JPS63185376A

JPS63185376A - コーン上清のフラクションｖから製造される細胞培養メディウム

Info

Publication number: JPS63185376A
Application number: JP62256121A
Authority: JP
Inventors: ハリー・エヌ・アントニアデス; ロバート・アール・ラファイコ
Original assignee: INSUCHI OBU MOL BAIOROJII Inc
Current assignee: INSUCHI OBU MOL BAIOROJII Inc
Priority date: 1986-10-10
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1988-07-30
Also published as: EP0264748A2; EP0264748A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野および従来の技術）本発明は哺乳類
細胞の培養に関する。

哺乳類細胞は、種々の目的で培養される。一つのますま
す重要な培養哺乳類細胞の用途は、治療用蛋白質、例え
ばプラスミドが含有する組換えＤＮＡによりコードされ
る組織プラスミノーゲンアクティベーターの製造である
。近年重要な製造用細胞の例は、マウスＣ１２７細胞お
よびチャイニーズハムスター卵巣細胞である。

治療用の目的で、哺乳類細胞が培養されるもう一つの例
は、ローゼンベルグら（１９８５）、Ｎｅｗ　　Ｅｎｇ
、　　Ｊ、　　Ｍｅｄ、　　　３↓３．　　１４８５に
記載された、癌治療方法である。この方法によれば、ヒ
トのリンパ球が血液から分離され、培養され、インター
ロイキン−２で処理されてリンパ球の増殖および活性化
が促され、これが患者に注入されて、活性化されたリン
パ球により腫瘍が攻撃される。

哺乳類細胞培養のもう一つつの重要な応用は、ハイプリ
ドーマを増殖させて、治療および診断に有用なモノクロ
ーナル抗体を製造することである。

ｌｌｌ１胞生産物またはｍ胞自身ががヒト患者に投与さ
れる用途における全ての哺乳類細胞培養方法において、
メディウムがウィルスおよびマイコプラズマを含まない
ことが重要である：これらは共に通常の滅菌用フィルタ
ーを通過することができ、特に肝炎およびエイズウィル
スは問題である。しかしながら、これらの微生物を除去
することは困難である。何故なら、殆どの哺乳類細胞は
成長に動物血清を必要とし、血清中の必要な蛋白質はウ
ィルスやマイコプラズマの殺滅に必要な加熱処理によっ
て、損なわれてしまうためである。

（発明が解決しようとする問題点および問題点を解決す
る手段）本発明者らは、血清の代わりに、コーン上清のフラクシ
ョン■として知られるヒト血漿分画（この分画は、安価
であり、ウィルス殺滅のための加熱条件である、６０℃
、２０時間に安定である）を使用することにより、非不
着性リンパ系細胞およびハイブリドーマ細胞の成長促進
および不着性細胞例えばヒト繊維芽細胞の維持に非常に
有効な、優れた、経済的哺乳類細胞培養メディウムが提
供されることを見出した。

上清のフラクション■は、コーンの血漿分画工程の第６
エ程で得られる分画である（コーンら、Ｊ、　　Ａｍ、
　　　Ｃｈｅｍ、　　　Ｓｏｃ、　　６８，４５９　（
１９４６）：および［ヒト血漿中のホルモン（Ｔ−ｆｏ
ｒｍｏｎｅｓ　　ｉｎ　　Ｈｕｍａｎ　　ＰＩａｓｍａ
）」、バリー　エヌ、　　アントニアデス＆！ｆｆｌ、
リトルブラウン・アンド・カンパニー、ボストンに記載
されている）。コーンの工程は、ビューロー・オブ・バ
イオロジカル・スタンダーズ（Ｂｕｒｅａｕ　　ｏｆ　
　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄｓ）が厳しく
規定する方法（政府の承認の下に時々若干の改良が加え
られる）により、許可を受けた実験室で行われる。哺乳
頻細胞の培養に有用であることが、本発明者らにより発
見された分画である上清フラクション■は、一般に捨て
られていた。本明細書において、上清フラクション■と
は、コーン分画工程で定義された分画自体またはヒト血
漿にたいして同様な方法を実施した結果として得られる
同様な分画を意味する。アントニアデスにより、記載さ
れたコーンの分画工程は、図に示す。アントニアデス以
来この方法には上ｔＩ７フラクシヨンＶの組成に影響し
ない若干の修正があり、今後もあると考えられる：例え
ば、コモンウェルス・オブ・マサチュセツツ（Ｃｏｍｍ
ｏｎｗｅａｌｔｈ　　ｏｆ　　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ
ｔｓ）により１９５５年に承認および採用された変法は
、次の文献に記載されているニアペンディクス（Ａｐｐ
ｅｎｄｉｘ）’１ａ　（１９８３年３月）［免疫血清グ
ロブリンおよび正常血清アルブミン（ヒト）の調製のた
めのヒト血漿の分画方法（Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　　ｆｏ
ｒｔｈｅ　　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　　ｏｆＨｕ
ｍａｎ　　Ｐｌａｓｍａ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　Ｐｒ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｅ　　ｓｅ
ｒｕｍ　　Ｇｌｏｂｕｌｉｎ　　ａｎｄ　　Ｎｏｒｍａ
ｌ　　Ｓｅｒｕｍ　　Ａｌｂｕｍｉｎ　（Ｈｕｍａｎ）
）」、コモンウェルス・オブ・マサチュセッッ・デパー
トメント・オプ・パブリック・ヘルス・バイオロジカル
・ラボラトリーズ（Ｃｏｍｍ。

ｎｗｅａｌｔｈ　　ｏｆ　　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔ
ｓ　　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｐｕｂｌｉｃ
　　Ｈｅａｌｔｈ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　１．ａ
ｂｏｒａｔｏｒ　１ｅｓ）。この変法は次のとおりであ
る。

皿Ｊ【エタノール　　　　　　　８％ｒ／２　　　　　　　　　　０．１４ｐＨ７，２＋０．２温度　　　　　　　　−２，５℃±０．２５℃蛋白質　
　　　　　　　　　５．１％＝し清−」−−スプク）鐙Ｇ４−１エタノール　２５％ｒ／２　　０．０９ｐＨ６，８５±０．１０　　研究目的に温度　　　−５
°Ｃ以下　　　　　　使用または蛋白質　　３．９％　
　　　　　　捨てられる上″“　ＩＩ　−１−ＩＩＩ　
　　　　　　７う」乞ン、二乙−ｎ＋ｍ□エタノール　
４０％ｒ”７２　　０．０９ｐＨ６，００±０．０５　　　方法９参照温度　　　−
５℃ 蛋白質　　２．８％フラクション　■ 研究目的に使用または廃棄１蛮−１間通プレフィルタ−クツ　（Ｃｕｎｏ）ＯＩＡクツ　６０３＋１／２％（ｗ／ｖ）濾過助剤エタノール　　　４０％ｒ／２　　　　０．１１ｐＨ４，８５±０．０５温度　　　　　−５，５℃±０．５％蛋白質　　　　　１．６％上布ヨ□コ（−□　　　　　フラｊゴ勺り乙−竺エタノ
ール　１０％（通常廃棄される）　　　ｒ／２　　０．０１ｐＨ４，
６±０．　１温度−２，５±０．５蛋白質　　３％１υ組クツ６０Ｓパツド＋１／４％（ｗ　／　ｖ　）助剤菫藍エタノール　　４０％Ｉ”７２　　　　０．０１ｐＨ６，５±０．５温度　　　　　−５”Ｃ以下蛋白質　　　　２．５％本発明の他の態様および利点は、以下に述べる本発明の
好ましい態様および特許請求の範囲から明らかであろう
。

本発明の細胞増殖メディウムを調製する第一ステップは
、コーン寒冷メタノール分画法６を用いで、ヒト血漿か
ら蛋白質に冨んだ上清フラクション■を単離することで
ある。一般に、このステップは水性エタノール分画用溶
液を使用する一連の分画ステップを含む；ここでは、エ
タノール濃度、イオン強度、ＰＨ１および蛋白質濃度を
変化させた、一連の溶液を用いる。各分画ステップは、
適当な分画溶液での処理および引き続く遠心分離を含み
、異なる血漿蛋白質分布を有する血漿画分を与える。各
分画ステップの各分画用溶液のエタノール濃度、イオン
強度、ＰＨ１および蛋白質濃度、並びに各分画ステップ
の温度は、分画蛋白質の安定性を最大にするように選択
されている。分画操作は、上清フラクション■が分離さ
れるまで続けられる。

上清フラクション■が分離されると、このフラクション
は、１回ないしそれ以上の限外減退ステップで濾過され
て、蛋白質が約３０ＫＤより大きい分子■を有し、蛋白
質が主としてアルブミン（約８０％）からなる分画を生
じる。この蛋白質フラクションを、次いで滅菌して細菌
および肝炎その他のウィルスを約６０°Ｃ５約１０〜２
０時間の熱処理で除去し、更に滅菌フィルターで濾過さ
れる。最終蛋白質濃度は、約４〜２０ｇ蛋白質７１００
ｍ１溶液である。

次に、滅菌蛋白質を慣用の血清不含有メディウム（細胞
の増殖に要求される電解質等の無機塩類、アミノ酸類、
およびビタミン類を含む、例えばＲＰＭ１１６４０、Ｒ
ＰＭＩ＋ＨＥＰＥＳ、ダルベツコ修正メディウム等）と
混合して、本発明の細胞増殖メディウムを製造する。完
全メディうム中の蛋白質濃度は約１０（１−２０００ｕ
ｇ／ｍｌ、好ましくは、約４００ｐｇ／ｍｌである。

得られたメディウムは、種々の哺乳類細胞を増殖させお
よび維持するために使用可能である。そのような細胞に
は、つぎのような一般的なものが含まれる：ｌ）リンパ
細胞：２）付着性細胞（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔ　　ｃｅｌＩｓ）；および３）ハイブリドー
マ細胞。慣用の細胞培養技術および条件が使用できる。

特定の細胞増殖メディウムの製造の例を次に説明する。

分前工程ヒト血漿にューヨーク血液センター）を−３°Ｃで次の
組成を有する分画溶液で処理した：ａ）　エタノール　
　　８％ｂ）　　イ、ｆ−ｙ濃度（１−／２）　　Ｏ，’１４ｃ
）ｐＨ７，２得られた混合物の蛋白質含量は５．１％であった。この
混合物を次いで分離しそして上清（上清■）を保存した
。上清ｌを一５°Ｃで次の組成を有する分画溶液で処理
した：ａ）　エタノール　　２５％ｂ）　イオン濃度（ｒ／２）　　０．０９ｃ）ｐＨ６，
９得られた混合物の蛋白質含量は３．０％であった。この
混合物を次いで分離して上清（上清■および■）を保存
した。

」１清■おＪ−び■を一５°Ｃで次の組成を有する分画
溶液で処理した：ａ）　エタノール　　１８％ｂ）　イオン濃度（ｒ／２）　　０．０９ｃ）ｐｌ−１
６，９得られた混合物の蛋白質含量は１．６％であった。この
混合物を次いで分離して上清（上清■−１）を保存した
。

上清ＴＶ−１を一５℃で次の組成を有する分画溶液で処
理した：ａ）　エタノール　　４０％ｂ）　イオン濃度（ｒ／２）　　　０．０９ｃ）ｐＨ５
，８得られた混合物の蛋白質含量は１．０％であった。この
混合物を次いで分離して上清（上清■−４）を保存した
。

上清ＴＶ−４を一５℃で次の組成を有する分画溶液で処
理した：ａ）　エタノール　　４０％ｂ）　イオン濃度（ｒ／２）　　０．１１ｃ）ｐＨ４，
８得られた混合物の蛋白質含量は０．８％であった。この
混合物を次いで分離して上清を廃棄し、蛋白質に冨んだ
分画（分画■）を保存した。

殆どの成分としてアルブミンを含有する分画■を一３°
Ｃで次の組成を有する分画溶液で処理した：ａ）　エタノール　　１０％ｂ）　イオン濃度（ｒ／２）　　　０．１ｃ）ｐｌ＋　
　　　　４．５得られた混合物の蛋白質含量は３％であった。

この混合物を次いで分離しそして上清を保存した；これ
が上清フラクション■に相当する。

濾−過工程上記の分画工程で得られた上清フラクション■を３０Ｋ
Ｄで分離する限外濾過膜を用いて濾過し、３０ＫＤより
小さい成分は全て廃棄した。３０ＫＤ上に残った成分を
、６０°Ｃで１０〜２０時間加熱して、肝炎ウィルスお
よびその他のウィルスを殺滅した。この熱処理を受けた
成分は、該処理の間に安定に保たれ、蛋白質のゲル化は
生じなかった。この熱処理した成分を、ひき続いて滅菌
ナイロン６６の０．１μｍメンブランフィルタ−で濾過
して細菌を除去した。この濾過により、蛋白質濃度が”
Ｉ　ｇ　／　１００　ｍ　ｌ溶液の蛋白質フラクション
が得られた。

□季■□己１１′メディウムの１Ｊ−Ｉｌ上記の蛋白質
フラクションにグルタミンおよび適当な抗体または抗生
物質を添加したちのｌｏｍｌを、ＲＰＭ１１６４０血清
不含有メディウム（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ、　　　Ｉｎｃ
、　−Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　　Ｍｄ、　　カタログ＃
１０１０２）９９０に添加して細胞増殖メディウムを調
製した。

このメディウム中の蛋白質の濃度は、４００μｇ蛋白質
／ｍｌメディウムであった。このメディウムを次の細胞
ラインを通常の技術で増殖させおよび維持するために使
用した：Ａ、　　リンパ系細胞（１１ＨＬ−６０（ＡＴＣＣＣＣＬ２４０）−ヒト前骨
髄球性白血病！２１　　ＣＣＲＦ−ＣＥＭ　（ＡＴＣＣＣＣＬ　１１
９）ヒ１〜ｅ性リンパ芽球性白血病！３１　　Ｕ−９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９３）ヒ
ト組織球性リンパ肚［４１Ｋ５６２（ＡＴＣＣｃｃｔ２４３）ヒト慢性骨髄
性白血病（５１ＭＯ−Ｂ　（ＡＴＣＣＣＣＬ２４５）ヒトヘアリ
ー細胞（ｈａ　ｉ　ｒ　ｙ−ｃ　ｅ　Ｉ　１）白血病変
種（６１ＥＢ　Ｋ　、ヒトＥＢ形質転換Ｂ細胞（７）ＮＡ
ＭＡＣＵＡ、ヒトＥＢ形質転換Ｂ細胞Ｂ、　　ハイブリ
ドーマ［１１２Ｂ４、マウスＴ−細胞（２１Ｔｔ（２，２、（Ｍ１２．４．１）Ｂ−細胞リン
パ腫　ｘ　　Ｂ６マウス肺臓（３１Ｔ）１２．５、Ｍ１２．．４．１　ｘ　Ｂ６マウ
ス　ＡＰ　Ｉ　ｉ　ｃ＜４１Ａ２０、Ｂ細胞リンパ腫　マウス＋５１　　Ａ　
Ｒ４０Ｂ　Ｃ４Ａ　Ｉ　　マウス（６）ＡＲ３２ＣＡＪ
ＩＣ３マウス（７）ＴＮＰ　１４　Ｚ　　マウスＣ６付着性細胞＋１）　　Ｖ　Ｅ　ＲＯ、アフリカミドリザル腎臓（２
１膠芽腫、Ａ１７２（３１１１１！ｌ肉腫、Ｔ１０８０（４）オストロソリーム（ｏｓｔｒｏｓｏｒｅａｍ）、
Ｕ２０Ｓ（５１ＷＩ−３８−正常ヒト肺（６１０Ｍ２７６７１１５−正常ヒト肺（７）ＨＦＳ−
１−正常ヒト包皮（ｍ維芽細胞）その他の態様は、特許
請求の範囲に記載されている。

【図面の簡単な説明】

図はコーンの分画法の工程図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）コーン上清のフラクションＶからなる細胞培養メ
ディウム。
（２）ウィルスが存在しない、特許請求の範囲第１項記
載の細胞培養メディウム。
（３）特許請求の範囲第１項記載のメディウムに細胞を
接触させることよりなる、哺乳類細胞の培養方法。