JPS62162963A - 金属コロイド粒子を担体とする低分子物質に対する特異抗体の作成法 - Google Patents

金属コロイド粒子を担体とする低分子物質に対する特異抗体の作成法

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JPS62162963A
JPS62162963A JP61003825A JP382586A JPS62162963A JP S62162963 A JPS62162963 A JP S62162963A JP 61003825 A JP61003825 A JP 61003825A JP 382586 A JP382586 A JP 382586A JP S62162963 A JPS62162963 A JP S62162963A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 未発１］は免疫組織化学、イムノアッセイ等において用
いられる高い特異性を有する抗体、この耳の抗体を含有
する抗血清、およびこれらの製法に■１する。
免疫組織化学、イムノア・ンセイ等の方法はホルモン等
の生体内活性物質の分布あるいは定４ｋを高感度かつ特
異的に１ｌ１１定する分析法として学術および医療臨床
面に広く用いられている。この方法て最も重要な点は、
特異性が高く、力価の高い抗血清を１１）ることである
。従来より分子！逢の比較的大きな蛋白質、糖蛋白質等
については特異血清を得ることが、比較的容易てあった
か、アミノ酸、ペプチドを始めとする分子兜の小さな低
分子物質は、その抗原性（免疫応答性）か低いため、高
血清の作成か非常に困難てあった。即ち、これらの物質
は生体に投与される前に担体と結合されない限り免疫応
答を誘起することが出来ないか、弱い免疫応答しか誘起
することか出来ない、このため、公知ｆ段では、生血ア
ルブミン、ヘモシアニン、サイログロブリン等の蛋白質
を４ｇ体とし、１−エチル−３−（アミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＣＤＩ）、グルタルアルデヒド、ホルム
アルデヒド等の架橋剤を用いてこれと抗原を架橋するか
、ポリビニルピロリドンなどに吸着させて大分子の抗原
として、免疫応答性の上昇を試みてきた。しかしながら
、担体として用いた蛋白質や架橋剤に対する抗体も同時
に産成され、これらが特異性の低下を招くことを防ぐこ
とはできなかった。特にアミノ酸、アミン、アセチルコ
リン等低分子の物質を抗原とする場合、これら物質単独
に対する抗体はこれまて出来ておらず、低分子物質と架
橋剤との架橋構造に対する抗体しか作成出来なかった。
（免疫Ｍｌ　ｍ化学においては、このような低分子物質
の同定のために、架橋剤と回し固定剤を用いて生体固定
し、低特異性ながらも用いられて来た。） 本発明は、金属コロイド粒子を用いることにより、その
表面にアミノ酸、アミン、アセチルコリン、ペプチド等
の低分子物質をその表面電荷を利用して、イオン結合さ
せ、架橋剤を使用することなしに、また抗原性の低い金
属コロイドを使用することにより、それ自身にだいする
抗体産成を低く留め、低分子物質に対する抗体を、より
特異的に産成させたものであり、これは本発明名か初め
て発見した方法である。
本発明の方法により、上記抗体を産成する能力を有する
一定の遺伝的構造を持つ細胞（以下クローンという）を
哺乳動物の生体内に産成することかできる。このクロー
ンな哺乳動物の生体内より取り出し、抗体産成に利用す
ることもできる。即ち、クローンを通出な腫瘍細胞との
融合（ハイプリント化）によって永久に生存させ、この
クローンから抗体を産成させることも出来る。
従って、本発明により、上記の方法で１１られた。
クローンを利用する。上記抗体の製法が提供される０次
いで１本発明は、前述の方法によって得られた抗体また
はこの種の抗体を含有する抗血清を利用した免疫Ｍｌ　
ｍ化学、イムノアッセイ法を提供する。上記抗体は上記
抗原と高い特異性となしているので免疫組織化学、イム
ノアッセイは抗体と上記物質との結合によって行なわれ
る。この場合、アッセイされる物質は抗原として、抗体
との間に抗原抗体反応によって作用する１本発明によっ
て、蛍光抗体法−１非標識酵素抗体法、酵素抗体法、ア
ビジン−ビオチンコンプレックス法（ＡＢＣ）法、アビ
ジン−ビオチン法（ＡＢ法）（以と免疫組織化学）、ラ
ジオイムノアッセイ法、非アイソトープイムノアッセイ
法（たとえば酵讃−ＥＬＩＳＡ、金屈イオン　蛍光体、
化学的発光体等で標識を行った方法）　（以上イムノア
ッセイ）て行なうことかできる。
また、低分子物質を抗原とする以外にも。
蛋白質、糖蛋白質等の高分子物質を結合させ、これらの
抗体産成を容易にすることもてきる。
抗原として用いる低分子物質として好ましい一例を以下
に示す、理ち、グルタミン酸、アスパラギン酸を始めと
するアミノ酸類、セロトニン、ノルアドレナリン、ヒス
タミンを始めとするアミン類、テストステロン等のステ
ロイド類、アセチルコリンおよびそれらの誘導体１代謝
中間体、あるいは各種のペプチドホルモンおよびその活
性中心のペプチドである。
金属コロイド粒子の作成は、公知「１）によって行う、
（Ｆｒｅｎｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　２４１，２０−２２１
９７］；Ｓ　Ｌ　ａ　Ｌ　ｂ　ｉ　ｓ　　ａ　ｎ　ｄ　
　Ｆ　ａ　ｂ　ｒ　ｉ　ｋ　ａ　ｎ　ｏ　ｓ　、　　Ｃ
Ｉ＋　ｃ　ｍ　、　　ｌ　ｎ　ｄ　、　（＋、　＋ｌ　
ｎ　ｄ　ｏ　ｎ　）２７．８６０−８１ｉ１　１９５８
；　　ＢａｉｇｅｎＬ　　ａｎｄ　　Ｍｉｉｌｌｅｒ。
Ｆ、　Ｘ　１１　ｃ　ｒ　ｉ　ｃ　ｎ　Ｌ　ｉ　ａ　３
６　、４７２１９８０　（以ト金コロイド）；にｒｅｋ
ｅ、Ｊ、　Ｐｒａｔ、　３．２８１＋　＋９７４：　Ｇ
ｒｉ＋＋ａｕｘ、　１ｉＣｒ。
ＤＬｓｃｌ＋、　ＣＩ＋ｅ＋＊、　Ｇｅｓ、　！７．１
０４１８８４　（以上鉄コロイド）　；　Ｍｉｉｌｌｅ
ｒ、　Ｚ、＾ｎｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、　５７．３１１１
９０８　　（水酸化アルミニウムコロイド））。陽電子
６：ｆ電ノ＾（例えば−Ｎ　Ｈ、”基）の結合のために
は粒子表面か負電荷を帯電している金コロイド粒子を用
いることがてきる。また、陰電子荷電）、Ｉｉ（例えば
−ｃ　ｏ　ｏ　−＞、ｌ；　）の結合のためには粒子表
ｔｍか陽電荷なり１）電している鉄コロイド等を用いる
ことがてきる。しかしながら、金属粒子と低分子物質と
の結合は、単なるイオン結合のみでなく、他の結合形式
（例えば　Ｖａｎ　ｄｃｒ　＊ａａｒｓ力など）も作用
している可能性か示唆され、結合形式については、コロ
イド化学領域における研究進歩を待たなければならない
。以下に実施例を示す。
λ−差二上Ｌ」２Ｆｒｅｎｓの方法によって金コロイド
を作成する。ｌ［１０ｍ１の０．０１＄塩化金溶液に４
■１クエン酸ソータと共に沸巳し、クエン酸ソータの還
元能を利用して径約１３から１５ｎｓの金コロイド粒子
を作成する。これを冷却後、グルタミン酸にたいする抗
体を作成するため、グルタミン酸と金コロイドのコンプ
レツクスを作成した。即ち、上記金コロイド液と５１Ｉ
ｇ／ｍｌｅ度のグルタモ２醜水溶液（各々Ｐｌ＋約９．
０．　ｐＨ約９．５に０．２１−に、ＣＯ□水溶液を用
いて調整）を混和し、安定なコンプレックスを作成した
。混合比は、全コロイド１ｍｌに対しグルタミン酩水溶
液約１から１．５１とするのか良好であった。この条ヂ
１て通常最終濃度　０．５から０．９駕のＮａＣ１添加
によって凝集する金コロイド粒子かグルタミン酸と結合
することによって安定化を増し、同程度のＮａＣｌｅ度
では凝集しなくなる。この安定化された壮丁ムのコンブ
し・ンクスｌ謹１に対し１ｍｌのフロイントのコンプリ
ートアジュバントと混和乳化し、これを１匹のウサギに
皮内注射した。この際、０．１から［１，２ｍｌずつ、
数■ケ所にわけて江射した。これと同じ操作を２から３
週間ごとに繰りかえし、Ｎｔ終回（４回目）の注射後約
１０口で採血し、血清を採取した。この血清の性状につ
いて調べた所図１に示すように、この抗血清は約５から
８万倍において添加した”Ｃ−グルタミン酸と５０％結
合七を示し、非常に力価の高い抗血清てルタミン酸と１
００％の交叉性を示す以外は類似アミノ酸であるアスパ
ラギン酸にも殆ど交叉性を示さなかった。また、ラット
中枢神経系をこの抗血清を用いて染色した所、きわめて
高い染色性を示し、免疫組織化学においても十分に使用
し得る抗血清であることか示された。また、この：ＩＳ
実は数匹のウサギをＨｌいて再現された。
Ｌｉ２ユ 同一の方法によってアスパラギン酸、グリシン、タウリ
ン、アセチルコリンを抗原として用い特異抗血清が作成
されることが確認されたが。
結果は１１例１とほぼ同様であった。金コロイド：抗原
のＰＨおよび（比）は、アスパラギン酸の場合　ｐＨ７
（１・ｌ）、グリシンの場合、ｐｔｉ５　（１：　２　
）　、タウリンの場合、ｐＨ７（１：ｌＯ）、アセチル
コリンの場合、ｐ）（７（１：２）か良々ｆてあった。
ｉ（１・り１） １　、　！ＩＳ件の表示　昭和６１年特許第３８２５号
２１発１１の名称 金属ゴロイト粒子を担体として作成された低分子物質の
特異抗体およびその作成法 ３、補正をする渚 １１を件との関係　特許出願人 住所　大阪市住之江区市港中３−４−１１−５、補正命
令の日付（発送口） 昭和６１年５月２３１１ ６、補正の対象 １、明細書の図面の簡単な説明の欄 ７、補正の内容 １．１１細Ｈｇｔｔ頁１７行に以下の項目を加える。
【図面の簡単な説明】
ｆＲ１１−Ｊは抗ｒＸ（グルタミン酸）と抗体との結合
試験を示す、横軸は抗血清の希釈系列を、縦軸は上情巾
に残存した非結合クルタミン酸放射箋を示す、抗血清濃
度が高い程（［７１の左側）４抗体結合グルタミン酸放
射能（遠心１２０００ｒｐ−での沈澱放射源）が増し、
非結合クルタミン酸放射能が減少する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）特異抗体の作成において、金属コロイド表面に低
    分子物質を吸着あるいはイオン結合させ物質の抗原性を
    高めた上、ウサギ等の哺乳動物に投与し得た低分子物質
    に対する特異抗体の作成法（２）抗体が上記抗体を含有
    する抗血清の形である特許請求範囲１記載の方法 （３）抗体が上記抗体産成能を有するクローンから得ら
    れた抗体である特許請求範囲１記載の方法（４）哺乳動
    物がマウス、ラットまたはモルモットである特許請求範
    囲１、２、３のどれかに記載された方法 （５）哺乳動物がウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ロバ、
    ブタまたはウシである特許請求範囲１、２、３のどれか
    に記載された方法 （６）特許請求範囲１から５までのどれかに記載された
    方法によって得られた抗体およびその抗体を含有する抗
    血清 （７）特許請求範囲３に記載された方法によって得られ
    た特許請求範囲１記載の抗体産成能を有するクローン
JP61003825A 1986-01-10 1986-01-10 金属コロイド粒子を担体とする低分子物質に対する特異抗体の作成法 Granted JPS62162963A (ja)

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