JPH06509418A - 内因性サイトカイン類の測定方法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内因性サイトカイン類の測定方法およびキット発明の分野 本発明は、ヒトまたは動物における免疫学的機能を監視する方法に関するもので ある。より詳細には、本発明は、これに限定されるものではないが、血液、並び に唾液、鼻分泌物、涙および汗などを含む池の体液内のサイトカイン濃度を正確 に測定することに関する。

発明の背景 ここで用いる言葉「サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）　］は、免疫または他の 細胞が分泌する成長因子として定義され、これは、免疫システムの細胞、゛　例 えばこれに限定されるものではないがＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびマクロフ ァージなどに作用する。代表的なサイトカイン類には、これに限定されるもので はないが、インターロイキン１σ、インターロイキン−１β、インターロイキン −２、インターロイキン−６、インターフェロン−アルファ、インターフェロン −ガンマ、腫瘍壊死因子−ａ１成長因子、例えばＴＧＦＢＳＮＧＦＳＥＧＦ、お よびオンコジーン、例えばｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｏｓなどから成る群が含まれ る。言葉ｒＥ　Ｉ　ＡＪは、標識として酵素が用いられているイムノア・ソセイ のいずれをも意味している。ここで用いる言葉「内因性サイトカイン類」は、イ ンビボで産生されそして通常血液および他の種々の生物学的流体の中を循環する サイトカイン類を意味している。この言葉は、まだ転写後修飾を受けていない、 より大きな分子量形態のサイトカイン類であるプロホルモン類も包含している。

健康そしてエイズ、癌および自己免疫病などの病気への感受性に対する種々の因 子の影響（行動および環境のストレスを含む）には、免疫システムが介在してい ると考えられている（＾ｄｅｒ、　Ｒ，他編集、「精神神経免疫学Ｊ　（ＰＳＹ ＣＩＩＯＮＥＵＲＯＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）　、第２版、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ　（１９９１）　）。しかしながら、この免疫の機能および宿主の防御シス テムに対してこれらの影響の多くが示す効果を確実に評価するのは困難であった 。これは、部分的には、この免疫システム活性の評価方法の多くは、血清または 細胞であろうと血液成分に焦点を当てているということが原因となっている。

新しく生まれた精神神経免疫学として知られている分野は、生付動因子が内的に 変換されて免疫システムに影響を与えそしてこれによって種々の病理学的過程へ の敏感性または耐性が影響を受ける様式を、より機構的な様式で定義付けするこ とをめている。ストレスの如き生付動因子は、病理学的結果にとって正もしくは 負の危険因子となり得る（Ｍａｉｅｒ、　Ｓ、Ｆ、他、ＢＲＡＩＮ　ＢＥＩ（Ａ Ｖ、　ＩＭＩＩＵＮ、　２：８７９１　（１，９８８））、何人かの研究者は、 ヒトにおける正もしくは負の心構えは癌、エイズまたは自己免疫病における宿主 の全体的応答に貢献する有意な因子であり得ると考えている（例えば」二組Ａｄ ｅｒ他参照）。

単一個体における免疫システムが有する個々の成分を経時的に評価して定限する 我々の能力（例えばエイズに関連した病気の開始点および／または治療を監視す るにとって重要である）は弱いものであった（Ｋｉｅｃｏｆｔ池、　ＢＲＡＩＮ 　ＢＥＨＡｖ、ＩＭＭＵＮ、２二６７−７８　（１９８ｇ）　；Ｇｌａｓｅｒ、 Ｒｆｌｈ、　ＢＲＡＩＮ　ＢＥＨＡＹ、　ＩＭＭＵＮ、　１：１０７−１１２　 （１９８７））　。免疫システムの調整に参加させ得る行動戦略に関する研究に は、幅広い種類の研究者（インビトロの免疫学的技術の複雑さに必ずしも慣れて いない研究者を含む）が用いることが可能な容易に利用できる分析手段が必要で ある。現在のところこのような方法は明らかに不足している。

精神神経免疫学研究で幅広く用いられている１つの方法は、リンパ球芽球形成ま たはリンパ球形質転換試験としても知られている、マイトジェンを用いインビト ロでリンパ球を刺激する方法である（Ｍａｌｕｉｓｈ、＾、Ｅ。

他、「臨床実験室免疫学のマニュアルＪ　（ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＣＬＩＮＩＣ ＡＬ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）　（第３版）　、Ｒｏｓ ｅ、　Ｎ、Ｒ，他（編集）　、２７４−２８１　（１９８６）　）。この方法は 、血液から分離させたリンパ球を、種々の用量のマイトジェンの存在下、インビ トロで数日間培養することを伴っている。これらのマイトジェンは、典型的には 、植物誘導または微生物誘導された非特異的リンパ球増殖活性因子である。細胞 応答の尺度として、一般に、その培養されたリンパ球が示す３　）−（−チミジ ンを取り込む能力（よ（知られているＤＮＡ合成および細胞増殖の尺度）が用い られている。このような操作は高い変動性を示すことで熟練者に依存していると 共に、被験者の血清（もしこの検定の中に組み込まれるとしたならば）が与える ミクロ環境を含む数多（の未知因子の影響を受ける。

内分泌ホルモン類に関するより古典的なイムノアッセイとは対照的に、確立され たベースラインとなる応答が存在していないことから、実験室間そして実験室内 でさえも、比較を行うのが非常に困難である。しかしながら、リンパ球形質転換 試験は、全種類の細胞、即ち用いるマイトジェンに応じてＴリンパ球またはＢリ ンパ球両方の細胞が示す応答能力を試験していることから、この試験では、免疫 システムに関する機能的な情報が得られる。不幸なことには、このアッセイの不 正確さが理由で、それの利用性が大きく低下している。

精神神経免疫学研究で通常に用いられている２番目のアッセイは、ナチュラルキ ラー（Ｎ　Ｋ）細胞活性を測定する方法である（ｌｌｅｒｂｅｒｍａｎ、　Ｒ。

Ｂｏ、臨床実験室免疫学のマニュアルＪ　（ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＣＬＩＮＩＣ ＡＬ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＩＭＭＵＮＯＩ、０ＧＹ）　（第３版）　、Ｒｏ ｓｅ、　Ｎ、Ｒ，他（Ｉｉ集）　、３０８−３１４　（１９８６）　；Ｉｒｗｉ ｎ、　Ｍ、他、ＢＲ＾ＩＮ　ＢＥＨＡＶ、　ＩＩＩＩＩＩＪＮ、　１：９８−１ ０４　（１９８７）　：　Ｊｅ＋ａｍｏｔｔ、　ＪAＢ、、 ３ｄ、　Ｊ、　ＢＥＨＡＶ、　ＭＥＤ、１３：５３−７３　（１９９０）　）　 、再び、このアッセイもまた上に示した欠点の多くに苦しんでいる。このアッセ イが普及した１つの理由は、最も抗原に特異的であるか或は抗体に依存している 細胞毒性アッセイに比較してそれを行うのが比較的容易な点である。しかしなが ら、内分泌ホルモンで通常用いられているイムノアッセイに比較すると、これは まだ行うのがむしろ困難なバイオアッセイとしてランク付けされている。

ＮＫ細胞アッセイは、典型的には５１Ｃｒで予め標識を付けた適当な感受性を示 す腫瘍細胞系由来の標的細胞をある種の白血球細胞が自然発生的に溶解すること でそのラジオアイソトープを媒体の中に放出する能力を基としている。このアッ セイは、定量可能なベースラインが不足しており、個体間の比較は、血液細胞サ ンプルを連続的に希釈することによって影響を受ける溶解産物の差を基にしてい る。ＮＫ機能を有する細胞と、よく知られている種類の白血球およびリンパ球と の間の正確な関係はまだ不明確である。更に、癌または感染病に対する免疫学的 機能および宿主の防御でＮＫ細胞が果す役割は、確実には確立されていない。

普及して来ている、免疫システムを監視する３番目のアプローチは、細胞表面マ ーカーに特異的な抗体を用いたフロー血球計算法によるリンパ球サブセットの計 算である（Ａｕｌｔ、　Ｋ、、ｒ臨床実験室免疫学のマニュアルＪ　（ＭＡＮＵ ＡＬ　ＯＦ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ）　（第３版）　、Ｒｏｓｅ、　Ｎ、Ｒ，他（ｖａ集）　、２４７−２５３　（ ＋９８６）　）　、　コノ７ブローチハ、循環内ノ種々の種類のリンパ球分布を 即座に示すものであるが、如何なる細胞に関しても機能的情報を与えるものでは ない。数多くの心理生物学研究には前処理、処理および後処理設計が必要とされ ていることから、このアッセイは、いくつかの細胞数変化があまりにも早過ぎて 一過的であることで意味をなさなくなるといった欠点を有している。それとは対 照的に、リンパ球サブセットを循環させる長期状態ではあまりにも安定になり過 ぎることから、穏やかな刺激に対する正確な応答測定を得ることはできない。サ ブセットを計算するアプローチは、このように、主要な医学的病気で起こるより 恒久的な変化、例えばエイズにおけるＣＤ４”Ｔ細胞の損失などを試験するによ り適当である。従って、行動因子に対する免疫システムの応答を測定する目的で この方法を利用するには限界がある。

簡単でストレスのないサンプリングであるといった明らかな利点を有する４番目 のアプローチは、唾液内の分泌免疫グロブリンであるＩｇＡの測定を伴うもので ある（Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｒ，Ｂ、、　ｈ、池、Ｊ、　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ　 ３ニア３−８９　（１９８２）　；　５ｔｏｎｅ、＾、＾、他、Ｊ、　ＨＵＭＡ Ｎ　５ＴＲＥＳＳ　１３：１３６−１４０　（１９８７）　；ＪｅＩＩｌｍｏｔ ｔ、　Ｊ、Ｂ、　３ｄ他、ＢＥＨＡＶ、　ＭＥＤ、　１５：６３−７１　（１９ ８９）　；　Ｊｅａ＋ｍｏｔｔ、　Ｊ、ＢB ３ｄ池、Ｊ、　ＰＥＲ３，ＳＯＣ，ＰＳＹＣＨＯＬ、　５５：８０３−８１０　 （１９８８）　：　Ｊｅｗ＋ｍｏｔｔ、　Ｊ、Ｂ、　３ｄ他、ＬＡＮＣＥＴ　ｌ ：１４００−１４０２　（１９８３）　）。この唾液１ｇＡの全濃度は、未知の 抗原特異性を示す抗体の大きな集合が存在していることを反映したものである。

更に、唾液内の全１ｇＡレベルがどのように免疫システムの全体的動力学に関係 しているかは明らかでない。ＩｇＡ抗体は粘膜の表面と会合して、これらの表面 を感染から保護していると考えられている。その結果として、分泌１ｇＡは、唾 液内のみでな（気管支分泌物、初乳、ミルクおよび尿生殖器分泌物内にも見付は 出される。全体としての免疫システム活性の有効な指数として、分泌されたＩｇ Ａの監視を用いることは、問題視されている（上記５ｔｏｎｅ他；上記Ｊｅｍｍ ｏｔｔ他）。

注目すべきは、免疫システムに対する心理的ストレスの如き行動因子を試験する にとって、ストレスのない様式で体液のサンプリングを行うことができることが 特に重要である。例えば、静脈に針を刺して血液サンプルを得ることそれ自身は 、その得られるデータを汚染し得る心理的変化を生じさせ得る。従って、唾液の サイトカインまたは他の免疫システム産物レベルの測定を可能にする方法は、現 存しているアプローチに比べて下記の如きいくつかの主要な利点を有している： 例えば、（ａ）静脈切開に関連した危険およびストレスがなくなること；　（ｂ ）内部環境を見るウィンドーとして働くこと；　（Ｃ）簡単で「家に居て（ａｔ 　ｈｏｎ＋ｅ）　Ｊ採取が可能であること：　（ｄ）経時的な動的評価が可能な こと；（ｅ）脳／免疫システム相互作用を評価するための本質的に新規な手段が 得られること、（ｆ）健康に対するストレスの影響を評価する補助となる方策と して用いられること；そして（ｇ）エイズにおけるＨＩＶ感染のように、初期の 病理学的出来事が生じたあと症状が出ることに関係し得る尺度が得られること。

免疫システムが有する２種の調節分子はインターロイキン１および２（ＩＬ−１ およびＩＬ−２）である。このＩＬ−１およびＩＬ−２がサイトカインの「カス ケード」を調整する能力、およびそれに付随した細胞増殖、分化、およびリンパ 系細胞が示すエフェクター機能などは、詳細に特徴付けされている（例えばＫａ ｍｐｓｃｈｍｉｄｔ、　Ｒ，Ｆ、、Ｊ、　ＬＥＵＫ、　ＢＩＯＬ。

３６：３４１−３５５　（１９８４）　；Ｓａ＋ｉｔｈ、　Ｋ、＾１、ＡＮＮ、 　ＲＥＶ、ＩＭＭＵＮＯＬ、　２：３１９−３３３　（１９８４）　）。

最近の研究において、これらのサイトカイン類の両方が免疫システム外で恒常性 維持調節因子として作用していることが示されたように、これらの２つの分子が 示すシグナルは明らかに免疫システム内作用のみに限定されているものではない 。例えば、ＩＬ−１は、視床下部−下垂体−副腎から成る軸の有効な調節因子と して働（ことが示されており（Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ、　Ｈ，他、５ＣＩＥＮＣ Ｅ　２３３：６５２−６５４　（１９８６）　；　Ｂｅｒｎｔｏｎ、　Ｅ、Ｗ、 他、５ＣＩＥＮＣＥ　１９８７：５１９−５２１　（１９８７）　）　、一方Ｉ Ｌ−２は、ライディッヒ細胞ステロイド産生に影響を与えることが示されている （Ｇｏｕ、　Ｈ，他、ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯＧＹ　１２７：１２３４−１２３ ９　（１９９０））。研究の結果、ＩＬ−１およびＩＬ−２は、インビトロおよ びインビボにおいて直接（マクロファージまたはＴ細胞の存在なし）ホルモン依 存ヒト乳癌細胞の増殖を抑制することが示されている（Ｐａｃｉｏｔｔｉ、　Ｇ 、Ｆ他、ＭＯＬ、　ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬ、　２：４５９−４６４　（１９８８ ）；　Ｐａｃｉｏｔｔｉ、　Ｇ、　Ｆ、他、＾ＮＴＩＣＡＮＣＥＲＲＥＳ、　８ ：１２３３−１２４０　（１９８８）　；　ＰａｃｉｏｔｔｉB ＧＦ、他、＾ＮＴＩＣＡＮＣＥＲＲＥＳ、　１１：２５−３２　（１９９１）） 。従って、これらのサイトカイン類は、免疫システムにおける古典的な自己分泌 ／パラ分泌ループに影響を与えるばかりでなく内部分泌回路にも影響を与え、従 って、内分泌と免疫システムの間の相互作用を調節し得る。

「内分泌様」ホルモンとして役割を果すＩＬ−１およびＩＬ−２は、それらの仮 想標的部位に到達して影響を与えるに充分な量で存在している必要がある。従っ て、従来から免疫システムに属していると考えられている上記シグナル分子に関 する内分泌作用の生物学的基本を確かめることは、これらの分子の内因性濃度を 定量的様式で検出して監視することができるか否かに依存している。血液内で直 接ＩＬ−１およびＩＬ−２並びに池のサイトカイン類を測定する通常方法は満足 されるものでなかった。

今日まで、ＩＬ−１およびＩＬ−２に関する研究は、主に、リンパ球増殖に刺激 を与えること、並びに適応性のある免疫応答および他の形態の宿主防御における ヘルパーおよびエフェクター機能でそれらが果す役割に関するものであった。こ のような焦点を当てた結果として、これらのサイトカイン類に関する研究は、イ ンビトロで培養した細胞の刺激か、或は免疫学的病気における血液のサイトカイ ンレベルをインビボで測定することに限定されていた。最近の研究において、Ｉ Ｌ−１は循環の「内因性」成分であると見なすべきであるが、その濃度は数多く の［現実の（ｒｅａｌ　１ｉｆｅ）　Ｊ状態で変化し得ることが示されている。

一般に、ＩＬ−１およびＩＬ−２または他のサイトカイン類をインビボにおける 免疫競合の尺度として見る場合、研究者達は、白血病および関節炎の如きひどい 病態生理学的条件下の大きな濃度変化に焦点を当ててきた。更に、循環している サイトカインレベルに関する報告は、対照と比較して患者内ではそのレベルが上 昇することに関係付けられており、正常な被験者内でもＩＬ−１およびＩＬ−２ が検出され得ると共に種々の潜在的因子による調整を受け得るといった事実に対 してはほとんど注意が払われていない（Ｍｉｃｈｉｅ、　！Ｉ、Ｒ，他、ＮＥＴ 　ＥＮＧ、　Ｊ、　ＭＥＤ、　３１８：１４８１−１４８６　（１９８ｇ）　： 　Ｇｒａｕ、Ｇ、Ｅ、他、ＬＹＭＰＩＩＯＫＩＮＥ　ＲＥＳ、　７：３３５　（ １９８８）　；　５ｈｅｎｋｉｎ。

＾他、ＬＹＭＰＩＩＯＫＩＮＥ　ＲＥＳ、　７：３３３　（１９８８））。

血清または血漿内のサイトカイン類を測定することに加えて、他の生物学的流体 内でも種々のサイトカイン類が検出された。例えば、Ｋｉｍｂａｌｌ、　Ｅ、Ｃ ，他（Ｊ、　ＩＭ肛ＮＯＬ、　１３３：２５６−２６０　（１９８４）　）は、 ヒト尿内のＩＬ−１生活性を報告した。Ｔａａ＋ａｔａｎｉ、　Ｔ、他（ＩＭＭ ＵＮＯＬＯＧＹ　６５：３３７−３４２　（１９８８））は、クロマトグラフィ ーおよびバイオアッセイ方法を用いて、ヒト洋膜液内にＩＬ−１ａおよびＩＬ− １８が存在していることを開示した。同じグループは酵素イムノアッセイを用い て、ヒト洋膜液内のＩＬ−１ａおよびＩＬ−１８を測定した（Ｔｓｕｎｏｄａ、 　Ｈ，他、ＬＹＭＰＨＯＫＩＮＥ　ＲＥＳ、　７：３３３（１９８８））　。ｌ ｉｌｍｏｔｔ、　Ｒ，Ｗ、他（ＬＹＭＰＩＴＯＫＩＮＥ　ＲＥＳ、　７：３３４ 　（１９８８））は、他の病気と比較して、のう飽性線維症におけるヒト気管支 肺胞洗浄液内のＩＬ−１８（ＥＩＡによる）およびＩＬ−１生活性を測定した。

Ｋｈａｎ他０１０Ｌ、　ＣＥＬＬ、　ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬ、　５８：２２１− ２３０　（１９８８））は、ヒト卵胞液内に高レベルのＩＬ−１様生活性が存在 していることを示す報告を行った。天庖癒患者の水庖液内にリンフォトキシンが 存在していることが報告された（Ｊｅｆｆｅｓ、　Ｅ、ｆ、他、Ｊ、　ＣＬＩＮ 、　ＩＭＭＵＮＯＬ、　４：３１−３５　（１９８４））、また、ヒトの汗の中 にｌ−１が存在していることも報告された（Ｄｉｄｉｅｒｊｅａｎ他「ヒト外分 泌汗内の生物学的活性を示すインターロイキン１：ａ／Ｂ比に関する部位依存変 動、およびストレスで誘発されて上昇した分泌」、ＣＹＴＯＫＩＮＥ　２：４３ ８−４４６　（１９９０））。

ネコ（Ｃｏｃｅａｎｉ、　Ｆ、他、ＢＲＡＩＮ　ＲＥＳ、　４４６：２４５−２ ５０　（１９８８））およびヒト（例えばＰｅｔｅｒ、　Ｊ、Ｂ、他、ＮＥＵＲ ＯＬＯＧＹ　４１：１２１−１２３　（１９９１年１月）参照）の脳を髄液（Ｃ ３Ｆ）内にＩＬ−１を見付は出したことが報告された。Ｐｅｔｅｒ池（上記）は 、多発性硬化症患者および正常な対照が有するＣ５Ｆおよび血清内のＩＬ−１８ および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を試験した結果、彼らは、これらの２種の流体内 に存在している上記サイトカイン類のレベルを予後もしくは診断で利用すること はできないと結論付けた。

ｆｅｓｔａｃｏｔｔ、　Ｃ，１，他（ＡＮＮ、　Ｒ１（ＥＵＭ、　ＤＩＳ、　４ ９：６７６−６８１　（１９９０））はイムノアッセイを用いて、リウマチ性疾 患にかかった患者の滑液内のサイトカイン類を測定した（　Ｉ　Ｌ−１１３に関 してはＥＩＡ　、Ｉｔ、−２，ＴＮＦ。

ＩＦＮアルファおよびガンマに関してはＲＩＡ）。

臨床的に正常なヒトの歯肉液内で、ＩＬ−１様生活性を示す因子が検出されたが （Ｏｐｐｅｎｈｅｉｎ＋、　Ｊ、　Ｊ、他、ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴ、　ＰＲＯＣ ，１４：５５３−５５５（１９８））　、炎症を起こしていない歯肉領域よりも 炎症を起こした領域内の活性の方が高かった。この歯肉液内因子は、ＩＬ−１お よび表皮胸腺細胞活性化因子の両方に相当する分子量を示していた（Ｃｈａｒｏ ｎ、　Ｊ＾、他、ＩＮＦＥＣ，ＩＭＭＵＮ、　３８：１］９０−１１９５　（１ ９８２））　。Ｅ　Ｉ　Ａを用いたＪａｎｄｉｎｓｋｉおよび同僚による研究（ Ｊａｎｄｉｎｓｋｉ、　Ｊ、他、Ｊ、　ＤＥＮＴ、　ＲＥＳ、　６７：２３０７ 　（１９８８）；　Ｊａｎｄｊｎｓｋｊ、Ｊ、他、　Ｊ、ＤＥＮＴ、ＲＥＳ、６ ８：５２６　（１９８８）；　Ｊａｎｄｉｎｓｋｉ、Ｊ。

池、Ｊ、　ＤＥＮＴ、　ＲＥＳ、　６８：Ｉ２３３　（１９８ｇ））では、歯周 組織内にＩＬ−１σが存在している一方、歯周病にかかった患者の歯肉間隙液内 ではＩＬ、−１が主流であると報告された。組換え型ヒトＩＬ−１ａおよびＬＬ −ＩＢに対するポリクローナル抗血清を用いた最近の研究およびウェスタンブロ ッティングによる測定により、慢性的な炎症性歯周病にかかった患者の歯肉間隙 液内に見いだされるＩＬ−１生活性の主要部分は、一般に、膜結合型１ｔ−１と 見なされるＩＬ−１であることが開示された（Ｋａｂａｓｈｉｉｉ、　Ｈ他、１ ＮＦＥｃ、　ＩＭＭＵＮ、　、５８・２６２１−２６２７　（１９９０））。細 胞表面からの酵素的開裂によってＩＬ−１が誘導されるといった示唆がなされた 。この後者の研究では、歯肉液が唾液で汚染されることを避ける特別な注意が払 われた。これらの事実は、歯肉液内のＩＬ−１が唾液を基としていることに対す る強力な論争を与えている。

上に示した文献の概略から分かるであろうように、血液および他の体液内の内因 性サイトカイン類を測定する数多くの試みが行われてきた。

しかしながら、これらの報告を再考する時、血液内サイトカイン濃度および血液 内サイトカイン濃度変動に関して報告された結果が幅広く変化していることは明 らかである。

数多くの報告は、イムノアッセイを用いたのでは正常な被験者のサイトカイン類 （即ちＩＬ−２）を検出することは不可能であることを示唆している。充分に記 述されている可溶ＩＬ−２レセプタと、循環しているＩ　Ｌ−２とを結合させる ことは可能であり得る。その結合部位が、サンドイッチアッセイシステムの捕捉 用抗体による認識の障害になる可能性があり、これが、ＩＬ−２の検出を不可能 にしているように見える。

二者択一的に、この分子が捕捉されたとしても、その捕捉用抗体とその可溶ＩＬ −２レセプタの両方がＩＬ−２と結合することによる立体障害で第二抗体による 検出が邪魔され得る。実際、３番目の大きな蛋白質を結合させるに充分なスペー スは存在していない可能性がある。鍵となる要素は、これらのサンドイッチＥＬ ＩＳＡアッセイの設計では全体の一部のみの検出を可能にすることが示唆されて いる点である。

いくつかのアッセイ操作は、非常に少ない量のサイトカインを検出することを可 能にしているが、他の操作では全く検出されない。この差は、そのアッセイシス テムに関係しているか或はそのサイトカインに関係しているか或はそれの両方に 関係している可能性がある。Ｃａｎｎｏｎ、　Ｊ、Ｇ他、ＬＹＭＰＨＯＫＩＮＥ 　ＲＥＳ、、７：４５７−４６５　（１９８８）が行った観察には、この問題が 報告されており、ここでその著者は、ある種の血漿物質がそのアッセイを阻害し ている結果として検出が影響を受けることを示している。この研究において、こ れらの著者は、障害となっている物質を除去する目的で血漿のクロロホルム抽出 を行うことを推奨している。単にこれらの血漿の因子がそのアッセイの性能に影 響を与えているか或はサイトカインそれ自身に関係しているかは、この研究では 明らかでない。このような問題を更にＣａｐｐｅｒ、　Ｓ、Ｊ、他、ＣＹＴＯＫ ＩＮＥ　２：１８２−１８９　（１９９０）が記述している。、Ｃａｐｐｅｒ、 　Ｓ、Ｊ、他は、ＩＬ−１６およびＢは蛋白質と結合することを示しており、そ してこの血漿を酸性にすることによって、これらの血清に結合している蛋白質か ら上記分子を解離させると、その検出可能レベルが変化することを示している。

このマスキング問題は、インビボ源から採取した生物学的サンプルにユニークで あると見られ、インビトロ細胞培養物の上澄み液に含まれている血清結合蛋白質 は多くない。

サイトカイン「結合蛋白＠　（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　Ｊの最良例 は、循環内で見いだされる可溶Ｉ　Ｌ−２レセプタを記述しているデータから推 論され得る。この分子は、Ｔ細胞上の低親和性を示すＩＬ−２レセプタｒＴａｃ Ｊと免疫学的に類似していることが示された。Ｔ細胞が存在していない循環内に それが存在していることは、それは細胞の外側から細胞の内側にシグナルを伝達 し得るレセプタでない可能性があると言った強力な論争を与えている。しかしな がら、これらのデータは、この分子がまだＩＬ−２と結合する能力を有すること を示していない。この循環内のＩ　Ｌ−２がこの蛋白質に結合し、そしてこのよ うな結合した複合体が、「サンドインチ」アッセイによる内因性■Ｌ−２の検出 を本質的に不可能にしているものである、と言った論争を我々は与えるものであ る。

池のサイトカイン類（例えばＩＬ−１）は、それらの検出を有効に隠している血 清内の他のキャリアー分子と結合することができる。

加うるに、Ｉ　Ｌ　−１を含む種々のサイトカイン類は、特定の正常もしくは病 理上の生物学的流体の中に存在していると報告されているが、唾液または鼻分泌 物内のサイトカイン類またはリンフ才力イン類の報告は全（なされていない。実 際、インターフェロンの薬力学研究を報告している論文（Ｄｉｅｚ、　Ｒ，＾、 他、Ｊ、　ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ　ＲＥＳ、　７：５５３−５５７　（１９８７ 年１０月））には次のように述べられている：　ｒ、　、　、現在のところ、唾 液および鼻分泌物内にインターフェロンが存在しているか否かは明らかでない」 。

体液内の種々の内因性サイトカイン類濃度を簡単に、正確にそして再現可能様式 で測定することができるならば、多大な利益となり得るであろう。これにより、 免疫システムへの有効なウィンドーが作り出されるばかりでなく、生理学的に相 互作用する無数の過程への有効なウィンドーが作り出されるであろう。このよう な手段は、種々の環境で有効性を示すことで、基本的な医科学、臨床薬剤、疫学 および法廷科学にとって重要なデータ集積を可能にするであろう。

必要とされている方法は、循環しているサイトカインに結合し得る結合蛋白質の 影響を受けないで血液の正確なサイトカイン濃度をもたらす、血液内の内因性サ イトカイン類を測定する信頼できる方法である。加うるに、唾液または鼻分泌物 の如き生物学的流体内のサイトカイン類を測定することが可能であるならば、個 体の免疫システムの分析が簡潔になり、これによって恐らくは、培養物内でこれ らの細胞が示す行動を長期間に渡って分析する、厄介でありそして高い変動性を 示すアッセイを用いることに取って代わるであろう。

本発明は、ヒトまたは動物内の内因性サイトカイン類の検出および監視で用いる ための競合固相イムノアッセイである。この競合固相イムノアッセイは、「サン ドインチ」アッセイよりはむしろ「１部位」イムノアッセイである。本発明は、 血液および他の生物学的流体内の内因性サイトカインレベルを測定するに特に有 効である。従来技術の方法では、サイトカインに結合する蛋白質（または池の血 液産物）が明らかにそのサイトカイン蛋白質を隠していることから、血液内のサ イトカインレベルを信頼できる様式で測定することはできなかった。本発明を用 いてサイトカイン類を測定することにより、特別なサイトカインの濃度を正確に 測定することができる。加うるに、本発明は、唾液、鼻分泌物および涙の如き流 体内の内因性サイトカイン類の測定で特に有効である。

本発明は、体液のサンプリングが容易であることにより、「正常な」並びに「刺 激された」レベルのサイトカイン類を測定することを可能にするものである。本 発明は、病原体、化学品、治療薬、並びに生行動因子によるチャレンジに直面し た時の、これらの化学的伝達シグナルおよびそれらの調節不良（ｄｙｓｒｅｇｕ ｌａｔｉｏｎ）を監視する新規な手段を提供するものである。

従って、本発明はまた、新規な競合イムノアッセイを用いてヒトまたは動物の唾 液または鼻分泌物内のサイトカイン濃度を測定することを含む、ヒトまたは動物 内のサイトカインレベルを非侵入測定する方法を意図したものである。このイム ノアッセイは、酵素イムノアッセイであるか、或は放射能元素、蛍光標識などの 池の標識を用いたイムノアッセイであり得る。

本発明は、血液および池の体液内の蛋白質を測定するに特に有効であり、これら の蛋白質には、これに限定されるものではないが、インターロイキン−１ａ、イ ンターロイキン−１１３，インターロイキン−２、インターロイキン−６、イン ターフェロン−アルファ、インターフェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−アル ファを含む群から選択される蛋白質が含まれる。本発明は、まだ特徴付けされて いないところの、血液内の他のサイトカイン様分子を検出して定量するに有効で あると考えられる。

別の具体例において、本発明は、被験者の血液でない体液内のサイトカイン濃度 を測定することを含む、被験者の免疫学的活性を監視する方法を意図したもので ある。好適な具体例において、この体液は唾液である。別の具体例において、こ の体液は鼻分泌物である。

従って、本発明の１つの目的は、ヒトまたは動物の体液内の内因性サイトカイン 濃度を正確に測定する方法を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、ヒトまたは動物の血液内の内因性サイトカイン濃度を 正確に測定する方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、唾液および鼻分泌物内の内因性サイトカイン濃度を正確に 測定する方法を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、体液内のサイトカイン濃度を病理学的状態に関係させ 得る方法を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、サイトカイン類を測定する方法を提供することにある 。

本発明の別の目的は、これらの試験を行うための臨床的環境を必要としない、サ イトカインレベルを監視する方法を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、行動上の不安定さに応答したサイトカインレベルを評 価して測定する方法を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、化学的、ウィルスまたは細菌のチャレンジに対する応 答として、サイトカインレベルを評価する方法を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、同じ病気の過程の間に生じるサイトヵインレベルを監 視する方法を提供することにある。

本発明の１一つの目的は、病気の危険を示す指数としてサイトカインレベル測定 を用いる方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、臨床的信号の指示としてサイトカインレベルを用いる方法 を提供することにある。

本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、以下に開示する具体例および 添付請求の範囲の詳述を再考することで明らかになるである図１は、組換え型ヒ トインターロイキン−１ａに対するラビットポリクローナル抗血清の相対的抗体 タイターを示すグラフである。

図２は、クロマトグラフィーを受けさせた抗ＩＬ−１抗血清の画分が示す免疫反 応性を表すグラフである。

図３は、ＥＩＡにおけるアッセイ希釈液に関するＩＬ−１ａ標準曲線を示すグラ フである。

図４は、ＩＬ−１ａに特異的なＥＩＡに関する血清平行性をを示すグラフである 。このグラフは、図３のデータをロジット変換したものであり、ＩＬ−１σＥＩ Ａの血清平行性の確認である。

図５は、ＥＩＡにおけるアッセイ希釈液（図４）に関するＩ　Ｌ−２標準曲線を 示すグラフである。

図６は、図４に関して行った血清平行性を示すグラフである。

図７は、サイトカインでスパイクされている（ｓｐｉｋｅｄ）血清をＩＬ−１（ 図７Ａ）またはＩＬ−２（図７Ｂ）に特異的な抗体で処理し分別したＨＰＬＣ確 認を示すグラフである。

図８は、１７ｋＤａのＷＨＯ標準（レーン１）と−緒に泳動する免疫反応性材料 の単−帯を示すウェスタンプロットである。

図９から１１は各々、３人の正常な女性志願者由来のＩＬ−１ａおよびＩＬ−２ の２４時間プロファイルを示すグラフである。

図１２は、唾液内のＩＬ−１ａ免疫反応性を示すグラフである。唾液を１：５． １：５０および１：５００に希釈し、そしてこの希釈の対数としてプロットした 。

図１３は、唾液内のＩＬ−２免疫反応性を示すグラフである（図９と同様に希釈 ）。

図１４から２０は、肉体的および心理的ストレスを受けた４人の被験者における 唾液のＩＬ−１およびＩＬ−２レベルを示している。

図２１は、唾液内ＩＬ−２免疫反応性とＩＬ−２標準とのＨＰＬＣ分離を示して いる。

詳細な説明 本発明は、ヒトまたは動物由来の生物学的流体、例えば血液、唾液、鼻分泌物ま たは涙などの中のサイトカインレベルを測定する方法を提供するものである。通 常のアッセイにおいてサイトカイン活性を隠していたサイトカイン結合蛋白質が 存在していたとしても、本発明に従い、血液内のサイトカイン型蛋白質を正確に 測定することができる。

これらの方法は、被験者の免疫学的活性を監視するに特に有効である。

このような監視は、（１）サイトカイン免疫治療または他の形態の治療を受けて いる被験者、（２）唾液のリンフ才力インまたはサイトカインレベルが異常な免 疫学的障害を有する患者、（３）免疫機能に対する行動の影響の効果を試験すべ き個人などで用いられ得る。これらの方法は、種々の生行動刺激、例えば心理社 会学的（ｐｓｙｃｈｏｓｏｃｉａｌ）ストレスに応答する個人における免疫学的 活性を非侵入様式およびストレスのない様式で監視するに特によく適合している 。

本発明の方法は、これに限定されるものではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ｌ− ４、ＩＩ、−６、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファおよび ＴＮＦ−ベータなどを含む数多（の公知サイトヵイン類またはリンフ才力イン類 のいずれかが存在していることを検出するか或はそれの濃度またはレベルを測定 する目的で用いられ得る。

本発明者らは、血清並びに唾液および鼻分泌物内のサイトカイン類を正確に測定 する目的で用いられ得る競合ＥＩＡを開発した。唾液および鼻分泌物内のサイト カイン類を測定することが可能なことより、血液よりも容易に入手可能な体液内 の該蛋白質を測定することが可能になる。

本発明は、好適にはポリクローナル抗体を基としている１部位アッセインステム のいずれかを１０している。本発明者らは、サイトカインは生物学的流体内の他 の分子と結合するが、部位認識で利用され得るその分子の部分は少なくとも一部 であることを発見した。この部位はポリクローナル抗体結合を達成することが可 能であり、これが、１部位システムを用いてそれを検出することを可能にしてい る。

このような仮定は、本発明者らが行った直接的観察によって更に支持されている 。ｆＬ−２サンドイツチアツセイを用いて細胞培養物の上澄み液および血漿サン プルを試験した研究において、培養物の上澄み液内のＩＬ−２は検出可能である が、血漿サンプル内のそれは検出不可能であることが確認された。次に、これら の血漿サンプルを５７℃で３０分間加熱した。これらのサンプルを再び分析した 結果、ＩＬ−２レベルの検出は可能であった。これらのデータは、２部位アッセ イは厄介であり、１部位ポリクローナル抗体システムの開発を示唆していた。こ の１部位システムは、さらなる処理を行うことなく、通常の血清または血漿内の ＩＬ−２検出を可能にするものである。実際、この血清を上述したように加熱す ると、加熱していないサンプルに比較して、検出されるＩＬ−２が少なくなる。

これらは観察は、下記によって説明され得る。サンドイッチアッセイを用いた場 合、加熱すると、いずれとも比較しないで何かを見ることになる。しかしながら 、この競合アッセイシステムを用いる場合、その全体は既に検出されている。

本発明の方法は、免疫システムに関する迅速で敏感な動的「スナップショット」 が得られる新規な手段を基礎的研究者および臨床医の両方に与えるものである。

本発明の方法を用いることで、エイズまたは自己免疫病などにおける主要な崩壊 が生じている間ばかりでなく、通常のストレスを受けた生活上の出来事に呼応し た、ヒトまたは動物内の免疫システムの状態を示す、より明確な図を得ることが 可能になる。このような情報は、免疫システムに対する影響を通して健康または 病気を助長する種々の因子に関する知識を増大させ得ると共に、健康促進行動に 関して、個人、ヘルスケア提供者および社会がより理論的な決定を充分に行うこ とを可能にするものである。

生物学的流体内のサイトカインレベルを測定するための本発明の方法は、典型的 には、このサイトカインに結合し得る抗体の存在下でその生物学的流体を培養し て、その抗体に結合するか或は結合しないサイトカイン量を検出することを含ん でいる。

通常のイムノアッセイ、特にＥＩＡは、本分野でよく知られている（例えばＶｏ ｌｌｅｒ、＾９、ＤＩＡＧＮＯ３ＴＩＣＨＯＲＩＺＯＮＳ　２：ｌ−７、Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ　Ｐｕ ｂｌｉｃａｔｉｏｎ、　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　（１９７ｇ）　； 　Ｖｏｌｌｅｒ、＾B 他、ＢＵＬＬ、　ＷＨＯ５３：５５−６５　（１９７６）：　Ｖｏｌｌｅｒ、＾ 、他、Ｊ、　ＣＬＩＮ、　ＰＡＴＩＩＯＬ、　３１：５０７−５２０　（１９７ ８）　；　Ｂｕｔｌｅｒ、　Ｊ、Ｅ、、ＭＥＴＬ　ＥＮＺＹＭＯＬ、　７３：４ ８２−５２３　（１９８１）；ｌｌａｇｇｉｏ、　Ｅ、　（編集）、ＥＮＺＹＭ Ｅ　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹｌＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ。

ＦＬ　（１９８０）　；　Ｈｅｖｅｙ他、米国特許第４．２２８．２３７号；　 Ｐａｒｉｋｈ他、米国特許第４、２９８．６８５号（これらの引用文献はここで は参照にいれられる））。

本発明者らは、生物学的材料内のホルモン類および成長因子を測定するための新 規な競合形態の酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）（またＰｌｅ ｂａｎｉ他、Ｊ、　ＩＭＭＵＮＯＬ、　ＭＥＴＨ，９０：２４１　（１９８６） も参照）を開発した。未知のりガント、例えばサイトカインなどを検出する様式 は、競合ラジオイムノアッセイのそれに類似している。簡単に言えば、標識を付 けた被検体、例えば標識を付けたビオチニル化ＩＬ−１の特異的量は、制限され た数の抗体結合部位に関して、標識を付けていないＩＬ−１と競合状態にある（ 未知のサンプル内か或は標準内において）。

上述した方法は、好適にはイムノアッセイであり、より好適には酵素イムノアッ セイであり、最も好適には競合酵素イムノアッセイである。

」二連した方法は、被験者の免疫学的活性を監視する方法を提供するものであり 、ここでの測定は１回以上行われる。更に、上述した方法は、被験者におけるサ イトカイン治療を監視する方法を提供するものであり、ここで監視されるべき被 験者は、サイトカイン治療を受けている人である。好適には、監視されるべきサ イトカインは、免疫治療を示すサイトカインである。

本発明の好適な具体例において、このアッセイの第一段階では、サイトカイン分 子上の数多くのエピトープ類を認識する抗体、好適にはラビットポリクローナル 抗体を、固相支持体または担体、好適にはポリスチレン製ＥＩＡプレートのウェ ルの上に吸着させる。次に、この「捕捉用抗体」として知られている抗体を用い て、これを、そのサンプルまたは標準内の、その標識を付けた被検体、例えばビ オチニル化したＩＬ−１と、標識を付けていない被検体と結合させる。適当な洗 浄段階を行った後、その標識のための酵素接合結合相手、例えばストレプトアビ ジンまたは抗ビオチン抗体などを、その抗体−被検体複合体と一緒に培養するこ とにより、その酵素をその複合体に結合させる。結合していない酵素接合結合相 手のいずれも除去した後、色素形成する酵素基質を添加する。この結合した酵素 が、その基質を着色生成物に変化させ、これを比色手段で検出することができる 。単位時間当たりに現れる色度合は、そのサンプルの中に存在している被検体量 に反比例している。被検体、例えばＩＬ−１の濃度が上昇するにつれて、その発 生する色度合が低下する。これは、固定量の固定化抗体への結合に関して、この サンプル内に存在している多量のＩＬ−１と固定量のビオチニル化ＩＬ−１とが 成功裏に競合し、そしてその結合した標識なしのＩＬ−１は、その結果として、 次に起こる結合相手−酵素複合体の結合を生じないからである。

本発明に従う競合ＥＩＡは、迅速に、好適には７時間以内に行うことができるよ うに設計されているが、これを−晩アッセイとして用いる柔軟性も有している。

このアッセイの好適な形態において、これの最初の２時間の間、その捕捉用抗体 、好適にはラビット抗ヒトサイトカイン抗体を、９６個ウェルのイムノプレート のウェルに吸着させる。次の２時間の間に、結合していない抗体をそのプレート から洗い流した後、標準もしくは未知物と共に、特定量の標識サイトカイン、好 適にはビオチニル化すイト力インを添加する。次に、その結合相手、好適には酵 素、好適にはアルカリ性ホスファターゼに接合させたストレプトアビジンを添加 した後、色素形成基質、好適にはｐ−ニトロフェニルホスフェートを添加するこ とによって、その結合した標識サイトカイン量を検出する。

次に、その得られる色を、適当な波長、例えばｐ−ニトロフェニルホスフェート の二ナトリウムに関しては４０５ｎｍの波長における吸収（または光学密度、Ｏ Ｄ、）として読み取る。この色は、いくつかの時点、例えば４時間および２４時 間で、比色計、例えばＥＬＩＳＡプレート読み装置を用いて読み取られ得る。

言葉「固相支持体」は、抗原もしくは抗体と結合し得る如何なる支持体も意味し ている。よく知られている支持体または担体には、これに限定されるものではな いが、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、デキストラン、 ナイロン、アミラーゼ類、天然もしくは改質セルロース類、ポリアクリルアミド 類、アガロース類および磁鉄鉱などが含まれる。この支持体材料は、その抗原が 抗体に結合し得る限り、本質的に如何なる構造配置を有していてもよい。従って 、この支持体の構造はビードの如く球形であるか、試験管の内部表面の如（筒状 であるか、或は棒の外部表面などであってもよい。二者択一的に、この表面はノ ート、試験片などの如く平らであってもよい。好適な担体は、ポリスチレン製ミ クロタイタープレートウェルの底または側面である。本分野の技術者は、抗体ま たは抗原と結合させるための数多くの他の適切な担体を認識しているか、或は常 規実験を用いて上記を確かめることができるであろう。

被検体、例えばサイトカイン（或は以下に記述する如き抗すイト力イン抗体）に 標識を付ける好適な方法は、ＥＩＡで酵素に接合させる結合相手と結合し得る標 識にそれを連結させる方法である。この酵素は、今度は、後でその基質に暴露さ れると、分光光度測定、蛍光測定または可視手段などで検出され得る化学的部分 を生じるような様式で、その基質と反応する。本発明のＥＩＡ方法で有効な酵素 には、これに限定されるものではないが、アルカリ性ホスファターゼ、グルコー スオキシダーゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、ブドウ球 菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒド ロゲナーゼ、アルファーグリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホ スフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アスパラギナーゼ、リ ボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒ ドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼなどが含ま れる。

蛍光を示す化合物を用いてその被検体（または抗体）に標識を付けることも可能 である。蛍光標識を付けた結合被検体を、適当な波長を有する光に暴露すると、 これは発光することからその存在が検出され得る。

最も通常に用いられている蛍光標識用化合物の中には、フルオレセインイソチオ シネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコンアニン、アロピコシアニン 、０−フタルデヒドおよびフルオレサミンなどがある。

蛍光を発する金属、例えば１３１Ｅｕ、またはランタニド群の他のものを用いて 、被検体または抗体に標識を付けることができる。これらの金属は、ジエチレン −トリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤ ＴＡ）の如き金属キレート群を用いて、その被検体または抗体に結合させ得る。

この被検体または抗体を化学発光化合物に連成させることによっても、それに標 識を付けることができる。化学発光標識が付いている結合分子が存在しているこ とを、その化学反応過程の間に生じる発光の存在を検出することによって測定す る。特に有効な化学発光標識用化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テ ロマチイック（ｔｈｅｒｏ■ａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール 、アクリジニウム塩およびしゅう酸エステルなどである。

同様に、主発光化合物を用いてその被検体または抗体に標識を付けることができ る。主発光は、生物学的システムの中で見いだされる種類の化学発光であり、こ こでは、触媒蛋白質がその化学発光反応の効率を上昇させている。発光の存在を 検出することにより、主発光蛋白質の存在を測定する。標識を付けるに重要な主 発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンなどである。

酵素イムノアッセイを用いることに加えて、本発明の方法は、池の種々のイムノ アッセイのいずれかを用いてサイトカインのレベルを測定することができる。例 えば、サイトカイン（または以下に示す如き、サイトカインに特異的な抗体また は抗体フラグメント）を放射能標識することにより、ラジオイムノアッセイ（Ｒ Ｉ　Ａ）の使用を通してサイトカインを検出することも可能である。ＲＩＡに関 する良好な説明が、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、　Ｂ、著、ｒＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　 ＯＦ　ＲＡＤＩＯＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳＪ　ノｒ放射リガンドアッセイ技術 に関する第七トレーニング過程Ｊ　、Ｔｈｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　５ｏｃｉｅ ｔｙ、　１−５頁、４６−４９頁および６８−７８頁（１９８６年３月）の中に 見付は出され得る。

そしてまた、Ｗｏｒｋ　Ｔ、　Ｓ、他著「分子生物学における実験室技術および 生化学Ｊ　（ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　ＡＮＤ　ＢＩＯＣ ＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ）　、Ｎｏｒｔｈ 　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｓ＋ｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ　（１９７ｇ）　も参照のこと。

ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターなどの如き手段を用いるか 或はオートラジオグラフィーなどを用いることで、放射性アイソトープを検出す ることができる。本発明の目的で特に有効なアイソ）−フ類１ｔ、３）（、Ｉｔ １５１１電！＋■、３８３．盲’Ｃオヨヒ好ｊｌｌ：ハ”’　Ｉ　テ、ｔ１＋る 。

よく知られている方法に従って、与えられたロットの抗すイト力イン抗体が示す 結合活性を測定することができる。本分野の技術者は、常規実験を用いることに より、各々の測定で用いられ得る最適なアッセイ条件を決定することができるで あろう。

特別な状態に通常であるか或は必要とされている如き、洗浄、撹拌、振とう、濾 過などの如き他の段階をこれらのアッセイに加えることも可能である。

標識を付けた抗体またはその標識を付けた被検体のための結合相手の検出は、例 えばもしその検出可能標識が放射性を示すガンマ発光体である場合、シンチレー ションカウンターを用いることで達成されるか、或は例えばその標識が蛍光材料 である場合、蛍光測定装置を用いて達成され得る。酵素標識または色素形成基質 の場合の検出は、比色方法を用いて達成され得る。同様に調製した標準物質との 比較において、基質が示す酵素反応の度合を可視的に比較することによっても、 検出を行うことができる。

本発明の１つの具体例において、唾液または鼻分泌物などの如き体液を試験管の 中に集める。例えば、適当に位置させた収集用容器の中に被験者の唾液を吐き出 させるか或は流し込ませるようにその被験者に依頼する。唾液分泌の刺激物、例 えばチューインガム片または結晶性刺激物、例えばクエン酸飲料ミックスまたは 酸っばいキャンディ−などを用いて、その唾液の流出を増強してもよい。

別の具体例において、より洗練された収集操作は、歯科用綿を用いて浄化された 唾液抽出物を伴うものである。好適な具体例は、糖が入っていない粉末飲料ミッ クスをその歯科用綿にコートすることで、唾液分泌のための刺激物および唾液収 集のための「液だめ」の両方として用いる。

次に、５ｃｃの使い捨て用プラスチック製シリンジの胴部の中にその飽和させた 綿を置くことで、浄化された唾液を抽出する。プランジャーを再びその胴部の中 に挿入して、そのシリンジの先端の所に収集用試験管を實（。次に、この歯科用 綿を圧縮することで、その綿から、浄化された唾液を押し出させる。

別の具体例において、より洗練された収集装置、例えば経口拡散液だめ（ｆａｄ ｅ、　Ｓ、Ｅ、の米国特許第４．５９４．３２６号、米国特許第４．７９８．２ ０７号（ここではそれらの全体が参照にいれられる））などを用いることができ る。

上記装置は、流体、好適には唾液内の物質濃度を時間積分（ｔｉｍｅ−ｉｎｔｅ ｇｒａｔｅｄ）様式で測定することを可能にするものである。この装置を、被験 者の］」に取り付け、受動的な拡散により、興味の持たれている化合物、好適に は本文中で記述する如きサイトカインをそれに集める。この装置は、透析膜の如 き選択的透過性を示す膜で覆われている小さな口が多数輛わっている、小型の密 封されたプラスチック製シリンダーである。これらの口は、測定すべき物質を拡 散させるための制限された通路を限定しており、上記物質は、それの濃度勾配に 関係して、その装置の中に集められる。測定すべき物質と結合し得る物質、例え ばサイトカインに特異的な抗体などをこの装置の内部チャンバの中に供給するこ とによって、勾配を維持することができる。より最近になって、ヒト唾液内コル チコステロイド類の時間積分測定を行う目的で上記装置を利用することが示され た（Ｗａｄｅ、　Ｓ、Ｅ、他、ＣＬＩＮ、　ＣＨＥＭ、　３７：１１６６−１１ ７２　（１９９１）　）、これらの研究は、（ａ）その装置によるホルモンの吸 収速度は、それが用いられている媒体が示す質量流量の影響を受けないこと、（ ｂ）唾液が本質的に血液で汚染されていても、その装置の性能は影響を受けない こと、（Ｃ）ホルモン濃度が偶然的に極めて変化した時でも、この装置はそれの 総和を正確に示すことができること、そして（ｄ）ヒト被験者由来の唾液に関す る個人差を容易に示すことが可能なことを示している。

本発明はまた、本発明の方法で用いるための試験キットを提供する。

本発明のキットは、体液、好適には唾液または鼻分泌物内のサイトカイン類を測 定するに有効性を示す。各キットには、生物学的流体、例えば唾液などの収集、 アッセイ方法および結果の解釈などに関する詳細な指示が含まれている。このキ ットを、好適には、Ｆ　Ｄ　Ａ　（Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ＾ｄｍｉｎｉｓ ｔｒａｔｉｏｎ）が医学装置として認可するインビトロ診断製品に適用可能な品 質保証操作の下で組み立てる。

好適な具体例において、このキットには、（ａ）上記唾液または鼻分泌物を集め るための容器手段；（ｂ）測定すべきサイトカインに特異性を示す第一結合相手 が入って０る第二容器： （Ｃ）標識を付けた形態の精製サイトカインが入っている第三容器；および （ｄ）上記標識を付けたサイトカモン上の上記標識のための第二結合相手が入っ ている第四容器； が脩わっている。上記キットには、好適には（ｅ）固相担体 が更に脩わっている。

好適な様式において、１つのキットの中には、８０種の未知物の分析（二重に） を行うに充分な試薬が入っている。

好適には、このキットには、生物学的流体を集めるための装置、例えば唾液用サ ンプリング管、上述した如き受動的経口拡散液だめ力１或（まそれの同等物、或 は鼻分泌物を得るためのアスピレータ−など力（備わっている。任意に、このキ ットには、体液の産生またはそれ力（流れ出すのを刺激するための物質、例えば 唾液が流れ出すのを刺激するためのチューインガム、鼻の分泌を刺激するための メタコリンなどが含まれて０る。

好適な具体例において、本発明のキ・ソトには、（１）測定すべきサイトカイン に特異的な捕捉用抗体：（２）ＩＩ識を付けた形態の精製サイトカイン。

（３）アッセイＦｌｌ準として働かせるための標準ヒトサイトカイン；および （４）標識を付けｊコサイトカイン上の標識のための酵素接合結合相手：が含ま れている。

このキットには、任意に、 （５）該酵素のための色素形成物質： （６）１５．９ｇ／ＬのＮ　ａ　！　ＣＯｓ、２９．３ｇ／ＬのＮ　ａ　ＨＣＯ ｓおよび０．１からｌａｇ／ｍｔ、のゼラチンを含んでいるコーティング緩衝液 ： （７）標準希釈液； （８）基質用緩衝液； （９）洗浄用緩衝液；および （１０）９６個ウェルのポリスチレン製ＥＩＡプレートが２枚：含まれている。

好適な具体例において、ＩＬ−１ａを測定するための本発明のキットには、 （１）精製したポリクローナルラビット抗ヒトＩＬ−１ａ抗体（捕捉用抗体）： （２）ビオチン接合させたヒト組換え型ＩＬヒト組換え型ＩＬ−１σ；および （３）アルカリ性ホスファターゼに接合させたストレプトアビジン：が含まれて いる。

好適な具体例において、上述した如きキットには、追加的に、（４）ｐ−ニトロ フェニルホスフェートの二ナトリウム（基質）；（５）１５．９ｇ／ＬのＮａ２ ＣＯ３，２９，３ｇ／ＬのＮａＨＣＯｓおよび４０ｍｇ／ＬのＢＳＡを含んでい るコーティング緩衝液。

（６）０．１％のＢＳＡと０．１％のＮａＮ、を補った燐酸塩緩衝食塩水（ｐｌ ■７．４）を含んでいる標準希釈液；（７）１．２５５ｇ／ＬのＮａ２ＣＯ３， ０，８４４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３および０．２０３ｇ／ＬのＭ　ｇ　Ｃｌ　２を 含んでいる基質用緩衝液；（８）０．２％（７）Ｔｗｅｅｎ−２０と０．　１％ のＮａＮ３を補ったＰＢＳを含んでいる洗浄用緩衝液。

（９）９６個ウェルのポリスチレン製ＥＬＩ　ＳＡプレートが２枚；含まれてい る。

上記キットには、小びん、試験管などの容器の１個以上を密に限定された状態で その中に入れるように区分された担体が含まれており、上記容器の各々には、イ ムノアッセイの個々の要素が含まれている。

例えば、流体相の捕捉用抗体が入っているか、或は二者択一的に、固相支持体の 上に既に固定されている捕捉用抗体が入っている容器であってもよい。さらなる 容器には、標識を付けた（例えばビオチン接合させたか或は酵素接合さぜた）サ イトカインか、或は溶液内の標識抗体が含まれている。さらなる容器には、検出 すべきサイトカインを連続希釈することを包括するｌｌｌ！準が含まれていても よい。サイＩ・カインの標準溶液を用いて、横軸上にサイトカイン濃度をプロッ トしそして縦軸上に検出シグナルをプロットした標準曲線を作成する。サイトカ インが含まれているサンプル、例えば唾液などから得られる結果を、上記プロッ トから補間を行うことで、サイトカイン濃度を得ることができる。

上述したキットでは、インターロイキン−１ａ、インターロイキン−ＩＢ、イン ターロイキン−２、インターロイキン−６、インターフェロン−アルファ、イン ターフェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−アルファを含む群から選択さ第１る サイトカインが好適である。最も好適には、このサイトカインはインターロイキ ン−１ａ、インターロイキン−ＩＢまたはインターロイキン−２である。

上述したキットの１つの具体例において、このサイトカインに好適な標識はビオ チンであり、好適な第二結合相手はストレプトアビジンである。好適な具体例に おいて、第一結合相手は、サイトカインに特異的な捕捉用抗体であり、その第二 結合相手は酵素接合結合相手、好適には酵素接合ストレプトアビジンである。好 適には、この酵素はアルカリ性ホスファターゼである。このキットは、追加的に 、この酵素のための色素形成基質を含んでいてもよい。

本発明のキットには、生物学的流体、例えば唾液などの収集、分析方法およびそ の結果の解釈などに関する詳細な指示が含まれている。キット形態の中に組み込 まれ得るアッセイの種類は多く、それには例えば競合アッセイおよび非競合アッ セイが含まれ、そしてこれらには、ＲＩ　Ａ。

ＥＩＡＳＥＬＩＳＡｌ並びに免疫測定（ｉｍｌｌｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）もしくは サンドイッチイムノアッセイなどが含まれる。

本発明の方法は、静脈切開によるサンプル収集に関連した危険およびストレスを なくさせるものである。本発明のアッセイ方法は、正常および病気両方の、ヒト もしくは動物被験者における研究を容易にする有効な監視手段を提供するもので ある。本発明の方法は、まず第一に、ヒトの免疫システムを研究しようとしてい る人、例えば脳−免疫システムの相互作用に興味を示している研究者にか、或は サイトカイン類か、サイトカインレベルに影響を与える薬剤か、或は免疫システ ムに作用しそして唾液の如き体液内のサイトカイン濃度が変化するとき影響を受 け得る作用を示す薬剤などを用いて治療したΦ者を追跡している医者の手に、！ ｌＩ潔で、侵入性を示さず、信頼性が高く、再現性を示すと共に客観的分析装置 を渡すことである。

ここに本発明を一般的に記述して来たが、説明として提供しそして特に明記され ていない限り本発明を制限することを意図したものでない下記の実施例を参照す ることにより、上記がより容易に理解されるである体重が約２−３ｋｇの、病原 体を有していないニューシーラント白色ラビットを、その各動物から免疫前の血 液サンプルを得るに先立って、病原体のない施設の中で２週間隔離して環境に慣 らす。この前免疫採血して１週間後、抗原溶液と金を２：１の比率で混合したア ルカリ性ｐＨを有するコロイド状金を含んでいる１：１希釈の免疫原性エンハン サ−（＾５ｓａｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、）を、５００ａｇの各ペプチ ドと混合する。このエンハンサ−を用いることで、そのペプチドを、他のより大 型でより高い抗原性を示す分子、例えばＢＳＡまたはＫ　Ｌ　Ｈなどと先に接合 させることなく、免疫原性を示す分子としてそれらを働かせることが可能になる 。この第一免疫化では、そのペプチド−アジュバント混合物をフロイント完全ア ジュバントの中に乳化させた後、１匹のラビットに皮下注射する。２週間後、こ のペプチド／エンハンサ−混合物をフロインド不完全アジュバントの中に乳化さ せた後、皮下注射する。この注射を行って３日後、耳の静脈を通して血液を５ｍ Ｌ取り出し、そしてその得られる血清の抗体タイターを試験する（以下に示す） 。その２番目の注射を行って約２週間後、各ラビットに、ペプチド／エンハンサ −混合物のみを追加し、そして４日後採血した。後で行う、そのペプチド／エン ハンサ−混合物のみが入っている注射と採血を、月に一度行う。

ＩＬ−１およびＩ　Ｌ−２抗血清の滴定および精製ＩＬ−１またはＩＬ−２の２ 番目の注射をラビットに行った後、血液サンプルを５ｍＬ取り出して、その血清 の抗体タイターを試験した。図１ａは、その免疫原性エンハンサ−がＩＬ−１ａ に特異的な抗血清を非常に高いタイターで生じさせることを容易にしていること を示している。

示すように、混ぜ物が入っていない血清を２対数希釈（即ち１　：　１００希釈 からｔ：ｔｏ、ｏｏｏ希釈）しても、その発生するシグナルは低下しない。ＩＬ −２に特異的な抗血清に関しても同様なタイターが観察される。これらの抗血清 タイターは高いが、その混ぜ物が入っていない血清は、許容されない背景色が発 生することから、さらなるアッセイ開発で用いることはできない。その結果とし て、両方の抗血清共、以下に示す如き精製を行った。

混合イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー（Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅ ｒ、　Ｉｎｃ、、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、　ＮＪ）を用いて、各ポリクロー ナル抗血清の精製を行う。２５ｍＭのＭＥＳ　（２−［Ｎ−モルホリノ］エタン スルホン酸）の中に入っている０から０．７５ＭのＮａＣｌ−次勾配（ＮａＣＩ なしの時ｐＨ５，６，０，７５ＭのＮａＣ１の時ｐＨ７，０）を用いて、そのカ ラムから樹脂結合抗体を溶離させる。５ｍＬの両分を集めて蛋白質含有量を分析 する（２８０ｎｍの吸収）。直接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いて、特異 的抗体の存在を試験する。アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ラビット抗体を 用いてラビット抗体を検出する。ノイズに対するシグナルの比率が５以上である 両分をプールして、ＰＢＳに対して透析する。その得られるプールした一定分量 を、それらの個々のＥＩＡのための抗体溶液として用いる。

ＩＩ、−１ａ抗血清の混合イオン交換精製で観察された典型的なりロマトグラム を、図２に示す。この樹脂は、この血清を主要な２つの両分に分配し、その１つ の両分には、アルブミンおよびトランスフェリンの如き血清不純物が含まれてお り（画分１−１０・黒丸）、そしてもう１つの両分には、免疫グロブリンが非常 に豊富な両分が含まれている（画分１２−３０：穴の開いた丸）。試験を行った 後、ノイズに対するシグナル比が５もしくはそれより良好な両分のみをプールし て、ＰＢＳに対して透析を行う（図２：穴の開いた丸）。

実施例ＩＩ 直接および競合酵素イムノアッセイ １、　抗血清の滴定 両方のペプチドに関して試験した血液（ｂｌｅｅｄ）　、そしてその後行った全 ての産生血液を、直接ＥＩＡにより相対的抗体タイターに関して試験した。ｔ　 Ｌ−ｉまたはＩＬ−２のどちらかを、濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるようにコーテ ィングｌ１１７液（１５，９ｇ／ＬのＮａ１ＣＯ３，２９゜３ｇ／ＬのＮａＨＣ Ｏ，、ｐＨ９，６）で希釈する。この溶液の１００ＩＩＬ、を、９６個ウェルの ミクロタイタープレートの中の１６個のウェルに分配した後、室温で２時間培養 する。この培養を行っている間、その前免疫血液および谷ペプチドのための試験 血液の両方から得られる血清サンプルを、アッセイ希釈液（Ｎ　ａ　Ｎ３が０． 　１％入っている燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ））で１・１００．１・ｉ、ｏｏｏ 、１：１０．０Ｏ０および１：１００，１００に希釈する。

培養後、これらのウェルを３００１１Ｌの洗浄用緩衝液（ＰＢＳ中０゜２％のＴ ｗｅｅｎ−２０溶液）で洗浄し、そして指示したウェルに、その希釈した血清を １００ル加えて、１時間培養する。この培養に続いて、これらのウェルを洗浄用 緩衝液で洗浄した後、各ウェルに１００μＬのアルカリ性ホスファターゼ接合ヤ ギ抗ラビット抗血清を添加する。この混合物を１時間培養した後、洗浄を行う。

ＥＬＩＳＡプレート読み装置を用　゛いて１５分以内に、色素形成基質であるｐ −ニトロフェニルポスフェートの二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｆｆｉｉｃ ａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＮＯ）と色反応（４０５ｎｍにおける吸 収：Ａ４０５）を測定する。

２、１Ｌ−１およびＩＬ−２の測定 精製した、ＩＬ−１またはＩＬ−２に対する抗血清を、コーティング緩衝液で１ ：１０．０００に希釈した後、ミクロプレートのウェルに１００ル加え、そして ２時間培養する。次に、これらのウェルを洗浄用緩衝液で洗浄した後、標準また は未知サンプルを５ｏルの量で加え、そして１時間培養する。ｉｔ、−１または 目７−２の６種の濃度（１００゜２５．６２５．１，５６３．０．３９および０ ．０９８ｎｇ／ｍｌ、）を用いて標準曲線を作成する。起こり得るマトリックス の影響を考慮して、アッセイ希釈液でか、或は内因性Ｉ　Ｌ−１もしくはＩＬ− ２を前吸収させる時に用いた５０％血清溶液（以下に記述）で、その標準を希釈 した。１時間培養した後、これらのウェルに、接合させたＩＬ−１またはＩＬ− ２（＾５ｓａｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、）を５０＃Ｌ加え、そしてこれ らと、標準またはサンプル内のＩ　Ｌ〜１もしくはＩＬ−２とを、更に１時間競 合させる。次に、これらのウェルを洗浄した後、アルカリ性ホスファタ−ゼ接合 抗ラビット抗体（＾５ｓａｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、）と−緒に４５分 間培養し、そして続いて基質を添加する。その得られる色反応を４０５ｎｍの吸 収で測定する。コンピューター補助の４つのノ（ラメーターログーロジット曲線 ソフトウェア０１ｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｌｌａｎａｇｅｒ、　Ｂｉｏ−Ｒａｄ、 　ＲｉｃｈｍｏｎｄＳＣ＾）を用いて、その標準曲線に関するデータ、並びに未 知物に関する力価見積もり値を解析する。

図３から６は、ＩＬ−１（図３および４）およびＩＬ−２（図５および６）両方 に関するＥＩＡにおける古典的な競合速度を示している。その得られる４０５ｎ ｍにおける吸収（ＯＤ４０５）に対して、サイトカイン欅準濃度の対数をプロッ トすると、Ｓ字曲線が生じる（図３および５）。その観察された吸収値をロジッ ト関数に変換すると、直線が生じる（図４および６）。両方のアッセイの検出限 界は９８ｐｇ／ｍＬであり、これは、１個のウェル当たり２．８Ｘ１０′□′６ モルのＩＬ−１から成るモル値と、１個のウェル当たり３．６Ｘ１０−１６モル のＩＬ−２から成るモル値に相当しており、直線範囲は０．４から２５　ｎ　ｇ ／ｍＬである。更に、両方の分析に関するＥＤｓｏ（５０％競合が生じる濃度） （マ約１．０から１．５ｎｇ／ｍＬである。

この反応物に血清を添加すると、生じる色は有意に低くなる。このことは、生じ る結合が低く、１００％血清内で未知サンプルを測定することは無価値であるこ とを示している。しかしながら、この血清を連続的に希釈することの影響を検査 すると、血清とア・ソセイ希釈液との５０％混合物では、検出閾値およびＥ　Ｄ 　ｓ。の両方に関して、ア・ソセイ希釈液単独のとき得られる標準曲線に匹敵す る結果が得られる。その標準曲線に悪影響を与えることなく最大で５０％の血清 または血漿を用（Ａること力（できる。

アッセイの確認 １、　血清の影響 ＰＢＳ内の標準物質に対する血清内標準物質の平行試験を行い、そして血清内の 添加したサイトカイン類を定量的に回収することによって、ＩＬ−１とＩＬ−２ 両方のＥＩＡを確認する。免疫反応性を示すＩＬ−１およびＩＬ−２が入ってい る血清サンプルをアッセイ希釈液で連続的に希釈することによって血清平行実験 を実施し、これらを、ＩＬ−１およびＩＬ−２０ＥＩＡ両方における未知物とし て用いた。これらのＥＩＡを開発する時点で、標準曲線と、連続的に希釈した血 清サンプル両方に関する吸収値を、平行性に関して解析する。

ｘＬ−１ｍよびＩＬ−２のＥＩＡが示す性能に対する血清の影響を試験する必要 がある、と言うのは、このアッセイの主要な目的の１つは、循環内に■Ｌ−１お よびＩＬ−２が内因的に存在しているか否かを測定することであるからである。

下記の如き２つの独立した方法を用いてこれを達成する。試験を行った１番目の 研究は、公知量のサイトカイン類を予め添加した血清（「サイトカインでスパイ クされている血清（ｃｙｔ。

ｋｉｎｅ−ｓｐｉｋｅｄ　ｓｅｒｕｍ）　Ｊ　）からサイトカイン類を定量的に 回収する試験である。このアッセイでは、標準希釈液またはアッセイ希釈液で１ ＝１に希釈したヒト血清に関する標準曲線を生じさせた。

平行試験により、アッセイ希釈液または５０％ヒト血清に関して生じさせた標準 曲線は平行であることが示されている（図４および６）。従って、血清が入って いるサンプルは、マトリックスの影響を表しているが、そこに含まれている非特 異的因子はＩＬ−１またはＩＬ−２がそれらの個々の抗体に結合するのを阻害し ていない。更に、両方のアッセイ（アッセイ希釈液または予め吸収させた血清に 関して行った）に関するスロープおよびＥＤ５゜値は非常に類似しており、この ことは、免疫反応性を示すＩＬ−１もしくはＩＬ−２を取り出した元の血清を、 内因性ｔＬ−１および１１．−２レベルを検出するための担体マトリックスとし て用いることができることを示している。

２８　吸収の分析 ２番目のアプローチは、個々の抗体によるサイトカインの吸収、そしてその吸収 された材料を高性能液クロ（ＨＰＬＣ）で分析することを伴うものである。この 試験では、抗体をコーティング緩衝液で１：５００に希釈した後、ＥＩＡプレー トに、どちらかの抗体を１００ｐＬ加える。

２４時間後、これらのプレートを洗浄用緩衝液で洗浄し、そしてＩＬ−１または ＋１．−２が入っている１００ａＬの血清を適当なウェルに添加して、−晩培養 する。培１１１、これらのプレートを洗浄用緩衝液で洗浄し、そして２ＭのＮａ ＣＩを１００μＬ添加することによって、ウェルに結合した材料をそのウェルか ら溶離させた後、そのプレートを一８０℃で急速冷凍する。その溶離して来た材 料を、１００ｍＭのＮａＨＰＯ４緩衝液の中に１００μｇ　／　ｍ　Ｌ入ってい るＢＳＡを用いて予め平衡にしたゲル濾過■Ｐ　Ｌ　Ｃサイジングカラムで分離 する。１．５ｍＬの両分を１分毎に集めて、急速冷凍する。次に、各両分の免疫 反応性を、）ｉ　Ｐ　ＬＣ分別した標準が示す免疫反応性と比較する。

アッセイ希釈液で希釈したサイトカインの線形ＨＰＬＣ勾配分離で１分間集めた 両分を、それらの個々のＥＩＡで試験する。次に、その得られる免疫反応性を、 ＨＰ　Ｌ　Ｃで分別し、抗体で捕捉しそしてサイトカインでスパイクされている 血清が示す免疫反応性と比較する（図７）。これらのＥＩＡで用いたＩＬ−１ま たはＩＬ−２抗体を用いて、そのサイトカインでスパイクされている血清からＩ Ｌ−１またはＩＬ−２を捕捉する。そのプレートの上に捕捉された材料は、その 標準と同じクロマトグラム位置に移ることを、上記結果は示している。２８０ｎ ｍにおける吸収を基にして他の蛋白質も検出されるが、根拠のあるＩＬ−１また はＩＬ−２標準と一緒に溶離させた両分の中では、抗体吸収血清が示す免疫反応 性が最も高いことを、図７は示している。

３、ウェスタン分析 ウェスタンプロット分析を用いてまた、ＩＬ−１抗体捕捉サンプルを試験した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色は数多くの追加的蛋白質が存在し ていることを示しているが、免疫反応性を示す材料の単−帯が１７ｋＤａのＷ） （０標準と一緒に泳動することを、図８は示している。

４、　ＩＬ−２バイオアツセイを用いた交差確認血清で希釈した組換え型ＩＬ− ２標準を用いて、このＩＬ−２のＥＩＡをｌ−２バイオアツセイに対して交差確 認する。このバイオアッセイは、その標準または他の参考標準内の種々のＩＬ− ２濃度によって引き起こされる、培養ウェル内の乳酸量の関数として、ＩＬ−２ 依存細胞系であるＣＴＬＬ−２の増殖応答を測定することを含んでいる。この応 答を、そのＩＬ−２のＥＩＡ標準曲線から計算した時のその標準が示す力価見積 もり値と比較する。最後に、ＩＬ−１またはＩＬ−２抗体を用いた免疫吸収を行 った後、ＩＬ−１とＩＬ−２の免疫反応性を含んでいる血清が示すＩＬ−１また はＩＬ−２レベルが小さくなっているか否かを測定する交差吸収試験を実施する 。この実験に先立って、このサンプルはＩＬ−１を２．５ａｇ／ｍＬそしてＩＬ −２を２０ｎｇ／ｍＬ含有していることが示されている。このサンプルを２つの 一定分量に分割して、標準的アッセイ条件下、ＩＬ−１またはＩＬ−２抗体と一 緒にインキュベートする。その後、これらのウェルからサンプルを取り出して、 後のアッセイで、ＩＬ−１およびＩＬ−２レベルの分析を行う。

バイオアッセイで常規通り４および１５Ｕ／ｍＬとして測定された内部標準は、 このＥＩＡではそれぞれ３．１および１７．５Ｕ／ｍＬ含んでいると計算される 。他のサイトカイン類または血清因子を用いて、各ＥＩＡを交差反応性に関して 試験する。

５、　交差反応性の分析 各アッセイにおいて、他のサイトカイン類および主要な血清因子を用いて、該試 薬が示す交差反応性も試験する。この試験では、各ＥＩＡにおいて、最大標準濃 ｔｆ　（１００ｎｇ／ｍＬ）で各サイトカインを試験する一方、これらの血清因 子に関しては、１ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で試験する。以Ｆに示す方稈式で計算し た如き各サイトカインの交差反応性％として、これらの結果を示す。

交差反応性（％）＝非特異的試薬濃度　ｘ　１００実際の濃度 この［Ｌ−１およびＩＬ−２両方のＥＩＡは、非常に高い度合の特異性を示して いる。どちらのアッセイ共、試験した他のサイトカイン類のいずれも有意な度合 では認識せず、その交差反応性範囲は０から０．　５％である（表１）。更に、 試験した血清因子は、その標準濃度を１００゜０００倍越える濃度でも、そのア ッセイを邪魔しない。この交差吸収試験により、ＩＬ−１およびＩＬ−２抗体は それらの個々のサイトカインを血清内で特異的に認識することが示された。例え ば、ＩＬ−１のレベルは、この血清サンプルをＩＬ−２抗体で処理したとしても 変化しない。

抗ＩＬ−２抗体を用いてこのサンプルの吸収を行った後、ＩＬ−ルベルは、３か ら２．５ａｇ／ｍＬにまで低下する。それとは対照的に、このサンプルを抗ＩＬ −１抗体で吸収させると、そのＩＬ−１濃度は１゜５ａｇ／ｍＬまで降下する。

同様に、抗ＩＬ−２抗体を用いた吸収では、その測定したＩＬ−２レベルは１８ ｎｇ／ｍＬから２ａｇ／ｍＬにまで低下する一方、抗ＩＬ−１抗体を用いた吸収 では本質的に影響を受けない（１６ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２濃度）。

表　１ １Ｌ−１σおよびＩ　１−−−２のＥＩＡを用いた時のサイトカイン類および他 の血清成分の交差反応性（％） 試験物質　１１．−１αのＥＩＡ　ＩＬ−２のＥＩＡＩＬ−１ａ　１００　０． 　Ｏ ＩＩ、−１８０，１０，０ ＩＬ、−２０，１１００ Ｉｔ、−３０，ＯＯ，Ｏ Ｔｌ、−４０，ＯＯ，０ ＩＬ−６０，ＯＯ，５ ＴＮＦσ　０．００、Ｏ ＧＭ−Ｃ３Ｆ　０．　０　０．　０ Ｇ−Ｃ３Ｆ　Ｏ，００，Ｏ Ｍ−Ｃ５ＦＯ，００，Ｏ ＩｇＧ　Ｏ，００，０ ヘモグロビンＢ　Ｏ，００，０ ビリルビン　ｏ、ｏ　ｏ、。

ａ２−マクログロブリン　ｏ、ｏ　ｏ、。

省略形・ＴＮＦ　：腫瘍壊死因子、ＧＭ−Ｃ８Ｆ：顆粒球／マクロファージコロ ニー刺激因子、Ｇ−Ｃ８Ｆ：ｌｉ粒球コロニー刺激因子、Ｍ−Ｃ３Ｆ：マクロフ ァージコロニー刺激因子。

Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　Ｂｒａｎｃｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉ ｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｍｅｎｔａｌ　ｌ１ｅａｌｔｈが行っている進行中 の２４時間神経内分泌プロファイルの一部として、Ｎｏｒｍａｌ　Ｖｏｌｕｎｔ ｅｅｒ　Ｐｒｏｇｒａｍ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　 １ｌｅａｌｔｈを通して、正常な女性志願者を３人募る。内在ヘパリンロックを 通して血液サンプルを１５分毎に２４時間取り出す。サンプルを集め、氷の上に 置いた後、６時間毎にバッチ遠心分離する。その得られる血漿を収穫し、分析の ための解凍を行うまで一７０℃で保存する。各アッセイでサンプルを二重分析し 、そしてＩＬ−１σとＩＬ−２の両方に関する分析を同時に行う。

Ｃ１ｕｓｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓを用いてピーク周波数および期間を測定する （Ｖｅｌｄｈｕｉｓ、　Ｊ、Ｄ、他、ＡＭ、　Ｊ、　ＰＨＹＳＩＯＬ、　２５０ ：Ｅ４８６９３　（１９８６）　）。

これらの３人の正常な志願者から得たデータは、ＩＬ−１およびＩＬ−２レベル はその日全体を通して安定でな（、その日全体を通して多数のサイトカインスパ イク（ｓｐｉｋｅｓ）が生じることを示している（図９−１１）。これらのデー タは、ＩＬ−２レベルの変化によって一時的に■Ｌ−ルベルの変化が影響を受け るが、各時点におけるＩＬ−２レベルは一定してそれよりも高いことを示してい る。このような結論は更に、一時的ピークおよびそれらの期間を同定するコンピ ューター補助パルス周波数分析によって支持されている。この分析は、本質的に 全てのＩ　Ｌ−１ピークおよびそれらの期間は、一時的に一致してＩ　Ｌ−２が 上昇することに合致していることを示している。以前に示したように、このよう な一時的な一致ははアッセイ交差反応性とは関係していない、何故ならば、どち らのアッセイも相互のサイトカインを検出しないからである。

基線となる２４時間の規則的な分泌プロファイルが存在しているか否かを測定す る目的で、各個人に関する１５分毎のデータから平均時間しベルを計算する（図 ８、下のパネル）。試験した被験者の数が限られていることから、一定した分泌 プロファイルが存在しているか否かを決定するのは困難である。

従って、本発明に従うＥＩＡを用いてヒト血清中で測定されるサイトカインレベ ルは、［、−１に関して０．５−１．５ｎｇ／ｍＬの範囲でありモしてＩＬ−２ に関しては１から８ｎｇ／ｍＬの範囲である。ここに報告するサイトカインレベ ルはそれらの個々のレセプタが示す報告された解離定数（Ｋｉｌｉａｎ、　Ｐ、 Ｉｌ、他、Ｊ、　ＩＭＭＵＮＯＬ、　１３６：４５０９−４５１４　（１９８６ ）；Ｄｏｗｅｒ、　Ｓ、に、他、Ｊ、　ＥＸＰ、　ＭＥＤ、　１６２：５０１− ５１５　（１９８５）　）よりも低い位の大きさであることを示すことは興味の 持たれることである。レセプタの親和力と循環ホルモン濃度との間のこのような 関係は、充分に記述されている他の内分泌システムと一致している。

ここに報告する結果は、ＩＬ−２レベルは明らかにＩＬ−１シグナルを反映して おり、それの増幅であることを示している。ＩＬ−１は、■１、−２の産生およ び分泌を刺激することから（上記５ＩＩｉｔｈ、　Ｋ、＾、）、これらの２つの パターンが一時的に一致していることとＩＬ−２レベルがＩＬ−ルベルよりも高 いことが確認されたことは、充分に記述されている免疫システム内ＩＬ−１／Ｉ Ｌ−２カスケードと一致している。

Ｋａｈｎ、　Ｊ、Ｐ、他、ＢＩＯＬ、　ＰＳＹＣＩ（ＩＡＴ、　２３：３３５− ３４９　（１９８８）が記述した方法を用いて唾液を採取する。被験者は、彼ら の唾液を飲み込むことなく、無糖ガム片の半分を３回噛む。１５ｍＬの円錐形試 験管を口の所に置きそしてその唾液をその試験管の中に流し込むことによって、 その中に唾液を集める。その試験管の中に唾を吐（ようにするのではなくむしろ 彼らの唇の所に集まってきた唾液をその試験管の中に流し込むようにすることを 、被験者に指示する。平均的な収集量は約２から３ｍＬである。

二者択一的に、レモネードの風味を有するＣｒｙｓｔａｌ　Ｌｉｇｈｔ　（商標 ）の如き酸っばい無糖飲料ミックスを歯科用綿にコートすることによって、唾液 を集めることができる。このコートした綿をそのガムとほおの間に２から３分間 入れておく。この綿を取り出して、５ｃｃシリンジの胴部の中に入れる。このシ リンジのプランジャーを再び入れ、そして試験管をそのシリンジの出口の所に置 く。このプランジャーでその綿を圧縮し、そしてその綿の中に存在している唾液 をその試験管の中に集める。この集めた溶液は浄化された唾液であり、これは分 析の準備ができている。

唾液のＩＬ−１σおよびＩＬ−２レベルをＥＩＡで測定した結果をそれぞれ図１ ２と図１３に示す。この試験では、２人の被験者から得た唾液を標準希釈液で連 続的に希釈する。この希釈液から得られるＯＤを、標準希釈曲線と比較した。こ れらのデータは、唾液を連続的に希釈すると、その標準を連続的に希釈した時の 曲線に平行した曲線が生じること鼻分泌物内すイト力インの測定 唾液の場合と同様、抗ＩＬ−２抗体を用いて展開した鼻分泌物のウェスタンプロ ットでは、約６’０　３０ｋＤａの分子量に相当する帯が観察される。この抗Ｉ Ｌ−２抗体で出発材料を前処理すると、この帯を吸収してしまった。しかしなが ら、その吸収段階に先立って、このサンプルにＩＬ−２抗原を過剰充填すると、 この帯はもはや吸収されなくなる。

これらの結果は、より高い分子量形態のＩＬ−２免疫反応性材料が鼻分泌物の中 に存在していることを示している。

実施例Ｖｌｌ 肉体的および心理的ストレスが唾液のサイトカイン類を調整する科学中間試験期 間中の１４から１５才の男子に関する、唾液のＩＬ−１および５Ｌ−２レベルを 測定する。心理的ストレスを与えるものである試験の測定に関して、背景レベル の測定を行う目的で、試験５日後の唾液サンプルを入手する。試験当日、試験が 始まる前１０分内（「前Ｊ）および試験後５分内（「後」）の唾液サンプルを入 手する。階段を５回上がり降りする肉体的ストレスの影響もまた、上記試験後生 な（とも７日間評価する。運動に先立って、背景レベルのためのサンプルを入手 する。階段を３回−１１かり降りした後、２回目の唾液サンプルを入手する。

最後に、この運動期間が終了した時点で別のサンプルを入手する。これらのデー タを、精神的および肉体的状みを行って２週間後に採取したサンプル（「ベース ライン」）と比較する。これらの結果を図１４−２０に示し、これは、肉体的な 運動には有意なＩＬ−１およびＩＬ−２濃度上昇が伴うことを示している。心理 的ストレスは、より大きな不安影響を与えると見られ、ここでは、その学校の試 験前、そしてそれの予期状管で、サイトカインレベルが上昇する。

数多くの自己免疫病（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ、＾、著、Ｄ、Ｐ、　５ｔ ｉｔｅｓ他編集［基礎および臨床免疫学Ｊ　（ＢＡＳＩＣＡＮＤ　ＣＬＩＮＩＣ ＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）　、Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃ ａｔｉｏｎｓＳＬｏｓ　Ａｌｔｏｓ、　ＣＡ　（１９８８））が生付動因子（ｆ ｅｉｎｅｒ、　Ｉｆ。

著「心理生物学およびヒトの病気Ｊ　（ＰＳＹＣＩＩＯＢＩＯＬＯＧＹ　ＡＮＤ 　ＨＵＩＩＡＮ　ＤＩＳＥＡＳＥ）　、ＥｌｓｅｖｉｅｒｌＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　 （１９７７）　；上記＾ｄｅｒ他）に関係していると考えられている。この実施 例では、自己免疫病に苦しむ患者を選択する。

これらの患者は、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己 免疫甲状腺炎（橋本甲状腺炎）　、Ｇｒａｖｅｓ病、炎症性腸病、自己免疫ブド ウ膜網膜炎、多発性筋炎および特定種の糖尿病などが含まれる。

これらは患者に、カテコールアミンレベルの上昇と心拍数上昇が伴うことが知ら れている通常の行動ストレス（例えば口頭の数学試験）または冷昇圧試験（ｃｏ ｌｄ　ｐｒｅｓｓｏｒ　ｔｅｓｔ）を含むストレスを受けさせる。唾液のサイト カインレベルを上と同様に測定する。このストレスを予期している状態およびそ れを受けている途中の両方で、唾液のＩＬ−１と［Ｌ−２が上昇する。このよう なサイトカイン類の変化を病気の症状と関係させることが可能であり、これは、 これらの症状の開始に関する有効な指示となり得る。

実施例ＩＸ 唾液由来サイトカインと標準サイトカインとの比較登録されている約１１００ｎ ／ｍＬの唾液サンプルを凍結乾燥した後、元の体積の１／１０に再構成する（そ の結果、理論濃度はｌｕｇ／ｍＬであった）。この溶液の１００ｕＬを、１００ ｍＭのＮ　ａ　ＨＰ　０４緩衝液１ｍＬ当たり１１００ｕのＢＳＡを用いて予め 平衡にしたゲル濾過サイジングカラム（Ｚｏｒｂａｘ　ＧＦ−２５０、ＤｕＰｏ ｎｔｌｌｌｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ）が用いられているイソクラティック（ １ｓｏｃｒａｔｉｃ）高性能液クロ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）に注入した。１分毎に５０ ０ｕＬの両分を溶離させて集めた。

この実験の後、そのカラムにＩＬ−２標準（１０ｕｇ／ｍＬ）を注入した。」二 に記述したのと同様に、この溶液を１００ｕＬ注入して両分を集めた。全てのサ ンプルを、ＥＩＡで分析するまで一２０℃で冷凍した。

標準および未知物に関して５０ｕＬのサンプルを用い、ＡＲＩの指示に従ってＩ Ｌ−２のＥＩＡを行った。各プレートにはそれ自身の標準曲線を含ませ、そして 全てのサンプルを同じ日に分析した。これらの得られるＯＤに関して、それらの 個々の標準曲線から補間を行うことで、力価見積もり値が得られた。

これらのデータを図２１に示す。ＩＬ−２免疫反応濃度をｙ軸上に示し、そして 両分番号をそのＸ軸上に示す。この図から分かるように、唾液サンプル内と標準 内のＩＬ−２の量は異なっている。このような差は、標準溶液に比較して唾液内 のＩＬ−２の濃度が１／１０であることによるものである。

これらのクロマトグラムは、同じ位置（画分番号１５から２２）に明確な免疫反 応性（連続的に上昇させた３つのサンプルが限定している）を示している。また 、２つのクロマトグラム全体に渡って免疫反応性が一致していることを特記する 。唾液内で測定したＩＬ−２は標準ＩＬ−２と類似していることは明らかである 。

ここに本発明を充分に記述して来たが、本発明の精神および範囲から逸脱しない 限りそして必要以上の実験を行うことなく、幅広い範囲の相当するパラメーター 、濃度および条件内で上記が行われ得ることは、本分野の技術者は理解するであ ろう。本発明の特定具体例に関連させて本発明を記述して来たが、さらなる修飾 を行い得ることは理解されるであろう。添付請求の範囲で以下に示す如く、本出 願は、一般に本発明の原理に従う本発明の如何なる変法、使用または応用も網羅 することを意図しており、そして本発明が関係している技術内で公知もしくは通 常実施の範囲内に入ると共に上に挙げた必須的特徴に適用され得る如き、本開示 からの上記変更を包含している。

血清希釈 画分番号 濃度　（ｎｇｚｍｌ） 濃度　（ｎｇｔｍｌ） 濃度　（ｎｇ　／　ｍｌ） 両分番号 画分番号 Ｗ ９７．０００− ６９．０００− ４３．０００− ２５．０００− １日の時刻 １日の時刻 １日の時刻 １日の時刻 １日の時刻 −２，５−２，０−１，５−１，０−０，５０，００，５Ｃｏ　１．５２．０ベ ース　前　途中　後 ベース　前　途中　後 標準 唾液 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ（Ｂ Ｆ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、Ｔ Ｇ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．１部位イムノアッセイを用いて、ヒトまたは動物由来の生物学的流体内のサ イトカイン濃度を測定することを含む、ヒトまたは動物内のサイトカインレベル を測定する方法。
2. ２．該サイトカインがインターロイキン−１α、インターロイキン−１Ｂ、イン ターロイキン−２、インターロイキン−６、インターフェロン−α、インターフ ェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−αから成る群から選択される請求の範囲１ の方法。
3. ３．該サイトカインがインターロイキン−１αである請求の範囲２の方法。
4. ４．該サイトカインがインターロイキン−１Ｂである請求の範囲２の方法。
5. ５．該サイトカインがインターロイキン−２である請求の範囲２の方法。
6. ６．該サイトカインがインターロイキン−６である請求の範囲２の方法。
7. ７．該生物学的流体が唾液および鼻分泌物から成る群から選択される請求の範囲 １の方法。
8. ８．該イムノアッセイが該サイトカインに特異的なポリクローナル抗体を利用し ている請求の範囲１の方法。
9. ９．該イムノアッセイが競合イムノアッセイである請求の範囲１の方法。
10. １０．１部位イムノアッセイを用いて、ヒトまたは動物由来の生物学的流体内の 、そのヒトまたは動物に投与されたサイトカイン濃度を測定することを含む、ヒ トまたは動物におけるサイトカイン治療を監視する方法。
11. １１．該サイトカインがインターロイキン−１α、インターロイキン−１Ｂ、イ ンターロイキン−２、インターロイキン−６、インターフェロン−α、インター フェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子一αから成る群から選択される請求の範囲 １０の方法。
12. １２．該サイトカインがインターロイキン−１αである請求の範囲１１の方法。
13. １３．該サイトカインがインターロイキン−１Ｂである請求の範囲１１の方法。
14. １４．該サイトカインがインターロイキン−２である請求の範囲１１の方法。
15. １５．該サイトカインがインターロイキン−６である請求の範囲１１の方法。
16. １６．該生物学的流体が唾液および鼻分泌物から成る群から選択される請求の範 囲１０の方法。
17. １７．該イムノアッセイが該サイトカインに特異的なポリクローナル抗体を利用 している請求の範囲１０の方法。
18. １８．該イムノアッセイが競合イムノアッセイである請求の範囲１０の方法。
19. １９．ヒトまたは動物の唾液または鼻分泌物内のサイトカイン濃度を測定するこ とを含む、ヒトまたは動物におけるサイトカインレベルを非侵入測定する方法。
20. ２０．該サイトカインがインターロイキン−１α、インターロイキン−１Ｂ、イ ンターロイキン−２、インターロイキン−６、インターフェロン−α、インター フェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子−αから成る群から選択される請求の範囲 １９の方法。
21. ２１．該サイトカインがインターロイキン−１αである請求の範囲２０の方法。
22. ２２．該サイトカインがインターロイキン−１Ｂである請求の範囲２０の方法。
23. ２３．該サイトカインがインターロイキン−２である請求の範囲２０の方法。
24. ２４．該サイトカインがインターロイキン−６である請求の範囲２０の方法。
25. ２５．該サイトカインをイムノアッセイで測定する請求の範囲１９の方法。
26. ２６．該サイトカインを１部位イムノアッセイで測定する請求の範囲２５の方法 。
27. ２７．該イムノアッセイが競合イムノアッセイである請求の範囲２６の方法。
28. ２８．該１部位イムノアッセイがポリクローナル抗体を用いている請求の範囲２ ６の方法。
29. ２９．ａ．生物学的流体を集めるための第一容器；ｂ．測定すべきサイトカイン に特異的な第一結合相手が入っている第二容器； ｃ．標識を付けたサイトカインが入っている第三容器；ｄ．上記標識を付けたサ イトカイン上の上記標識のための第二結合相手が入っている第四容器； が備わっている、ヒトまたは動物由来の生物学的流体内のサイトカインレベルを 測定するためのキット。
30. ３０．固相担体が更に備わっている請求の範囲２９のキット。
31. ３１．該標識を付けたサイトカインがビオチンで標識されておりそして該結合相 手がアビジンである請求の範囲２９のキット。
32. ３２．該アビジンがストレプトアビジンである請求の範囲３１のキット。
33. ３３．該第一結合相手が該サイトカインに特異的な捕捉用抗体である請求の範囲 ２９のキット。
34. ３４．該第二結合相手がその標識を付けたサイトカイン上の該標識のための酵素 接合結合相手である請求の範囲２９記載のキット。
35. ３５．該酵素のための色素形成基質を更に含んでいる請求の範囲３４記載のキッ ト。
36. ３６．該酵素がアルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーター ガラクトシダーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デル タ−５−ステロイドイソメラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグ リセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、 西洋ワサビペルオキシダーゼ、アスパラギナーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアー ゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミ ラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼから成る群から選択される請求の範囲 ３４のキット。
37. ３７．該酵素がアルカリ性ホスファターゼである請求の範囲３６のキット。