ES2360782B1 - Medios para cultivo de células de mamíferos que comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de Cohn y uso de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Medios para cultivo de células de mamíferos que
comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de Cohn y uso
de los mismos.
La presente invención se refiere a medios de
cultivo de células de mamíferos que comprenden sobrenadante de
algunas de las fracciones del fraccionamiento del plasma humano
según el método de Cohn, más en particular, el sobrenadante de las
fracciones I y II+III. Cuando dicho sobrenadante es adicionado como
suplemento de medios de cultivo proporciona diferentes nutrientes y
factores para un adecuado mantenimiento y/o proliferación de las
células de mamíferos cultivadas. Además, la presente invención se
refiere al procedimiento de preparación y al uso de dicho medio en
el cultivo de células de mamíferos.
Description
Medios para cultivo de células de mamíferos que
comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de Cohn y uso
de los mismos.
La presente invención se refiere a un suplemento
para su uso en medios de cultivo de células de mamíferos. Dicho
suplemento se obtiene a partir del plasma desfibrinado
(sustancialmente libre de fibrinógeno y fibrina) de origen humano y,
cuando es adicionado como suplemento de medios de cultivo
proporciona los diferentes nutrientes y factores para un adecuado
mantenimiento y/o proliferación de células cultivadas.
Los cultivos celulares se utilizan en la
industria biotecnológica principalmente para la producción de
proteínas recombinantes y anticuerpos raonoclonales. Recientemente
también se ha desarrollado una tecnología para el cultivo de
diferentes tipos de células troncales para su utilización en la
terapia celular, en combinación o no con la terapia génica.
Para poder cultivar y mantener con éxito las
diferentes líneas celulares se necesita un medio que imite las
condiciones del medio interno donde se encontrarían estas células
in vivo. Generalmente, el medio de cultivo consta de un medio
basal que garantiza el pH, los nutrientes y las sales y se pueden
añadir una serie de suplementos que permiten la proliferación
celular. Uno de los suplementos más utilizados es el suero sanguíneo
de origen animal. El origen animal de este suero puede implicar
serias restricciones para su utilización en la obtención de
productos para uso en humanos, ya que al reconocer los residuos de
origen animal como antígenos extraños se pueden originar reacciones
adversas en los receptores. Además, los sueros animales poseen el
inconveniente de que su composición no es definida, pues existe una
gran variabilidad entre fabricantes por el uso de diferentes razas
animales. También, debido al procedimiento de obtención, existe una
gran variabilidad lote a lote, lo que implica que puedan ocurrir
grandes variaciones en la capacidad de crecimiento y en la
producción de un cultivo determinado.
La principal dificultad para el establecimiento
de las líneas celulares es obtener medios nutritivos adecuados que
sean capaces de reemplazar el medio natural, como extractos
embrionarios, hidrolizados de proteína o sueros. Un primer grupo de
medios, tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, H. (1955).
"The specific aminoacid requirements of mammalian cells (strain L)
in tissue culture". J. Biol. Chem. 214 : 839.) y el más complejo
199 de Morgan y col. (Morgan, J.G., Morton, J.H. y Parker, R.C.
(1950). "Nutrition of animal cells in tissue culture. I Initial
studies on a synthetic médium". Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73 :
1.) eran medios definidos pero que precisan de un suplemento de
suero entre el 5 y el 20%.
A fin de eliminar el aporte de medios complejos
no definidos se han ido formulando medios más complejos como NCTC
109 (Evans, V.J., Bryant, J.C., Fioramonti, M.C., McQuilkin, W.T.,
Sanford, K.K., y Earle, W.R. (1956), "Studies of nutrient media
for tissue C cells in vitro. I A protein-free
chemically defined médium for cultivation of strain L cells".
Cancer REs. 16 : 77.), 135 (Evans, V.J. y Briant, J.C. (1965).
"Advances in tissue culture at the National Cancer Institute in
the United States of America". En "Tissue culture", edit.
por C.V. Ramakrishnan (ed.). W. Junk. The Hague. pp.
145-167.), Ham F10 y F12 (Ham, R.G. (1963). "An
improved nutrient solution for diploid Chínese hámster and human
cell lines". Exp. Cell REs. 29 : 515., Ham, R.G. (1965).
"Clonal growth of mammalian cells in a chemically defined
synthetic médium". Proc. Natl. Sci. USA 53 : 288.), serie de los
MCDB (Ham, R.G. y McKeehan, W.L. (1978). "Development of improved
media ans culture conditions for clonal growth of normal diploid
cells". In vitro 14 : 11-22.) y los medios
de Sato suplementados con hormonas (Barnes, D. y Sato, G. (1980).
"Methods for growth of cultured cells in serum
free-medium". Anal. Biochem. 102 :
255-270).
255-270).
La aproximación recomendada para establecer un
medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12,
suplementado con elevada concentración de suero (20%) y probar
suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla
reducir o suprimir.
Después de años de investigación en la
composición de los medios, la elección de éstos sigue siendo
empírica.
Los principales medios empleados y sus
aplicaciones son:
- Medio Basal de Eagle (BME): es un medio
elemental con sólo los aminoácidos esenciales. Se necesita siempre
la suplementación con suero bovino fetal al 10%. Se utiliza para el
crecimiento de fibroblastos de ratón y células HeLa.
- Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM): es el
medio de uso más corriente, contiene más aminoácidos y en mayor
concentración que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de
cultivos y requiere la adición de suero (10%).
- R.P.M.I. 1640: es un medio diseñado para el
crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en
suspensión. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos
adecuados.
- Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM):
contiene cuatro veces, la concentración de aminoácidos y vitaminas
que el BME. Se usa para la selección de hibridomas suplementado con
HAT
(hipoxantina-aminopterina-timidina)
o HT (hipoxantina-timidina).
- Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM):
es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina
bovina, transferrina, selenito, entre otros elementos. Es muy útil
para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. También sirve
para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas
concentraciones.
- McCoy 5ª: es un medio diseñado para el
crecimiento de líneas celulares diploides tanto de rata como
humanas.
- Medio L-15 de Leibovitz: es un
medio utilizado para el cultivo de virus.
- Medio F-10 de Ham: es un medio
utilizado para el crecimiento de líneas celulares humanas, debe ser
suplementado con proteínas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu,
Zn. Es útil para el cultivo de células amnióticas.
- Medio F-12 de Ham: es un medio
útil para el crecimiento de líneas celulares con suplementos
proteínicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de
suero.
- Medio 199: es un medio muy utilizado para el
cultivo de células no diferenciadas y estudio de
cromosomopatías.
\vskip1.000000\baselineskip
Todo medio de cultivo está formado por los
siguientes elementos:
1. Soluciones salinas equilibradas (BSS).
2. Aminoácidos.
3. Vitaminas.
4. Otros suplementos orgánicos de bajo peso
molecular (nucleósidos, intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato,
lípidos).
5. Hormonas y factores de crecimiento
(suero).
6. Inhibidores del crecimiento de los
contaminantes (antibióticos y antifúngicos).
\vskip1.000000\baselineskip
En los medios no definidos, las hormonas y
factores de crecimiento suele aportarlos el suero. Los tipos de
suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero
bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo
("horse serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS).
El más utilizado es el suero de ternera, mientras que el suero
bovino fetal es usado en líneas más exigentes, y el suero humano en
líneas humanas.
La utilización de suero es problemática pues a
pesar de que la composición del suero es conocida en parte, existen
gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables que
pueden influir notablemente en el cultivo. Además, el suero varía de
lote a lote, debido a la variabilidad de la propia técnica de
obtención de la sangre, del proceso de obtención del suero
(coagulación de la sangre) y de las condiciones de separación del
suero, así como la diferencia entre las distintas fuentes de suero.
Además, cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de
controles tediosos y costosos. Por otra parte, si se deben purificar
productos del medio de cultivo, la presencia de componentes
variables en el suero dificulta notablemente estos procesos.
Algunos factores séricos, como el factor de
crecimiento plaquetario (PDGF), estimulan la proliferación de
fibroblastos, lo que puede ser un problema en el establecimiento de
cultivos primarios especializados, especialmente si se produce una
gran variación en su contenido.
En conjunto, la inclusión de suero en los medios
de cultivo supone un gran inconveniente para la estandarización de
protocolos experimentales y de producción de células. Por ello se
realizan importantes esfuerzos para el establecimiento de medios de
composición definida para el crecimiento celular. Esto, además de la
reproducibilidad buscada, permite establecer medios selectivos en
los que crezca el tipo celular deseado. La desventaja de estos
medios es que en muchos casos el crecimiento de las células es menor
y las líneas celulares permanecen viables menos
generaciones.
generaciones.
Se han realizado diferentes intentos para
conseguir suplementos de los medios de cultivo celulares que eviten
los problemas que representan los sueros empleados en la actualidad.
Entre ellos se han ensayado diferentes fracciones procedentes del
plasma humano y existen importantes contradicciones en el estado de
la técnica en cuanto a la utilidad de las diferentes fracciones del
plasma humano.
De forma general, se han ensayado diferentes
fracciones del plasma humano procedentes del fraccionamiento
plasmático según el método de Cohn (Cohn E.J. et al; J Am
Chem Soc, 1946) y variaciones del mismo (Kistler and Friedli,
Nischmann; en Curling, JM ed, Methods of plasma fractionation.
Academic Press 1980), estando todos estos ensayos dirigidos al uso
de los diferentes precipitados obtenidos en el fraccionamiento,
especialmente las fracciones II+III, III, IV (IV_{1} ó IV_{4}) y
V, o sus equivalentes en las diferentes variaciones del método de
fracciona-
miento.
miento.
El objetivo inicial de la separación de las
mencionadas fracciones (precipitado) es la obtención de un
precipitado enriquecido en una determinada proteína, como punto de
partida para la purificación de la misma, por ejemplo
\gamma-globulinas y \alpha y
\beta-globulinas en el caso de las fracciones
II+III ó III; \alpha-globulinas y transferrina en
la fracción IV y albúmina en la fracción V. Por ello en estas
fracciones se presenta de forma mayoritaria un único tipo de
proteína, estando presente otras proteínas como impurezas,
generalmente en mucha menor cantidad. El uso de estas fracciones en
cultivos celulares implica la adición al medio de cultivo de un tipo
de proteína mayoritaria y de una variedad de proteínas que la
acompañan como impurezas, entre las cuales se deben situar las que
requieren las células en el medio de cultivo para que el uso de
dicho material tenga éxito. Esta ha sido hasta la actualidad una
forma obvia pero ineficiente de suplementar los medios de cultivos
celulares. Seguramente esta sea la causa de la disparidad de
resultados obtenidos, ya que pequeñas variaciones en el método de
fraccionamiento no variarán significativamente la recuperación de la
proteína mayoritaria, pero podrán introducir gran variabilidad en la
recuperación de las diferentes proteínas acompañantes. Por ejemplo,
la obtención de la fracción II+III, según el método de Cohn, se
realiza a una concentración de etanol de entre 20 y 25% a -5ºC y pH
6,9. Según el método de Nitschmann, partiendo de un material
equivalente, se precipita a una concentración de etanol de 19% a
-5ºC y pH 5,8. Con esta variación de pH se obtienen fracciones con
características diferentes, especialmente en el contenido de
\gamma-globulinas y otras proteínas
acompañantes.
acompañantes.
Por otra parte la utilización de sobrenadantes,
comparada con la utilización de fracciones precipitadas, presenta
las ventajas adicionales, entre otras, de que mantiene una elevada
concentración de albúmina en el medio y, sobre todo, evita la
pérdida de componentes (p.ej., hormonas, citoquinas, lípidos...) que
son importantes para el crecimiento celular y que podrían no estar
presentes en los precipitados o bien perder su funcionalidad
(inactivarse) en presencia de concentraciones de alcohol superiores
al 20%, como las empleadas para precipitar la fracción TT+TTT en
determinadas condiciones (25%) o las fracciones IV1+IV4 y V (40% de
etanol).
El documento EP0143648 (Macleod) describe el uso
de las fracciones II+III, III, IV_{1} y IV_{4} como suplemento
de los medios de cultivo en sustitución del suero animal. También
indica que ni la fracción II ni la fracción V presentan utilidad
para este uso. En todos los casos, este documento se refiere
exclusivamente a las fracciones precipitadas en el fraccionamiento
de Cohn o sus variantes. Además, este documento da a conocer un
proceso para obtener el material adecuado como suplemento de medios
de cultivo a partir de las fracciones anteriormente mencionadas.
Este proceso consiste básicamente en la suspensión del precipitado
en agua y homogenización del mismo. Posteriormente, se procede a
ajustar el pH para conseguir una mejor disolución de las proteínas y
para llevarlo a las condiciones fisiológicas que permitan el
crecimiento de las células. Por otro lado, este proceso contempla,
además, la eliminación de la \gamma-globulina
presente mediante precipitación con polietilenglicol y la separación
del material de bajo peso molecular mediante cromatografía de
exclusión molecular. Por lo tanto, la eficacia del material
preparado de esta manera es muy dependiente del proceso específico
de preparación.
En otro documento de Macleod (Advances in
Biochemical Engineering Biotechnology, Vol. 37; 1988) indica que las
fracciones II, III y IV producen poco o ningún efecto en el
crecimiento celular, debido posiblemente a la presencia de
inhibidores del crecimiento y dirige la atención a la fracción
IV_{4} como material ideal para suplementar medios de cultivo.
La EP 0 440 509 (Macleod) describe un suplemento
para medios de cultivo celulares basado en la fracción IV o en la
fracción II+III de Cohn, y el proceso para su obtención. Mediante el
proceso descrito se obtiene un producto sustancialmente libre de
inmunoglobulinas, inactivado de virus y estable. Se procede a la
separación de la inmunoglobulina por precipitación con
Polietilenglicol y a la inactivación de virus por pasteurización, en
presencia de sorbitol como estabilizante. Este proceso es
especialmente aplicable a la fracción IV (IV_{1} ó IV_{4}).
El documento EP 0264748 (Antoniades) describe el
sobrenadante de la fracción V de Cohn como suplemento de medios de
cultivo celulares en sustitución del suero animal. Según este
documento, la ventaja de este material es que no tiene coste y que
puede ser calentado a 60ºC durante 20 horas.
El sobrenadante de la fracción V es el material
final de desecho del fraccionamiento de Cohn, por lo que su uso
obviamente no presenta un coste económico como detrimento en el
rendimiento de dicho fraccionamiento. Este material presenta un
alto contenido de etanol (40%), que es altamente tóxico, y que en
este documento no se menciona como debe ser eliminado. Por otra
parte, para el tratamiento descrito a 60ºC debería ser necesaria la
estabilización de la proteína presente, pero también se obvia este
detalle en el documento, con lo que la invención es difícilmente
realizable tal y como está descrita. Tampoco debe despreciarse el
efecto desnaturalizante del etanol a una concentración tan elevada
como este caso.
La WO 94/18310 (Mankarious) describe un método
para producir un suplemento de los medios de cultivo celulares a
partir de la fracción IV_{4} de Cohn. Este método contempla la
suspensión de la fracción IV_{4} y posterior clasificación y
también la inactivación o eliminación de virus, por pasteurización
y/o filtración.
La patente GB 2 166 756 A describe un método
para el cultivo de células de bazo para la producción de interferón.
Este método se basa en un medio de cultivo RPMI que es suplementado
con una fracción sérica obtenida a partir suero o plasma al que se
ha eliminado el fibrinógeno y que se caracteriza por que se le ha
extraído la prealbúmina y las gammaglobulinas (pág. 1, líneas
30-34). En una realización preferente, esta fracción
se purifica por precipitación con alcohol entre el 10 y el 20%, a un
pH de 5.85 (pág. 1, líneas 37-38). En una
realización particular (obtención de la fracción EPF), el
sobrenadante usado como medio de cultivo se obtiene a una
concentración de etanol del 19% a un pH de 5.85 (pág. 2, líneas
44-45). El sobrenadante obtenido se dializa con
objeto de eliminar el etanol, siendo posteriormente liofilizado para
su conservación. Opcionalmente se liofiliza sin diálisis previa, con
lo que también se elimina el etanol. Según los inventores, con un
medio de cultivo (RPMI) suplementado con dicha fracción se obtiene
una excelente producción de interferón. En la precipitación
alcohólica del plasma, las condiciones de proceso (concentración de
etanol, pH, fuerza iónica del medio, temperatura y concentración de
proteína) deben fijarse cuidadosamente para mantener en solución
determinadas proteínas e insolubilizar otras con objeto de que
precipiten y así proceder a su separación. Variaciones en alguna o
algunas de las mencionadas condiciones producirán diferencias
importantes en el producto obtenido, siendo la concentración de
etanol y el pH, los factores determinantes de la composición del
precipitado y sobrenadante obtenidos.
Se han realizado otros intentos de suplementar
medios de cultivo celulares a partir de suero o fracciones séricas
de origen humano, en sustitución del suero fetal bovino, como
muestran los documentos WO 2004/055174, EP 1820852 ó CA 1177424. El
suero obtenido a partir de sangre total, o a partir de plasma, no
puede equipararse a una fracción plasmática concretamente definida y
caracterizada y presenta el inconveniente de la falta de
reproducibilidad lote a lote. Además, ninguno de estos documentos
consigue definir y caracterizar la composición exacta del material
utilizado. De esta manera, se siguen presentando gran parte de los
problemas asociados al uso del suero de origen
animal.
animal.
Kwok y otros dieron a conocer el uso de plasma
de embarazadas en sustitución del suero fetal bovino para el cultivo
de un tipo específico de células, atribuyendo su efecto a la
presencia de factores desconocidos. De igual manera, postula un
efecto sinérgico de la albúmina humana en ese tipo de cultivo. Es
evidente para un experto en la materia que con el uso de plasma de
embarazadas se busca la presencia de factores de crecimiento celular
equiparables a los del suero fetal, pero la homogeneidad de este
material no es comparable a las mezclas de plasma de miles de
donantes, según se describe más adelante.
Como se ha descrito anteriormente, se han
realizado numerosos intentos para sustituir el suero animal como
suplemento de medios para el cultivo celular. Una parte de estos
intentos se ha realizado a partir de fracciones de plasma humano,
especialmente de fracciones del método de Cohn. A pesar de ello, en
la actualidad se sigue utilizando comúnmente el suero animal como
suplemento de medios de cultivo de células de mamíferos y se ha
fracasado en los intentos de sustituirlo por un derivado del plasma
humano.
Por todo lo anteriormente mencionado, se deduce
que en el estado de la técnica actual no se dispone de un material
de origen humano que sea útil como suplemento de medios de cultivo
celulares, que sea, además, seguro frente a la trasmisión de agentes
patógenos, que pueda ser obtenido a escala industrial con un coste y
un rendimiento aceptable, que presente una adecuada uniformidad lote
a lote y que tenga una calidad de grado farmacéutico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores han realizado investigaciones
encaminadas a la sustitución del suero de origen animal como
suplemento de medios de cultivo por fracciones del plasma humano y
han encontrado, de manera sorprendente, que partiendo de un
sobrenadante del fraccionamiento de Cohn, específicamente el
sobrenadante de la fracción II+III o él sobrenadante de la fracción
I, es posible suplementar medios de cultivo celulares, obteniendo
excelentes resultados en cuanto a crecimiento celular. El uso de
este material soluciona los problemas antes mencionados, ya que es
de origen humano, se obtiene de forma industrial bajo normas de
correcta fabricación (GMPs), con un coste y rendimiento aceptables,
presenta una adecuada uniformidad y reproducibilidad lote a lote y
posee una calidad de grado farmacéutico. Además, este material puede
ser tratado con métodos que eviten la transmisión de pató-
genos.
genos.
Para la preparación de estos derivados se
procede según se describe a continuación.
En primer lugar, se obtiene plasma humano de
donantes sanos al que se añade una solución anticoagulante
conteniendo, en una utilización preferente de la invención,
solamente citrato sódico en cantidad suficiente para evitar la
coagulación del plasma. La adición de sustancias (p.ej.:
carbohidratos como la glucosa) destinadas a la mejor conservación de
las células sanguíneas no es imprescindible, puesto que el plasma
empleado en la invención está sustancialmente libre de células, al
poderse haber obtenido por plasmaféresis en presencia de
anticoagulante, en lugar de por donación de sangre total.
Las cantidades de anticoagulante, así como otras
normativas que debe cumplir el procedimiento de obtención,
almacenamiento y manipulación de plasma humano están descritas en
normativas internacionales de carácter público que afectan a la
industria fraccionadora del plasma humano, como son, por ejemplo, el
"Code of Federal Regulations" de los EE.UU. de América, las
directrices y normativas de la Administración Federal de los
Fármacos y Alimentos de los EE.UU. de América (Food and Drug
Administration, FDA) y de la Agencia Europea de Evaluación de
Medicamentos (European Medicines Evaluation Agency, EMEA), así como
en las directrices y normativas de la Conferencia Internacional de
Armonización farmaceútica (International Conference of
Harmonization, ICH) y de las farmacopeas internacionales, por
ejemplo, las Farmacopeas Europea, japonesa o de los EE.UU. de
América, e incluyen también las normas conocidas como Normas de
Correcta Fabricación actuales (current Good Manufacturing Practices,
cGMP). En adelante este conjunto de normativas se referirán como
"el conjunto de normativas que afectan al fraccionamiento del
plasma humano con fines farmaceúticos". Dicho conjunto de
normativas también son de aplicación en las etapas de la invención
que se describen a continuación.
Una vez obtenido el plasma humano, se congela,
almacena y transporta de acuerdo con el conjunto de normativas que
afectan al fraccionamiento del plasma humano con fines farmaceúticos
y, en una utilización preferente de la invención, específicamente de
acuerdo con los requerimientos de la monografía 0853 de la
Farmacopea Europea. Cada unidad (donación) de plasma se analiza para
descartar la presencia de marcadores de infección vírica en los
donantes, que previamente han sido sometidos a cuestionarios y
exámenes físicos de acuerdo con las normativas mencionadas
anteriormente. En aplicación preferente de la invención, el plasma
de un posible donante no se emplea hasta que el donante ha sido
sometido al procedimiento de evaluación dos veces en un intervalo de
tiempo inferior a 6 meses, momento en el que el donante pasa a estar
"cualificado" ("qualified donor").
En una aplicación preferente de la invención,
muestras obtenidas de cada donación se analizan para descartar la
presencia de marcadores de infección como, por ejemplo, el virus de
inmunodeficiencia humana (VIH), los virus de hepatitis B y C (VHB y
VHC) y otros virus patógenos para el hombre. Forma parte de la
invención un almacenamiento controlado de las donaciones de plasma
durante un período no inferior a 60 días, preferentemente no
inferior a 90 días, que permitiría retirar donaciones previas si un
donante, previamente sano, diese indicios, con posterioridad a la
donación, de infección por agentes patógenos u otros factores de
riesgo sanitario. En una aplicación preferente de la invención, los
análisis de las muestras de cada donación se repiten una o varias
veces tras preparar mezclas piloto ("minipools" o "pilot
pools") de un número variable de donaciones que, por ejemplo,
pueden oscilar entre 10 y 10000, preferentemente entre 90 y 2000 y
más preferentemente entre 100 y 1000. Para estas repeticiones de
análisis se pueden emplear métodos de amplificación del material
genético de los virus como, por ejemplo, la reacción en cadena de la
polimerasa (Polimerase Chain reaction, PCR) u otros métodos
incluidos genéricamente dentro de los conocidos como análisis de
ácidos nucléicos (Nucleic Acid Testing, NAT).
Una vez completados todos los análisis y el
período de almacenamiento controlado (inventory hold), tras
descartar las unidades no aptas según los análisis, el plasma puede
ser utilizado en las etapas siguientes de la inven-
ción.
ción.
La siguiente etapa consiste en descongelar
donaciones, en número no inferior a 100 unidades, preferentemente
superior a 1000 unidades y más preferentemente superior a 4000
unidades. La descongelación se puede realizar, en una aplicación
preferente de la invención, entre 0 y 4ºC de temperatura. Las
donaciones se mezclan durante el proceso de descongelación dando
lugar a una mezcla plasmática ("plasma pool"). Opcionalmente,
se puede separar un material que precipita, ya que es inestable
debido al proceso de descongelación y que suele describirse como
"crioprecipitado" y es rico en factor von Willebrand (FVW),
factor VIII (FVIII), fibrinógeno (FBN), fibronectina (FNC) y otras
proteínas.
A continuación, en una utilización preferente de
la invención, se añade al plasma etanol (96%) de grado farmacéutico
hasta alcanzar una concentración de aproximadamente el 8%
(volumen/volumen). Para evitar la desnaturalización de proteínas
debida al proceso exotérmico de disolución del etanol en el plasma,
la adición se realiza con un caudal de adición controlado.
Simultáneamente y con el mismo objetivo, la temperatura del pool de
plasma se hace descender gradualmente hasta aproximadamente -2ºC. La
presencia de etanol evita la congelación del plasma. En estas
condiciones precipita una fracción de proteínas muy rica en
Fibrinógeno y que incluirla la mayor parte de las proteínas
presentes en el crioprecipitado si este, en una aplicación de la
invención, no se hubiese separado con anterioridad a la adición de
alcohol. Esta fracción se denomina genéricamente como fracción I
(Fr-I) de Cohn, ya que se obtiene por un
procedimiento esencialmente correspondiente al descrito por Edwin J.
Cohn (Cohn E.J. et al; J Am Chem Soc, 1946). Cuando se separa
el precipitado obtenido en esta etapa, la fracción sobrenadante se
encuentra sustancialmente libre de fibrinógeno, y por tanto libre de
cualquier interferencia que pudiera causar el fibrinógeno en los
cultivos celulares, siendo adecuada para el objeto de la invención,
como suplemento para medios de cultivo de células, una vez se
elimina el alcohol añadido, por su toxicidad para las células.
En una aplicación preferente de la invención,
habiéndose separado previamente cualquiera o ninguno de los dos
precipitados anteriormente descritos (crioprecipitado y
Fr-I), se añade a la mezcla existente etanol (96%)
de grado farmacéutico hasta alcanzar una concentración del 20 al 25%
(volumen/volumen). Para evitar la desnaturalización de proteínas
debida al proceso exotérmico de disolución del etanol en el plasma,
la adición se realiza con un caudal de adición controlado.
Simultáneamente y con el mismo objetivo, la temperatura del pool de
plasma se hace descender gradualmente hasta aproximadamente -5ºC. La
presencia de etanol evita la congelación del plasma. En estas
condiciones precipita una fracción de proteínas muy rica en las
proteínas anteriormente descritas como presentes en el
crioprecipitado y en la Fr-I (si no se han separado
previamente, según se describe con anterioridad) y, además, muy rica
en inmunoglobulinas, principalmente IgG e IgM. Esta fracción se
denomina genéricamente como fracción I+II+III
(Fr-I+II+III), si no se ha separado previamente la
Fr-I, o fracción II+III (Fr-II+III)
de Cohn, si se separó previamente la Fr-I. Cuando se
separa el precipitado obtenido en esta etapa, la fracción
sobrenadante se encuentra sustancialmente libre de fibrinógeno e
inmunoglobulinas y, por tanto, libre de interferencias que pudieran
ser causadas por estas proteínas en los cultivos celulares, siendo
adecuada para el objeto de la invención, como suplemento para medios
de cultivos de células, una vez se elimina el alcohol añadido, por
su toxicidad para las células.
Durante las etapas descritas se aplican
controles del proceso de producción de los materiales derivados del
plasma, para garantizar que los procesos se realizan dentro de las
especificaciones requeridas en cuanto a concentración de proteína,
pH, contaje de microorganismos, etc.
Estos sobrenadantes se obtienen por un
procedimiento esencialmente correspondiente al descrito por Edwin J.
Cohn, si bien pueden existir diferencias de composición, tanto
debidas a los cambios de escala de producción (número de donaciones
y volumen de los pooles de plasma), como a variaciones entre el
procedimiento de la invención y el procedimiento aplicado en aquella
época.
Estos sobrenadantes obtenidos directamente del
fraccionamiento industrial del plasma humano (basado en el método de
Cohn), aparte de la eliminación del etanol que contienen
(aproximadamente 8% en el sobrenadante de la fracción I y
20-25% aproximadamente en el sobrenadante de la
fracción II+III), no requieren tratamientos posteriores de
purificación.
La eliminación del etanol contenido en estos
sobrenadantes puede realizarse por cualquiera de los métodos
conocidos en el estado de la técnica. Preferentemente puede
realizarse mediante diálisis o diafiltración o directamente mediante
liofilización, evaporación o desecación (p. ej. Spray drying) siendo
estos métodos fácilmente industrializables.
Una forma de preparación válida para obtener un
producto totalmente estable consiste en partir de cualquiera de los
sobrenadantes descritos y, opcionalmente, diluirlos convenientemente
con agua para inyección, solución salina fisiológica o tampón, a pH
7-8 y temperatura entre 2-8ºC. La
solución se clarifica por placas de celulosa o de profundidad, que
sean inertes en cuanto a adsorción de proteína, y finalmente se
clarifica hasta aproximadamente 0,5 micras de poro. Posteriormente
se somete el producto a diafiltración, utilizando membranas de
aproximadamente 10 kDa de corte molecular nominal, frente 2
volúmenes o más de agua para inyección, solución salina fisiológica
o tampón, a un pH preferente de 7 aproximadamente. Preferentemente,
el número de volúmenes de intercambio en la diafiltración es
aproximadamente de 5.
La solución diafiltrada es clarificada por
filtración absoluta con gradiente de filtros de 0,2 micras hasta 0,1
micras de tamaño de poro. Posteriormente el producto puede ser
nanofiltrado por aproximadamente 35 nm y 20 nm de tamaño de poro, a
una temperatura preferente de 2-8ºC y a una presión
transmembrana inferior o igual a 1 bar. La carga aplicada es
preferentemente alrededor de 70 Litros/m^{2} de área para el
filtro de menor tamaño de poro.
El producto obtenido puede concentrarse por
ultrafiltración hasta el mismo valor de concentración de proteína
total del material de partida (sobrenadante), o más concentrado si
se prefiere.
En cualquier caso, el material obtenido se
dosifica en viales o botellas de vidrio y se guarda almacenado
preferentemente a -30ºC o temperatura inferior hasta el momento de
su uso. Como paso previo a la dosificación del sobrenadante en
viales, se puede proceder a realizar una filtración esterilizante,
por un tamaño de poro entre 0.1 y 0.2 micras.
Este producto congelado puede asimismo
liofilizarse, o someterse a otros tratamientos, para disponer de un
producto desecado. El producto puede someterse a radiación gamma y,
en estado desecado, puede conservarse preferentemente entre 2 y 8ºC
hasta su uso.
En el caso de no realizar la diafiltración del
material de partida (S/Fr-I o
S/Fr-II+III, o equivalente) y optar por la
eliminación del alcohol directamente por liofilización, se dosifica
a viales o botellas de vidrio. Previamente a la dosificación del
sobrenadante en viales, se puede proceder a realizar una filtración
esterilizante, por un tamaño de poro entre 0.1 y 0.2 micras. El
material dosificado se congela preferentemente a temperatura menor o
igual a -30ºC, y se somete a liofilización y radiación gamma tal y
como se conocen estas técnicas.
De manera opcional, este material puede ser
tratado con métodos de eliminación/inactivación de agentes
patógenos. De forma preferente se puede proceder a la irradiación
del material, congelado o liofilizado con radiación gamma, entre 15
y 35 kilo-greys, obteniéndose con 25
kilo-greys el óptimo entre estabilidad de la
composición y eliminación de virus.
El producto liofilizado puede almacenarse,
preferentemente entre 2-8ºC, durante largo período
de tiempo.
A nivel de proliferación celular, el
sobrenadante de Fr-II+III se mantiene estable
(porcentajes de proliferación iguales (100+20)% o superiores al SFB)
al menos 168 días en forma liofilizada, conservado en nevera
(2-8ºC).
Este material, reconstituido en Medio cultivo
Hams F12, es estable al menos 113 días a temperatura menor o igual a
-18ºC (porcentajes de proliferación celular iguales o superiores a
tiempo cero).
La estabilidad del Medio de cultivo Hams F12,
suplementado al 50% con S/Fr-II+III es de 4 días en
nevera.
Una forma de conservación preferente del
material hasta su uso es como liofilizado en su envase final. De
esta manera, puede procederse a su dosificación directa y se puede
eliminar el etanol en el propio proceso de liofiliza-
ción.
ción.
Estos sobrenadantes se añaden a medios de
cultivo convencionales libres de suero, que contienen sales
inorgánicas, aminoácidos, vitaminas, entre otros componentes
necesarios para el crecimiento celular, como por ejemplo el medio
F12 de Ham o el medio de Dulbecco modificado (DMEM).
El medio resultante puede ser utilizado para
cultivar una gran variedad de células de mamíferos. Para ello son
utilizadas técnicas y condiciones de cultivo convencionales, que son
conocidas por un experto en la materia.
El sobrenadante liofilizado puede reconstituirse
en medio de cultivo base, por ejemplo el medio F12 de Ham o en el
medio mínimo esencial modificado por Dulbecco (DMEM), en agua
destilada o desionizada y apirógena, o en soluciones salinas o
tampones habituales de cultivo celular.
El sobrenadante reconstituido en medio de
cultivo puede utilizarse para suplementar el medio de cultivo base
añadiendo desde un 2% a un 50% (v/v) de sobrenadante reconstituido,
por ejemplo: 2 ml de Sobrenadante de fracción I o de fracción II+III
reconstituido en medio a 98 ml de medio base (2%) otro ejemplo sería
añadir 50 ml de sobrenadante de Fracción I o de fracción II+III
reconstituido en medio a 50 ml de medio base (50%).
El sobrenadante reconstituido en agua,
soluciones salinas o tampones aptos para cultivo celular se
recomienda adicionarlo al medio de cultivo base entre un 2% y un 20%
(v/v) por ejemplo 20 ml de sobrenadante reconstituido en 80 ml de
medio (20%). En el caso de ser necesario llegar a concentraciones
del 50% (v/v) seria necesario adicionar el sobrenadante
reconstituido a medio base doble concentrado (2X) por ejemplo añadir
50 ml de sobrenadante de fracción I o de fracción II+III en agua a
50 ml de medio base 2X.
El medio de cultivo suplementado puede
utilizarse para las técnicas habituales de cultivo, este medio
suplementado puede utilizarse directamente o filtrarse previamente
por 0,22 \mum.
En caso de material (sobrenadante) conservado
congelado, previa a la adición al medio base, debe descongelarse.
Una vez descongelado se recomienda adicionarlo al medio de cultivo
base entre un 2% y un 20% (v/v) por ejemplo 20 ml de sobrenadante de
fracción II+III reconstituido en 80 ml de medio (20%). En el caso de
ser necesario llegar a concentraciones del 50% (v/v) en la
suplementación del medio seria necesario adicionar el sobrenadante
de fracción I o de fracción II+III doble concentrado (2X) por
ejemplo añadir 50 ml de sobrenadante de fracción II+III a 50 ml de
medio base 2X.
El medio de cultivo suplementado puede
utilizarse para las técnicas habituales de cultivo, este medio
suplementado puede utilizarse directamente o filtrarse previamente
por 0,22 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se procede a la mezcla y descongelación de
donaciones individuales de plasma procedente de plasmaféresis, la
descongelación se realiza en un reactor a una temperatura controlada
entre 0 y 4ºC. Se obtienen finalmente 3783 kg. de plasma.
Para la separación del crioprecipitado se
procede a la centrifugación del plasma, entre 9000 y 12000 xg,
manteniendo la temperatura de la centrifugación entre 0 y 4ºC.
Para proceder a la separación de la fracción I,
se comprueba la concentración de proteína del sobrenadante de
crioprecipitado (S/C), que debe ser del 5% aproximadamente. Si es
superior se diluye con agua para inyección. Asimismo se ajusta el pH
a 7 aproximadamente.
Partiendo del S/C, se le adiciona etanol hasta
una concentración del 8% (volumen/volumen). La velocidad de adición
del etanol debe ser lenta (menor o igual a 2 kg/min) y con agitación
moderada para evitar la desnaturalización. Durante la adición del
etanol se disminuye gradualmente la temperatura del sobrenadante, en
el reactor de precipitación, hasta llegar a una temperatura final de
-2ºC. El pH final debe situarse aproximadamente en 7.
Después de aproximadamente 2 horas de reacción
se procede a la centrifugación para la separación de la Fracción I.
Esta centrifugación se realiza entre 9000 y 12000 xg. El
sobrenadante obtenido (S/Fr-I) se mantiene a una
temperatura de entre 0 y -4ºC.
En este punto, o bien en el S/C, podría haberse
extraído opcionalmente el Complejo de Protrombina, por cromatografía
de intercambio iónico (Curling, JM ed, Methods of plasma
fractionation. Academic Press 1980).
\newpage
Para la separación de la fracción II+III, se
procede al ajuste de pH del S/Fr-I a aproximadamente
7 y seguidamente se adiciona etanol para llevarlo al 20%
(volumen/volumen). La velocidad de adición del etanol debe ser lenta
(menor o igual a 2 kg/min) y con agitación moderada para evitar la
desnaturalización. Durante la adición del etanol se disminuye
gradualmente la temperatura del sobrenadante, en el reactor de
precipitación, hasta llegar a una temperatura final de
aproximadamente -5ºC. El pH final debe situarse cercano a 7.
En este ejemplo, después de aproximadamente 6
horas de reacción se procede a la separación de la fracción
II+III.
II+III.
En este punto (sobrenadante de la fracción
II+III), o en el S/C, o en el S/FrI puede procederse a la extracción
opcional de la Antitrombina, por cromatografía de afinidad a
heparina (Fernandez J. et al. Sangre 41 (supl. 3) 42
(1996).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Un sobrenadante de fracción II+III obtenido
según el ejemplo 1, se diluye con agua para inyección a pH
7-8 y temperatura entre 2-8ºC hasta
una concentración de etanol del 8%. La solución se clarifica por
placas de celulosa hasta 0,5 micras de poro. Posteriormente se
somete opcionalmente el producto a diafiltración para eliminar el
etanol, utilizando membranas de polisulfona de 10 kDa de corte
molecular nominal, frente a agua para inyección, a un pH de 7. El
número de volúmenes de intercambio en la diafiltración es de 5.
La solución es clarificada por filtración
absoluta con gradiente de filtros de 0,2 micras hasta 0,1 micras de
tamaño de poro. Posteriormente el producto opcionalmente se
nanofiltra por 35 nm y 20 nm de tamaño de poro, con filtros de
celulosa cupra-amonio, a una temperatura entre 2 y
8ºC y a una presión transmembrana inferior a 1 bar, hasta el bloqueo
de los filtros como máximo.
El producto se concentra por ultrafiltración
hasta el mismo valor de concentración de proteína total del material
de partida y previa filtración esterilizante, por un tamaño de poro
de 0.2 micras, se dosifica en viales de vidrio y se guarda
almacenado a -30ºC hasta el momento de su uso.
Este producto congelado puede liofilizarse para
disponer de un producto desecado que se somete a radiación gamma y
puede conservarse entre 2 y 8ºC hasta su uso.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
3
La composición mayoritaria de diferentes lotes
de material obtenido según el ejemplo 2 (sobrenadantes liofilizados
y reconstituidos en H_{2}O), comparada con la de un suero fetal
Bovino, se muestra en las Tablas siguientes:
Ejemplo
4
La línea celular CHO corresponde a células de
ovario de hámster chino, estas células presentan morfología
epitelial y crecen en modo adherente. El cultivo utilizado proviene
de "European Collection of Cell Cultures" ECACC con nº de
catálogo 85050302.
Se reconstituye el sobrenadante de fracción I
con medio de cultivo F12 de Ham's como se ha indicado
anteriormente.
Se preparan diferentes concentraciones
(volumen/volumen) de Fracción I en medio de cultivo (20%; 40%; 60%;
80% y 100%) así como medio suplementado con un 20% (v/v) de suero
fetal bovino (FBS) y medio sin suplementar.
Se siembra en una placa de 96 pocillos 50 \mul
por pocillo de una suspensión de células CHO a una concentración
entre 5 x 10^{5} y 1 x 10^{6} células/ml en medio de cultivo sin
suplementar.
Se añade a cada columna de la placa 50 \mul
por pocillo del medio que deseamos testar de forma que la dilución
final proporcionará medio sin suplementar, suplementado con un 10%
FBS y suplementado con un 10; un 20; un 30; un 40 y un 50% de
sobrenadante de fracción I.
La placa de 96 pocillos se incuba a 37ºC; en una
atmósfera con un 8% CO_{2} y alta humedad relativa (incubador para
cultivos celulares) durante 48 horas.
Se añaden 100 \mul de medio sin suplementar a
una columna para tener un blanco de la técnica.
Tras 48 horas de incubación se añade a cada
pocillo 10 \mul del reactivo WST-1/ECS del equipo
comercial "Cell proliferation assay kit" de Millipore con nº de
catálogo 2210.
Tras una incubación de 2 a 4 horas en
condiciones de cultivo habituales para la línea (37ºC; 8% CO_{2})
se agita una placa durante un minuto y se mide la absorbancia en un
lector de microplacas a una longitud de onda de
420-480 nm, siendo la lectura de longitud de onda de
referencia superior a 600 nm (generalmente las placas se leen en un
lector SUNRISE de Tecan a una longitud de onda de 450 nm y una
longitud de onda de referencia de 620 nm utilizando para el control
del equipo, la lectura y análisis de datos el software Magellan V
6.3).
Los valores de absorbancia superiores al blanco
más dos veces la desviación estándar de éste se consideran positivos
para la técnica.
En el próximo paso se resta el valor promedio
del blanco al resto de pocillos de la placa.
Se calculan los valores promedio de los pocillos
de cada columna (una vez restado el blanco de la técnica)
correspondiendo el valor promedio de cada columna el valor promedio
para el medio sin suplementar y el medio suplementado con FBS o
diferentes concentraciones de sobrenadante de fracción I
respectivamente.
Se considera que las células en medio sin
suplementar prácticamente no proliferan (0%) por lo que el valor de
absorbancia promedio en esta columna se resta a todos los valores
promedios de todas las columnas.
El valor de absorbancia del medio de referencia
(medio F12 de Ham suplementado con un 10% de FBS) se considera el
valor 100% de proliferación por lo que se dividen todos los valores
promedio del punto anterior (una vez se les ha restado el valor del
medio sin suplementar) por este valor para obtener el porcentaje de
proliferación respecto al medio de referencia.
Con los medios suplementados entre un 20 y un
50% de sobrenadante de fracción I como norma general se obtienen
porcentajes de proliferación similares al medio de referencia (medio
con 10% de Suero Fetal Bovino) o muy superiores (medio con 50% de
sobrenadante de fracción I).
A continuación se muestran los resultados de
proliferación en porcentaje.
Proliferación celular (%) CHO en
medio Ham's F12 suplementado con FBS o S/Fr
I
Ejemplo
5
Este ensayo se realiza de forma idéntica al
ensayo anterior, suplementando los medios con sobrenadante de
fracción II+III en lugar de sobrenadante de fracción I.
Respecto a los resultados de proliferación, a
partir de un 20% de sobrenadante de fracción II+III como suplemento
del medio, los resultados son similares a los obtenidos con el medio
de referencia (suplementado con 10% de FBS) y al emplear medios
suplementados con un 50% de sobrenadante de fracción II+III los
resultados de proliferación son superiores a los obtenidos con el
medio de referencia.
A continuación se muestran los resultados de
proliferación en porcentaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Proliferación celular (%) CHO en
medio Ham's F12 suplementado con FBS y S/Fr-II+III
(n=4)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Este ensayo se realiza de forma idéntica al
ensayo anterior suplementando los medios con sobrenadante de
fracción II+III irradiado con radiación gamma, a las dosis de 25 y
35 kGy (kilo Greys).
Respecto a los resultados de proliferación se
comprueba que no existen diferencias significativas entre los
resultados obtenidos con sobrenadante de fracción II+III sin
irradiar e irradiado con 25 y 35 kGy.
A continuación se muestran los resultados de
proliferación en porcentaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Proliferación celular (%) CHO en
medio Ham's F12 suplementado con FBS, S/Fr-II+III
o S/Fr-II+III gamma
irradiado
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Este ensayo se realiza de forma idéntica al
ensayo del ejemplo 1 utilizando como medio de cultivo base, medio
mínimo esencial modificado por Dulbecco (DMEM), y la línea Celular
Vero en lugar de la línea CHO.
La línea celular Vero corresponde a células de
riñón del mono verde africano, estas células presentan morfología
similar a fibroblastos (Fibroblast-like) y el modo
de crecimiento es adherente. El cultivo utilizado proviene de
"European Collection of Cell Cultures" ECACC con nº de catálogo
84113001.
Los resultados obtenidos en cuanto a la
proliferación muestran un resultado muy similar o superior al
obtenido con el medio de referencia a partir de un 30% de
suplementación con sobrenadante de fracción II+III gamma irradiado
El medio suplementado con un 20% de sobrenadante de fracción II+III
gamma irradiado proporciona unos resultados muy similares al medio
de referencia (medio base suplementado con 10% FBS).
A continuación se muestran los resultados de
proliferación en porcentaje.
Proliferación celular (%) Vero
en medio DMEM suplementado con FBS o S/Fr-II+III
gamma irradiado
(n=8)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se utiliza un frasco con un cultivo de células
CHO generalmente próximo a la confluencia.
Se decanta el medio de cultivo.
Se lava la monocapa celular con tampón fosfato
salino (PBS), a una temperatura entre 20 y 37ºC, aproximadamente se
utilizan 10 ml por cada 25 cm^{2} y se decanta.
Se añade una solución de tripsina 0,05%/EDTA
0,02% (la tripsina puede ser recombinante o de origen animal)
utilizando 2 ml por cada 25 cm^{2} de superficie cultivada. La
solución se extiende por toda la superficie de forma que quede como
una fina película y se decanta el exceso de solución.
El frasco se mantiene a una temperatura entre 20
y 37ºC hasta que las células se separen de la superficie.
Se añade medio de cultivo F12 de Ham
suplementado con un 50% de sobrenadante de fracción II+III (25 kGy)
entre 5 y 15 ml por frasco cultivado.
Se disocian las células agitando el frasco, o
pipeteando, y se realiza el recuento de células.
Se dispensa en nuevos frasco de cultivo
repartiendo en una proporción de 1:3 a 1:10.
El volumen total de medio F12 de Ham
suplementado con un 50% de sobrenadante de fracción II+III (25 kGy)
en los nuevos frascos de cultivo debe ser de 0,2 a 0,3 ml/cm^{2}
de superficie de cultivo.
El frasco se incuba en un incubador para cultivo
celular a 37ºC con alta humedad relativa y concentración de CO2
adecuada al medio de cultivo utilizado (en este caso un 8%).
El medio de cultivo se debe renovar entre uno y
3 días.
Después de diferentes pases utilizando el medio
de cultivo suplementado con un 50% de S/Fr-II+III
(25 kGy), se observa que el cultivo sigue viable y con capacidad de
crecimiento.
Se monitorizó la viabilidad, el tiempo de
duplicación de la población (TDP) y el nº total de células en una
superficie de 75 cm^{2} durante 16 pases consecutivos obteniéndose
una viabilidad promedio del 92,7 9%, un TDP promedio de 7 3,8 horas
y un número total de células promedio de 4.34 x 10º células/75
cm^{2}. Los resultados obtenidos con el medio de referencia
durante nueve pases consecutivos fueron una viabilidad promedio del
97,81%, un TDP promedio de 27,49 horas y un número total de células
promedio de 1.28 x 107 células/75 cm^{2}.
En una segunda experiencia se monitorizaron
estos mismos parámetros en células (CHO) cultivadas con un 50, 20 y
10% de S/Fr-II+III durante 3 a 7 pases. Para células
cultivadas en medio suplementado con 50% de
S/Fr-II+III se obtuvo: TDP 103.22, viabilidad 90.21%
y 6.14 x 10^{6} células en 75 cm^{2}. Para células cultivadas en
medio suplementado con 20% de S/Fr-II+III se obtuvo:
TDP 70.4 5, viabilidad 94.89%, 7.72 x 10^{6} células en 75
cm^{2}. Para células cultivadas en medio suplementado con 10% de
S/Fr-II+III se obtuvo: TDP 83.04, viabilidad 91.07%,
5.87 x 106 células en 75 cm^{2}.
\newpage
Ejemplo
9
El subcultivo se realiza igual que en el ejemplo
anterior pero utilizando medio F12 de Ham's suplementado con un 20%
de sobrenadante de fracción II+III (25 kGy) en lugar de un 50%.
Después de diferentes pases utilizando el medio
de cultivo suplementado con un 20% de S/Fr-II+III
(25 kGy), se observa que el cultivo sigue viable y con capacidad de
crecimiento.
En este caso se monitorizó la viabilidad, TDP y
número de células totales en 75 cm^{2} durante 6 pases
consecutivos siendo la viabilidad promedio del 97,13%, el TDP
promedio de 8 6,32 horas y un número total de células promedio de
5.96 x 10^{6} células/75 cm^{2}.
Ejemplo
10
Estabilidad del sobrenadante de la
Fr-II+III, medida como el porcentaje de
proliferación de células CHO, suplementadas con 50% de sobrenadante
de la Fr-II+III reconstituido en HAM's s F12,
respecto al medio suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino.
El sobrenadante de Fr-II+III se
mantiene estable (porcentajes de proliferación iguales (100+20)% o
superiores al SFB) al menos 168 días en forma liofilizada,
conservado en nevera (2-8ºC).
Este material, reconstituido en Medio cultivo
Hams F12, es estable al menos 113 días a temperatura menor o igual a
-18ºC (porcentajes de proliferación celular iguales o superiores a
tiempo cero).
Claims (9)
1. Medio para el cultivo de células de mamíferos
caracterizado porque comprende, además de los nutrientes
habituales de los medios de cultivos basales para cultivo de células
de mamíferos, el sobrenadante de la fracción I del método de Cohn o
el sobrenadante de la fracción II+III del método de Cohn.
2. Medio de cultivo, según la reivindicación 1,
caracterizado porque los sobrenadantes de las fracciones de
Cohn son obtenidos a partir de mezclas ("pooles") de, como
mínimo, 1000 donantes humanos.
3. Medio de cultivo, según la reivindicación 1 ó
2, caracterizado porque el sobrenadante de la fracción de
Cohn se encuentra en forma desecada.
4. Medio de cultivo, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
sobrenadante de la fracción de Cohn se encuentra en forma
congelada.
5. Procedimiento de preparación de un medio de
cultivo de células de mamíferos, según las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque la preparación del sobrenadante de la
fracción I o la fracción II+III del fraccionamiento del plasma
humano según el método de Cohn comprende las etapas de
- precipitación con etanol
- separación del sobrenadante
- congelación o desecación
y opcionalmente las etapas de
- dilución y/o
- diálisis o diafiltración y/o
- eliminación de agentes patógenos;
y la posterior adición del sobrenadante
preparado de esta manera al medio de cultivo basal.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento, según la reivindicación 5,
caracterizado porque el sobrenadante desecado se reconstituye
en el medio de cultivo basal, en agua destilada o desionizada y
apirógena, o en soluciones salinas o tampones habituales de cultivo
celular.
7. Procedimiento, según la reivindicación 5,
caracterizado porque el sobrenadante desecado se reconstituye
en el medio de cultivo basal.
8. Procedimiento, según las reivindicaciones 5 a
7, caracterizado porque el plasma humano es obtenido a partir
de mezclas ("pooles") de, como mínimo, 1000 donantes
humanos.
9. Uso del medio de cultivo que comprende el
sobrenadante de la fracción I del método de Cohn o el sobrenadante
de la fracción II+III del método de Cohn para cultivar células de
mamíferos.
Priority Applications (31)
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