JP3467515B2 - インターフェロン活性の測定法 - Google Patents
インターフェロン活性の測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、インターフェロンの生
物学的活性測定法に関するものである。さらに詳しく
は、インターフェロンを含む検体を細胞に作用させ、誘
導されるタンパク質を定量することを特徴とする、イン
ターフェロンの生物学的活性測定法に関するものであ
る。 【０００２】 【従来の技術】インターフェロンはウイルス抑制因子と
してアイザックス（Isaacs) とリンデマン（Lindemann)
によって発見されたタンパク質であり（A. Isaacs, J.
Lindenmann; Proc. Roy. Soc. Ser. B., 147, 258, 195
7)、現在α、β、γ、ωの４種類に分類されている。こ
れらインターフェロンには、抗ウイルス作用以外に、細
胞増殖抑制作用、細胞表在抗原発現の増強といった抗腫
瘍作用、マクロファージの貪食能亢進、ナチュラルキラ
ー活性の増強といった免疫系への応答等、様々な作用が
あることが知られている。 【０００３】インターフェロンは、その作用から抗ウイ
ルス剤、抗腫瘍剤としての薬効が期待され、現在Ｂ型お
よびＣ型肝炎、急性骨髄性白血病、多発性骨髄種、悪性
黒色腫等の治療薬として幅広く使用されている。また、
インターフェロンの病態への関与はＩ型糖尿病をはじめ
として古くから知られており、近年血液細胞のインター
フェロン産生量がこれら病態を知る上で重要な情報とな
ることが示されている（M. Kita ら, J. Clin, Lab, An
al, 5, 238-241, 1991、中川修一ら, 日本泌尿器科学会
雑誌81, 262-267, 1990 ）。 【０００４】これらのことから、インターフェロンの臨
床応用を進めるため、あるいは病態を把握するためには
インターフェロンの活性を測定することが非常に重要で
あることが伺える。事実、インターフェロンの活性測定
は現在、様々な目的で頻繁に行われている。 【０００５】インターフェロンの作用メカニズムについ
ては、インターフェロンが持つ複雑な作用機作のため、
一部しか解明されていないのが現状であるが、インター
フェロンの作用により２’→５’オリゴアデニル酸合成
酵素、ホスホジエステラーゼ等のタンパク質が誘導さ
れ、その結果抗ウイルス作用が生じることが判明してい
る。このようなインターフェロンと２’→５’オリゴア
デニル酸合成酵素との関係に基づき、ヒトあるいは動物
にインターフェロンを投与した後の２’→５’オリゴア
デニル酸合成酵素の推移を測定することによりインター
フェロンの作用を確認した例が報告されている。しか
し、インターフェロンの作用により細胞中に誘導される
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素量が、添加したイ
ンターフェロン活性と一定の関係にあること、言い換え
れば、２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素量を定量す
れば、添加したインターフェロン活性が定量できること
については何ら報告されていなかった。 【０００６】ところで、インターフェロン活性を測定す
る方法としては、生物学的測定法、免疫学的測定法が広
く知られている。生物学的測定法は、ＦＬ細胞、ＷＩＳ
Ｈ細胞等のインターフェロンに感受性の高い細胞に対し
てインターフェロンを含む検体を作用させた後に、これ
ら細胞に感染能を持つシンドビスウイルス（Sindbis vi
rus ）、水ほう性口内炎ウイルス（Vesicular stomatit
is virus、ＶＳＶ）等を一定量添加し、感染させる。こ
の際、インターフェロンにより誘導されたウイルス抵抗
性の程度を測定することにより、インターフェロン活性
を測定する方法であり、原理的には間接測定法と呼ばれ
るものである。ウイルス抵抗性の程度の測定とはウイル
スの増殖の抑制を指標に行われるものであり、ウイルス
プラーク数の測定、ウイルス収量の直接定量、ウイルス
核酸の合成量の測定が用いられ、ウイルス増殖能を５０
％抑制するサンプルの希釈倍率からインターフェロン力
価が算出される。また、ウイルス増殖の結果として細胞
を破壊させる細胞変性効果（ＣＰＥ）の測定法も用いら
れ、細胞のＣＰＥを５０％阻止するサンプルの希釈倍率
からインターフェロン力価が算出される。これらの測定
値を同時に測定したインターフェロン標準品により校正
することによって、国際標準単位のインターフェロン力
価（ＩＵ）が求められる（小林茂保ら, 免疫生化学実験
法（続生化学実験講座５）, 日本生化学会編, P245, 東
京化学同人, 東京, (1986)）。現在、これらの測定法の
中でＣＰＥを指標にした生物学的測定法が最も広く利用
されている。 【０００７】これらの方法は、インターフェロンが細胞
上のインターフェロンレセプターと結合した結果生じる
細胞の抗ウイルス状態を測定するものであるため、生物
学的活性を持つインターフェロン量（インターフェロン
活性）のみを測定する方法であるといえる。しかしこれ
らの測定法は操作が煩雑であり、しかも検出限界はアッ
セイ系によって異なるが、ＣＰＥを指標とする方法を用
いた場合、理論的に６ＩＵ／ｍｌ程度（山崎修道、Phar
ma Medica 、４（９）、１１１−１１８（１９８６））
であり、充分な検出感度が得られているとは言えない状
況にあった。 【０００８】一方、免疫学的測定法は、インターフェロ
ンに対する抗体を用いて定量を行う方法であり、定量手
段により放射免疫測定法および酵素免疫測定法があり、
抗体の組み合わせ法により競合法および非競合法の分類
がある。たとえば、非競合法による酵素免疫測定法とし
ては、固相に抗インターフェロン抗体を固定化し、イン
ターフェロンを特異的に結合させた後、酵素標識抗イン
ターフェロン抗体を結合させて、酵素反応により検出す
る方法（石古博昭ら, 医学のあゆみ, 192(3),182, (198
4) ）、酵素標識抗インターフェロン抗体のかわりに抗
インターフェロン抗体を用い、更に酵素標識抗抗体を結
合させる方法（Ora Horovitzら, Immunoenzymatic Tech
niques, S. Auramens ら編集, P193, Elsevier Science
Publishers B. V. (1983)）等が知られている。 【０００９】これらの方法は、インターフェロンに対す
る特異抗体に結合したインターフェロン量を定量するも
のである。本方法における検出限界は２ＩＵ／ｍｌ（バ
イオソースインターナショナル社、ヒトインターフェロ
ン−α エライザキット）程度であり、生物学的測定法
と同程度にインターフェロンを検出する方法であると言
えるが、生物学的活性を有するインターフェロンのみな
らず活性を有しないインターフェロンをも測定されてし
まうため、インターフェロンの活性測定を行うには不適
切な方法である。これらのことから、インターフェロン
の生物学的活性を簡易により高感度に検出する方法が望
まれていた。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、インターフェロンの生物学的活性を従来法より
簡易に、しかも高感度に測定する方法を提供することで
ある。 【００１１】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、生物学的
に微量のインターフェロン活性を測定する方法について
鋭意検討を行った結果、インターフェロンの作用により
誘導されたタンパク質量は、添加したインターフェロン
の活性と一定の関係にあることを発見した。この事実を
基に、検体中のインターフェロン活性は、細胞中に誘導
されたタンパク質を定量することにより測定可能である
ことを見い出し、本発明を完成するに到った。 【００１２】すなわち、本発明の要旨は、インターフェ
ロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロ
ン−ωを含む検体を、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ−９３７細
胞、Ｈ９細胞及びＦＬ細胞からなる群より選ばれる一つ
の細胞に作用させ、誘導される２’→５’オリゴアデニ
ル酸合成酵素を定量することを特徴とするインターフェ
ロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロ
ン−ω活性の測定法、に関する。 【００１３】本発明の特徴は、検体を細胞に作用させた
結果、検体中のインターフェロンにより誘導されるタン
パク質量を定量し、種々の既知活性量のインターフェロ
ンを添加した細胞中に誘導される当該タンパク質量から
作成した検量線からインターフェロン活性を算出すると
ころにある。以下、本発明について詳細に説明する。 【００１４】本発明が測定対象とするインターフェロン
は、哺乳類のインターフェロンであれば特に制限される
ものではなく、ヒト、サル、ウシ、ネコ、イヌ、ウサ
ギ、ラット、マウス等のインターフェロンが例示でき
る。インターフェロンのタイプについても特に制限はさ
れないが、インターフェロンレセプタータイプＩ（臨床
医１９（６）１５４０−１５４４（１９９３）、治療学
２７（１０）１１５９−１１６３（１９９３）を参照の
こと）と結合するものが好ましく、具体的にはインター
フェロン−α、−βおよび−ωが例示できる。またイン
ターフェロンは、天然の原料（たとえば白血球、線維芽
細胞、リンパ球など）、あるいは天然由来の原料（たと
えばセルラインなど）から誘導されたインターフェロン
でも、組み換えＤＮＡ技術により調製されたインターフ
ェロンでもよく、特に制限されるものではない。また、
インターフェロンレセプタータイプＩと結合するもので
あれば、一部のアミノ酸の置換、削除、挿入等を行った
インターフェロンの改変体であってもよい。 【００１５】測定に使用する細胞は、測定対象のインタ
ーフェロンに対し感受性を有する細胞であれば特に制限
されるものではない。即ち、インターフェロンが細胞表
面のインターフェロンレセプターと結合することによ
り、所定のタンパク質が誘導され、インターフェロンの
活性に依存して誘導される量が決定されるような細胞で
あればよい。具体的には、測定対象のインターフェロン
を産生する種の白血球、単球、リンパ球、線維芽細胞、
及び上皮細胞等、並びに、単球、リンパ球、線維芽細
胞、上皮細胞等の各種細胞に由来する株細胞が例示さ
れ、なかでも単球、リンパ球、線維芽細胞、上皮細胞等
に由来する株細胞がより好ましい。 【００１６】例えば、ヒトインターフェロン−αを測定
対象とした場合、ヒト細胞が用いられ、具体的にはヒト
の白血球、単球、リンパ球、線維芽細胞、及び上皮細胞
等、並びにヒトの単球、リンパ球、線維芽細胞、上皮細
胞等に由来する株細胞が挙げられる。上記のうち、好ま
しくは株細胞が用いられ、例えばＴＨＰ−１細胞（ヒト
単球株細胞；国立衛生試験所、がん細胞リサーチバンク
（ＪＣＲＢ）より入手可能）、Ｕ−９３７細胞（組織球
性リンパ腫株細胞；ＪＣＲＢより入手可能）、Ｈ９細胞
（リンパ球系株細胞；（株）林原生物化学研究所藤崎細
胞センターより入手可能）、ＦＬ細胞（大日本製薬
（株）より入手可能）、ＷＩＳＨ細胞（羊膜由来株細
胞）が挙げられ、特に好ましくはＴＨＰ−１細胞または
Ｕ−９３７細胞が例示できる。また、例えばマウス、ウ
サギ、サル、ウシのインターフェロンを測定対象とした
場合、具体的には、それぞれＬ９２９細胞（マウス）、
ＲＫ−１３細胞（ウサギ）、Ｖｅｒｏ細胞（サル）、Ｍ
ＤＢＫ細胞（ウシ）が例示できる。これらの細胞株は、
国立衛生試験所等の研究機関の細胞バンク、または大日
本製薬（株）等の取り扱い業者から入手できる。 【００１７】定量対象となるタンパク質は、インターフ
ェロンにより誘導されるタンパク質であれば制限される
ものではなく、具体的には酵素が例示される。より具体
的には２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素、ホスホジ
エステラーゼが例示できる。当該タンパク質の定量法は
特に制限されるものではなく、例えば、免疫化学的方
法、液体クロマトグラフィーによる定量法、酵素反応生
成物の直接定量による酵素活性測定法等が挙げられる。
市販の測定キット等も当該タンパク質の定量に使用でき
る。また、測定により得られる数値は、絶対量、タンパ
ク量、酵素活性のいずれでも良い。 【００１８】本発明によるインターフェロン活性の測定
は、例えば以下に述べる方法を用いることができる。ま
ず、測定に使用する細胞を適切な細胞数ずつ容器に添加
する。このとき、当該細胞は適当な培地や緩衝液中に浮
遊させた状態で容器に添加してもよい。培地としては適
当量の胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地、
イーグル最少必須培地等が、緩衝液としてはリン酸塩緩
衝液等が挙げられる。使用する容器は特に制限されるも
のではなく、例えば、蓋付き試験管、細胞培養ディッシ
ュ、マイクロプレート、９６穴細胞培養プレート等が挙
げられる。添加する細胞数は特に制限されるものではな
く、例えば５×１０3 〜１×１０6 個／容器、好ましく
は１×１０4 〜５×１０5 個／容器である。次に、当該
容器に標品または検体を添加する。検体は細胞毒性を示
す成分を含まないものであれば特に制限されるものでは
なく、例えば血清、血漿、緩衝液、培地、細胞培養上清
等が挙げられる。具体的には、イーグル最少必須培地
（日水製薬（株））（１０％胎児ウシ血清を含有するも
の及び含有しないもの）、ヒト血清、血漿；ウサギ、ラ
ット等の動物の血清、血漿、臓器ホモジネート；ナマル
バ細胞等の細胞培養上清；リン酸塩緩衝液、トリスグリ
シン緩衝液等が挙げられる。検体中のインターフェロン
が高濃度であると推測できる場合は、測定用の容器に添
加する前に、インターフェロンを含有しない血清等によ
り検体を希釈することが好ましい。 【００１９】検体を添加した後、一定時間細胞をインキ
ュベートすることにより、検体中のインターフェロンを
細胞に作用させる。インキュベート時間はインターフェ
ロンの作用が発現するに充分な時間であれば特に制限さ
れるものではない。具体的には３時間〜４８時間が例示
でき、好ましくは６時間〜２４時間が、さらに好ましく
は１２時間〜２４時間が例示できる。インキュベート時
の温度は、測定に用いる細胞を細胞培養する条件と同一
でよい。インキュベートの後、誘導されたタンパク質を
定量可能な状態にするために細胞の破砕処理等を行う。
細胞処理の方法は特に制限されるものではなく、例えば
超音波、凍結融解、浸透圧により、又は機械的に細胞を
破砕する方法、有機溶媒、界面活性剤等により細胞膜の
透過性を上げる方法等が例示できる。 【００２０】続いて、当該タンパク質を定量する。定量
方法は公知の方法を用いることができる。例えば、２’
→５’オリゴアデニル酸合成酵素を定量するには、２−
５Ａキット’栄研’（栄研化学（株）製）を用いること
ができる。また、ホスホジエステラーゼを定量するに
は、ラッセルらの方法（J.Biol.Chem., ２４８、１３３
４（１９７３））を用いることができる。当該タンパク
質の定量の前に精製を行って、混在物を除去してもよ
く、定量に差し障りがなければ、細胞を処理したその状
態のまま、混在物を除去することなく定量してもよい。
このようにして、検体中のインターフェロンにより誘導
されたタンパク質量を定量し、種々の既知活性量のイン
ターフェロンを添加した細胞中に誘導された当該タンパ
ク質量から作成した検量線からインターフェロン活性を
測定することができる。 【００２１】 【実施例】以下、本発明を実施例及び比較例によって説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 【００２２】実施例１ 種々の既知活性量のインターフェロン−α（センダイウ
イルス誘発ヒトリンパ芽球インターフェロン、住友製薬
（株）；なお、以下の実施例等において、インターフェ
ロン−αとしてはこのものを用いた。）を含有する１０
％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地（日水製薬
（株））の検体２００μｌを丸底キャップ付きチューブ
（Falcon２０８３；以下、チューブと略記する。）に入
れ、さらにＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）；な
お、以下の実施例等において、ＲＰＭＩ１６４０培地と
してはこのものを用いた。）２００μｌに浮遊させたＴ
ＨＰ−１細胞（１．６×１０5 個；なお、以下の実施例
等において、ＴＨＰ−１細胞としてはこのものを用い
た。）を添加した。３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時
間インキュベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕
した。得られた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合
成酵素活性を２−５Ａキット’栄研’（栄研化学（株）
製）を用い、キット添付の方法によって測定した。イー
グル最少必須培地の検体の測定値から、インターフェロ
ンを含まない当該培地の測定値（以下、ブランク値と略
記する。）を差し引いた値を図１に示す。図１におい
て、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はインターフェロン
−α濃度を示す。 【００２３】測定に使用する細胞（本実施例ではＴＨＰ
−１細胞）の細胞数は、トリパンブルー染色により生細
胞を染色し、計数することによって求めた。以下の実施
例等においても、細胞数を同様にして求めた。 【００２４】図１より、インターフェロン−αの濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があり、この関係は再現性よく得られることが
示された。したがって、２’→５’オリゴアデニル酸合
成酵素活性の測定によるインターフェロン−αの活性測
定が可能であることが分かった。また、本測定法の検出
限界は、図１より０．０５〜０．１ＩＵ／ｍｌ程度であ
り、ウイルス抵抗性の程度を指標とした従来の生物学的
測定法（検出限界：６ＩＵ／ｍｌ程度）の約６０倍〜１
２０倍と非常に高感度であることが分かった。 【００２５】実施例２ 種々の既知量のインターフェロン−αを含有するヒト血
清検体２００μｌをチューブに入れ、ＲＰＭＩ１６４０
培地２００μｌに浮遊させたＴＨＰ−１細胞（１．６×
１０5 個）をこのチューブに添加した。３７℃、５％Ｃ
Ｏ2 気相下で２０時間インキュベートした後、凍結融解
法により細胞を粉砕した。得られた溶液中の２’→５’
オリゴアデニル酸合成酵素活性を実施例１と同様の方法
で測定した。検体の測定値からブランク値を差し引いた
値を図２中の□に示す。実施例１の結果を図２中の■に
示す。図２において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸は
インターフェロン−α濃度を示す。 【００２６】図２より、ヒト血清の場合でも、インター
フェロン−α濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵
素活性との間には一定の関係があり、この関係は再現性
よく得られることが示された。したがって、本発明がア
ッセイ用培地（すなわち、イーグル最少必須培地）中の
みならず、血清サンプル中のインターフェロン−αの活
性測定にも適用可能であることが分かった。 【００２７】実施例３ 種々の既知活性量のインターフェロン−β（ヒト線維芽
細胞由来天然型インターフェロン−β、（株）東レ；な
お、以下の実施例において、インターフェロン−βとし
てはこのものを用いた。）を含有する１０％胎児ウシ血
清含有イーグル最少必須培地の検体１５０μｌを９６穴
細胞培養プレートに入れ、さらに、ＲＰＭＩ１６４０培
地１５０μｌに浮遊させたＴＨＰ−１細胞（４．５×１
０4 個）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時
間インキュベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕
した。得られた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合
成酵素活性を実施例１と同様の方法により測定した。検
体の測定値からブランク値を差し引いた値を図３に示
す。図３において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はイ
ンターフェロン−β濃度を示す。 【００２８】図３より、インターフェロン−β濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があり、この関係は再現性よく得られることが
示された。したがって、本発明がインターフェロン−β
の活性測定にも適用可能であることが分かった。 【００２９】実施例４ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有する１
０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体２０
０μｌ、または種々の既知活性量のインターフェロン−
αを含有するヒト血清検体２００μｌをそれぞれチュー
ブに入れ、各チューブにＲＰＭＩ１６４０培地２００μ
ｌに浮遊させたＵ−９３７細胞（１．６×１０5 個）を
添加し、３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキュ
ベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得ら
れた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性
を実施例１と同様の方法により測定した。それぞれの検
体の測定値からその検体に対するブランク値を差し引い
た値を図４に示す。▲は検体が１０％胎児ウシ血清含有
イーグル最少培地の場合、△は検体がヒト血清の場合で
ある。図４において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸は
インターフェロン−α濃度を示す。 【００３０】図４より、インターフェロン−α濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があり、この関係は再現性よく得られることが
示された。さらに、検体がヒト血清であっても同様の結
果が示された。したがって、Ｕ−９３７細胞を用いた場
合、検体がアッセイ用培地であっても血清であってもイ
ンターフェロン−αの活性測定が可能であることが分か
った。 【００３１】実施例５ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有する１
０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体２０
０μｌにＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌに浮遊させた
Ｈ９細胞（１．６×１０5 個）を添加し、３７℃、５％
ＣＯ2 気相下で２０時間インキュベートした後、凍結融
解法により細胞を粉砕した。得られた溶液中の２’→
５’オリゴアデニル酸合成酵素活性を実施例１と同様の
方法により測定した。１０％胎児ウシ血清含有イーグル
最少必須培地の検体の測定値からブランク値を差し引い
た値を図５に示す。図５において、縦軸は当該酵素活性
値を、横軸はインターフェロン−α濃度を示す。 【００３２】図５より、インターフェロン−α濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があることが示された。したがって、Ｈ９細胞
を用いた場合でもインターフェロン−αの活性測定が可
能であることが示唆された。 【００３３】実施例６ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有する１
０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体１５
０μｌ、または種々の既知活性量のインターフェロン−
βを含有する１０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須
培地の検体１５０μｌを９６穴細胞培養プレートに加
え、ここに１０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培
地１５０μｌに浮遊させたＦＬ細胞（４．５×１０
4 個）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間
インキュベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕し
た。得られた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合成
酵素活性を実施例１と同様の方法により測定した。それ
ぞれの検体の測定値からその検体に対するブランク値を
差し引いた値を図６に示す。◆はインターフェロン−α
の場合、◇はインターフェロン−βの場合である。図６
において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はインターフ
ェロン−α及び−β濃度を示す。 【００３４】図６より、インターフェロン−α及び−β
濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間
には一定の関係があり、この関係は再現性よく得られる
ことが示された。したがって、ＦＬ細胞を用いた場合、
インターフェロン−α及び−βの活性測定が可能である
ことが分かった。 【００３５】実施例７ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有する１
０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体２０
０μｌにＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌに浮遊させた
ヒト単球（１．６×１０5 個；健常人より採取した血液
よりエルトリエーション法により分離して得たもの。）
を添加し、３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキ
ュベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得
られた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活
性を実施例１と同様の方法により測定した。１０％胎児
ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体の測定値から
ブランク値を差し引いた値を図７に示す。図７におい
て、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はインターフェロン
−α濃度を示す。 【００３６】図７より、インターフェロン−α濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があることが示された。したがって、ヒト単球
を用いた場合でもインターフェロン−αの活性測定が可
能であることが示唆された。 【００３７】実施例８ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有するヒ
ト血清検体１５０μｌを、９６穴細胞培養プレートの各
ウェルに入れ、これにＲＰＭＩ１６４０培地１５０μｌ
に浮遊させたＴＨＰ−１細胞（６×１０4 個）を添加し
た。３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキュベー
トした後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得られた
溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性を実
施例１と同様の方法により測定した。ヒト血清検体の測
定値からブランク値を差し引いた値を図８に示す。図８
において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はインターフ
ェロン−α濃度を示す。 【００３８】図８より、実施例１におけるチューブを用
いる実験系よりスケールが小さい９６穴細胞培養プレー
ト上においてもインターフェロン−α濃度と２’→５’
オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一定の関係が
あることが示され、本発明が９６穴細胞培養プレートに
おけるインターフェロン−αの活性測定にも適用可能で
あることが分かった。 【００３９】実施例９ インターフェロン−αを５０、２５、１２．５、６．２
５、３．１３、１．５６、０．７８１、０．３９１、
０．１９６、０．０９８ＩＵ／ｍｌ含有するヒト血清検
体１５０μｌを、９６穴細胞培養プレートの各ウェル中
に入れ、これにＲＰＭＩ１６４０培地１５０μｌに浮遊
させたＴＨＰ−１細胞（６×１０4 個）を添加し、３７
℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキュベートした
後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得られた溶液中
の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性を実施例１
と同様の方法により測定した。得られた酵素活性から実
施例８に示した方法により求めた検量線を用いてインタ
ーフェロン−α濃度を算出した。結果を表１に示す。 【００４０】比較例１ 実施例９に示した検体について、ＦＬ細胞とシンドビス
ウイルスを使用したバイオアッセイ（ＣＰＥ）法および
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法（ダイナボット社製
インターフェロン−αＲＩＡキットを使用）によりイン
ターフェロン−αの定量を行った。結果を表１に示す。 【００４１】 【表１】 【００４２】表１より、従来法では検出できない低濃度
のインターフェロン−αが、本発明の方法により測定可
能であることが判明した。また、添加量と本発明からの
算出量がよく一致することから、本発明の信頼性が高い
ことが示された。 【００４３】ここで、ＣＰＥ法を山崎の方法（山崎修
道、Pharma Medica 、４（９）、１１１−１１８（１９
８６））に従って実施した。 【００４４】また、ＲＩＡ法は上記キットを用いて行わ
れた。本キットは第１抗体にヒツジポリクロナール抗体
を、第２抗体に 125Ｉ標識マウスモノクロナール抗体を
使用するサンドイッチ法によるラジオイムノメトリック
アッセイキットである。具体的な操作法を以下に示す。 【００４５】ポリスチレン製５４穴プレート（キット添
付）に、検体または標品１００μｌを添加した。これ
に、血清検体のアッセイのための標品には正常血清１０
０μｌを、それ以外には０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１
００μｌ加え、そして予め蒸留水にて湿らせた抗体ビー
ズ（キット添付）をウェルあたり１ヶ添加し、これを３
７℃で２０±２時間インキュベートした。ウェル中の溶
液を廃棄し、２５０μｌの蒸留水でウェル中の抗体ビー
ズを３回洗浄した後、 125Ｉ標識抗インターフェロン抗
体溶液（キット添付）２００μｌを添加した。これを３
７℃で３時間インキュベートした後、抗体溶液を廃棄、
２５０μｌの蒸留水で３回洗浄し、抗体ビーズに吸着し
た放射線量をガンマーカウンターにて測定した。インタ
ーフェロン量は得られた放射線量から、同時に測定した
標品の放射線量により作成した検量線を用いて算出し
た。 【００４６】実施例１０ インターフェロン−α製剤（遺伝子組み換え型ヒトイン
ターフェロン−α２ａ製剤、キャンフェロン、武田薬品
工業（株））をＢ型肝炎患者の筋肉内に投与し、３及び
６時間後の血清１５０μｌを９６穴細胞培養プレートに
入れた。これにＲＰＭＩ１６４０培地１５０μｌに浮遊
させたＴＨＰ−１細胞（６×１０4 個）を添加し、３７
℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキュベートした
後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得られた溶液中
の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性を実施例１
と同様の方法により測定した。得られた酵素活性から実
施例８に示した方法により求めた検量線を用いてインタ
ーフェロン−α濃度を算出した。結果を表２に示す。 【００４７】比較例２ 実施例１０に示した検体について、比較例１と同様に、
ＦＬ細胞とシンドビスウイルスを使用したバイオアッセ
イ（ＣＰＥ）法によりインターフェロン−αの定量を行
った。結果を表２に示す。 【００４８】 【表２】 【００４９】表２より、インターフェロン−α濃度が高
く、従来法（ＣＰＥ法の場合）において測定可能な血清
サンプルについては、本発明の方法による測定値と従来
法の間でよく一致することが判明した。表１、表２の結
果より実際の臨床サンプル中のインターフェロン活性を
本発明の方法により測定できることが明らかになった。 【００５０】 【本発明の効果】本発明の方法を用いることにより、イ
ンターフェロンの生物学的活性を従来法より簡便にかつ
高感度に測定することが可能である。
物学的活性測定法に関するものである。さらに詳しく
は、インターフェロンを含む検体を細胞に作用させ、誘
導されるタンパク質を定量することを特徴とする、イン
ターフェロンの生物学的活性測定法に関するものであ
る。 【０００２】 【従来の技術】インターフェロンはウイルス抑制因子と
してアイザックス（Isaacs) とリンデマン（Lindemann)
によって発見されたタンパク質であり（A. Isaacs, J.
Lindenmann; Proc. Roy. Soc. Ser. B., 147, 258, 195
7)、現在α、β、γ、ωの４種類に分類されている。こ
れらインターフェロンには、抗ウイルス作用以外に、細
胞増殖抑制作用、細胞表在抗原発現の増強といった抗腫
瘍作用、マクロファージの貪食能亢進、ナチュラルキラ
ー活性の増強といった免疫系への応答等、様々な作用が
あることが知られている。 【０００３】インターフェロンは、その作用から抗ウイ
ルス剤、抗腫瘍剤としての薬効が期待され、現在Ｂ型お
よびＣ型肝炎、急性骨髄性白血病、多発性骨髄種、悪性
黒色腫等の治療薬として幅広く使用されている。また、
インターフェロンの病態への関与はＩ型糖尿病をはじめ
として古くから知られており、近年血液細胞のインター
フェロン産生量がこれら病態を知る上で重要な情報とな
ることが示されている（M. Kita ら, J. Clin, Lab, An
al, 5, 238-241, 1991、中川修一ら, 日本泌尿器科学会
雑誌81, 262-267, 1990 ）。 【０００４】これらのことから、インターフェロンの臨
床応用を進めるため、あるいは病態を把握するためには
インターフェロンの活性を測定することが非常に重要で
あることが伺える。事実、インターフェロンの活性測定
は現在、様々な目的で頻繁に行われている。 【０００５】インターフェロンの作用メカニズムについ
ては、インターフェロンが持つ複雑な作用機作のため、
一部しか解明されていないのが現状であるが、インター
フェロンの作用により２’→５’オリゴアデニル酸合成
酵素、ホスホジエステラーゼ等のタンパク質が誘導さ
れ、その結果抗ウイルス作用が生じることが判明してい
る。このようなインターフェロンと２’→５’オリゴア
デニル酸合成酵素との関係に基づき、ヒトあるいは動物
にインターフェロンを投与した後の２’→５’オリゴア
デニル酸合成酵素の推移を測定することによりインター
フェロンの作用を確認した例が報告されている。しか
し、インターフェロンの作用により細胞中に誘導される
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素量が、添加したイ
ンターフェロン活性と一定の関係にあること、言い換え
れば、２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素量を定量す
れば、添加したインターフェロン活性が定量できること
については何ら報告されていなかった。 【０００６】ところで、インターフェロン活性を測定す
る方法としては、生物学的測定法、免疫学的測定法が広
く知られている。生物学的測定法は、ＦＬ細胞、ＷＩＳ
Ｈ細胞等のインターフェロンに感受性の高い細胞に対し
てインターフェロンを含む検体を作用させた後に、これ
ら細胞に感染能を持つシンドビスウイルス（Sindbis vi
rus ）、水ほう性口内炎ウイルス（Vesicular stomatit
is virus、ＶＳＶ）等を一定量添加し、感染させる。こ
の際、インターフェロンにより誘導されたウイルス抵抗
性の程度を測定することにより、インターフェロン活性
を測定する方法であり、原理的には間接測定法と呼ばれ
るものである。ウイルス抵抗性の程度の測定とはウイル
スの増殖の抑制を指標に行われるものであり、ウイルス
プラーク数の測定、ウイルス収量の直接定量、ウイルス
核酸の合成量の測定が用いられ、ウイルス増殖能を５０
％抑制するサンプルの希釈倍率からインターフェロン力
価が算出される。また、ウイルス増殖の結果として細胞
を破壊させる細胞変性効果（ＣＰＥ）の測定法も用いら
れ、細胞のＣＰＥを５０％阻止するサンプルの希釈倍率
からインターフェロン力価が算出される。これらの測定
値を同時に測定したインターフェロン標準品により校正
することによって、国際標準単位のインターフェロン力
価（ＩＵ）が求められる（小林茂保ら, 免疫生化学実験
法（続生化学実験講座５）, 日本生化学会編, P245, 東
京化学同人, 東京, (1986)）。現在、これらの測定法の
中でＣＰＥを指標にした生物学的測定法が最も広く利用
されている。 【０００７】これらの方法は、インターフェロンが細胞
上のインターフェロンレセプターと結合した結果生じる
細胞の抗ウイルス状態を測定するものであるため、生物
学的活性を持つインターフェロン量（インターフェロン
活性）のみを測定する方法であるといえる。しかしこれ
らの測定法は操作が煩雑であり、しかも検出限界はアッ
セイ系によって異なるが、ＣＰＥを指標とする方法を用
いた場合、理論的に６ＩＵ／ｍｌ程度（山崎修道、Phar
ma Medica 、４（９）、１１１−１１８（１９８６））
であり、充分な検出感度が得られているとは言えない状
況にあった。 【０００８】一方、免疫学的測定法は、インターフェロ
ンに対する抗体を用いて定量を行う方法であり、定量手
段により放射免疫測定法および酵素免疫測定法があり、
抗体の組み合わせ法により競合法および非競合法の分類
がある。たとえば、非競合法による酵素免疫測定法とし
ては、固相に抗インターフェロン抗体を固定化し、イン
ターフェロンを特異的に結合させた後、酵素標識抗イン
ターフェロン抗体を結合させて、酵素反応により検出す
る方法（石古博昭ら, 医学のあゆみ, 192(3),182, (198
4) ）、酵素標識抗インターフェロン抗体のかわりに抗
インターフェロン抗体を用い、更に酵素標識抗抗体を結
合させる方法（Ora Horovitzら, Immunoenzymatic Tech
niques, S. Auramens ら編集, P193, Elsevier Science
Publishers B. V. (1983)）等が知られている。 【０００９】これらの方法は、インターフェロンに対す
る特異抗体に結合したインターフェロン量を定量するも
のである。本方法における検出限界は２ＩＵ／ｍｌ（バ
イオソースインターナショナル社、ヒトインターフェロ
ン−α エライザキット）程度であり、生物学的測定法
と同程度にインターフェロンを検出する方法であると言
えるが、生物学的活性を有するインターフェロンのみな
らず活性を有しないインターフェロンをも測定されてし
まうため、インターフェロンの活性測定を行うには不適
切な方法である。これらのことから、インターフェロン
の生物学的活性を簡易により高感度に検出する方法が望
まれていた。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、インターフェロンの生物学的活性を従来法より
簡易に、しかも高感度に測定する方法を提供することで
ある。 【００１１】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、生物学的
に微量のインターフェロン活性を測定する方法について
鋭意検討を行った結果、インターフェロンの作用により
誘導されたタンパク質量は、添加したインターフェロン
の活性と一定の関係にあることを発見した。この事実を
基に、検体中のインターフェロン活性は、細胞中に誘導
されたタンパク質を定量することにより測定可能である
ことを見い出し、本発明を完成するに到った。 【００１２】すなわち、本発明の要旨は、インターフェ
ロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロ
ン−ωを含む検体を、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ−９３７細
胞、Ｈ９細胞及びＦＬ細胞からなる群より選ばれる一つ
の細胞に作用させ、誘導される２’→５’オリゴアデニ
ル酸合成酵素を定量することを特徴とするインターフェ
ロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロ
ン−ω活性の測定法、に関する。 【００１３】本発明の特徴は、検体を細胞に作用させた
結果、検体中のインターフェロンにより誘導されるタン
パク質量を定量し、種々の既知活性量のインターフェロ
ンを添加した細胞中に誘導される当該タンパク質量から
作成した検量線からインターフェロン活性を算出すると
ころにある。以下、本発明について詳細に説明する。 【００１４】本発明が測定対象とするインターフェロン
は、哺乳類のインターフェロンであれば特に制限される
ものではなく、ヒト、サル、ウシ、ネコ、イヌ、ウサ
ギ、ラット、マウス等のインターフェロンが例示でき
る。インターフェロンのタイプについても特に制限はさ
れないが、インターフェロンレセプタータイプＩ（臨床
医１９（６）１５４０−１５４４（１９９３）、治療学
２７（１０）１１５９−１１６３（１９９３）を参照の
こと）と結合するものが好ましく、具体的にはインター
フェロン−α、−βおよび−ωが例示できる。またイン
ターフェロンは、天然の原料（たとえば白血球、線維芽
細胞、リンパ球など）、あるいは天然由来の原料（たと
えばセルラインなど）から誘導されたインターフェロン
でも、組み換えＤＮＡ技術により調製されたインターフ
ェロンでもよく、特に制限されるものではない。また、
インターフェロンレセプタータイプＩと結合するもので
あれば、一部のアミノ酸の置換、削除、挿入等を行った
インターフェロンの改変体であってもよい。 【００１５】測定に使用する細胞は、測定対象のインタ
ーフェロンに対し感受性を有する細胞であれば特に制限
されるものではない。即ち、インターフェロンが細胞表
面のインターフェロンレセプターと結合することによ
り、所定のタンパク質が誘導され、インターフェロンの
活性に依存して誘導される量が決定されるような細胞で
あればよい。具体的には、測定対象のインターフェロン
を産生する種の白血球、単球、リンパ球、線維芽細胞、
及び上皮細胞等、並びに、単球、リンパ球、線維芽細
胞、上皮細胞等の各種細胞に由来する株細胞が例示さ
れ、なかでも単球、リンパ球、線維芽細胞、上皮細胞等
に由来する株細胞がより好ましい。 【００１６】例えば、ヒトインターフェロン−αを測定
対象とした場合、ヒト細胞が用いられ、具体的にはヒト
の白血球、単球、リンパ球、線維芽細胞、及び上皮細胞
等、並びにヒトの単球、リンパ球、線維芽細胞、上皮細
胞等に由来する株細胞が挙げられる。上記のうち、好ま
しくは株細胞が用いられ、例えばＴＨＰ−１細胞（ヒト
単球株細胞；国立衛生試験所、がん細胞リサーチバンク
（ＪＣＲＢ）より入手可能）、Ｕ−９３７細胞（組織球
性リンパ腫株細胞；ＪＣＲＢより入手可能）、Ｈ９細胞
（リンパ球系株細胞；（株）林原生物化学研究所藤崎細
胞センターより入手可能）、ＦＬ細胞（大日本製薬
（株）より入手可能）、ＷＩＳＨ細胞（羊膜由来株細
胞）が挙げられ、特に好ましくはＴＨＰ−１細胞または
Ｕ−９３７細胞が例示できる。また、例えばマウス、ウ
サギ、サル、ウシのインターフェロンを測定対象とした
場合、具体的には、それぞれＬ９２９細胞（マウス）、
ＲＫ−１３細胞（ウサギ）、Ｖｅｒｏ細胞（サル）、Ｍ
ＤＢＫ細胞（ウシ）が例示できる。これらの細胞株は、
国立衛生試験所等の研究機関の細胞バンク、または大日
本製薬（株）等の取り扱い業者から入手できる。 【００１７】定量対象となるタンパク質は、インターフ
ェロンにより誘導されるタンパク質であれば制限される
ものではなく、具体的には酵素が例示される。より具体
的には２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素、ホスホジ
エステラーゼが例示できる。当該タンパク質の定量法は
特に制限されるものではなく、例えば、免疫化学的方
法、液体クロマトグラフィーによる定量法、酵素反応生
成物の直接定量による酵素活性測定法等が挙げられる。
市販の測定キット等も当該タンパク質の定量に使用でき
る。また、測定により得られる数値は、絶対量、タンパ
ク量、酵素活性のいずれでも良い。 【００１８】本発明によるインターフェロン活性の測定
は、例えば以下に述べる方法を用いることができる。ま
ず、測定に使用する細胞を適切な細胞数ずつ容器に添加
する。このとき、当該細胞は適当な培地や緩衝液中に浮
遊させた状態で容器に添加してもよい。培地としては適
当量の胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地、
イーグル最少必須培地等が、緩衝液としてはリン酸塩緩
衝液等が挙げられる。使用する容器は特に制限されるも
のではなく、例えば、蓋付き試験管、細胞培養ディッシ
ュ、マイクロプレート、９６穴細胞培養プレート等が挙
げられる。添加する細胞数は特に制限されるものではな
く、例えば５×１０3 〜１×１０6 個／容器、好ましく
は１×１０4 〜５×１０5 個／容器である。次に、当該
容器に標品または検体を添加する。検体は細胞毒性を示
す成分を含まないものであれば特に制限されるものでは
なく、例えば血清、血漿、緩衝液、培地、細胞培養上清
等が挙げられる。具体的には、イーグル最少必須培地
（日水製薬（株））（１０％胎児ウシ血清を含有するも
の及び含有しないもの）、ヒト血清、血漿；ウサギ、ラ
ット等の動物の血清、血漿、臓器ホモジネート；ナマル
バ細胞等の細胞培養上清；リン酸塩緩衝液、トリスグリ
シン緩衝液等が挙げられる。検体中のインターフェロン
が高濃度であると推測できる場合は、測定用の容器に添
加する前に、インターフェロンを含有しない血清等によ
り検体を希釈することが好ましい。 【００１９】検体を添加した後、一定時間細胞をインキ
ュベートすることにより、検体中のインターフェロンを
細胞に作用させる。インキュベート時間はインターフェ
ロンの作用が発現するに充分な時間であれば特に制限さ
れるものではない。具体的には３時間〜４８時間が例示
でき、好ましくは６時間〜２４時間が、さらに好ましく
は１２時間〜２４時間が例示できる。インキュベート時
の温度は、測定に用いる細胞を細胞培養する条件と同一
でよい。インキュベートの後、誘導されたタンパク質を
定量可能な状態にするために細胞の破砕処理等を行う。
細胞処理の方法は特に制限されるものではなく、例えば
超音波、凍結融解、浸透圧により、又は機械的に細胞を
破砕する方法、有機溶媒、界面活性剤等により細胞膜の
透過性を上げる方法等が例示できる。 【００２０】続いて、当該タンパク質を定量する。定量
方法は公知の方法を用いることができる。例えば、２’
→５’オリゴアデニル酸合成酵素を定量するには、２−
５Ａキット’栄研’（栄研化学（株）製）を用いること
ができる。また、ホスホジエステラーゼを定量するに
は、ラッセルらの方法（J.Biol.Chem., ２４８、１３３
４（１９７３））を用いることができる。当該タンパク
質の定量の前に精製を行って、混在物を除去してもよ
く、定量に差し障りがなければ、細胞を処理したその状
態のまま、混在物を除去することなく定量してもよい。
このようにして、検体中のインターフェロンにより誘導
されたタンパク質量を定量し、種々の既知活性量のイン
ターフェロンを添加した細胞中に誘導された当該タンパ
ク質量から作成した検量線からインターフェロン活性を
測定することができる。 【００２１】 【実施例】以下、本発明を実施例及び比較例によって説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 【００２２】実施例１ 種々の既知活性量のインターフェロン−α（センダイウ
イルス誘発ヒトリンパ芽球インターフェロン、住友製薬
（株）；なお、以下の実施例等において、インターフェ
ロン−αとしてはこのものを用いた。）を含有する１０
％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地（日水製薬
（株））の検体２００μｌを丸底キャップ付きチューブ
（Falcon２０８３；以下、チューブと略記する。）に入
れ、さらにＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）；な
お、以下の実施例等において、ＲＰＭＩ１６４０培地と
してはこのものを用いた。）２００μｌに浮遊させたＴ
ＨＰ−１細胞（１．６×１０5 個；なお、以下の実施例
等において、ＴＨＰ−１細胞としてはこのものを用い
た。）を添加した。３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時
間インキュベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕
した。得られた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合
成酵素活性を２−５Ａキット’栄研’（栄研化学（株）
製）を用い、キット添付の方法によって測定した。イー
グル最少必須培地の検体の測定値から、インターフェロ
ンを含まない当該培地の測定値（以下、ブランク値と略
記する。）を差し引いた値を図１に示す。図１におい
て、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はインターフェロン
−α濃度を示す。 【００２３】測定に使用する細胞（本実施例ではＴＨＰ
−１細胞）の細胞数は、トリパンブルー染色により生細
胞を染色し、計数することによって求めた。以下の実施
例等においても、細胞数を同様にして求めた。 【００２４】図１より、インターフェロン−αの濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があり、この関係は再現性よく得られることが
示された。したがって、２’→５’オリゴアデニル酸合
成酵素活性の測定によるインターフェロン−αの活性測
定が可能であることが分かった。また、本測定法の検出
限界は、図１より０．０５〜０．１ＩＵ／ｍｌ程度であ
り、ウイルス抵抗性の程度を指標とした従来の生物学的
測定法（検出限界：６ＩＵ／ｍｌ程度）の約６０倍〜１
２０倍と非常に高感度であることが分かった。 【００２５】実施例２ 種々の既知量のインターフェロン−αを含有するヒト血
清検体２００μｌをチューブに入れ、ＲＰＭＩ１６４０
培地２００μｌに浮遊させたＴＨＰ−１細胞（１．６×
１０5 個）をこのチューブに添加した。３７℃、５％Ｃ
Ｏ2 気相下で２０時間インキュベートした後、凍結融解
法により細胞を粉砕した。得られた溶液中の２’→５’
オリゴアデニル酸合成酵素活性を実施例１と同様の方法
で測定した。検体の測定値からブランク値を差し引いた
値を図２中の□に示す。実施例１の結果を図２中の■に
示す。図２において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸は
インターフェロン−α濃度を示す。 【００２６】図２より、ヒト血清の場合でも、インター
フェロン−α濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵
素活性との間には一定の関係があり、この関係は再現性
よく得られることが示された。したがって、本発明がア
ッセイ用培地（すなわち、イーグル最少必須培地）中の
みならず、血清サンプル中のインターフェロン−αの活
性測定にも適用可能であることが分かった。 【００２７】実施例３ 種々の既知活性量のインターフェロン−β（ヒト線維芽
細胞由来天然型インターフェロン−β、（株）東レ；な
お、以下の実施例において、インターフェロン−βとし
てはこのものを用いた。）を含有する１０％胎児ウシ血
清含有イーグル最少必須培地の検体１５０μｌを９６穴
細胞培養プレートに入れ、さらに、ＲＰＭＩ１６４０培
地１５０μｌに浮遊させたＴＨＰ−１細胞（４．５×１
０4 個）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時
間インキュベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕
した。得られた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合
成酵素活性を実施例１と同様の方法により測定した。検
体の測定値からブランク値を差し引いた値を図３に示
す。図３において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はイ
ンターフェロン−β濃度を示す。 【００２８】図３より、インターフェロン−β濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があり、この関係は再現性よく得られることが
示された。したがって、本発明がインターフェロン−β
の活性測定にも適用可能であることが分かった。 【００２９】実施例４ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有する１
０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体２０
０μｌ、または種々の既知活性量のインターフェロン−
αを含有するヒト血清検体２００μｌをそれぞれチュー
ブに入れ、各チューブにＲＰＭＩ１６４０培地２００μ
ｌに浮遊させたＵ−９３７細胞（１．６×１０5 個）を
添加し、３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキュ
ベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得ら
れた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性
を実施例１と同様の方法により測定した。それぞれの検
体の測定値からその検体に対するブランク値を差し引い
た値を図４に示す。▲は検体が１０％胎児ウシ血清含有
イーグル最少培地の場合、△は検体がヒト血清の場合で
ある。図４において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸は
インターフェロン−α濃度を示す。 【００３０】図４より、インターフェロン−α濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があり、この関係は再現性よく得られることが
示された。さらに、検体がヒト血清であっても同様の結
果が示された。したがって、Ｕ−９３７細胞を用いた場
合、検体がアッセイ用培地であっても血清であってもイ
ンターフェロン−αの活性測定が可能であることが分か
った。 【００３１】実施例５ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有する１
０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体２０
０μｌにＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌに浮遊させた
Ｈ９細胞（１．６×１０5 個）を添加し、３７℃、５％
ＣＯ2 気相下で２０時間インキュベートした後、凍結融
解法により細胞を粉砕した。得られた溶液中の２’→
５’オリゴアデニル酸合成酵素活性を実施例１と同様の
方法により測定した。１０％胎児ウシ血清含有イーグル
最少必須培地の検体の測定値からブランク値を差し引い
た値を図５に示す。図５において、縦軸は当該酵素活性
値を、横軸はインターフェロン−α濃度を示す。 【００３２】図５より、インターフェロン−α濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があることが示された。したがって、Ｈ９細胞
を用いた場合でもインターフェロン−αの活性測定が可
能であることが示唆された。 【００３３】実施例６ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有する１
０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体１５
０μｌ、または種々の既知活性量のインターフェロン−
βを含有する１０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須
培地の検体１５０μｌを９６穴細胞培養プレートに加
え、ここに１０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培
地１５０μｌに浮遊させたＦＬ細胞（４．５×１０
4 個）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間
インキュベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕し
た。得られた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合成
酵素活性を実施例１と同様の方法により測定した。それ
ぞれの検体の測定値からその検体に対するブランク値を
差し引いた値を図６に示す。◆はインターフェロン−α
の場合、◇はインターフェロン−βの場合である。図６
において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はインターフ
ェロン−α及び−β濃度を示す。 【００３４】図６より、インターフェロン−α及び−β
濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間
には一定の関係があり、この関係は再現性よく得られる
ことが示された。したがって、ＦＬ細胞を用いた場合、
インターフェロン−α及び−βの活性測定が可能である
ことが分かった。 【００３５】実施例７ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有する１
０％胎児ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体２０
０μｌにＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌに浮遊させた
ヒト単球（１．６×１０5 個；健常人より採取した血液
よりエルトリエーション法により分離して得たもの。）
を添加し、３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキ
ュベートした後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得
られた溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活
性を実施例１と同様の方法により測定した。１０％胎児
ウシ血清含有イーグル最少必須培地の検体の測定値から
ブランク値を差し引いた値を図７に示す。図７におい
て、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はインターフェロン
−α濃度を示す。 【００３６】図７より、インターフェロン−α濃度と
２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一
定の関係があることが示された。したがって、ヒト単球
を用いた場合でもインターフェロン−αの活性測定が可
能であることが示唆された。 【００３７】実施例８ 種々の既知活性量のインターフェロン−αを含有するヒ
ト血清検体１５０μｌを、９６穴細胞培養プレートの各
ウェルに入れ、これにＲＰＭＩ１６４０培地１５０μｌ
に浮遊させたＴＨＰ−１細胞（６×１０4 個）を添加し
た。３７℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキュベー
トした後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得られた
溶液中の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性を実
施例１と同様の方法により測定した。ヒト血清検体の測
定値からブランク値を差し引いた値を図８に示す。図８
において、縦軸は当該酵素活性値を、横軸はインターフ
ェロン−α濃度を示す。 【００３８】図８より、実施例１におけるチューブを用
いる実験系よりスケールが小さい９６穴細胞培養プレー
ト上においてもインターフェロン−α濃度と２’→５’
オリゴアデニル酸合成酵素活性との間には一定の関係が
あることが示され、本発明が９６穴細胞培養プレートに
おけるインターフェロン−αの活性測定にも適用可能で
あることが分かった。 【００３９】実施例９ インターフェロン−αを５０、２５、１２．５、６．２
５、３．１３、１．５６、０．７８１、０．３９１、
０．１９６、０．０９８ＩＵ／ｍｌ含有するヒト血清検
体１５０μｌを、９６穴細胞培養プレートの各ウェル中
に入れ、これにＲＰＭＩ１６４０培地１５０μｌに浮遊
させたＴＨＰ−１細胞（６×１０4 個）を添加し、３７
℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキュベートした
後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得られた溶液中
の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性を実施例１
と同様の方法により測定した。得られた酵素活性から実
施例８に示した方法により求めた検量線を用いてインタ
ーフェロン−α濃度を算出した。結果を表１に示す。 【００４０】比較例１ 実施例９に示した検体について、ＦＬ細胞とシンドビス
ウイルスを使用したバイオアッセイ（ＣＰＥ）法および
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法（ダイナボット社製
インターフェロン−αＲＩＡキットを使用）によりイン
ターフェロン−αの定量を行った。結果を表１に示す。 【００４１】 【表１】 【００４２】表１より、従来法では検出できない低濃度
のインターフェロン−αが、本発明の方法により測定可
能であることが判明した。また、添加量と本発明からの
算出量がよく一致することから、本発明の信頼性が高い
ことが示された。 【００４３】ここで、ＣＰＥ法を山崎の方法（山崎修
道、Pharma Medica 、４（９）、１１１−１１８（１９
８６））に従って実施した。 【００４４】また、ＲＩＡ法は上記キットを用いて行わ
れた。本キットは第１抗体にヒツジポリクロナール抗体
を、第２抗体に 125Ｉ標識マウスモノクロナール抗体を
使用するサンドイッチ法によるラジオイムノメトリック
アッセイキットである。具体的な操作法を以下に示す。 【００４５】ポリスチレン製５４穴プレート（キット添
付）に、検体または標品１００μｌを添加した。これ
に、血清検体のアッセイのための標品には正常血清１０
０μｌを、それ以外には０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１
００μｌ加え、そして予め蒸留水にて湿らせた抗体ビー
ズ（キット添付）をウェルあたり１ヶ添加し、これを３
７℃で２０±２時間インキュベートした。ウェル中の溶
液を廃棄し、２５０μｌの蒸留水でウェル中の抗体ビー
ズを３回洗浄した後、 125Ｉ標識抗インターフェロン抗
体溶液（キット添付）２００μｌを添加した。これを３
７℃で３時間インキュベートした後、抗体溶液を廃棄、
２５０μｌの蒸留水で３回洗浄し、抗体ビーズに吸着し
た放射線量をガンマーカウンターにて測定した。インタ
ーフェロン量は得られた放射線量から、同時に測定した
標品の放射線量により作成した検量線を用いて算出し
た。 【００４６】実施例１０ インターフェロン−α製剤（遺伝子組み換え型ヒトイン
ターフェロン−α２ａ製剤、キャンフェロン、武田薬品
工業（株））をＢ型肝炎患者の筋肉内に投与し、３及び
６時間後の血清１５０μｌを９６穴細胞培養プレートに
入れた。これにＲＰＭＩ１６４０培地１５０μｌに浮遊
させたＴＨＰ−１細胞（６×１０4 個）を添加し、３７
℃、５％ＣＯ2 気相下で２０時間インキュベートした
後、凍結融解法により細胞を粉砕した。得られた溶液中
の２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性を実施例１
と同様の方法により測定した。得られた酵素活性から実
施例８に示した方法により求めた検量線を用いてインタ
ーフェロン−α濃度を算出した。結果を表２に示す。 【００４７】比較例２ 実施例１０に示した検体について、比較例１と同様に、
ＦＬ細胞とシンドビスウイルスを使用したバイオアッセ
イ（ＣＰＥ）法によりインターフェロン−αの定量を行
った。結果を表２に示す。 【００４８】 【表２】 【００４９】表２より、インターフェロン−α濃度が高
く、従来法（ＣＰＥ法の場合）において測定可能な血清
サンプルについては、本発明の方法による測定値と従来
法の間でよく一致することが判明した。表１、表２の結
果より実際の臨床サンプル中のインターフェロン活性を
本発明の方法により測定できることが明らかになった。 【００５０】 【本発明の効果】本発明の方法を用いることにより、イ
ンターフェロンの生物学的活性を従来法より簡便にかつ
高感度に測定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１におけるインターフェロン−
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。 【図２】図２は、実施例１及び実施例２におけるインタ
ーフェロン−αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合
成酵素活性の関係を示すグラフである。■は検体が１０
％胎児ウシ血清含有イーグル最少培地の場合、□は検体
がヒト血清の場合である。 【図３】図３は、実施例３におけるインターフェロン−
βの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。 【図４】図４は、実施例４におけるインターフェロン−
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。▲は検体が１０％胎児ウシ血
清含有イーグル最少培地の場合、△は検体がヒト血清の
場合である。 【図５】図５は、実施例５におけるインターフェロン−
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。 【図６】図６は、実施例６におけるインターフェロンの
濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の関係
を示すグラフである。◆はインターフェロン−αの場
合、◇はインターフェロン−βの場合である。 【図７】図７は、実施例７におけるインターフェロン−
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。 【図８】図８は、実施例８におけるインターフェロン−
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。 【図２】図２は、実施例１及び実施例２におけるインタ
ーフェロン−αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合
成酵素活性の関係を示すグラフである。■は検体が１０
％胎児ウシ血清含有イーグル最少培地の場合、□は検体
がヒト血清の場合である。 【図３】図３は、実施例３におけるインターフェロン−
βの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。 【図４】図４は、実施例４におけるインターフェロン−
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。▲は検体が１０％胎児ウシ血
清含有イーグル最少培地の場合、△は検体がヒト血清の
場合である。 【図５】図５は、実施例５におけるインターフェロン−
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。 【図６】図６は、実施例６におけるインターフェロンの
濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の関係
を示すグラフである。◆はインターフェロン−αの場
合、◇はインターフェロン−βの場合である。 【図７】図７は、実施例７におけるインターフェロン−
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。 【図８】図８は、実施例８におけるインターフェロン−
αの濃度と２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素活性の
関係を示すグラフである。
フロントページの続き
(72)発明者 高田 義博
アメリカ合衆国 ニューヨーク 10154,
ニューヨーク，パーク アベニュー
345，スミトモ ファーマシューティカ
ルズカンパニー，リミテッド ニューヨ
ーク オフィス内
(72)発明者 藤岡 敬治
大阪府茨木市蔵垣内１丁目３番45号 住
友製薬株式会社内
(56)参考文献 特開 昭62−115291（ＪＰ，Ａ)
特開 昭55−144898（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 インターフェロン−α、インターフェロ
ン−βまたはインターフェロン−ωを含む検体を、ＴＨ
Ｐ−１細胞、Ｕ−９３７細胞、Ｈ９細胞及びＦＬ細胞か
らなる群より選ばれる一つの細胞に作用させ、誘導され
る２’→５’オリゴアデニル酸合成酵素を定量すること
を特徴とするインターフェロン−α、インターフェロン
−βまたはインターフェロン−ω活性の測定法。
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