은 모계만을 통하여 전달된다. 그러나, 동형상태를 유지하기 위한 보통의 기전을 우회하는 방법(예컨대, 세포질 운반(CT) 및 SCNT)을 점점 많이 사용함으로써, 교란된 미토콘드리아의 기능은 이러한 공급원으로부터 유래한 줄기 세포에 내재할 수 있게 되었다.
한 측면에서, 반수성체는 일측 부모이므로, 이형상태 가질 가능성이 최소화된다.
세포 요법에 의해 치료 가능한 기타 질병 몇 병태로서는, 예컨대 척수 손상, 다발성 경화증, 근위축증, 당뇨병, 간 질환, 예컨대 급성 질환(바이러스성 간염 및 약물의 과복용(아세타미노펜) 등), 만성 질환[만성 간염 및 기타(일반적으로 간경변을 일으키는 간염)], 유전적 간 결함(B형 혈우병, 인자 IX 결핍증, 불리루빈 대사 결함, 요소 회로 결함, 리소좀 축적병 및 a1-항 트립신 결핍증 등), 심장병, 연골 치환, 화상, 족부 궤양, 위장관 질환, 혈관 질환, 신장 질환, 망막 질환, 각막 질환, 요로 질환 및 노화 관련 질환 및 병태를 포함한다.
본 방법은 결함 유전자, 예컨대 결함 면역계 유전자, 섬유성 낭종 유전자를 치환하거나, 또는 치료적으로 유용한 단백질, 예컨대 성장 인자, 림포카인, 시토킨, 효소 등을 발현하는 유전자를 도입하는데 사용될 수 있다.
예컨대, 뇌 유래 성장 인자를 암호화하는 유전자는 본 발명에 의하여 생성되는 인간의 다능성 세포에 도입될 수 있으며, 신경 세포로 분화된 세포와 파킨슨병 환자에 이식된 세포가 이러한 질병이 발병하였을 때 신경 세포의 손상을 늦출 수 있는 것이다.
또한, 본 발명의 다능성 인간 ES 세포는 분화에 관한 시험관 내 모델, 특히, 초기 발생 과정을 조절하는데 관여하는 유전자 연구용 모델로서 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 ES 세포를 사용하여 생성된 분화 세포 조직 및 기관은 약물 연구에 사용될 수 있다.
또, 본 발명의 ES 세포 또는 이로부터 유래하는 분화 세포는 기타 ES 세포 및 세포 콜로니의 생성을 위한 핵 공여체로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여 얻어진 다능성 세포는 배 발생에 관여하는 단백질 및 유전자를 동정하는데 사용될 수 있다. 이는, 예컨대 차등적 발현(differential expression)에 의해 이루어질 수 있는데, 즉, 본 발명에 의하여 생성된 다능성 세포 내 발현된 mRNA와, 상이한 세포 유형, 예컨대 신경 세포, 심근 세포, 기타 근육 세포 및 피부 세포 등으로 분화되는 세포로서 발현되는 mRNA를 비교함으로써 이루어질 수 있다. 따라서, 어떠한 유전자가 특정 세포 유형의 분화에 관여하는지를 판단할 수 있다.
또한, 특이적인 유전적 결함, 예컨대 듀케네 근 발육 이상(Duchene's Muscular Dystrophy)을 유발하는 유전적 결함을 가지는 ES 세포 및/또는 이것의 분화된 자손은, 유전적 결함과 관련된 특정 질병을 연구하는 모델로서 사용될 수 있다.
또한, 본원에 개시된 방법에 의하여 생성된 다능성 세포주를, 상이한 성장 인자들을 상이한 농도로 포함하는 혼합물에 노출시키고, 또한 상이한 세포 배양 조건 하, 예컨대 상이한 세포 매트릭스 상에서 배양한다거나 또는 상이한 기체 분압 하에서 배양한다거나 하여, 원하는 분화 세포 유형을 생성 및 증식시킬 수 있는 조건을 확인하는 것도 본 발명의 또 다른 목적이다.
한 실시양태에서는, 분화 및/또는 증식의 조절을 위한 기계적 지원 없이(3D 스캐폴딩 없이) 시험관에서 생성되는 합성 각막이 개시된다. 일 측면에서는, 최종적으로 시험관 내에서 분화된 각막을 포함하나 이에 한정되지 않는 합성 각막이 개시된다.
또다른 실시양태에서, 상기 각막은 단위생식적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 생성되며, 여기서 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 유래하는 줄기 세포를 인위적으로 조작하여 각막을 생성한다.
일 측면에서, 합성 각막은 DNA 억제제로 처리된 섬유아세포 영양공급층 상에서 혈청 대체물(M/SR), 플라즈마네이트, 및 gpl30/STAT 경로 및/또는 MAP 키나제 경로를 활성화시키는 1 이상의 미토젠을 포함하는 배지에서 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 분리된 줄기 세포를 배양하는 단계, 플라즈마네이트를 포함하는 M/SR(M/SRP)에서 미토젠 처리된 세포를 미토젠 첨가 없이 거의 포화상태가 될 때까지 배양하는 단계(여기서, M/SRP의 1/2 부피는 거의 포화상태인 세포가 색소침착되고 반구형으로 부푼 외관을 나타낼 때까지 주기적으로 M/SR로 대체됨), 및 M/SR에서 색소침착되고/반구형으로 부푼 세포를 젤라틴으로 코팅된 기층에 옮기는 단계(여기서, M/SR의 1/2 부피는 부유 세포괴가 발달될 때까지 주기적으로 M/SR로 대체되는데, 상기 부유 세포괴가 합성 각막임)를 포함하여 생성된다. 관련 양상에서, M/SR은 KO Hi 글루코스 DMEM, 스트렙토마이신, 비필수 아미노산, Glutamax-I, β-머캅토에탄올 및 혈청 대체물을 포함한다. 또다른 관련 양상에서, M/SRP는 M/SR 성분 및 플라즈마네이트를 포함한다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것이나 이를 제한하지 않는다.
실시예 1
인간 단위생식적 배아발생 줄기 세포의 제조
물질 및 방법
도너(donor)는 금전적 대가 없이 난자와 혈액(DNA 분석용)을 자발적으로 공여 하였다. 도너는 포괄적으로 설명된 동의 서류에 서명을 하였으며, 이들에게는, 공여한 모든 재료가 연구에 사용되는 것이지 복제용으로 사용되는 것이 아니라는 것을 주지시켰다. 난소를 자극하기 이전에, 난모세포 도너에게 인간 세포, 조직 및 세포계 생산물 및 조직계 생산물의 도너를 위한 FDA 적격성 심사 지침에 따른 적합성에 관한 검사를 수행하였다[Food and Drug Administration. (Draft) Guidance for Industry: Eligibility Determination for Donors of Human Cells, Tissues, and Cellular and Tissue Based Products (HCT/Ps), 2004년 5월, 및 Russian Public Health Ministry의 명령 N 67 (02.26.03)]. 상기 의료 검사에는 X-선, 혈액 및 소변 분석, 그리고 간 기능 테스트를 포함하였다. 도너를 또한 매독, HIV, HBV 및 HCV 존재 여부에 대해 스크리닝하였다.
대상 도너에서 표준 호르몬 자극을 이용하여 과배란을 유도하여 난모세포를 얻었다. 각 도너의 난자에 이들 월경 주기 중 제3일∼제13일에 FSH에 의한 난소 자극을 수행하였다. FSH 총 1500IU가 제공되었다. 도너의 월경 주기 중 제10일∼제14일에는 고나도리베린 길항제 오르가루트란(Orgalutran; Organon, Holland)을 0.25㎎/일로 주입하였다. 도너의 월경 주기 중 제12일∼제14일에는 매일 75IU FSH + 75IU LH(Menopur, Ferring GmbH, Germany)을 주입하였다. 만일 초음파 검사에서 여포 지름이 18∼20㎜인 것으로 표시되면, 도너의 월경 주기 중 제14일에 hGC(Choragon, Ferring GmbH, Germany)의 1회량 8000IU를 투여하였다. hCG 주입 후 35시간 대략 제16일에 경질 천공을 수행하였다. 초음파 유도 하 바늘 흡인을 사용하여, 마취된 도너의 동난포로부터 난포액을 채취하여 멸균 튜브에 넣었다.
난구 난모세포 복합체(Cumulus oocyte complex; COC)를 난포액으로부터 골라내어, 플러싱 배지(Flushing Medium; MediCult)에서 세척한 후, 유동 파라핀(MediCult) 중층이 있는 Universal IVF 배지(MediCult, 표 1 참조) 중에서 20% O2, 5% CO2, 37℃의 습윤 분위기하에 2 시간 항온처리하였다
IVF 배지
조성
염화칼슘
EDTA
글루코스
인간 혈청 알부민
황산마그네슘
페니실린 G
염화칼륨
인산 이수소 칼륨
중탄산나트륨
염화나트륨
젖산나트륨
피루브산나트륨
물
활성화하기 이전에, 난구-난모세포 복합체(COC)를 신비트로 하이아다제(SynVitro Hyadase; MediCult)로 처리하여, 난구 세포를 제거한 다음, 이를 30분 동안 파라핀 중층이 있는 Universal IVF 배지 중에서 항온처리하였다.
이 시점에서, 난모세포와 배아를, 37℃의 습윤 분위기 중에서 O2가 감소된 혼합 기체(90% N2 + 5% O2 + 5% CO2)를 사용하여 배양하였으며, 이때 이오노마이신은 처리하지 않았다. 난모세포를 5μM 이오노마이신 중에서 5분 동안 항온 처리하여(CO2 항온 처리기 내, 37℃, 기체 환경 = 20% O2 및 5% CO2) 활성화한 후, 1 mM 6-디메틸아미노퓨린(DMAP)과 함께 IVF 배지, 파라핀 중층 중에서 4시간 동안 배양하였다(기체 환경 = 90% N2, 5% O2 및 5% CO2, 37℃). 유동 파라핀 오일(MediCult, A/S, Denmark) 중층이 있는 500㎕의 배지 중 4-웰 평판(Nunclon, A/S, Denmark)에서 활성화 및 배양을 수행하였다.
활성화된 난모세포를 5% O2, 5% CO2 및 90% N2를 포함하는 기체 환경하에 IVF 배지 중에서 배양하고, 활성화된 난모세포로부터 생산된 배아를 동일한 혼합 기체 중에서 배양하였다.
활성화된 난모세포를, 상기 조건하의 IVF 배지 중에서, 내부 세포괴(ICM)를 함유한 완전히 증식된 배반포가 배반포 스코어링 변형 등급 1AA 또는 2AA에서 관찰될 때까지 항온 처리하였다(Blastocyst Scoring Modification; Shady Grove Fertility Center, Rockville, MD, 및 Georgia Reproductive Specialists, Atlanta, GA).
0.5% 프로나제(Sigma, St. Louis)로 처리하여 투명대를 제거하였다. 배반포로부터 유래하는 ICM을 면역 절제술에 의해 분리하였고, 이때, 상기 배반포를 인간의 비장 세포에 대한 말의 항혈청과 함께 항온 처리한 후, 기니아 피그 보체에 노출시켰다. 처리된 배반포를 가만히 피펫으로 옮겨 ICM으로부터 영양외배엽 세포를 분리하였다.
전체 배반포로부터 phESC를 유도하기 위하여, 배반포를 phESC의 배양용으로 설계된 배지(즉, 4ng/㎖ hrbFGF, 5ng/㎖ hrLIF 및 10% 인간 제대혈 혈청으로 보강된 VitroHES(Vitrolife)) 중 영양공급층에 넣었다. 배반포가 부착되고 영양질 세포가 퍼질 때, ICM을 눈으로 확인할 수 있었다. 3∼4일 동안 더 배양하고 나서, 가늘게 늘인 유리 피펫을 사용하여 영양외배엽 증식물로부터 ICM의 기계식 스플라이싱(slicing)을 통해 이 ICM을 분리하였다. 또한, 상기 IMC 세포를, 96-웰 평판 중 10% 인간 제대혈 혈청, 5 ng/㎖ 인간 재조합 LIF(Chemicon Int'l, Inc., Temecula, CA), 4 ng/㎖ 재조합 인간 FGF(Chemicon Int'l, Inc., Temecula, CA) 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/100㎍)으로 보강된 VirtroHES™ 배지(예를 들어, DMEM/고 글루코스 배지, VitroLife, Sweden)에서, 유사 분열이 정지된 출산 후 인간 진피 섬유아세포의 영양공급세포층 상에서 배양하였다(5% CO2 및 20% O2, 37℃). 이 혼합 기체는 줄기 세포를 배양하는데 사용되었다. 비-동물성 물질을 사용하여 인간 섬유아세포 배양액을 제조하였다. 10㎍/㎖ 미토마이신 C(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 3시간 동안 섬유아세포를 불활성화하였다.
별도의 방법에서, 배반포를 인간 비장 세포에 대한 말의 항혈청과 함께 항온처리한 후, 이를 토끼의 보체에 노출시킴으로써 면역 절제술을 수행하였다. 처리된 배반포를 가만히 피펫으로 옮겨 ICM으로부터 영양외배엽 세포를 분리하였다. 인간 제대혈 혈청을 함유하는 배지를 사용하여 유도된, 유전적으로 무관한 개체로부터 얻은 신생아의 피부 섬유아세포(HSF)의 영양공급층에서, 분리된 ICM을 추가로 배양하였다(부모 동의하에). 미토마이신 C를 사용하여 상기 HSF 영양공급층의 유사 분열을 정지시켰다.
HSF 배양용 배지는 90% DMEM(고 글루코스, L-글루타민(Invitrogen), 10% 인간 제대혈 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/100㎎)(Invitrogen) 포함)으로 구성되었다.
ICM 및 phESC를 배양하기 위하여, 4ng/㎖ hrbFGF, 5ng/㎖ hrLIF 및 10% 인간 제대혈 혈청이 보강된 VitroHES™(Vitrolife)를 사용하였다. ICM은 신선한 영양공급층 상에 기계적으로 도말하여, 3∼4일 동안 배양하였다. 제1 콜로니를 기계적으로 절단하여, 배양 후 5일 경과시에 다시 도말하였다. 배양 5∼6일 경과 시 모든 후속 계대배양을 실시하였다. 초기 계대배양에 있어서, 콜로니를 기계적으로 2개의 군집으로 나누어 다시 도말하였다. 여기에 콜라게나제 IV를 처리하고 기계적으로 분리하여 phESC를 추가로 계대배양하였다. phESC를 습윤 분위기 중에 5%의 CO2 및 37℃에서 증식시켰다.
난모세포 활성화
최초 4명의 도너로부터, 활성화된 난모세포를 5% O2, 5% CO2 및 90% N2를
포함하는 기체 환경하의 IVF 배지 중에서 배양한 다음, 5일 이상을 더 배양하였다. 표 2는 활성화된 난모세포의 성숙 과정을 나타낸 것이다. 각각의 난모세포를 4-웰 평판에 나누었다.
배양된 활성화 난모세포*
제1일 제2일 제3일 제4일
N1 1 전핵(pn),
1 극체(pb)		 2 할구(bl) 등할,
분열(fr) - 0%		 4 bl 등할,
fr-2%		 1 상실배,
fr-15%
N2 0 pn,
1 pb		 4 bl 부등할,
fr-4%		 5 bl 부등할,
fr-20%		 4 bl 부등할,
fr-40%
N3 1 pn,
1 pb		 2 bl 부등할,
fr-0%		 6 bl 등할,
fr-0%		 초기 배반포
N4 1 pn,
1 pb		 4 bl 등할,
fr-10%		 4 bl 등할,
fr-20%		 양호한 ICM 1AA인, 완전 증식 배반포
* 제1일에는 세포를 M1™ 배지(MediCult) 중에서 항온처리하였으며, 제2일∼제5일에는 M2™ 배지(MediCult) 중에서 항온처리하였다. 배지는 매일 바꾸어 주었다. M1™ 및 M2™는 인간 혈청 알부민, 글루코스 및 유도 대사 생성물, 생리 염, 필수 아미노산, 불필수 아미노산, 비타민, 뉴클레오티드, 중탄산나트륨, 스트렙토마이신(40㎎/ℓ)와 페니실린(40.000IU/ℓ), 그리고 페놀 레드를 함유한다.
N4로부터 내부 세포괴를 분리하여, 상기에 요약한 바와 같이, 인간 섬유아세포의 영양공급세포로 옮겼다. N1 및 N2는 제6일째 되는 날에 퇴화하였다. 또한, 제6일에, N3은 ICM 2AB인, 완전히 증식된 배반포를 생산하였다. 이후, 제6일에 N3을 인간 섬유아세포의 영양공급세포로 옮겼다. N4로부터 ICM은 바뀌지 않았다. N3을 줄기 세포를 분리하는데 사용하였다.
ICM 세포를, 5% CO2 및 95% N2를 포함하는 기체 환경 하의, VitroHES™ 배지 중에서 배양하고, 45일 이상 이어졌다. 표 2a는 N3 ICM 세포 배양의 진행 과정을 나타낸다.
N3-ICM 배양의 진행 과정*
제3일 신선한 영양공급세포 상에 ICM을 이식하였음.
제8일 세포 콜로니를 기계적으로 6개로 나눈 후, 이를 96-웰 평판 중 3개의 웰 내에서 배양하였음-1차 계대배양.
제14일 1차 계대배양 콜로니 중 5개의 콜로니로부터 세포를 기계적으로 나누고,
2차 계대배양 콜로니 중 20개의 콜로니를 24-웰 평판 중 3개의 웰 내에서 배양하였음.
제20일 세포를 35㎜의 접시에 도말하였음-3차 계대배양.
제24일 35㎜ 접시 5개에 세포를 접종하였음-4차 계대배양.
하나의 접시를 5% 프로나제(Sigma)를 사용하여 실온에서 화학적으로 나누었음.
제30일 35㎜ 접시 25개에 세포를 접종하였음-5차**계대배양.
제34일 6차** 세포 계대배양.
제35일 6차 계대배양으로부터 11개의 앰플을 동결하였음.
제37일 7차** 세포 계대배양.
제44일 7차 계대배양으로부터 12개의 앰플을 동결하였음.
제45일 8차 세포 계대배양.
*세포는 M2 배지(MediaCult) 중에서 생육하였음.
**이들 계대배양은 프로나제 분해에 의해 수행햐였음.
줄기 세포 분리
5명의 도너로부터 얻은 난모세포로부터, 메디컬트(MediCult) 배지를 사용한 후 감압 산소하에 배양하여, 제5일 또는 제6일 배양시 23개의 배반포를 생산할 수 있었다. 상기 배반포 중 11개는 눈으로 확인할 수 있는 ICM을 보유하였다(표 3).
반수성체 및 단위발생적 배아 줄기 세포주의 형성
도너
번호		 채집된
난모세포		 공여된
난모나포		 정상적 활성화된 난모세포 생성된
반수성체		 유도된 배반포
ICM과 함께 육안 관찰 ICM 없이
1 8 4 4 4 2 - phESC-1 면역 절제수술
2 15 8 8 8 3 3 phESC-3
phESC-4
phESC-5
모두 전체 배반포로부터 유래
3 27 14 121 112 3 2 전체 배반포로부터 유래한
phESC-6
4 22 11 103 10 2 3 전체 배반포로부터유래한
phESC-7
5 20 94 7 7 1 4 생성 세포주 없음
1-2개의 난모세포가 활성화되지 않았음; 2-활성화 이후 1개의 난모세포가 퇴화되었음.
3-1개의 난모세포가 활성화되지 않았음; 4-2개의 난모세포가 중기 I에서 폐기되었음.
이들 결과에서, 단위발생적으로 활성화된 난모세포로부터 배반포 형성이 약 57.5%의 성공률임을 나타낸다.
면역조직화학적 염색법
면역 염색을 위해, 영양공급층 상의 hES 세포 콜로니와 phESC 세포를 미세 커버 글라스 위에 놓고, 이를 PBS로 2회 세척한 다음, 100% 메탄올로 -20℃에서 5분 동안 고정시켰다. 세포를 PBS + 0.05% 트윈(Tween)-20으로 2회 세척하고, 다시 PBS + 0.1% 트리톤(Triton) X-100으로 실온에서 10분 동안 투과 처리하였다. 세포를 세척한 후, 차단 용액(PBS + 0.05% 트윈-20 + 4% 염소 혈청 및 3% 인간 제대혈 혈청)과 함께 실온(RT)에서 30분간 항온처리하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 모노클로날 항체는 차단 용액 중에서 희석하고 실온에서 1시간 동안 사용하였다: 케미콘(Chemicon)제, SSEA-1(MAB4301)(1:30), SSEA-3(MAB4303)(1:10), SSEA-4(MAB4304)(1:50), OCT-4 (MAB4305)(1:30), TRA-1-60(MAB4360)(1:50) 및 TRA-1-81(MAB4381)(1:50). 세포를 세척한 다음, 2차 항체인 알렉사 플루오 546(Alexa Fluor 546)(오렌지색 형광) 및 488(녹색 형광)(Molecular Probes, Invitrogen)을 PBS + 0.05% 트윈-20 중에 1:1000으로 희석시키고, 이를 실온에 1시간 동안 적용하였다. 세포를 세척하고, 핵을 PBS + 0.05% 트윈-20 중 DAPI(Sigma) 0.1㎍/㎖으로 실온에서 10분간 염색하였다. 세포를 세척하고, 이를 모위올(Mowiol; Calbiochem)과 함께 슬라이드 위에 놓았다. 형광 현미경을 사용하여 형광 이미지를 나타냈다.
3주령 배상체 또는 수축성 배상체의 중배엽 마커를 검출하기 위하여, 근육 특이 마커로서 모노클로날 마우스 항-데스미나 항체 항-인간 알파 액티닌 항체(Chemicon)와, 내피 마커로서 항-인간 CD31/PECAM-1 항체(R&D Systems), 항-인간 VE 카데린(DC144) 항체(R&D Systems)를 사용하였다.
배상체의 내배엽 마커를 검출하기 위하여, 모노클로날 마우스 항-인간 알파-페토프로테인 항체(R&D Systems)를 사용하였다.
알칼리성 포스파타제 및 텔로머라제 활성
알칼리성 포스파타제와 텔로머라제의 활성에 대해 제조자의 지침에 따라 AP 키트 및 TRAPEZE 키트(Chemicon)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 수행하였다.
핵형 분석(karyotyping)
핵형을 분석하기 위하여, hES 세포를 10㎍/㎖ 데메콜신(Demecolcine; Sigma)으로 2시간 동안 처리하고, 0.05% 트립신/EDTA(Invitrogen)를 사용하여 상기 세포를 수집한 다음, 이를 3분 동안 700×rpm에서 원심 분리하였다. 펠릿을 5㎖의 0.56% KCl에 재현탁하고, 이를 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 원심 분리를 반복하여 수행한 후, 상청액을 제거한 다음 세포를 재현탁하고, 이를 다시 5㎖의 얼음 냉각 메탄올/아세트산 혼합물(3:1)로 4℃에서 5분간 고정하였다. 세포 고정 과정을 2회 반복 수행한 후, 세포 현탁액을 현미경의 슬라이드 위에 놓고, 이 제제를 김사 개질 염색약(Giemsa Modified Stain; Sigma)으로 염색하였다. 이러한 방법으로 제조된 세포들로부터 중기체에 대해 표준적 G-밴딩 방법(G-banding method)으로 분석하였다. 수량 5/1000의 중기 확산체(spread)를 드러냈고 63개의 중기체를 분석하였다.
배상체 형성
hES 및 phESC 세포 콜로니를 기계적으로 여러 덩어리로 나누고, 이들을 85% 녹아웃 DMEM(Knockout DMEM), 15% 인간 제대혈 혈청, 1× MEM NEAA, 1mM 글루타맥스(Glutamax), 0.055 mM β-머캡토에탄올, 페니실린-스트렙토마이신(50U/50㎎), 4ng/㎖ hrbFGF(이들 모두는 인비트로겐(Invitrogen)사제. 다만, 혈청은 제외)를 함유하는 배지 중, 1.5% 아가로스(Sigma)로 미리 코팅한 24 웰 평판의 각 웰에 넣었다. 인간 EB를 14일 동안 현탁 배양액 중에서 배양하고, 이를 배양 접시 위에 놓아 증식물을 얻어내거나, 또는 현탁액 중에서 1주 더 배양하였다.
배양 접시의 표면에 부착된 2주령 배상체를, 분화 배지[DMEM/F12, B27, 2 mM 글루타맥스, 페니실린-스트렙토마이신(lOOU/lOO㎍) 및 20ng/㎖ hrbFGF(모두 "인비트로겐"사제)] 중에서 1주일 동안 배양하여, 신경의 분화를 유도하였다. 일부 배상체에서는 신경의 형태를 띠는 분화 세포가 생산되었으며, 다른 배상체를 절개하여 이를 더 배양한 결과 신경 세포구가 생산되었다.
배상체 생산에서 사용하였던 배지와 동일한 배지 중에 있는 부착성 표면에 도말한 후, 5일 동안 배양시켰더니, 주기적으로 박동하는 배상체가 자생적으로 나타났다.
각막 형성
hES를 미토겐, LIF 및 bFGF와 함께 증식 배지 중에서 증식하였다(>40% 포화상태(confluent) 미토마이신 C 처리 인간 섬유아세포 영양공급 층상에서). 거의 포화상태(즉, ES가 선명한 콜로니 경계를 상실한 경우)의 배양 배지를 미토겐 추가 없이 증식 배지로 교체한다. 그 후, 상기 배지 중 50%를 2-3일마다 최소 3주간 EB 배지로 교체한다. 이때, 색소침착된 세포는 배양액 중에서 소형 볼 또는 대형 돔과 컬럼으로 발현한다.
그 후 상기 배지를 배양액으로부터 제거한 후 세포를 EB 배지로 격렬하게 세척하여 원하는 세포를 회수한다. 그 후 EB 배지 세척액과 수확된 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 별도 배양 용기로 이동시켰다. 2일 후, 옮겨진 배양액 중 배지의 50%를 EB 배지로 교체하였다. 이어서, 유적과 비슷한 소형의 부유 세포괴가 눈으로 확인될 때까지, 옮겨진 배양액 중 배지의 50%를 3-4일마다 최소 3주간 EB 배지로 교체하였다. 이 시점에서, 배지를 교체할 때 부유 세포괴 또는 렌즈를 휘저어 놓지 않도록 주의가 필요하였다. 상기 배지의 50%를 제거하고 증식 각막이 배지 중에 완전히 가라앉도록 보장된 충분한 용량의 EB 배지로 3-4일마다 교체한다.
증식 배지:
KO Hi 글루코스 DMEM
500 U/㎖ 스트렙토마이신
1% 비필수 아미노산
2 mM 글루타맥스-I
0.1 mM β-머캅토에탄올
8% 혈청 대체물
8% 플라즈마네이트(Plasmanate; Beyer, Res Triangle Park)
미토젠:
10ng/㎖ LIF
5ng/㎖ bFGF
EB 배지 :
KO Hi 글루코스 DMEM
500 U/㎖ 스트렙토마이신
1% 비필수 아미노산
2 mM 글루타맥스-I
0.1 mM β-머캅토에탄올
13% 혈청 대체물
조직학적 검사
시편(10mm 맑은/백색 반투명 조직구)을 중성 완충 포르말린(NBF) 중에 고정시킨 후 70% 에탄올에 넣었다. 구를 2분할하고, 한 부분은 육안 소견을 위해 검사하였고 한 부분은 현미경으로 검사하였다.
상기 시편을 뮤신 염색(예, 과요오드산 쉬프 염색[PAS]), 생체 아민 염색, 멜라닌 염색, 리포크롬 색소 염색, 철과 칼슘용 염색, 요산염 염색, 지방 염색, 연결 조직 염색, 김자 염색, 미생물 염색(예, 항산균(acid fast bacilli) 염색, 고모리 메텐아민 은 염색, 등)을 비롯한, 일련의 조직 염료에 의해 염색하였다.
HLA 타입핑
다이날(Dynal)의 다이나비드 DNA 다이렉트 블러드(Dynabeads DNA Direct Blood(Invitrogen))를 사용하여, 도너의 혈액, hES, phESC 세포, 그리고 인간 신생 피부 섬유아세포(NSF)로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 제조자의 지침에 따라서, 대립유전자 특이적 서열 결정용 프라이머(PCR-SSP, Protrans)를 사용하는 PCR에 의해, HLA 타입핑을 수행하였다. HLA 클래스 I 유전자(HLA A*, B*, Cw*)는 A*01-A*80, B*07-B*83, Cw*01-Cw*18 부위를 한정하는 PROTRANS HLA A*B*Cw*를 사용하여 형별 검사하였다. HLA 클래스 II 유전자(HLA DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5*, DQA1*, DQB1*)는 DRB1*O1-DRB1*16(DR1-DR18), DRB3*, DRB4*, DRB5* 부위를 한정하는 PROTRANS HLA DRB1*과, DQB1*02-DQB1*06(DQ2-DQ9), DQA1*0101-DQA1*0601 부위를 한정하는 PROTRANS HLA DQB1*DQA1*을 사용하여 분석하였다. PCR 증폭을 수행하였다: 94℃에서 2분간; 94℃에서 10초간, 65℃에서 1분간(10회); 94℃에서 10초간, 61℃에서 50초간, 72℃에서 30초간(20회). 증폭된 생산물을 2% 아가로스 겔 상에서 확인하였다.
아피메트릭스 SNP 마이크로어레이(Affimetrix SNP microarray) 분석
페놀/클로로포름 추출법에 의하여, 혈액, 난구 세포, phESC 및 NSF로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 4명의 백인 피험자로부터 얻은 이들 DNA 시료를 아피메트릭스 맵핑 50K 하인드 240 어레이(Affimetrix Mapping 5OK Hind 240 Array)[아피메트릭스 진 칩 맵핑 100 K 키트(Affimetrix GeneChip Mapping 1OOK kit)의 일부]를 사용하여 유전자형분석을 실시하였다. 처음에, 데이터 세트는 57,244개의 2진 SNP 마커를 포함하였다. 마커 수는 게놈 시료의 등가성을 확인하고 이형성을 연구하는데 필요한 수를 초과하므로, 22개의 상 염색체 중 15개(1∼15번 염색체)를 선택하였다. 길이가 더 짧은 7개의 염색체를 제거하여, 마커가 나오지 않을 가능성을 줄이거나, 또는 무작위 시료 채취 중 소정의 염색체에 대한 하나의 마커만을 선별하였다. 렐첵(Relcheck; 0.67 버젼, Copyright ⓒ 2000 Karl W. Broman, Johns Hopkins University, Licensed under GNU General Public License version 2(June 1991))을 이용하여, 1,459개의 마커를 분석하였다.
게놈 임프린팅 분석
문헌[Li외 다수, J Biol Chem (2002) 277(16):13518-13527]에 개시된 바와 같이 총 핵산을 제조하였다. 트리-시약(Tri-reagent; Sigma)을 사용하거나, 또는 RNA 제조 키트(Qiagen; Valencia, CA)를 사용하여 세포로부터 RNA 및 DNA를 추출하였다.
다양한 시료로부터 얻은 RNA를 함유한 노던 블롯에 대해, 표준적 방법(참조예, Sambrook외 다수, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, 2nd ed, Cold Spring Harbor Press)에 의하여 필터 상에 블럿팅하였다(도 3 참조). mRNA에 특이적으로 혼성화하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 상기 노던 필터에 혼성화하였다. [γ32P]ATP(Amersham Biosciences)를 사용하여, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 말단을 표지화하였다. 이후, 매회 0.1% SDS를 함유하는 0.2×SSC(1×SSC = 0.15M NaCl 및 0.015 M 시트르산나트륨)로서 상기 필터를 60℃에서 10분 동안 3회 세척하고, 포스포이미저(PhosphorImager; Molecular Dynamics)로 분석하였다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 서열은 다음과 같은 등록 번호를 가지는 서열로부터 얻었다: NP002393(Peg1_2 및 Peg1_A; 이 유전자에 있어서, 인간 PEG1은 2개의 다른 프로모터로부터 전사되어, 2개의 아형 전사체를 생성하였으며, 이들 전사체중, 오로지 하나만이(아형 1_2) 임프린트되었음). 부계 발현 아형 1은 부계 대립유전자의 엑손 1 내 메틸화되지 않은 CpG 섬(island)과 함께 생성되었고, 반면에, 모계 유전자(아형 1_A) 내 상응하는 CpG 섬은 완전히 메틸화되었다[참조예, Li 외 다수 (2002), 상동]; CAG29346(SNRPN); AF087017(H19); NR_001564(비활성 X 특이적 전사체-XIST); 및 P04406(GAPDH).
DNA 핑거프린팅 분석
페놀/클로로포름 추출법에 의하여, 게놈 DNA를 혈액, hES 세포 및 NSF로부터 분리하고, 이를 HinfI 제한 효소(Fermentas)로 분해하여, 0.8% 아가로스 겔에 로딩하였다. 전기 영동 후, 서던 블럿을 수행함으로써, 변성된 DNA를 나일론 막(Hybond N, Amersham)으로 옮기고, P-표지화된(CAC) 5개의 올리고뉴클레오티드 프로브로 혼성화하였다. 상기 막을 크로넥스 강화 스크린(Cronex intensifying screen)을 사용하는 X-선 필름(Kodak XAR) 상에 노출시켜 엠데이터(mData)를 분석하였다.
1위치 PCR 유전자형분석(Monolocus PCR genotyping)
3' 아포 지방 단백질 B 과변이 소위성 위치(3 'ApoB VNTR)
염색체 위치: 2p23-p23
GenBank 위치 및 위치의 한정: APOB, 아포 지방 단백질 B(Ag(x) 항원 포함) 비번역 부위
반복 서열 5'-3': (TATAATTAAATATT TTATAATTAAAATATT)n (서열 번호 1)
대립유전자 래더(ladder) 크기 범위(염기): 450 + 10 + 2 프라이머 + 링크
VNTR 래더 크기 범위(반복부의 수, 문헌(Ludwig외 다수, 1989)에 의함: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52
기타 공지의 대립유전자(반복부의 수): 25, 27, 28, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 54, 55
프로메가 K562 DNA® 대립유전자 크기(반복부의 수): 36/36
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지(DNA Technology Ltd., Russia)
초기 항온처리: 95℃, 2'
30회 순환:
변성 94℃, 1'
연장 및 프라이머 결합 60℃, 2'
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무제한 시간
본 분석은 문헌[Verbenko외 다수; Apolipoprotein B 3'-VNTR polymorphism in Eastern European populations.Eur J Hum Gen (2003) 11(1):444-451]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다(표 4 참조).
러시아인 개체군에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 대립유전자 빈도 관찰된 대립유전자 수
25 0.001 1
30 0.079 75
32 0.071 68
33 0.001 1
34 0.238 227
35 0.004 4
36 0.393 375
37 0.001 1
38 0.036 36
39 0.001 1
40 0.014 13
42 0.001 1
44 0.042 41
45 0.006 6
46 0.033 31
48 0.067 64
50 0.011 10
52 0.001 1
동형접합체 94
이형접합체 333
총 시료 427
D1S80(pMCT118) 과변이 소위성 위치(D1S80 VNTR)
염색체 위치: 1p35-36
GenBank 위치 및 위치 한정: 인간 D1S80 및 MCT118 유전자
반복 서열 5'-3': (GAAGACAGACCACAG)n (서열 번호 2)
대립유전자 래더 크기 범위(염기): 387∼762
VNTR 래더 크기 범위(반복부의 수): 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 40, 41
기타 공지의 대립유전자(반복부의 수): 13, 14, 15, 38, 39, >41
프로메가 K562 DNA® 대립유전자의 크기(반복부의 수): 18/29
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지(Russia)
초기 항온처리: 95℃, 2'
30회 순환:
변성 94℃, 45"
프라이머 결합 60℃, 30"
연장 72℃, 45"
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무제한 시간
본 분석은 문헌[Verbenko외 다수; Allele frequencies for D1S80 (pMCT118) locus in some Eastern European populations. J Forensic Sci (2003) 48(l):207-208]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다(표 4 참조).
러시아인 개체군에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 대립유전자 빈도 관찰된 대립유전자 수
18 0.280 33
20 0.017 2
21 0.009 1
22 0.042 5
23 0.017 2
24 0.390 46
25 0.017 2
26 0.025 3
28 0.068 8
29 0.009 1
30 0.034 4
31 0.059 7
33 0.017 2
34 0.008 1
36 0.008 1
동형접합체 15
이형접합체 44
총 시료 59
D6S366
염색체 위치: 6q21-qter
GenBank 위치 및 위치 한정: NA
대립유전자 래더 크기 범위(염기): 150∼162
STR 래더 크기 범위(반복부의 수): 12, 13, 15
기타 공지의 대립유전자(반복부의 수): 10, 11, 14, 16, 17
프로메가 K562 DNA? 대립유전자의 크기(반복부의 수): 13/14
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지(Russia)
초기 항온처리: 95℃, 2'
30회 순환:
변성 94℃, 1'
연장 및 프라이머 결합 60℃, 2'
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무제한 시간
본 분석은 문헌[Efremov외 다수; An expert evaluation of molecular genetic individualizing systems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandem repeats. Sud Med Ekspert (1998) 41(2):33-36]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다(표 6 참조).
러시아인 개체군에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 대립유전자 빈도 관찰된 대립유전자 수
10 0.008 3
11 0.059 21
12 0.316 112
13 0.251 89
14 0.085 30
15 0.175 62
16 0.015 7
17 0.011 4
총 시료 177
D16S539
염색체 위치: 16q24-qter
GenBank 위치 및 위치 한정: NA
반복 서열 5'-3': (AGAT)n
대립유전자 래더 크기 범위(염기): 264∼304
STR 래더 크기 범위(반복부의 수): 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
프로메가 K562 DNA? 대립유전자의 크기(반복부의 수): 11/12
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지(Russia)
초기 항온처리: 95℃, 2'
30회 순환:
변성 94℃, 45"
프라이머 결합 64℃, 30"
연장 72℃, 30"
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무제한 시간
본 분석은 문헌[GenePrint® STR Systems(Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행하였다(표 7 참조).
백인종 미국인에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 대립유전자 빈도 관찰된 대립유전자 수
6 0.000 0
7 0.000 0
8 0.026 11
9 0.107 45
10 0.079 33
11 0.319 134
12 0.269 113
13 0.167 70
14 0.031 13
15 0.002 1
동형접합체 57
이형접합체 153
총 시료 210
D7S820
염색체 위치: 7q11.21-22
GenBank 위치 및 위치 한정: NA
반복 서열 5'-3': (AGAT)n
대립유전자 래더 크기 범위(염기): 215∼247
VNTR 래더 크기 범위(반복부의 수): 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14
프로메가 K562 DNA? 대립유전자의 크기(반복부의 수): 9/11
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지(Russia)
초기 항온처리: 95℃, 2'
30회 순환:
변성 94℃, 45"
프라이머 결합 64℃, 30"
연장 72℃, 30"
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무제한 시간
본 분석은 문헌[GenePrint? STR Systems(Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행하였다(표 8 참조).
다른 개체군에서 D7S820에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 백인종 미국인에 대한 대립유전자 빈도 관찰된 대립유전자 수 러시아인에 대한 대립유전자 빈도 관찰된 대립유전자 수
6 0.002 1 0.0012 1
7 0.010 4 0.0087 7
8 0.155 65 0.1928 155
9 0.152 64 0.1480 119
10 0.295 124 0.2524 203
11 0.195 82 0.2040 164
12 0.121 51 0.1580 127
13 0.057 24 0.0299 24
14 0.012 5 0.0050 4
동형접합체 43 92
이형접합체 167 310
총 시료 210 402
인간 폰 빌레브란트 인자 유전자 과변이 소위성 위치 II(vWFII)
염색체 위치: 12p13.3-12p13.2
GenBank 위치 및 위치 한정: HUMvWFII, 인간 폰 빌레브란트 인자 유전자
반복 서열 5'-3': (ATCT)n/(AGAT)n
대립유전자 래더 크기 범위(염기): 154∼178
STR 래더 크기 범위(반복부의 수): 9, 11, 12, 13
기타 공지의 대립유전자(반복부의 수): 8, 10, 14, 15
프로메가 K562 DNA? 대립유전자의 크기(반복부의 수): 13/13
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지(Russia)
초기 항온처리: 95℃, 2'
30회 순환:
변성 94℃, 1'
연장 및 프라이머 결합 60℃, 2'
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무제한 시간
본 분석은 문헌[Efremov외 다수; An expert evaluation of molecular genetic individualizing systems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandem repeats. Sud Med Ekspert (1998) 41(2):33-36]에 개시된 바와 같이 실행하였다(표 9 참조).
러시아인 개체군에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 대립유전자 빈도 관찰된 대립유전자 수
9 0.082 37
10 0.088 40
11 0.392 177
12 0.296 134
13 0.069 31
14 0.058 26
15 0.015 7
총 시료 226
D13S317
염색체 위치: 13q22-q31
GenBank 위치 및 위치 한정: NA
반복 서열 5'-3': (AGAT)n
대립유전자 래더 크기 범위(염기): 165∼197
STR 래더 크기 범위(반복부의 수): 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
기타 공지의 대립유전자(반복부의 수): 7
프로메가 K562 DNA? 대립유전자의 크기(반복부의 수): 8/8
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지(Russia)
초기 항온처리: 95℃, 2'
30회 순환:
변성 94℃, 45"
프라이머 결합 64℃, 30"
연장 72℃, 30"
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무제한 시간
본 분석은 문헌[GenePrint? STR Systems (Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행하였다(표 10 참조).
다른 개체군에서 D13S317에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 백인종 미국인에 대한 대립유전자 빈도 관찰된 대립형질 수 러시아인에 대한 대립유전자 빈도 관찰된 대립유전자 수
7 0.000 0 0 0
8 0.143 60 0.1393 112
9 0.052 22 0.0883 71
10 0.052 22 0.0684 55
11 0.305 128 0.3706 298
12 0.307 129 0.2040 164
13 0.083 35 0.0871 70
14 0.057 24 0.0423 34
15 0.000 0 0 0
동형접합체 61 90
이형접합체 149 312
총 시료 210 402
인간 폰 빌레브란트 인자 유전자 과변이 소위성 위치(vWA)
염색체 위치: 12p12pter
GenBank 위치 및 위치 한정: HUMVWF A31, 인간 폰 빌레브란트 인자 유전자
반복 서열 5'-3': (AGAT)n
대립형질 래더 크기 범위(염기): 139-167
STR 래더 크기 범위(반복 번호): 14, 16, 17, 18
다른 공지된 대립유전자(반복 번호): 11, 12, 13, 15, 19, 20, 21
프로메가 K562 DNA® 대립유전자 크기(반복 번호): 16/16
PCR 프로토콜:
서멀 사이클러(thermal cycler): DNA 테크놀로지 리미티드, 러시아
초기 배양: 95℃, 2'
30회 주기를 위한 순환:
변성 94℃, 1'
신장 및 프라이머 연결 60℃, 2'
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무한 시간
분석은 진프린트(GenePrint)® STR 시스템(은 염색 검출) 기술 매뉴얼 D004호에 기재된 바대로 수행한다. 프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 메디슨 소재: 1993-2001. 표 11 참조.
상이한 개체군에서 HUMVWFA31에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 코카서스인-아메리칸인에 대한 대립유전자 빈도 관찰된 대립
유전자의 수		 러시아인에 대한
대립유전자 빈도		 관찰된 대립
유전자의 수
13 0.000 0 0.0025 2
14 0.131 56 0.0796 64
15 0.082 35 0.0920 74
16 0.211 90 0.2127 171
17 0.265 113 0.2836 228
18 0.202 86 0.2251 181
19 0.087 37 0.0833 67
20 0.021 9 0.0199 16
21 0.000 0 0.0012 1
동형접합체 38 70
이형접합체 175 332
총 샘플 213 402
CSF-1 수용체 유전자 현미부수체 좌위에 대한 인간 c-fms 원형종양 유전자(CSF1PO)
염색체 위치: 5q33.3-34
유전자은행(GenBank) 좌위 및 좌위 정의: HUMCSF1PO, 인간 c-fms 원형종양 유전자
반복 서열 5'-3';(AGAT)n
대립형질 래더 크기 범위(염기): 295-327
STR 래더 크기 범위(반복 번호): 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
다른 공지된 대립유전자(반복 번호): 6
프로메가 K562 DNA? 대립유전자 크기(반복 번호): 9/10
PCR 프로토콜:
서멀 사이클러: DNA 테크놀로지 리미티드, 러시아
초기 배양: 95℃, 2'
30회 주기를 위한 순환:
변성 94℃, 45"
프라이머 연결 64℃, 30"
신장 72℃, 30"
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무한 시간
분석은 진프린트® STR 시스템(은 염색 검출) 기술 매뉴얼 D004호에 기재된 바대로 수행한다. 프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 메디슨 소재: 1993-2001. 표 12 참조.
코카서스인-아메리칸인에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 대립유전자 빈도 관찰된 대립
유전자의 수
6 0.000 0
7 0.000 0
8 0.002 1
9 0.033 14
10 0.251 108
11 0.309 133
12 0.330 142
13 0.060 26
14 0.014 6
15 0.000 0
동형접합체 47
이형접합체 168
총 샘플 215
인간 갑상선 퍼옥시다제 유전자 현미부수체 좌위(TPOX)
염색체 위치: 2p25.1-pter
유전자은행 좌위 및 좌위 정의: HUMTPOX, 인간 갑상선 퍼옥시다제 유전자
반복 서열 5'-3':(AATG)n
대립형질 래더 크기 범위(염기): 224-252
STR 래더 크기 범위(반복 번호): 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13
다른 공지된 대립유전자(반복 번호): 없음
프로메가 K562 DNA? 대립유전자 크기(반복 번호): 8/9
PCR 프로토콜:
서멀 사이클러: DNA 테크놀로지 리미티드, 러시아
초기 배양: 95℃, 2'
30회 주기를 위한 순환:
변성 94℃, 45"
프라이머 연결 64℃, 30"
신장 72℃, 30"
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무한 시간
분석은 진프린트? STR 시스템(은 염색 검출) 기술 매뉴얼 D004호에 기재된 바대로 수행한다. 프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 메디슨 소재: 1993-2001. 표 13 참조.
코카서스인-아메리칸인에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 대립유전자 빈도 관찰된 대립
유전자의 수
6 0.002 1
7 0.000 0
8 0.528 227
9 0.093 40
10 0.056 24
11 0.284 122
12 0.037 16
13 0.000 0
동형접합체 76
이형접합체 139
총 샘플 215
인간 티로신 하이드록실라제 유전자 현미부수체 좌위(TH01)
염색체 위치: 5q33.3-34
유전자은행 좌위 및 좌위 정의: HUMTHO1, 인간 티로신 하이드록실라제 유전자
반복 서열 5'-3':(AATG)n
대립형질 래더 크기 범위(염기): 179-203
STR 래더 크기 범위(반복 번호): 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11
다른 공지된 대립유전자(반복 번호): 9.3
프로메가 K562 DNA? 대립유전자 크기(반복 번호): 9.3/9.3
PCR 프로토콜:
서멀 사이클러: DNA 테크놀로지 리미티드, 러시아
초기 배양: 95℃, 2'
30회 주기를 위한 순환:
변성 94℃, 45"
프라이머 연결 64℃, 30"
신장 72℃, 30"
연장 단계: 72℃, 5'
중지 단계: 4℃, 무한 시간
분석은 진프린트? STR 시스템(은 염색 검출) 기술 매뉴얼 D004호에 기재된 바대로 수행한다. 프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 메디슨 소재: 1993-2001. 표 14 참조.
코카서스인-아메리칸인에 대한 대립유전자 빈도
대립유전자 대립유전자 빈도 관찰된 대립
유전자의 수
5 0.007 3
6 0.237 101
7 0.148 63
8 0.117 50
9 0.155 66
9.3 0.331 141
10 0.005 2
11 0.000 0
동형접합체 50
이형접합체 163
총 샘플 213
결과
이러한 방법으로부터의 hES 세포는 배아 줄기 세포에 통상적인 많은 특징: 세포질 지질체, 작은 세포질/핵 비율 및 명확히 식별가능한 핵인을 나타낸다. hES 세포 콜로니는 체외 수정 후에 유도된 인간 배아 줄기 세포에 대해 이전에 보고된 것과 유사한 형태학을 나타낸다. 세포는 면역반응성에서 알칼리 포스파타제(도 1A), 8량체 결합 전사 인자 4 mRNA(Oct-4)(도 1B), 단계 특이적 배아 항원 1(SSEA-1)(도 1C), 단계 특이적 배아 항원 3(SSEA-3)(도 1D), 단계 특이적 배아 항원 4(SSEA-4)(도 1E), 종양 거절 항원 1-60(TRA-1-60)(도 1F), 종양 거절 항원 1-81(TRA-1-81)(도 1G)에 대해 양성이고, 단계 특이적 배아 항원 1(SSEA-1)(도 1C)(마우스 배아 줄기 세포에 대해 양성이지만, 인간에 대해 양성이 아님)에 대해 음성이다. 텔로머라제 활성은 종종 복제 불멸과 연관되고 줄기 세포를 비롯한 생식 세포, 암 세포, 및 다양한 줄기 세포에서 통상적으로 발현되지만, 대부분의 체세포 형태에서는 결여되어 있다. 체외 증식에서 3 개월 후에 이러한 방법에 의해 제조된 세포는 이의 미분화된 형태학을 유지하고 높은 수준의 텔로머라제 활성(도 2A)을 나타낸다. 세포의 다능성은 배상체 형성(도 2B, 2C)에 의해 체외에서 조사하고, G-밴디드(banded) 핵형분석은 세포가 일반 인간 46XX 핵형(도 2D)을 갖는다는 것을 보여준다.
DNA 핑거프린팅 분석은 32P 표지된 (CAC)s 올리고뉴클레오타이드 탐침(도 2E)에 의한 써던 블롯팅(Southern blotting) 및 이종교배, 및 상이한 좌위를 갖는 1좌위 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 난모세포 도너의 혈액에서, ES 세포에서, 그리고 HNSF 영양공급세포에서 수행한다.
1좌위 PCR의 경우에, 유전자형분석은 혈액 (도너) DNA와 OL1 DNA 사이의 모든 좌위(그러나 하나의 좌위의 경우, D7S820)에 대해 동일한 대립유전자를 나타낸다. 표 15 참조.
1좌위 PCR 유전자형분석
NN 좌위 정의 염색체 위치 hES NSF 혈액
1. 3'ApoB 2p24-p23 36/48 36/36 36/48
2. D1S80 1p35-36 18/24 22/31 18/24
3. D6S366 6q21-qter 13/15 17/17 13/15
4. D16S359 16q24-qter 8/13 12/13 8/13
5. D7S820 7q11.21-22 11/11 9/10 10/11
6. vWFII 12p13.3-12p13.2 11/13 9/11 11/13
7. D13S317 13q22-q31 9/12 11/12 9/12
8. vWA 12p12pter 14/18 17/18 14/18
9. CSF1PO 5q33.3-34 12/12 12/13 12/12
10. TPOX 2p25.1-pter 8/11 8/11 8/11
11. TH01 5q33.3-34 6/6 6/9,3 6/6
모든 이형접합 도너 좌위(그러나 하나의 좌위의 경우, D7S820)의 이형접합성(heterozygosity, heterozygosis)은 hES 좌위에서 변하지 않는다. hES DNA에서 D7S820 좌위의 동형접합성(homozygosity, homozygosis)은 DNA 복제 및 DNA 회복 동안 결실 가닥 염기쌍형성오류(slipped-strand mispairing)로 인한 돌연변이(현미부수체 반복에서 하나의 AGAT 단량체의 삽입)의 결과이다.
이러한 결과는 (도너 DNA 및 hES DNA에 대해 실질적으로 동일한 지문 패턴이 발견될 때) 다좌위 DNA 핑거프린팅에 의해 수득된 것에 일치한다.
도 2E는 hES 세포의 이형접합성 및 난모세포 도너의 혈액에 의한 이의 동정을 증명하고, hES 세포와 영양공급세포 사이의 상사성은 없다. hES 세포주의 DNA 프로파일은 MHC I형 및 II형 내의 다형성 유전자를 사용하여 PCR계 단일형 분석에 의해 확인한다. 난모세포 도너 혈액 세포로부터의, hES 세포로부터의, 그리고 영양 HNSF로부터의 총 게놈 DNA는 유전자형분석하고 비교한다. 데이터는 hES 세포 및 도너 혈액으로부터의 세포는 서로 구별 불가능하다는 것을 증명하고 따라서 자가(autologous)로 간주되어야 하며, 둘 다 영양공급세포의 DNA와 구별된다(표 16).
HLA 타이핑
MHC I MHC II
HLA-A HLA-B HLA-C DRB1 DQB1 DQA1
pHES-1 A*01
A*02		 B*15(63)
B*35		 Cw*04
Cw*0708		 DRB1*12
DRB1*13		 DQB1*06
DQB1*03		 DQA1*01
DQA1*0505
도너 A*01
A*02		 B*15(63)
B*35		 Cw*04
Cw*0708		 DRB1*12
DRB1*13		 DQB1*06
DQB1*03		 DQA1*01
DQA1*0505
HNSF A*25
A*32		 B*15(62)
B*18		 Cw*12
Cw*12		 DRB1*04
DRB1*15		 DQB1*06
DQB1*03		 DQA1*01
DQA1*03
DNA 핑거프린팅 및 HLA 타이핑 분석은 hES 세포가 이형접합이고 전체 도너 유전 물질을 함유한다는 것을 확인시켜 준다. 이러한 결과는 단위생식 원숭이 줄기 세포주로부터의 데이터와 일치하고(Vrana et al., Proc Natl Acad Sci USA (2003) 100 (Suppl 1):11911-11916), 도너 유전 물질 중 반을 함유하는 단위생식 마우스 줄기 세포주로부터의 데이터와 일치하지 않는다(Lin et al., Stem Cells (2003) 21:153-161).
phESC 세포주는 치밀하게 채워진 세포를 갖는 콜로니, 주요 핵인 및 핵에 대한 세포질의 작은 비를 형성하면서 hES 세포에서 예상되는 형태학을 나타낸다(도 4). 이러한 세포는 전통적인 hES 마커 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 OCT-4를 발현하고, 미분화된 마우스 배아 줄기 세포에 대해 양성 마커인 SSEA-1을 발현하지 않는다(도 4). 모든 세포주로부터 유래한 세포는 높은 수준의 알칼리 포스파타제 및 텔로머라제 활성을 나타낸다(도 5 및 도 6). G-밴디드 핵형분석은 phESC 세포주가 phESC-7 세포주를 제외하고 일반 인간 46,XX 핵형을 갖는다는 것을 보여준다(도 7). phESC-7 세포주로부터의 대략 91%의 세포는 47,XXX 핵형을 갖고 9%의 세포는 48,XXX,+6 핵형을 갖는다. 상이한 정도의 X 염색체 이형(heteromorphism)은 세포주; phESC-1 및 phESC-6 세포주에 대해 대략 12%; phESC-5 세포주에 대해 42%; 그리고 세포주 phESC7, phESC-3, 및 phESC-4 각각에 대해 70, 80, 및 86%로 관찰된다(도 7).
비교용 DNA 프로파일링은 phESC 세포주, 도너 체세포 및 영양공급세포 모두에서 수행한다. 이러한 연구는 염색체 변화를 연구하고 도너의 체세포에 대한 phESC의 유전적 상사성을 확인하기 위해 아피메트릭스(Affimetrix) SNP 마이크로어레이(Mapping 50K Hind 240 Arrays)를 사용한다. phESC 세포주와 이의 연관된 도너 체세포 사이의 모든 쌍을 이룬 유전자형은 "완전 형제(full sibling)"로서 동정되고 쌍의 모든 다른 조합은 "비연관된 것"으로서 동정된다. 내부 제어는 "일란성 쌍생아"로서 동일 phESC 세포주로부터 유도된 스플릿 배양액 사이에 쌍을 이룬 유전자형 관계를 동정한다(표 17, 데이터베이스 S1).
[표 17]
데이터베이스 S1.
Figure 112009011525658-pct00001
DNA 샘플은 다음과 같이 숫자를 매겼다: 1-인간 신생아 피부 섬유아세포; 2-phESC-7 세포주 도너; 3-phESC-7 세포주; 4-phESC-1 세포주; 5-phESC-1 세포주; 6-phESC-3 세포주; 7-phESC-4 세포주; 8-phESC-5 세포주; 9-phESC-6 세포주; 10-phESC-6 세포주 도너; 11-phESC-3 내지 phESC-5 세포주 도너; 및 12-phESC-1 세포주 도너.
결과는 오직 한쌍(샘플 4-5)이 일란성(MZ) 쌍생아로서 동정된다는 것을 보여준다. 10개의 다른 쌍(샘플 2-3, 4-12,5-12, 6-7, 6-11, 7-8, 7-11, 8-11, 9-10)은 완전 형제로서 동정되고, 쌍의 모든 다른 조합은 "비연관된 것"으로서 동정된다. 아웃풋에서의 IBS 컬럼은 쌍이 둘 다 타이핑되고 상태에 의해 동일한 0개, 1개, 또는 2개의 대립유전자를 공유하는 마커의 수를 나타낸다(유전자형분석 오차를 갖지 않는 이상적 조건하에 MZ 쌍생아의 경우, 모든 마커는 IBS=2하에 위치해야 한다). 아웃풋은 P(관찰된 마커|소정 관계식)를 직접적으로 나타내지 않지만, 이는 상사성의 측정치로서 LOD 소스 - log10{P(관찰된 마커|추정 관계식/P(관찰된 마커|최대 가능성이 수득되고 따라서 불러오기가 이루어진 관계식)}을 나타낸다. LOD 소스가 더 적을수록 2개의 샘플들 사이의 추정 관계식이 덜하다.
1,459 SNP 마커의 비교 분석은 phESC 이형접합성을 나타내고, 연관된 도너 체세포 유전자형과 비교하여 phESC 세포 유전자형에서 변화가 발생한다는 것을 보여준다. 이전에 이형접합이었던 체세포 게놈의 일부 부분은 연관된 phESC 세포주 게놈에서 동형접합이 된다. 이러한 동형접합에 대한 이형접합 패턴은 11-15%의 phESC-1, PhESC-3, phESC-4, phESC-5 및 phESC-6 세포주에서 발생하고, phESC7 세포주에 대해 19%이다(데이터베이스 S2). 또한, 유전적 차이가 동일한 난모세포 도너로부터 유도된 phESC 세포주와 phESC-5 세포주 사이에 관찰된다(표 18, 데이터베이스 S2).
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그 결과는 유도된 phESC 주의 이형접합성을 보여주고, 관련된 도너 유전자형과 비교하여 유전자형의 변화를 나타낸다. 도너 게놈의 이형접합 단편의 부분은 phESC에서 동형접합이 된다. 염색체 - 염색체 번호; RS ID - dbSNP 데이터베이스에서 RS 번호; 염기쌍 - Affimetrix GeneChip에 의해 기록된 바와 같은 염기쌍 거리; 코카서스인 중의 Freq A - 코카서스인 개체군 중의 A 대립유전자의 빈도.
종래의 연구에서, 마우스 난모세포의 단위발생적 활성화는 결과로 동형접합 배아 줄기 세포주를 형성하게 되었다(Lin et al., Stem Cells (2003) 21: 152). 인간 난모세포에서, 난모세포 단위발생적 활성화 후 감수분열의 제2 분열의 억제 및 이배체 배아의 발생은 완전한 동형접합 hES 세포의 유도화에 이르지 못한다.
HLA-타입핑 결과에 기초하여, 모든 phESC 주로부터 유도된 분화 세포는, 이것을 치료적 용도의 세포를 생성시키는 방법에 이용하도록, 난모세포 도너와 완전한 조직적합성을 가져야 한다(표 19).
[표 19]
phESC 세포주에 대한 HLA-타입핑
Figure 112009011525658-pct00069
영양공급세포로서 사용된 인간 섬유아세포로부터 유래한 유전 물질의 DNA-프로파일링은 phESC 세포주가 인간 섬유아세포로부터 유래한 물질에 의해 오염되지 않는 것으로 나타났다(표 19).
phESC-1 주는 35회 계대배양에 걸친 10개월 배양 동안 미분화된 상태로 잔류하였다. 다른 세포주는 21회 이상의 계대배양에 걸쳐 성공적으로 배양되었다. 모든 phESC 주로부터 유래한 세포는, 시험관내에서 분화 후, 현탁 배양 중에서 낭성 배상체를 형성하였고, 모든 3가지 배엽: 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 유도체를 야기하였다(도 4). phESC-1 주로부터 유래한 배상체의 약 5%는 플레이팅 처리한지 5일 후 비팅 세포(beating cell)를 야기하였다. phESC-6 주는 색소침착된 상피 유사 세포를 생성하였다(도 4I, 4K). 외배엽 분화는 뉴런 특이적 마커 뉴로필라멘트 68(도 4A), NCAM(도 4B), 베타-III-투68불린(도 4C) 및 신경교 세포 마커 GFAP(도 4D, 4M)에 대하여 양성 면역세포화학 염색법에 의해 나타낸다. 분화 세포는 근육 특이적 마커 및 내피 마커인 알파-액티닌(도 4G) 및 데스민(도 4J), PECAM-1(도 4E) 및 VE-Cadherin(도 4F)을 비롯한 중배엽 마커에 대하여 양성이었다. 내배엽 분화는 알파-페토프로테인에 대하여 분화 유도체의 양성 염색법에 의해 나타낸다. 이들 데이터는 phESC가 인간 신체의 모든 세포 유형에 이르게 되는 3가지 배엽으로 분화될 수있다는 점을 입증해 보여준다.
phESC-7의 변경된 핵형은 임상적 용도로부터 그것을 배제하는 이유일 수 있다. 인간 배아에서 게놈 임프린팅의 변경은 모측 또는 부측 발현된 유잔자에 연관된 질환의 발생에 기여할 수 있다(Gabriel et al., Pro Natl Acad Sci USA(1998) 95: 14857). phESC 주의 다른 특성을 연구개발하기 위해서, 그리고 세포 요법에 사용하기 위한 적합성을 결정하기 위해서, 임프린팅 분석을 수행하였다.
상기 요약 기재되어 있는 바와 같이, 노던 블롯을 제조하고, DNA 프로브 SNRPN, Peg1-2, Peg1-A, H19 및 GAPDH(내부 대조군)로 스크리닝 처리하였다. 블롯팅 처리된 핵산을 NSF, 신생아 피부 섬유아세포; hES, 수정된 난모세포로부터 유래한 인간 배아 줄기 세포주: 1, phESC-1; 2, phESC-3; 3, phESC-4; 4, phESC-5; 5, phESC-6; 6, phESC-7로부터 얻었다. NSF RT-, hES RT-, 1 RT-는 음성 대조군이었다. 도 3은 임프린팅 블롯의 결과를 도시한 것이다.
모측 임프린팅 유전자, Peg1-A는 시험된 모든 세포주에서 강한 결합을 나타낸다. (Peg1-A에 비하여) 보다 약하지만 일정한 결합이 모측 임프린팅 유전자 H19에 대한 모든 세포주에서 관찰되었다. SNRPN는 NSF, hES, phESC-4 및 phESC-6에서 주로 강한 결합을 나타낸다. Peg1-2는 NSF, hES, phESC-1(보다 약한 신호), phESC-3, phESC-5 및 phESC-6에서 주로 결합을 나타낸다. GAPDH 결합이 모든 래인에서 RNA의 유사한 로딩을 갖는 것으로 확인되었다.
각막 형성 및 조직학
성장하는 합성 각막은 설명된 바와 같이 배지 중에 구체를 완전히 함침시킴으로써 배양시켰다. 구체의 총체적 시각 검사(gross visual inspection)는 구체가 조직의 비교적 투명한 구이고 1 cm 이상의 직경으로 성장한다는 것을 보여준다(도 8).
총체적 검사시, 구체는 두께가 약 0.5 mm인 벽을 포함하면서 실질적으로 공동인 것으로 것으로 나타난다. 후속적인 조직학적/현미경적 검사는 견본이 주로 섬유 조직, 경우에 따라서는 섬유아세포를 지닌 섬유 조직으로 된 2개 조각으로 구성되어 있다는 점을 보여준다. 염색법은 PAS 및 트리크롬(Trichrome) 음성인 기저막의 존재를 확인시켜 주는데, 이는 보우만층(즉, 각막의 스트로마)가 존재한다는 점을 시사한다. 꼭대기에 있는 섬유 조직 층은 내피라기보다는 오히려 상피임을 나타내는 핵소체를 함유하는 단일 세포 층이다. 이러한 분석에 기초하여, 조직 견본은 각막과 적합성을 갖는다는 결론에 도달하였다.
상기 실시예를 참조하여 본 발명을 설명하기 했지만, 변경예 및 변형예는 본 발명의 사상 및 영역 내에 속한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 단지 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정된다.
참고 문헌
Figure 112009011525658-pct00070

Claims (36)

  1. 단위발생적 줄기 세포 유래의 분리된 합성 구체 조직.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 최종 분화되는 분리된 구체 조직.
  4. 제1항에 있어서, 상피 세포를 포함하는 분리된 구체 조직.
  5. 제4항에 있어서, 스트로마 세포를 포함하는 분리된 구체 조직.
  6. 제1항에 있어서, 광 위상 속도를 변화시키는 능력을 갖는 분리된 구체 조직.
  7. 제1항에 있어서, 5 mm 내지 11.5 mm의 가로 직경을 갖는 분리된 구체 조직.
  8. 제1항에 있어서, 중심부에서 0.5 mm 내지 0.6 mm의 두께 및 주변부에서 0.6 mm 내지 0.8 mm의 두께를 갖는 분리된 구체 조직.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 난모세포 도너와 조직적합성인 분리된 구체 조직.
  11. 제1항에 있어서, 동형상태(homoplasmic) 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 포함하는 분리된 구체 조직.
  12. 제10항에 있어서, 인간에 이식가능한 분리된 구체 조직.
  13. (a) 미수정된 인간 난모세포를 단위발생적으로 활성화시키는 단계로서, 활성화는 (i) 난모세포를 이온운반체(ionophore)와 고 O2 분압에서 접촉시키는 단계, 및 (ii) 난모세포를 세린-트레오닌 키나제 억제제와 저 O2 분압에서 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 단계,
    (b) 단계 (a)의 활성화된 난모세포를 저 O2 분압에서 배반포가 형성될 때까지 배양하는 단계,
    (c) 배반포를 영양공급세포(feeder cell)의 층으로 옮기고, 그 옮겨진 배반포를 고 O2 분압 하에 배양하는 단계,
    (d) 단계 (c)의 배반포의 영양외배엽으로부터 내부 세포괴(ICM)를 기계적으로 분리하는 단계로서, 내부 세포괴의 세포는 다능성이고 부계 임프린팅이 결여된 것인 단계,
    (e) 단계 (d)의 ICM의 세포를 인간 영양공급세포의 층 상에서 고 O2 분압 하에 배양하는 단계로서, 인간 배아 줄기 세포(hES) 마커 및 뉴런 특이적 마커에 의해 그 배양물 중에서 내부 세포괴의 세포를 확인하고, 그 확인된 세포를 후속적으로 분리하는 것인 단계,
    (f) 단계 (e)의 분리된 세포를, DNA 합성 억제제로 처리된 섬유아세포 영양공급층 상에서 혈청 대체물(M/SR), 플라즈마네이트, 및 gp 130/STAT 경로, MAP 키나제 경로 또는 gp 130/STAT 경로 및 MAP 키나제 경로 모두를 활성화하는 하나 이상의 미토젠을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계,
    (g) 단계 (f)의 미토젠 처리된 세포를, 미토젠을 첨가하지 않은 채 플라즈마네이트를 포함하는 M/SR(M/SRP) 중에서, 포화상태(confluence)가 되도록 배양하는 단계로서, M/SRP의 1/2 부피를 포화상태인 세포가 색소침착 및 돔형 외관을 나타낼 때까지 주기적으로 M/SR과 교체하는 것인 단계, 및
    (h) M/SR 중의 단계 (g)의 색소침착된 세포를 젤라틴 코팅된 기층에 옮기는 단계로서, M/SR의 1/2 부피를 합성 구체 조직이 발생할 때까지 주기적으로 M/SR과 교체하는 것인 단계
    를 포함하는, 합성 구체 조직의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 구체 조직은 3-D 스캐폴드의 부재 하에 발생하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 미토젠은 백혈병 억제 인자(LIF: leukemia inhibitory factor), bFGF 및 이들의 조합 중에서 선택되는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, DNA 합성 억제제가 알킬화제인 방법.
  17. 제16항에 있어서, DNA 합성 억제제가 미토마이신 C인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 영양공급세포가 인간 세포인 방법.
  19. 제13항에 있어서, hES 마커는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-91, OCT-4 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 뉴런 특이적 마커는 뉴로필라멘트 68, NCAM, 베타 III-튜불린, GFAP 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  21. 제13항의 방법에 의해 얻어지는, 단위발생적 줄기 세포 유래의 합성 구체 조직.
  22. 제1항에 있어서, 각막을 대체하는 약제의 제조에 사용하기 위한 합성 구체 조직.
  23. 제22항에 있어서, 대체되는 각막이 손상된 것인 합성 구체 조직.
  24. 제22항에 있어서, 대체되는 각막이 질환을 앓고 있는 것인 합성 구체 조직.
  25. 제24항에 있어서, 질환은 각막염, 각막 궤양, 각막 찰과상, 설맹, 광각막염(arc eye), 타이제슨(Thygeson) 표층 점상 각막병증, 푸크스(Fuchs) 이영양증, 원추각막, 건성 각결막염, 각막 감염, 및 각막 이영양증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 합성 구체 조직.
  26. 삭제
  27. 삭제
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