NO173144B

NO173144B - Fremgangsmaate til fremstilling av interferongamma

Info

Publication number: NO173144B
Application number: NO873120A
Authority: NO
Inventors: Masashi Kurimoto; Masakazu Mitsuhashi
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1986-07-25
Filing date: 1987-07-24
Publication date: 1993-07-26
Also published as: FR2615737A1; AU605492B2; EP0254593A3; EP0254593B1; NO873120D0; CA1340698C; DE3752184T2; FI873237L; EP0254593A2; DK388787D0; DE3752184D1; ES2115582T3; GB2194240B; GB2194240A; DK388787A; FR2615737B1; FI873237A0; GB8717610D0; FI873237A7; NO173144C

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår fremstilling og rensing av interferon-gamma.

Den foreliggende oppfinnelse angår særlig en fremgangsmåte til fremstilling av interferon-gamma, hvilken fremgangsmåte erkarakterisert vedat en etablert, human myelomonocytt, som er i stand til å produsere interferon-gamma tillates å produsere interferon-gamma og at det akkumulerte materiale isoleres; en fremgangsmåte til fremstilling av et monoklonalt anti-interferon-gamma-antistoff under anvendelse av det samme, og en anvendelse av det monoklonale antistoff til rensing av interferon-gamma.

Som beskrevet i Shigeyasu Kobayashi "Interferon" utgitt av

Kodansha Co., Ltd., Tokyo, Japan, 1975, D.A.J. Tyrell, "Interferon and its Clinical Potential", utgitt av William Heinemann Medical Books Ltd., London, 1976, og Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 21, nr. 4, 1976, s. 245-333, er interferon en betegnelse for glykoproteiner som er ekstracellulært induserbare i levedyktige celler når disse utsettes for påvirkningen av en interferon-induserer, f.eks. et virus, en bakterie, en protozon, en rickett-sia, en nukleinsyre, et endotoksin og et polysakkarid, og som har en ikke-spesifikk inhiberende virkning på virusvekst.

Etter oppdagelsen av interferoner har denne virkning gjort disse

til et potensielt profylaktisk og terapeutisk middel mot virussykdommer. Nylige undersøkelser har vist at interferoner oppviser en antionkogen virkning overfor virustumorer såvel som overfor ikke-virustumorer. På grunn av denne virkning stilles der store forventninger til utviklingen av farmasøytika som anvender interferoner.

Interferoner omfatter interferon-a (eller leukocyttinterferon), interferon-beta (eller fibroblastinterferon) og interferon-gamma (eller immuninterferon). Fremstilling av interferon-a og interferon-beta har funnet sted ved anvendelse av leukocytt- og fibro-blastceller. I den senere tid er farmasøytika, i hvilke disse interferoner er innkorporert, blitt kommersialisert.

De enkelte interferoner vil i det følgende bli forkortet il "IFN-alfa", "iFN-beta" og "IFN-gamma", iblant med forstavelsen "Hu", som angir human opprinnelse.

Til tross for at forskjellige fremgangsmåter til fremstilling av HuIFN-gamma er blitt foreslått, har ingen fremgangsmåter vært anvendt i industriell målestokk.

De fremgangsmåter ved hvilke der anvendes leukocytter eller T-lymfocytter som er avledet av humant periferisk blod, slik det er foreslått i f.eks. japansk patentutlegningsskrift nr. 58.891/82, 82.092/84, 70.099/85, 87.300/85, 139.700/85 og 149.600/85, internasjonal patentpublikasjon på japansk nr. 500,961/82 og 502.032/83 er i praktisk henseende ugunstige, da det er vanskelig å skaffe en stor mengde cellemateriale og HuIFN-produktiviteten fra disse celler er utilstrekkelig.

I japansk utlegningsskrift nr. 98.118/80 foreslås at en fremgangsmåte, ved hvilken en human celle som er oppnådd ved implan-tering av en etablert human celle i et ikke-humant varmblodig dyr eller ved plassering av cellen i et diffusjonskammer som er skaffet innenfor eller utenfor et ikke-humant varmblodig dyrs legeme og ved å tillate at cellen formerer seg, samtidig som cellen mottar næring i form av legemsvæske fra dyret, anvendes til fremstilling av HuIFN-gamma. Denne fremgangsmåte erkarakterisert veden rikelig tilgang på det humane cellemateriale.

Det har vist seg at HuIFN-gamma-produktiviteten ved fremgangsmåten varierer med typen av den anvendte humane celle. Det er således mulig å forbedre fremgangsmåten til fremstilling av HuIFN-gamma med vedvarende høye titre til at den også kan praktiseres i industriell målestokk.

Det er kjent at HuIFN-gamma har meget sterkere cytostatiske og antionkonogene virkninger enn HuIFN-alfa og HuIFN-beta. Det er også kjent at kombinasjonen med HuIFN-alfa og/eller HuIFN-beta øker de antivirale cytostatiske og antionkogene virkninger av HuIFN-gamma. Av disse grunner har utvikling av en fremgangsmåte til fremstilling av HuIFN-gamma i industriell målestokk vært meget etterspurt.

Det er således hensikten med den foreliggende oppfinnelse å utvikle en fremgangsmåte til fremstilling av HuIFN-gamma, som ikke har ovennevnte ulemper.

Denne hensikt oppnås ved en fremgangsmåte som er kjennetegnet ved det som fremgår av kravene.

I betraktning av det foregående, ble forskjellige etablerte humane celler, særlig etablerte humane lymfoblastoidceller, underkastet screening for deres HuIFN-gamma-produktivitet for å lette fremstillingen av HuIFN-gamma i industriell målestokk, og man undersøkte HuIFN-gammas potensielle virkning som profylaktisk og terapeutisk middel mot HuIFN-gamma-påvirkelige sykdommer.

Det har overraskende vist seg at etablerte humane myelomonocytter oppviser en høyere HuIFN-gamma-produktivitet enn andre lymfoblas-toide celler, og disse er velegnede som HuIFN-gamma-produserende celler, og videre at det oppnådde HuIFN-gamma er usedvanlig effektivt når det anvendes i profylaktiske og terapeutiske midler mot HuIFN-gamma-påvirkelige sykdommer.

Oppfinnelsen skal nå beskrives nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser HBL-38-celler ved fasekontrastmikro-skopi, og

fig. 2 viser resultatene av den karyotypiske analyse av HBL-38-celler.

Uttrykket "etablert human myelomonocytt" angir de myelomonocytter som ikke er gruppert i T- og B-celler, og som er identifiserbare ved kontroll av tilstedeværelsen av myelomonocytiske antigener ved antigen-antistoffreaksjon; f.eks. de myelomonocytter som er beskrevet i Iwanami Koza Men-eki Kagaku (The Iwanami Immunology Series), 3, "Immunity responsive cells", redigert av Tadamitsu Kishimoto og Takeshi Watanabe, s. 181-204, utgitt av Iwanami-shoten Publisher, Tokyo, Japan, 1986, og "Mammalian Cell Culture Technology", skrevet av Mikio Shikita og Isao Yamane, s. 141-162, utgitt av Soft Science Publications, Tokyo, Japan, 1985. Eksempler på slike myelomonocytter omfatter de av søkeren fremstilte HBL-38-celler, HL-60-celler, KG-1-celler, ML-1-celler, ML-2-celler, ML-3-celler, THP-1-celler og U-937-celler som beskrevet i de ovenfor angitte referanser samt CTV-1-celler som beskrevet i Japanese Journal of Cancer Research (Gann), 75, 1984, s. 660-664. Særlig foretrukne er HBL-38-celler ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse, idet de oppviser en høyere HuIFN-gamma-produktivitet. For å øke formeringshastigheten og HuIFN-gamma-produktiviteten kan det gen som koder for HuIFN-gamma-produksjonen introduseres i en lett subkultiverbar etablert human celle ved cellefusjon under anvendelse av f.eks. polyetenglykol eller Sendai-virus eller ved genetiske rekombinante teknikker under anvendelse av DNA-ligase, restriksjonsenzym (nuklease) og DNA-polymerase.

Fremgangsmåten til formering av humane myelomonocytter kan velges på passende måte. Eksempler på slike fremgangsmåter omfatter vevskulturfremgangsmåten, ved hvilken humane myelomonocytter inokuleres i et nærende dyrkningsmedium og dyrkes in vitro, og. fremgangsmåten ved hvilken humane myelomonocytter implanteres i et ikke-humant varmblodig dyr eller et diffusjonskammer som er plassert innenfor eller utenfor et ikke-humant varmblodig dyrs legeme og hvilke myelomonocytter deretter tillates å formere seg, idet de mottar dyrets nærende legemsvæske.

Først skal in vitro-formering forklares.

Under in vitro-formering kan et hvilket som helst nærende dyrkningsmedium anvendes så sant humane myelomonocytter formerer seg deri, f.eks. RPMI 1640-medium og Eagles minimalmedium. Disse dyrkningsmedier kan modifiseres ved tilsetning av vitaminer, mineraler, karbohydrater, aminosyrer og/eller pattedyrserum.

Dyrkningen kan være en énlags- eller en suspensjonsdyrkning. Temperaturen er 20-40°C, fortrinnsvis ca. 35-38°C, og podestoffet bør ha et celleantall pr. ml dyrkningsmedium som resulterer i en maksimal formering i løpet av en periode på ca. 1 uke, og som fortrinnsvis er 10^-10<?>celler/ml dyrkningsmedium. Dyrkningsmediet, som inneholder humane myelomonocytter, dyrkes under disse betingelser i 4-10 dager, og under dyrkningen kan dyrkningsmediet suksessivt fornyes, slik at tilstrekkelige mengder av næringsstoffer tilføres, og metabolitter, som er frigjort i dyrkningsmediet, vaskes ut og/eller fortynnes.

In vivo-formering skal nå forklares.

Humane myelomonocytter kan lett formeres ved bruk av in vivo-formeringen ved at de implanteres i et ikke-humant varmblodig dyr eller ved at de plasseres i et diffusjonskammer, i hvilket cellene kan tilføres nærende legemsvæske fra dyret og dyret fores på vanlig måte. In vivo-formerinqen resulterer i en større mengde HuIFN-gamma under anvendelse av intet eller langt mindre nærende dyrkningsmedium inneholdende dyrt serum, enn det som er tilfellet for in vitro-vevskultur.

In vivo-formerinqen har de ytterligere fordeler at mindre omhu er nødvendig under celleformeringen, at celleformeringen stabilise-res, og at HuIFN-gamma-produktiviteten pr. celle økes, særlig 2-10 ganger eller mer.

De ikke-humane varmblodige dyr som er anvendelige til in vivo-formering er de hvori humane myelomonocytter formerer seg, f.eks. fjærkre såsom kylling og due og pattedyr såsom hund, katt, ape, geit, gris, ku, hest, kanin, marsvin, rotte, hamster, mus og nakenmus.

Da implantasjon av humane myelomonocytter kan fremkalle en uønsket immunreaksjon hos dyret, er anvendelsen av et dyr som er så ungt som mulig, f.eks. et egg, et embryo eller et foster, eller et nyfødt dyr eller et speddyr, ønskelig for å redusere immunreaksjonen til det lavest mulige nivå.

For samme formål kan dyret bestråles med røntgen- eller gamma-stråler, ca. 200-600 rem, eller injiseres med et antiserum eller et immunundertrykkende stoff før implantasjonen.

Når nakenmus anvendes kan humane myelomonocytter implanteres uten forbehandling og lett formeres, og faren for å forårsake en uønsket immunreaksjon er mindre på grunn av at nakenmus fremkaller færre immunreaksjoner, selv som voksne.

Man kan stabilisere celleformeringen og/eller øke HuIFN-gamma-produksjonen ved suksessiv implantasjon under anvendelse av det samme eller forskjellige ikke-humane varmblodige dyr. Dette kan oppnås ved at man f.eks. først implanterer og formerer humane myelomonocytter i en hamster og deretter suksessivt implanterer den formerte celle i en nakenmus. En slik implantasjon kan utføres i ikke-humane varmblodige dyr av samme klasse eller orden, såvel som i dyr innenfor samme art eller slekt.

Humane myelomonocytter kan implanteres på et hvilket som helst sted i dyret når bare cellen formerer seg på det aktuelle sted, f.eks. i den allantoishulrommet kavitet eller intravenøst, intraperitonealt eller subkutant.

Alternativt kan humane myelomonocytter formeres ved at de anbringes i et tradisjonelt diffusjonskammer som kan være av varierende form og størrelse, og som er utstyrt med en hensiktsmessig innretning som utelukker dyrecellen, men som forsyner HBL-38 med den nærende legemsvæske fra et ikke-humant varmblodig dyr, hvilken innretning f.eks. kan være et membranfilter, et ultrafil-ter, eller en hulfiber med en porestørrelse på ca. 10~<7->10~<5>m, ved at kammeret innesluttes f.eks. intraperitonealt i et ikke-humant varmblodig dyr, og ved at cellen tillates å formere seg i kammeret, idet cellen tillates å motta nærende legemsvæske fra dyret.

Diffusjonskammeret kan f.eks. innsettes og plasseres på en slik måte på et dyr at næringsvæsken i diffusjonskammeret fritt kan sirkulere gjennom dette. Diffusjonskammeret kan innrettes på en slik måte at dyrkningen kan følges under celleformeringen gjennom kammerets vegg, og/eller at et diffusjonskammer med mellomrom kan skiftes ut med et nytt for å fortsette celleformeringen gjennom dyrets levetid uten at dyret avlives, samt for å øke celleproduk-sjonen pr. dyr i en utstrakt grad.

Da humane myelomonocytter aldri kommer i kontakt med dyrecellen og fremkaller langt færre uønskede immunreaksjoner ved fremgangsmåten, ved hvilken der anvendes et diffusjonskammer, kan et hvilket som helst ikke-humant varmblodig dyr fritt anvendes uten forbehandling med henblikk på å redusere immunreaksjonen, og den formerte celle kan lett isoleres.

Dyret fåres på vanlig måte, og det er ikke nødvendig å ta særlige hensyn selv etter implantasjonen. Maksimal celleformering oppnås vanligvis i løpet av 1-10 uker. Antallet oppnådde myelomonocytter er 10<7->10<12>celler pr. dyr eller mer. Nærmere bestemt forøkes de implanterte myelomonocytter 10^-10<?>ganger eller mer ifølge oppfinnelsen, hvilket er 10-10^ ganger mer enn det som oppnås ved poding og formering av myelomonocytter i in vitro næringsdyrkningsmedium. Dette er meget gunstig ved fremstilling av HuIFN-gamma.

En hvilken som helst induksjonsfremgangsmåte kan anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse, når bare den er i stand til å indusere HuIFN-gamma-produksjon i de humane myelomonocytter som oppnås på denne måte. De humane myelomonocytter kan utsettes for en IFN-gamma-induserers virkning i det dyr som anvendes til formeringen. F.eks. kan en human myelomonocytt som er formert i ascites i suspensjon eller en tumor, som f.eks. er dannet subkutant, utsettes direkte for en IFN-gamma-induserer, og det resulterende HuIFN-gamma isoleres fra ascites, serum og/eller tumoren, etterfulgt av rensing.

Den formerte humane myelomonocytt kan isoleres fra dyret og deretter utsettes for en IFN-gamma-induserer in vitro. F.eks. suspenderes en human myelomonocytt som er oppnådd ved isolering fra ascites eller ved ekstråksjon og disaggregasjon av den f.eks. subkutant dannede tumormasse i et næringsdyrkningsmedium, hvis temperatur holdes på 20-40°C, for oppnåelse av en celletetthet på 10<5->10<8>celler/ml, og utsettes for IFN-gamma-indusereren, hvilket etterfølges av isolering og rensing av det resulterende HuIFN-gamma.

Når et diffusjonskammer anvendes, kan humane myelomonocytter utsettes for en IFN-gamma-induserer i et diffusjonskammer eller

etter isolering derfra.

Primingsmetoden, ved hvilken der anvendes HuIFN, og/eller superinduksjonsfremgangsmåten, ved hvilken der anvendes antimeta-bolitter, kan anvendes til ytterligere økning av produksjonen av HuIFN-gamma.

Produksjonen av HuIFN-gamma pr. dyr kan ytterligere økes ved anvendelse av en eller flere av de følgende fremgangsmåter: 1 ) En fremgangsmåte, ved hvilken humane myelomonocytter utsettes for en IFN-gamma-induserer i dyret, isoleres fra visse steder på dyret eller fra hele dets. legeme og utsettes for IFN-gamma-indusereren in vitro, 2) en fremgangsmåte, ved hvilken humane myelomonocytter gjentatte ganger utsettes for en IFN-gamma-induserer, og 3) en fremgangsmåte, ved hvilken diffusjonskammeret, som er innesluttet i eller forbundet med dyret, skiftes ut med et nytt kammer med mellomrom.

De IFN-gamma-induserere som er anvendelige i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse, er vanligvis mitogener, f.eks. fytohemagglutinin, concanavalin A, kermesbærmitogen, lipopolysakkarid, endotoksin, polysakkarid og bakterier.

Antigener virker som IFN-gamma-induserere på sensibiliserte celler. IFN-gamma-indusererne anvendes vanligvis i en konsentrasjon på ca. 0,001 ug/ml til 10 mg/ml. Kombinasjonen av IFN-alfa-induserere, f.eks. virus, nukleinsyre og polynukleotid, kan føre til en øket produksjon av HuIFN-gamma og/eller induksjon av en simultan produksjon av HuIFN-alfa.

Det oppnådde HuIFN-gamma kan isoleres ved bruk av én eller flere tradisjonelle rense- og separasjonsfremgangsmåter, f.eks. utsaltning, dialyse, filtrering, sentrifugering, konsentrering og lyofilisering. Når ytterligere rensing er påkrevet, anvendes én eller flere andre tradisjonelle fremgangsmåter i kombinasjon, f.eks. adsorpsjon og desorpsjon med ioneveksling, gelfiltrering, isoelektrisk punkt-fraksjonering, elektroforese, ioneveksler-kromatografi, HPLC (høytrykksvæskekromatografi), kolonnekromato-grafi, og affinitetskromatografi. Kromatografi, ved hvilken der anvendes monoklonale antistoffer, fører til HuIFN-gamma av høyeste renhet.

Det HuIFN-gamma som således oppnås, kan med fordel anvendes til forebyggelse og behandling av HuIFN-gamma-påvirkelige sykdommer.

Med uttrykket "HuIFN-gamma-påvirkelige sykdommer" skal forstås de sykdommer som kan forebygges eller behandles med HuIFN-gamma, f.eks. virussykdommer såsom konjunktivitt, herpes-forårsaket keratitt, influensa, rubella, serumhepatitt og ervervet immun-defektsyndrom (AIDS); og ikke-virussykdommer som omfatter ondartede tumorer såsom colonkarsinom, lungekarsinom, leverkar-sinom og osteosarkom, og immunopatier, herunder atopisk allergi, myoastenia, collagenosis, perniciøs anemi, artikulær rheumatisme og systemisk lupus erythematosus.

Middelet ifølge oppfinnelsen kan fremstilles i en for den endelige anvendelse hensiktsmessig form, f.eks. i form av nebula, collyrium, munnvann (collutory), en flytende medisin såsom injeksjon, en pastaformet medisin såsom salve, og faste medisin-preparater såsom pulvere, granuler og tabletter.

HuIFN-gamma-innholdet ligger som regel i området 1-10.000.000 enheter/g. Effektiviteten kan forhøyes ved at man kombinerer én eller flere lymfokiner såsom HuIFN-alfa, HuIFN-beta, tumor-nekrosefaktor (TNF), lymfotoksin, interleukin 2 og B-cellediffe-rensierende faktor, eller naturlige eller syntetiske kjemoterapeutika.

HuIFN-gamma1 et kan anvendes i kombinasjon med adjuvantia, fyllstoffer og/eller stabilisatorer. Det således utvunnede middel er velegnet som f.eks. antiviralt middel, antionkogent middel, forsterker til antionkogene kjemoterapeutika, tumormetastase-depressor, palindromsupressor og immunregulator.

Aktiviteten av HuIFN ble bestemt ved anvendelse av plaquereduk-sjonsmetoden, ved hvilken der anvendes FL-celler som stammer fra human amnion, slik det er beskrevet i Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 20, nr. 6, 1975, s. 616-643.

Aktiviteten av HuIFN-gamma ble bestemt etter nøytralisering av henholdsvis HuIFN-alfa og HuIFN-beta med anti-HuIFN-alfa- og anti-HuIFN-beta-antistoffer.

Hemagglutinasjonstiteren ble bestemt i henhold til fremgangsmåten beskrevet hos J.E. Salk, The Journal of Immunology, 49, 1944, s. 87-98.

HBL-38-celler, som er skaffet av oppfinnerne, skal nå beskrives.

Etter å ha vært dyrket i et in vitro-næringsdyrkningsmedium, begynte en leukocytt fra en akutt myeloleukemipasient (55 år) å formere seg på den 21. dag. Gjentatte subkulturer av leukocytten ble dyrket, og det lyktes til slutt å oppnå en stabil formering av én av subkulturene. Denne subkultur ble betegnet "HBL-38".

1) Formering

Fordoblingstiden i RPMI 1640-medium, som var supplert med 10 volumprosent føtalt kalveserum, var ca. 30 timer.

2) Morfologi

HBL-38-celler hadde en tendens til å sette seg på kolbens innvendige bunn under dyrkningen, men festelsen var svak, og

cellene kunne lett frigjøres. Skjønt celleansamlinger ble dannet under dyrkningen, var disse ikke faste og kunne lett disaggrege-res. Resultatet av fasekontrastmikroskopundersøkelse er angitt på fig. 1. Cellen var regelmessig avrundet med et tykkelse på ca. 15 nm. Giemsa-farving viste at kjernen noen steder var omgitt av'en uregelmessig lobasjon eller en karyolobisme.

3) Kromosomantall

Kromosomanalyse ble utført med celler i eksponentiell vekst. Frekvensfordelingen av kromosomantallet er vist i tabell I. Observasjon av 150 kromosomer viste at kromosomantallet var i et lavt diploid område, og den oftest forekommende fordeling var 45 (53 kromosomer). 42 celler hadde et kromosomantall på 44.

4) Karyotypisk analyse

Resultatene av den karyotypiske analyse er angitt på fig. 2. Kjønnskromosomet var XY, og dette er i overensstemmelse med kjønnskromosomet fra cellekilden. fit motstykke til kromosom 17 og hele kromosom 18 manglet. Det ble funnet at et kromosom var innsatt henholdsvis i en kort arm (p) på kromosom 5 og en lang arm (q) på kromosom 12. Et ikke-identifiserbart markørkromosom og et kromatid ble observert.

5) Celleoverflatekarakter

Identifisering av HBL-38-celler ble utført ved hjelp av forskjellige celleoverflateantistoffer, og resultatene er angitt i tabell II. Analyse under anvendelse av geit-erytrocytter (E), erytrocytt-amboceptorer (EA) og erytrocytt-amboceptorkomplementer (EAC) viste at EA dannet 10 prosent rosetter, hvilket de andre ikke gjorde. Deteksjon av overflateimmunglobuliner (Smlg) under anvendelse av seks anti-humane geit-antistoffer viste at HBL-38-cellen var negativ overfor alle antistoffene. Screening av overflatemarkører under anvendelse av monoklonale antistoffer viste at 3AIfMCS-2, B3/25 og MY-9 oppviste en relativt høy positiv reaksjon, mens derimot NU-T2, Leu-5, Leu-4, A-50, BA-2, OKI-1, NU-N1, B2, MO-1 og MO-2 var negative.

6) Screening for EB-virus-bestemt kjerneantigen (EB virus determined nuclear antigen) (EBNA)

HBL-38-celler ble på et tidlig tidspunkt i fremstillingen screenet for EBNA flere ganger. Resultatene viste at HBL-38-celler var EBNA-negative.

7) Kolonidannelse på et blødt agarmedium HBL-38-celler ble undersøkt med henblikk på kolonidannelse på et 0,3 prosent agarmedium inneholdende en kolonistimulerende faktor (CSF). Omvendt mikroskopanalyse på den 14. dag viste at en

kolonidannende myeloidcelle var tilstede. Frekvensen var 1-2 prosent. Ingen kolonier ble dannet når der ikke ble tilsatt CSF.

HBL-38-celler ble gruppert under myelomonocytter på basis av de ovenfor angitte data.

Det nedenstående eksperiment 1 viser fremstilling av HuIFN-gamma.

Eksperiment 1

Sammenligning av HuIFN-gamma-produktivitet fra etablerte humane lymfoblastoidceller

Eksperiment 1-1

Produksjon av HuIFN av in vitro-dyrkede celler •

En etablert human lymfoblastoidcelle ble inokulert i RPMI 1640-medium (pH 7,2), som var anriket med 20 prosent føtalt kalveserum, og blandingen ble dyrket ved 37°C på vanlig måte. Den resulterende kultur ble vasket med serumfritt RPMI 1640-medium (pH 7,2) og deretter suspendert i nytt fremstilt dyrkningsmedium av samme type for dannelse av en suspensjon inneholdende 1x10^ celler/ml.

Deretter ble ca. 10ug/ml satt til den resulterende cellesuspensjon, og blandingen ble holdt på 37°C i 2 dager for å indusere HuIFN-produksjonen. Kulturen ble sentrifugert, og den oppnådde supernatant ble undersøkt for samlede HuIFN- og HuIFN-gamma-aktiviteter.

Resultatene er angitt i tabell III.

Som det kan ses fra disse resultater, ble det funnet at humane myelomonocytter produserte HuIFN-gamma, og at produksjonen var høyere enn den som ble oppnådd med de etablerte humane lymfoblastoidceller. HBL-38-celler hadde en overordentlig høy HuIFN-gamma-produktivitet.

Eksperiment 1 - 2

Produksjon av HuIFN av in vivo-dannede celler

Nyfødte hamstere ble injisert med et antiserum som var fremstilt i kaniner på vanlig måte for å svekke en mulig immunreaksjon, implantert subkutant med en etablert human myelomonocytt og foret i 3 uker på vanlig måte. De tumormasser som ble dannet i hamster-nes legemer ble ekstrahert og disaggregert ved suspensjon i saltvann inneholdende trypsin.

En suspensjon av de oppnådde celler ble behandlet og undersøkt for samlede HuIFN- og HuIFN-gamma-aktiviteter som i eksperiment 1-1 .

Resultatene er angitt i tabell IV.

NB: Verdiene angir HuIFN-aktivitet; verdiene i parentes angir HuIFN-gamma-aktivitet.

De data som er angitt i tabell III og IV bekrefter at etablerte humane myelomonocytter, særlig HBL-38-celler, oppviser en høyere HuIFN-gamma-produktivitet når de er formert in vivo enn når de er formert in vitro.

De følgende eksempler viser fremstillingen av HuIFN-gamma.

Eksempel A- 1

HBL-38-celler ble inokulert i RPMI 1 640-medium (pH 7,2) som var anriket med 10 volumprosent føtalt kalveserum for oppnåelse av en celletetthet på 5 x 10<5>celler/ml.

Den resulterende blanding ble dyrket ved 37°C, idet dyrkningsmediet periodisk ble fornyet. Deretter ble cellene vasket og suspendert i et nylig fremstilt dyrkningsmedium av samme type for oppnåelse av en celletetthet på 2 x 10*> celler/ml. Cellesuspensjonen ble tilsatt ca. 10ug/ml lipopolysakkarid, og blandingen ble holdt på 37°C i 2 dager for å indusere produksjonen av HuIFN. Den resulterende kultur ble sentrifugert, og et supernatant inneholdende ca. 5.100 enheter HuIFN-gamma pr. ml ble oppnådd. ;Eksempel A-2 ;Nyfødte hamstere ble injisert med et antiserum som var fremstilt i en kanin på vanlig måte for å svekke mulige immunreaksjoner, og ble subkutant implantert med HBL-38-celler og foret i 4 uker på vanlig måte. Tumormassene som ble dannet i dyrene, ca. 20 g hver, ble ekstrahert og disaggregert ved suspensjon i saltvann inneholdende kollagenase. ;Etter vask med Eagles essensielle minimalmedium ble cellene fortynnet med et nylig fremstilt dyrkningsmedium av samme type for oppnåelse av en celletetthet på ca. 2 x 10<*>>celler/ml, og 200 ug/ml fytohemagglutinin sammen med 5 g/ml lipid A ble tilsatt. Blandingen ble holdt på 37°C i 2 dager for å indusere produksjonen av HuIFN. Den resulterende kultur ble sentrifugert og en supernatant, som inneholdt ca. 93.000 enheter HuIFN-gamma, ble oppnådd. Således ble der oppnådd ca. 183.000.000 enheter HuIFN-gamma pr. hamster.

Eksempel A- 3

Nyfødte rotter fikk intravenøst implantert KG-1-celler og ble foret i fire uker på vanlig måte.

Tumormassene som ble dannet i dyrene, ca. 20 g hver, ble ekstrahert og disaggregert på tilsvarende måte som i eksempel A-2 for oppnåelse av en cellesuspensjon. Ca. 100 hemagglutinasjons-titre/ml Sendai-virus og ca. 5 ug/ml lipopolysakkarid ble tilsatt cellesuspensjonen, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 2 dager for å indusere produksjonen av HuIFN. Den resulterende kultur ble sentrifugert, og en supernatant inneholdende ca. 49.000 enheter HuIFN-gamma pr. ml ble oppnådd. HuIFN-gamma-utbyttet var ca.

97.000.000 enheter pr. rotte.

Eksempel A-4

CTV-1-celler ble suspendert i saltvann i sylindriske ca. 10 ml plastdiffusjonskamre med membranfiltre med porestørrelser på ca. 0,5 jun, og diffusjonskamrene ble anbragt intraperitonealt i voksne rotter.

Rottene ble foret i 4 uker på vanlig måte, og kamrene ble fjernet.

De oppformerte celler ble behandlet på tilsvarende måte som i eksempel A-1 for å indusere produksjonen av HuIFN. Den resulterende kultur ble sentrifugert, og en supernatant inneholdende ca. 41.000 enheter HuIFN-gamma pr. ml ble oppnådd. Utbyttet var ca. 78.000.000 enheter pr. rotte.

Eksempel A- 5

Embryoniske egg som var blitt forvarmet ved 37°C i 1 uke, ble implantert med HBL-38-celler og deretter inkubert ved den ovenfor angitte temperatur i ytterligere 1 uke. De oppformerte celler ble isolert ved å ødelegge eggene og ble behandlet på tilsvarende måte som i eksempel A-2 for å indusere produksjonen av HuIFN. Den resulterende kultur ble sentrifugert, og en supernatant inneholdende ca. 36.000 enheter HuIFN-gamma pr. ml ble oppnådd. Utbyttet var ca. 60.000.000 enheter pr. 10 egg.

De følgende eksempler B viser fremstilling av monoklonale anti-HuIFN-gamma-antistoffer og rensing av HuIFN-gamma under anvendelse av disse.

Eksempel B- 1 ( 1)

Fremstilling av delvis renset HuIFN-gamma

En væske inneholdende HuIFN-gamma, som var fremstilt ved bruk av den i eksempel A-2 angitte fremgangsmåte, ble dialysert med 0,01 M Tris-fosfatbuffer (pH 8,5) i 20 timer og deretter membranfUt-rert. Filtratet ble satt på en antistoffkolonne som bandt anti-HuIFN-alfa- og anti-HuIFN-beta-antistoffer, og den ikke-adsor- berte fraksjon ble samlet opp. Fraksjonen ble kromatofokusert for oppnåelse av en fraksjon med antiviral aktivitet, hvilken fraksjon deretter ble konsentrert og lyofilisert for oppnåelse av et pulver som inneholdt HuIFN-gamma med et aktivitetsutbytte på ca. 30 prosent. Den spesifikke aktivitet av pulveret var ca. 10^ enheter/mg protein.

Eksempel B- 1 ( 2)

Fremstilling av monoklonale anti-HuIFN-gamma-antistoffer

Delvis renset HuIFN-gamma, som var oppnådd ved den i eksempel B-1 (1) angitte fremgangsmåte, ble oppløst i saltvann til en konsentrasjon på ca. 0,05 vektprosent, og den resulterende oppløsning ble tilsatt et ekvivalent volum av Freunds komplette adjuvans. Mus ble intravenøst injisert med 0,2 ml alikvoter av blandingen og fikk den 7. dag etter den første injeksjon en forsterkende injeksjon på tilsvarende måte som ovenfor for å fremkalle immunisering. Miltene, i hvilke produksjonen av anti-HuIFN-gamma var blitt indusert i de antistoffproduserende celler, ble isolert fra musene, hakket i småstykker og disaggregert, hvoretter miltcellene ble suspendert i 37 °C varmt serumfritt Eagles essensielle minimalmedium (pH 7,2) inneholdende 50 vekt/volumprosent polyetenglykol 1000 sammen med P3-X63-Ag8-celler, som er musemyelomaceller skaffet fra Flow Laboratories Inc., Maryland, USA, for oppnåelse av respektive celletettheter på 10^ celler/ml. Etter 5 minutters henstand ble cellesuspensjonen fortynnet 20 ganger i et nylig fremstilt dyrkningsmedium av samme type og hybridcellene som var istand til å vokse på det hypoksantin-, aminopterin- og thyminholdige medium ble isolert og klonet i overensstemmelse med fremgangsmåten angitt av R.L. Davidson og P.S. Gerald,.Somatic Cell Genetics, 2, nr. 2. 1976, s. 175-176, for oppnåelse av en hybridcelle som var istand til å produsere anti-HuIFN-gamma-antistoff. Hybridcellen ble deretter intraperitonealt implantert i mus i en dosering på ca. 10^ celler pr. mus, disse ble foret i 2 uker og avlivet. Legemsvæskene, som ble oppsamlet fra musene, såsom ascites og blod, ble sentrifugert for oppnåelse av en supernatant, til hvilken ammoniumsulfat deretter ble satt for oppnåelse av 30-50 prosents metning. Det resulterende bunnfall ble dialysert og affinitetskromatografert på en immobilisert HuIFN-gamma-gel som var dannet ved reaksjon mellom HuIFN-gamma fremstilt ved fremgangsmåten angitt i eksempel B-1 (1 ) og BrCN-aktivert Sepharose ved værelsestemperatur. Den oppnådde anti-HuIFN-gamma-antistoffraksjon ble dialysert, konsentrert og lyofilisert til et pulver.

Produktet nøytraliserte immunologisk et HuIFN-gamma som stammet fra humane myelomonocytter.

Stabiliteten av det monoklonale antistoff i vandig oppløsning ble bestemt ved måling av den resterende nøytraliserende aktivitet etter 30 minutters inkubasjon ved pH 7,2. Resultatet var at det monoklonale antistoff beholdt over 80 prosent aktivitet ved inkubasjon ved 60 °C, men mistet over 90 prosent aktivitet ved inkubasjon ved 70°C. Etter 16 timers inkubasjon ved 4°C viste det monoklonale antistoff seg å være stabilt ved en pH-verdi i området 4,0-11,0, men mistet over 90 prosent aktivitet ved pH 2,0.

Ytterligere undersøkelser viste at det monoklonale antistoff var ustabilt i nærvær av 2-merkaptoetanol og forårsaket en antigen-antistoffreaksjon, særlig med anti-museimmunglobulin M-antistoff.

Dette bekreftet at det monoklonale antistoff tilhørte klassen immunglobulin M-antistoff.

Eksempel B- 1( 3)

Fremstilling av særdeles rent HuIFN-gamma

Delvis renset HuIFN-gamma som var fremstilt ved bruk av fremgangsmåten i eksempel B-1(1), ble kromatografert på en kolonne bestående av en immobilisert monoklonal antistoffgel som var fremstilt ved bruk av fremgangsmåten i eksempel B-1(2), og den fraksjon som oppviste HuIFN-gamma-aktivitet ble samlet opp, dialysert, konsentrert og lyofilisert for oppnåelse av et fast stoff som inneholdt HuIFN-gamma med et utbytte på ca. 80 prosent. Produktet var et ytterst rent HuIFN-gamma, og den spesifikke aktivitet var ca. 1,5 x 10<?>enheter/mg protein.

Eksempel B-2( 1)

Fremstilling av delvis renset HuIFN-gamma

En oppløsning inneholdende HuIFN-gamma som var fremstilt ved bruk av fremgangsmåten i eksempel A-3 ble delvis renset i henhold til fremgangsmåten i eksempel B-1(1) for oppnåelse av et HuIFN-gamma-preparat med en spesifikk aktivitet på ca. 10^ enheter/mg protein med et utbytte på ca. 20 prosent.

Eksempel B- 2( 2)

Fremstilling av et monoklonalt anti-HuIFN-gamma-antistoff

Miltceller ble skaffet ved å immunisere mus på en tilsvarende måte som i eksempel B-1(2) med unntagelse av at det delvis rensede HuIFN-gamma, som ble oppnådd i eksempel B-2(1), ble anvendt som antigen.

Miltcellene ble sammen med P3-NS-1/1-Ag4-1-celler, som er musemyelomaceller, skaffet fra Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan, suspendert i en saltoppløsning inneholdende 140 mM NaCl, 54 mM KC1, 1 mM NaH2P04og 2 mM CaCl2for oppnåelse av respektive celletettheter på 10<4>celler/ml. En nylig fremstilt saltoppløsning av samme sammensetning som ovenfor, og som ytterligere inneholdt UV-bestrålt inaktivert Sendai-virus, ble tilsatt cellesuspensjonen under isavkjølte betingelser, og blandingen ble etter 5 minutter fortynnet ca. 20 ganger i 37°C varmt RPMI 1640-medium. En hybridcelle, som var istand til å produsere anti-HuIFN-gamma-antistoff ble klonet ved å behandle den fortynnede blanding på tilsvarende måte som angitt i eksempel B-1(2).

I 7 dager gamle hamstere, hvis immunreaksjon var blitt svekket på vanlig måte, ble de oppnådde hybridceller implantert intraperitonealt i en dosering på ca. 10<?>celler pr. hamster, og hamstrene ble behandlet på tilsvarende måte som angitt i eksempel B-1(2) for oppnåelse av et monoklonalt antistoff.

Produktet nøytraliserte immunologisk et HuIFN-gamma som var fremstilt på tilsvarende måte som det som var fremstilt i

eksempel B-1(2).

Stabiliteten av det monoklonale antistoff i vandig oppløsning ble bestemt ved måling av den resterende nøytraliserende aktivitet etter 30 minutters inkubasjon ved pH 7,2. Resultatet var at det monoklonale antistoff beholdt over 80 prosent aktivitet når det ble inkubert ved 60 °C, men mistet over 90 prosent aktivitet når det ble inkubert ved 70°C. Etter 16 timers inkubasjon ved 4°C ble det funnet at det monoklonale antistoff var stabilt ved en pH-verdi innenfor området 2,0-11,0.

Ytterligere undersøkelser viste at det monoklonale antistoff var stabilt i nærvær av 2-merkaptoetanol, og at det forårsaket en antigen-antistoffreaksjon, særlig med anti-museimmunglobulin G-antistoff.

Dette bekreftet at det monoklonale antistoff hørte til klassen av immunglobulin G-antistoffer.

Eksempel B- 2( 3)

Fremstilling av ytterst rent HuIFN-gamma

Delvis renset HuIFN-gamma, som ble fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel B-2(1), ble kromatografert på en kolonne bestående av et immobilisert monoklonalt antistoff som var fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel B-2(2), og den fraksjon som inneholdt HuIFN-gamma ble isolert, dialysert og konsentrert for oppnåelse av en væske inneholdende HuIFN-gamma med et aktivitetsutbytte på ca. 85 prosent. Produktet var et ytterst renst HuIFN-gamma, og den spesifikke aktivitet var ca. 1,5 x 10^ enheter/mg protein.

Eksempel B- 3

Et filtrat som ble oppnådd ved dialyse av en HuIFN-gamma-holdig supernatant, som var oppnådd ved fremgangsmåten i eksempel A-1, ble dialysert mot saltvann inneholdende 0,01 M fosfatbuffer

(pH 7,2) i 15 timer, og den resulterende supernatant ble membranfiltert og renset på en antistoffkolonne i overensstemmelse med fremgangsmåten i eksempel B-1(3), konsentrert og lyofilisert for oppnåelse av et fast stoff inneholdende HuIFN-gamma med et

aktivitetsutbytte på ca. 75 prosent. Produktet var et særdeles rent HuIFN-gamma, og den spesifikke aktivitet var ca. 1,5 x 10<?>enheter/mg protein.

Eksempel B-4

HuIFN-gamma-supernatant, som var blitt oppnådd ved fremgangsmåten i eksempel A-4, ble dialysert og membranfiltert i overensstemmelse med fremgangsmåten i eksempel B-3. Det resulterende filtrat ble renset på en antistoffkolonne og konsentrert på tilsvarende måte som i eksempel B-2(3) for oppnåelse av en oppløsning inneholdende HuIFN-gamma med et aktivitetsutbytte på ca. 70 prosent. Produktet var et særdeles rent HuIFN-gamma, og den spesifikke aktivitet var ca. 1,5 x 10<?>enheter/mg protein.

Eksempel B- 5

HuIFN-gamma-holdig supernatant, som var blitt oppnådd ved fremgangsmåten i eksempel A-5, ble dialysert og membranfiltert i overensstemmelse med fremgangsmåten i eksempel B-3. Det resulterende filtrat ble renset på en antistoffkolonne, konsentrert og lyofilisert på tilsvarende måte som i eksempel B-1 (3) for oppnåelse av et fast stoff inneholdende HuIFN-gamma med et aktivitetsutbytte på ca. 70 prosent. Produktet var et særdeles rent HuIFN-gamma, og den spesifikke aktivitet var ca. 1,5 x 10<?>emheter/mg protein.

De følgende eksempler belyser anvendeligheten av produktet fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til kravene.

Det følgende eksperiment 2 viser forebyggelse og behandling av HuIFN-gamma-påvirkelige sykdommer under anvendelse av HuIFN-gamma .

Eksperiment 2

Profylaktiske og terapeutiske virkninger av HuIFN-gamma overfor HuIFN-gamma-påvirkelige sykdommer

Eksperiment 2- 1

Virusinhiberende aktivitet in vitro

HuIFN-gamma, som var fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel B-1(3), ble i et podestoff på 0,1, 1,0 eller 10,0 enheter tilsatt en primært monolagskultur av human føtal lunge i en 6 cm's petriskål, og kulturen ble inkubert i en inkubator med 5 prosent CO2ved 37°C i 20 timer. Enten varicella-zoster-virus eller human cytomegalovirus ble tilsatt den resulterende kultur i en dosering som muliggjorde dannelsen av 100 plaques i fravær av HuIFN-gamma.

Den virusinhiberende aktivitet ble bestemt ut fra den avtagende

mengde plaques.

Reduksjon i plaqueantall

hvor A betegner det plaqueantall som oppnås uten tilsetning av HuIFN-gamma, og B betegner plaqueantallet når HuIFN-gamma er tilsatt.

Resultatene er angitt i tabell V.

Disse resultater bekrefter at det HuIFN-gamma som ble anvendt i forbindelse med oppfinnelsen var ekstremt inhiberende overfor veksten av patogene vira.

Eksperiment 2- 2

Behandling av ondartede tumorer med HuIFN-gamma

Eksperiment 2- 2( 1)

Cytostatisk aktivitet av HuIFN-gamma overfor ondartede tumorer in vitro

HuIFN-gamma, som var fremstilt ved bruk av fremgangsmåten i eksempel B-1(3), ble tilsatt en alikvot RPMI 1640-medium som var anriket med 15 volumprosent føtalt kalveserum, til en sluttkon-sentrasjon på 5, 50 og 500 enheter/ml, og blandingen ble inokulert med ondartede humane tumorceller til en konsentrasjon på 5 x 10<5>celler/ml. Den resulterende blanding ble inkubert i en inkubator med 5 prosent CO2ved 37°C i 3 dager. Som kontroll ble den samme mengde HuIFN-gamma, som tidligere var inaktivert ved inkubasjon ved 100"C i 30 minutter, tilsatt nylig fremstilt dyrkningsmedium >av samme type som ovenfor, og blandingen ble behandlet på tilsvarende måte som ovenfor. Etter dyrkning ble de levedyktige celler farget med nøytralrødt i overensstemmelse med den fremgangsmåte som er beskrevet i Applied Microbiology, 22, nr. 4, 1971, s. 671-677. Deretter ble nøytralrødt eluert med syrnet etanol, og antallet levedyktige celler ble bestemt ut fra eluatets absorbans ved 540 nm.

Den cytostatiske effektivitet (%) ble bestemt fra følgende ligning:

Cytostatisk effektivitet

hvor A betegner antallet av levedyktige celler i testsystemet, og B betegner antall levedyktige celler i kontrollsystemet.

Resultatene er angitt i tabell VI.

NB: KB-celler er av human oral epidermoid-karsinoma-opprinnelse;

HEp-2-celler er av human strupehode epidermoid-karsinoma-opprinnelse,

KATO-II-celler er av human mage-karsinoma-opprinnelse; og P-4788 er av human tykktarm-karsinoma-opprinnelse.

Disse resultater bekrefter at det HuIFN-gamma . som anvendes ifølge oppfinnelsen oppviser en ekstrem inhiberende virkning ved konsentrasjoner på 5-500 enheter/ml overfor veksten av ondartede tumorceller såsom KB-celler, HEp-2-celler, KATO-II-celler og P-4788-celler.

Eksperiment 2- 2( 2)

Forsterkning av andre lymfokiners cytostatiske aktivitet ved bruk av HuIFN-gamma in vitro

Lymfokinene som ble anvendt i dette eksperiment, var HuIFN-gamma (5 enheter/ml), HuIFN-alfa (50 enheter/ml) og TNF (10 enheter/ml). Disse lymfokiner er naturlige produkter fra lymfoblastcel-ler.

Disse lymfokiner ble testet for cytostatisk effektivitet (%) i overensstemmelse med den fremgangsmåte som ble anvendt i eksperiment2-2(1). Resultatene er angitt i tabell VII.

Disse resultater bekrefter bekrefter tydelig at kombinasjonen med HuIFN-gamma i meget høy grad øker andre lymfokiners cytostatiske virkning overfor ondartede tumorer, og at denne forøkelse er synergistisk.

Eksperiment 2- 2( 3)

Forsterkning av kjemoterapeutikas cytostatiske aktivitet overfor ondartede.tumorer med HuIFN-gamma in vitro

1 ml alikvoter av et næringsdyrkningsmedium som er fremstilt i overensstemmelse med den fremgangsmåte som er angitt i eksperiment 2-2(1), ble inokulert med 10^ humane ondartede tumorceller, og blandingen ble dyrket i 1 dag. 50 enheter HuIFN-gamma, som var fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel B-1(3), og/eller 0,1 ml saltvann inneholdende et kjemoterapeutikum ble tilsatt den resulterende kultur, som deretter ble dyrket ved 37°C i 2 dager. Som kontroll ble der anvendt saltvann, hvor HuIFN-gamma og kjemoterapeutikum ikke var tilsatt. Etter dyrkningen ble den cytostatiske effektivitet (%) bestemt i overensstemmelse med fremgangsmåten i eksperiment 2-2(1). Konsentrasjonen av kjemoterapeutika var som følger: nimustinhydroklorid (ACNU), 1,0x10~<6>g/ml; fluoruracil (5-FU), 1,5x10~<8>g/ml; doksorubicin (ADM), 1,0x10-<10>g/ml; mitomycin C (MMC), 2,5x10-<9>g/ml; og vincristin-

sulfat (VCR), 1,5x10-<10>g/ml.

f

Resultatene er angitt i tabell VIII.

Disse resultater bekrefter klart at HuIFN-gamma i ekstrem grad øker den cytostatiske aktivitet av kjemoterapeutika overfor ondartede tumorer og at økningen er aritmetisk eller synergistisk.

Eksperiment 2- 2( 4)

Cytostatisk aktivitet overfor ondartede tumorer in vivo

BALB/c nakenmus ble i deres dorsale område implantert med et segment av humant brystcancervev. Fra det tidspunkt hvor tumorene hadde vokst til ca. 200 mm^, ble nakenmusene én gang daglig injisert med ett eller flere HuIFN-gamma som var fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel B-1(3), et lymfokin som stammer fra humane lymfoblastoidceller og/eller et kjemoterapeutikum i saltvannsoppløsning, hvilken injeksjon fant sted over en periode på 20 dager.

Deretter ble nakenmusene avlivet, og tumorene ble veid.

Som kontroll ble saltvann injisert på tilsvarende måte som ovenfor. Resultatene er angitt i tabell IX.

Disse resultater bekrefter klart at HuIFN-gamma i ekstrem grad inhiberer veksten av ondartede tumorer in vivo. Den cytostatiske aktivitet økte meget sterkt ved kombinasjon av én eller flere lymfokiner eller kjemoterapeutika for oppvisning av en sterk antionkogen virkning.

Eksperiment 2- 2( 5) Akutt toksisitet

Den akutte toksisitet av et HuIFN-gamma-preparat som var fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel B-1(3), ble undersøkt under anvendelse av 20 dager gamle mus.

Resultatet bekrefter at toksisiteten av HuIFN-gamma er ekstremt lav, dvs. 10<9>enheter eller høyere uttrykt som LD50, når det injiseres intraperitonealt.

De følgende eksempler C viser fremstillingen av et farmasøytisk preparat, hvilket som virksom bestanddel inneholder det HuIFN-gamma som er fremstilt ved bruk av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel C- 1

Flytende medisin

En flytende medisin ble fremstilt ved oppløsning av HuIFN-gamma som var fremstilt ved bruk av fremgangsmåten i eksempel B-1(3), i saltvann til en konsentrasjon på 500 enheter/ml.

Produktet i form av nebula, collyrium, collunarium eller colluto-rium er egnet som profylaktisk og terapeutisk middel mot virussykdommer såsom epidemisk konjunktivitt og influensa.

Eksempel C- 2

Inj eksj on

En bruksklar injeksjonsform ble fremstilt ved oppløsning av 100.000 enheter/ml HuIFN-gamma som var fremstilt ved bruk av fremgangsmåten i eksempel B-2(3), i saltvann, sterilfiltrering, fordeling og lyofilisering av 2 ml alikvoter av filtratet i ampuller, som deretter ble forseglet.

Produktet kan på tilsvarende måte som i eksempel C-1 med fordel anvendes som profylaktisk og terapeutisk middel mot virussykdommer .

Produktet er velegnet som profylaktisk og terapeutisk middel mot ondartede tumorer såsom brystcancer, lungekarsinoma, leverkarsi- norna og leukemi; og immunopatier såsom atopisk allergi, perniciøs anemi, artikulær reumatisme og systemisk lupus erytematosus.

Produktet er velegnet som forsterker for kjemoterapeutika såsom melfalan, metotreksat og ADM.

Eksempel C- 3

Inj eksj on

Til saltvann ble der tilsatt 10.000 enheter/ml HuIFN-gamma som var fremstilt ved fremgangsmåten ifølge eksempel B-3, 100.000 enheter/ml naturlig lymfoblastoid-HuIFN-alfa og 100.000 enheter/ml naturlig lymfoblastoid-TNF, og blandingen ble sterilfiltrert og lyofilisert på tilsvarende måte som i eksempel C-2 for oppnåelse av en fast injeksjonsform.

Produktet er velegnet til profylaktiske og terapeutiske midler mot virussykdommer.

Produktet er også velegnet til profylaktiske og terapeutiske midler mot ondartede tumorer såsom brystcancer, lungekarsinoma, leverkarsinoma, magecancer og leukemi; og immunopatier såsom atopisk allergi, kollagenasis, artikulær reumatisme og systemisk lupus erytematosus.

Produktet kan med fordel anvendes til å øke den cytostatiske aktivitet av kjemoterapeutika såsom tegafur, MMC og VCR.

Eksempel C- 4

Salve

HuIFN-gamma som var fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel B-1(3), og et naturlig lymfoblastoid-HuIFN-gamma ble knadd sammen med en liten mengde flytende parafin på vanlig måte, og hvitt vaselin ble tilsatt blandingen for oppnåelse av HuIFN-gamma- og HuIFN-alfa-konsentrasjoner på henholdsvis 50.000 enheter/g og 500.000 enheter/g.

Produktet er egnet til profylaktiske og terapeutiske midler mot hudsykdommer såsom herpes, hudkreft og atopisk dermatitt.

Eksempel C- 5

Enterisk overtrukket tablett

HuIFN-gamma som er fremstilt ved bruk av fremgangsmåten i

eksempel B-5, og et naturlig lymfoblastoid-TNF ble inkorporert i en tablett som ble fremstilt på tradisjonell måte under anven-

delse av stivelse og maltose som vehikel, i en mengde på 10.000 enheter pr. tablett (200 mg). De fremstilte tabletter ble deretter overtrukket med metylcelluloseftalat.

Produktet kan med fordel anvendes i profylaktiske og terapeutiske midler mot virussykdommer såsom virussykdommer i tynn- og tykktarmen, samt mot ondartede tumorer såsom tykktarmskreft og leverkreft og immunopatier såsom atopisk allergi, perniciøs anemi, artikulær reumatisme og systemisk lupus erytematosus.

Produktet kan med fordel anvendes til å øke den antionkogene aktivitet av kjemoterapeutika såsom ADM, 5-FU og MMC.

Som forklart i detaljer i det foregående, skaffer tradisjonelt anvendte fremgangsmåter en utilstrekkelig HuIFN-gamma-produktivitet, og dette gjør fremstilling av HuIFN-gamma i industriell målestokk meget vanskelig. Basert på den erkjennelse at etablerte humane myelomonocytter oppviser en overordentlig høy HuIFN-gamma-produktivitet skaffer den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte til fremstilling av HuIFN-gamma, som med fordel kan utføres i industriell målestokk.

Den foreliggende oppfinnelse skaffer også en fremgangsmåte til fremstilling av monoklonale antistoffer under anvendelse av det således utvunnede HuIFN-gamma, og skaffer en rensing under anvendelse av antistoffet og et profylaktisk og terapeutisk middel mot HuIFN-gamma-påvirkelige sykdommer. Middelet er meget effektivt overfor virussykdommer, ondartede tumorer og immunopatier, hvis behandling har vært ansett for meget vanskelig.

Den foreliggende oppfinnelse er en betydelig oppfinnelse innenfor området.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et strukturelt nytt interferon-gamma, karakterisert vedat den omfatter de følgende trinn: en etablert human myelomonocytt som er proliferert in vitro og som er i stand til å produsere interferon-gamma, utsettes for virkningen av en alminnelig kjent interferon-gamma induserer , f.eks. et mitogen, for å produsere interferon-gamma, og det akkumulerte materiale utvinnes.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat den etablerte humane myelomonocytt velges fra gruppen bestående av HBL-38-celler, HL-60-celler, KG-l-celler, ML-l-celler, ML-2-celler, ML-3-celler, THP-l-celler, U-937-celler og CTV-l-celler.

3. Fremgangsmåte til fremstilling av monoklonalt anti-interferon-gamma-antistoff som spesifikt nøytraliserer interferon-gamma ifølge kravene 1 og 2,karakterisert vedat den omfatter de følgende trinn: et ikke-humant varmblodig dyr tillates å danne en antistoffproduserende celle med det interferon-gamma ifølge kravene 1 og 2 som antigen, den antistoffproduserende celle utvinnes fra dyret, den antistoffproduserende celle fusjoneres med en myeloma- celle, en hybrideelle, som er i stand til å produsere anti- interferon-gamma-antistoff, selekteres, og hybridcellen dyrkes for fremstilling av monoklonalt antistoff, som er spesifikt overfor interferon-gamma.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert vedat det monoklonale antistoff tilhører klassen immunglobulin G eller M.

5. Anvendelse av et monoklonalt antistoff fremstilt ifølge kravene 3 og 4 til kolonnekromatografisk rensing av interferon-gamma produsert av en human myelomonocytt.