JPH08301787A - Ｖｉｉｉ：ｃ製剤 - Google Patents

Ｖｉｉｉ：ｃ製剤

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JPH08301787A
JPH08301787A JP8112373A JP11237396A JPH08301787A JP H08301787 A JPH08301787 A JP H08301787A JP 8112373 A JP8112373 A JP 8112373A JP 11237396 A JP11237396 A JP 11237396A JP H08301787 A JPH08301787 A JP H08301787A
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viii
plasma
factor
preparation
solution
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JP8112373A
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Theodore S Zimmerman
サミュエル ジマーマン セオドール
Carol A Fulcher
アン フルチャー カーラル
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Scripps Clinic and Research Foundation
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、VIII：Ｃに帰せられる凝固活性の
重要な薬剤価値に鑑み、VIII：ＲＰやその他の血漿蛋白
質を含まない、高い力価および高い比活性を有するヒト
のVIII：Ｃ製剤を提供することを目的とする。 【構成】 本発明は、１３４〜１１７２単位／ｍｌの力
価を有し、且つ本質的にVIII：ＲＰを含まないことを特
徴とするヒトのVIII：Ｃ製剤であり、また、２２４０単
位／ｍｇ以上の比活性を有することを特徴とするヒトの
VIII：Ｃ製剤からなる。このようなヒトのVIII：Ｃ製剤
は、例えば、血漿または濃縮液を用いて、因子VIII／フ
ォンウィルブランド因子複合物の成分分子、即ちVIII：
ＲＰからVIII：Ｃを分離し、凝固活性蛋白質VIII：Ｃを
濃縮精製することによって得ることができる。このよう
な濃縮精製法のひとつとして、血漿または濃縮液からの
２段階のクロマトグラフ吸着および濃縮法を用いること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、血漿から分離、精製
されたヒトのVIII：Ｃ製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】血漿からの抗血友病因子の分離について
は、文献に発表されている。抗血友病因子、すなわち因
子VIII凝固活性蛋白質（因子VIII）の精密な構造は、一
部には、十分量の純物質がえられず、より深い研究が不
可能なために、いまだに確認されていない。純物質の入
手に制約があり、しかもこの因子が稀薄状態で存在する
ために、この因子の治療上の利用が妨げられていた。
【０００３】因子VIII凝固活性蛋白質は、血友病血漿中
の凝固欠陥を正すよう機能する。これは、血漿中でフォ
ンウィルブランド因子蛋白質と複合して循環する。フォ
ンウィルブランド因子蛋白質は、フォンウィルブランド
病における血小板機能欠陥を変化させうる。因子VIII／
フォンウィルブランド因子複合物の凝固活性を有する部
分は因子VIII凝固活性蛋白質、因子VIII−凝固活性、ま
たは単にVIII：Ｃと呼ばれる（”VIII：Ｃ”の名称は、
以後、上記の凝固活性のある因子VIII分子の部分を同定
するために用いられる）。
【０００４】因子VIII／フォンウィルブランド因子複合
物のフォンウィルブランド病の血小板機能欠陥を正す能
力を有する他の部分は、フォンウィルブランド因子、因
子VIII関連抗原、VIIIＲ：Ａｇ、VIII：ＲＰ因子と呼ば
れる（表示“VIII：ＲＰ”は、以後因子VIII分子の血小
板補正機能を同定するために用いられる）。これまでに
実証されているわけではないが、VIII：Ｃが、非共有複
合物としてVIII：ＲＰと結合している小分子の性質と挙
動を示すという結論を裏付ける徴候がある。またVIII：
ＣおよびVIII：ＲＰの双方が結合している性質は適当な
条件のもとで開裂して２つの断片を生じうる単一分子で
もありうるという主張についての根拠もある。
【０００５】因子VIII／フォンウィルブランド因子複合
物、VIII：Ｃ、およびVIII：ＲＰの構造を同定する必要
性およびVIII：Ｃに帰せられる凝固活性の重要な薬剤価
値に鑑み、因子VIIIを精製する、およびVIII：ＣとVII
I：ＲＰを分離し、かつ濃縮する多くの試みが行なわれ
た。使用する技法は、一般に免疫吸着法またはイオン交
換クロマトグラフィのいずれかに基いていた。このため
に従来使用されている技法は、蛋白質を荷電イオン物質
から損傷のない状態で着脱させたり、または蛋白質を適
切量で回収することが困難なために、成功には制約があ
った。
【０００６】免疫吸着クロマトグラフィを利用するVII
I：ＣをVIII：ＲＰから分離する上記方法の１つが、
Ｅ．Ｇ．Ｄ．Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ等によりＪＯＵＲＮＡ
Ｌ ＯＦＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＣＬＩＮＩＣＡＬ Ｍ
ＥＤＩＣＩＮＥ．９３巻，４０頁（１９７９年）に“免
疫吸着クロマトグラフィによって調製した因子VIII凝固
活性の特性”の題名で発表されている。報告された方法
は、VIII：ＲＰに対する多クローン抗血清（抗−VIII：
ＲＰ）が結合されているアガロース・ビーズを充填した
クロマトグラフィ・カラムを用いて、VIII：Ｃをほとん
どすべてのVIII：ＲＰおよびほとんどのその他の血漿蛋
白質から分離する１段法である。因子VIII／フォンウィ
ルブランド因子を含む血漿が、VIII：ＣとVIII：ＲＰの
双方を吸着するカラムにかけられる。その他の不要な血
漿蛋白質は、緩衝塩水溶液で洗浄することによってカラ
ムから除去され、そして所望のVIII：Ｃが、その後のカ
ルシウム・イオン勾配液による溶離によってえられる。
この方法は、従来の既知の方法と比較して、VIII：Ｃの
純度と収率の双方の改善であると述べられているが、生
じた生成物はVIII：ＲＰおよびその他の血漿蛋白質をも
含むとも述べられている。このような不純物質は、アガ
ロース・ビーズに結合された多クローン抗血清を使用す
ることに原因するものと考えられる。抗血清を構成する
免疫グロブリンの大多数は、VIII：ＲＰに対して特異で
ないから、VIII：ＲＰに特異な抗体がアガロースに結合
されうる有効座数は、アガロース上の有限数の結合座に
対する抗血清の間の競合により、比較的少ない。
【０００７】アミノヘキシル置換アガロースを用いるク
ロマトグラフィ技法によって、VIII：ＲＰとリストセチ
ン共同因子からVIII：Ｃを分離するもう一つの方法が
Ｄ．Ｅ．Ｇ．Ａｕｓｔｅｎの、ＢＲＩＴＩＳＨ ＪＯＵ
ＲＮＡＬ ＯＦ ＨＡＥＭＡＴＯＬＯＧＹ，４３巻，６
６９頁（１９７９年）“因子VIIIのアミノヘキシル・セ
ファロース上でのクロマトグラフィによる分離”により
報告されている。記述の方法は、人間と豚の双方の因子
VIII／フォンウィルブランド因子の成分部分についての
改善法であると述べられている。しかしながら、この方
法もまた、得られる生成物中に不純物質が存在するとい
う欠点を示す。ＴｕｄｄｅｎｈａｍおよびＡｕｓｔｅｎ
による両方法において、不純物質を含む生成物が、通常
希望されるよりさらに稀薄な状態で、生成する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、VIII：
Ｃに帰せられる凝固活性の重要な薬剤価値に鑑み、VII
I：ＲＰやその他の血漿蛋白質を含まない、高い力価お
よび高い比活性を有するヒトのVIII：Ｃ製剤が要望され
ており、本発明はこのようなヒトのVIII：Ｃ製剤を提供
することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、１３４〜１１
７２単位／ｍｌの力価を有し、且つ本質的にVIII：ＲＰ
を含まないことを特徴とするヒトのVIII：Ｃ製剤であ
り、また、２２４０単位／ｍｇ以上の比活性を有するこ
とを特徴とするヒトのVIII：Ｃ製剤からなる。
【００１０】このようなヒトのVIII：Ｃ製剤は、例え
ば、血漿または濃縮液を用いて、因子VIII／フォンウィ
ルブランド因子複合物の成分分子、即ちVIII：ＲＰとVI
II：Ｃとを分離し、凝固活性蛋白質VIII：Ｃを濃縮精製
することによって得ることができる。このような濃縮精
製法のひとつとして、血漿または濃縮液からの２段階の
クロマトグラフ吸着および濃縮法を用いた場合について
以下に説明する。
【００１１】第１段階は、血漿または市販濃縮液からの
因子VIIIの免疫吸着法である。使用する吸着剤は、例え
ばアガロース・ビーズのような適当な基質に結合された
VIII：ＲＰに特異な単クローン抗体からなっている。VI
II：Ｃ／VIII：ＲＰが最初に吸着されてから、基質粒子
を緩衝溶液により十分に洗浄して、非吸着蛋白質を除去
する。つぎに吸着物質を、吸着VIII：Ｃを溶離するため
に、カルシウム・イオンを含む溶液で処理する。VIII：
ＲＰ部分は、抗VIII：ＲＰが結合した物質に吸着された
ままである。この時点で、最初に吸着されたVIII：Ｃの
約４０〜６０％が、高純度状態で回収される。ただし、
回収された凝固活性蛋白質は、きわめて純度は高いが、
すなわち、ほとんど汚染物質を含んでいないが、稀薄す
ぎるため、有意な治療的価値を有していない。
【００１２】この方法の第２段階は、アフィニィティ・
クロマトグラフィとして特性化される技法を用いて、回
収した高純度VIII：Ｃを主として濃縮することに向けら
れている。
【００１３】この方法の第１段階からえられた約１０〜
２０国際単位（以下“単位”と呼称する）の効力をもつ
VIII：Ｃ溶液を、アミノヘキシル置換アガロースを含む
カラムで処理する。つぎにカラムを緩衝溶液で洗浄し、
そしてVIII：Ｃをカルシウム・イオン含有溶液で溶離
し、１０００単位／ｍｌを超え、かつ血漿から１６０，
０００倍以上純化されているVIII：Ｃ濃縮液をうる。か
くて、この方法によって、予期しない高純度の凝固活性
蛋白質が、高度に濃縮され、かつ治療上有用な状態でえ
られた。これまでに使用された方法では、いくつかの理
由から、上記の顕著な結果を達成できない。前述したＴ
ｕｄｄｅｎｈａｍらの方法は、この発明によるVIII：Ｒ
Ｐに特異で、かつ高度に選択的な単クローン抗体の代り
に、結合多クローン抗血清を使用している。その結果、
VIII：ＲＰに特異な抗体が、少数しか、一定重量のアガ
ロースと結合しない。この発明では、単クローン抗体が
もっぱら比較的不活性な基質と結合される。Ｔｕｄｄｅ
ｎｈａｍらの方法を使用するときは、免疫グロブリン−
アガロース・ビーズｍｌ当りVIII：ＲＰ２.６〜６.４単
位（カラムに適用した量の５３.１〜８２.９％に相当）
のみが除去される。これは、この発明の単クローン抗体
免疫吸着剤を使用する場合に回収されるビーズｍｌ当り
１２．５〜１８．８単位（すなわち、カラムに適用した
VIII：ＲＰの９０〜１００％）以上と比較される。した
がって、ビーズｍｌ当りにより多くのVIII：Ｃ／VIII：
ＲＰ（因子VIII／フォンウィルブランド因子）を吸着す
る能力が、それが引続き免疫吸着剤から溶離された時、
より高濃度のVIII：Ｃを生ずる。かくて、Ｔｕｄｄｅｎ
ｈａｍらの方法による溶離液ｍｌあたり０.５〜１.２５
単位と対比して、この発明では、溶離液ｍｌ当りVIII：
Ｃ１０〜２０単位がえられる。
【００１４】この方法によると、VIII：ＲＰに対して高
親和力を示す単クローン抗体の選択もできる。一方、多
クローン抗体を使用すると親和力に変化をもたらす。VI
II：ＲＰの結合抗体の親和性と、VIII：ＲＰの溶離の間
には、間接的な関係があることを認めなければならな
い。かくて、VIII：ＲＰに対する抗体の親和性が高くな
るほど、溶離液中にVIII：Ｃとともに存在するVIII：Ｒ
Ｐの量が減少する。この発明によって、特異単クローン
抗体を無制限にうることもでき、したがってまた種々の
バッチの間の変動を排除できる。
【００１５】前述したように、Ａｕｓｔｅｎは、VIII：
ＣをVIII：ＲＰから分離するためにアミノヘキシル・ア
ガロースを使用したことを報告したが、分離および精製
段階に続いて、VIII：Ｃを濃縮するために、このような
物質が使用されたことはなかった。これまでに、クロマ
トグラフィにアミノヘキシル・アガロースを用いて達成
された最高のVIII：Ｃ濃度は、人間の蛋白質について溶
離液ｍｌ当りに０．５３単位、豚のVIII：Ｃについて溶
離液ｍｌ当り２．３８単位であった。この発明によれ
ば、これより数桁大きな濃度をうることができる。おそ
らく、さらに重要と考えられるのは、この発明によっ
て、これまでに報告されたより高い純度の人間のVIII：
Ｃがえられるという事実である（血漿の１６４，０００
倍対１７，０００倍）。以後に、さらに詳細に述べるこ
の方法によって、市販の濃縮液を使用すると、２，３０
０単位／ｍｇの比活性を有するVIII：Ｃがえられる。こ
れは血漿からの純度の１６４，０００倍に相当する。VI
II：Ｃと、VIII：ＲＰの比は、血漿中の比と比較すると
１０5以上である。
【００１６】以下の記述によって、VIII：Ｃの分離、精
製および濃縮が、従来知られなかった程度の純度と濃縮
度に達成されるために、この発明の実施態様が実施さ
れ、かつ用いられる方法の詳細が示される。この記述
は、この発明を例示するものではあるが、とくにこの発
明を限定するものと解されるべきではなく、また、当業
者の知識範囲内にあると考えられる変化は、この発明の
範囲内に入るとみなすものとする。
【００１７】
【実施例】
Ａ．VIII：ＲＰに対する単クローン抗体の調製 後に分離基質に結合されるVIII：ＲＰに対する単クロー
ン抗体は、因子VIII／フォンウィルブランド因子（VII
I：Ｃ／VIII：ＲＰ複合物）の高度に精製された調製物
から出発する段階的な方法に従って調製できる。免疫の
ための精製は、血漿源からえられた物質により行なう。
またポリビニル板のコーテングのためのあまり純度の高
くない物質は、ＦＡＣＴＯＲＡＴＥ（ニューヨーク州Ｔ
ｕｃｋａｈｏｅ市Ａｒｍｏｕｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｃｏ社製品の商標名）またはＨｅｍｏｐｈｉ
ｌ(カリフォルニア州Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ市Ｈｙｌａｎ
ｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製品の商標名)のよう
な市販されている抽出物からより高い濃度で得られる。
精製は、ＩＭＭＵＮＯ−ＡＳＳＡＹＳ：ＣＬＩＮＩＣＡ
ＬＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＦＯ
Ｒ ＴＨＥ １９８０’ｓ，Ｒ．Ｍ．Ｎａｋａｍｕｒ
ａ. 等編、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ., Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、３３９〜３４９頁（１９８０年）に発表さ
れたＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＲｏｂｅｒｔｓによる
“因子VIII関連抗原”に記述されているような、クリオ
プレピシテートの標準アガロース−ゲル濾過によって行
なわれる。マウスに、以下の手順にしたがって血漿から
得られた高度に精製した因子VIII／フォンウィルブラン
ド因子を注射した。ゼロ日に、マウスに、０．０５Ｍの
トリス、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、０．０２％のア
ジ化ナトリウム、１ｍＭのフェニル・メチルフッ化スル
フォニル、および１０単位／ｍｌのトレイシロール（ｔ
ｒａｙｓｙｌｏｌ)を含む０．１ｍｌの緩衝溶液中にｐ
Ｈ７．３で蛋白質１０ｍｇを溶解（または懸濁）させ、
等容量の完全フロイントアジュバントと振盪して調製さ
れた組成物を、腹腔内注射した。１４日目に、完全フロ
イントアジュバントが不完全フロイントアジュバントに
替った以外は上記と同一である物質をマウスに再び注射
した。２１日目に、１４日目の注射を繰返した。３８日
目に、マウスに精製VIII：Ｃ／VIII：ＲＰのみを注射し
た。４２日目に、マウスの脾臓を取り出しそしてＪＯＵ
ＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳ
ＴＲＹ，２２５巻，４９８０〜４９８３頁（１９８０
年）記載のＪ．Ｐ．Ｂｒｏｗｎらによる“単クローン抗
体による免疫析出法により識別した正常および悪性人間
細胞の蛋白質抗原”で発表された型の標準法にしたがっ
て融合した。標準法は、５０％ポリエチレン・グリコー
ル１０００が３５％ポリエチレン・グリコールに替って
いる程度にしか変えていない。VIII：ＲＰに対する抗体
を産生するクローンの放射免疫測定は次の手順により行
なう。“Ｖ”字型底を備えるフレキシブル型のポリビニ
ール板を、上記の手順にしたがって市販抽出液から精製
された蛋白質濃度０.１２５ｍｇ／ｍｌの因子VIII０.１
ｍｌでコーティングする。ポリビニール板を、アルブミ
ンでブロックし、緩衝液で洗浄し、そして被験クローン
からの培養液とインキュベートする。つぎにポリビニー
ル板を洗浄して、ラビット抗マウスＩｇＧ抗血清と反応
させ、もう一度洗浄し、そして125Ｉで標識した山羊抗
ラビットＩｇＧ抗血清をウェルに添加して、インキュベ
ートする。ポリビニール板を再び洗浄して、つぎに乾燥
し、そしてウェルを切除して計数する。陽性のクローン
を決定してから、これらを少なくとも２回サブクローニ
ングし、つぎにVIII：ＲＰに対する抗体を産生する安定
なクローンを、細胞注射の少なくとも４日前にプリスタ
ン０．５ｍｌにより腹腔内に前処置してあるＢａｌｂ／
Ｃマウスの腹腔に注射する。ハイブリドーマ細胞をマウ
ス当り約５×１０6細胞の濃度で、牛胎児血清のない
０．５ｍｌのＤａｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地を介
して注入する。マウスを、鼓脹した時に穿刺し、そして
腹水液を約１０単位／ｍｌのヘパリン中に集める。複数
のマウスからの腹水液をプールして、その後の単クロー
ンＩｇＧの分離用の適当量を供給する。ヘパリン化した
腹水液をただちに使用しないときは、この腹水液は、−
７０℃で保存し、そして使用直前に解凍しうる。腹水液
からのＩｇＧの最終収量は１００ｍｌ腹水液当りＩｇＧ
約１ｇである。
【００１８】VIII：Ｃを精製するために使用される単ク
ローンＩｇＧの特異性は次のようにして判断される。即
ち、まず下記の方法でＩｇＧを分離基質媒体と結合さ
せ、次に（１）結合したＩｇＧが血漿からVIII：ＲＰお
よびVIII：Ｃの両方を除去すること、および（２）VII
I：Ｃがその後カルシウム・イオン含有溶液で溶離さ
れ、一方VIII：ＲＰは固体状態の基質と結合している単
クローンＩｇＧと複合物を形成したままであることを明
示することにより判断される。
【００１９】続いて免疫吸着剤を調製するために使用さ
れる単クローンＩｇＧは、ヘパリン化してプールした腹
水液から捕集直後に分離でき、又は保存溶液の凍結部分
を解凍しうる。新鮮物質または凍結物質のいずれを使用
するかに関わりなく、溶液を４℃にたもち、その組成を
下記に示す等容量のリン酸塩緩衝塩水溶液（ＰＢＳ）に
よって処理する。稀釈腹水は、等容量の飽和硫酸アンモ
ニウム（ＳＡＳ）を４℃で撹拌しながら滴下することに
より沈殿させる。ＳＡＳは、過剰の硫酸アンモニウムを
水中で沸騰させ、４℃に冷却し、不溶解結晶を濾別し、
そして水酸化アンモニウムによって、ｐＨを７．０に調
節して、調製する。沈殿物とその上澄み液を少なくとも
２時間撹拌して、４℃で遠心分離する。遠心分離操作は
好ましくは１４，０００ｒｐｍで、６０分間行なう（３
０，０００×ｇ）。腹水の上澄み液は、もう２回ＳＡＳ
で沈殿させ、そして沈殿物と上澄み液の混合物を撹拌し
て、第１サイクルと同様な方法で遠心分離する。第３沈
殿からえられるペレットは、稀釈腹水液と等容量のＰＢ
Ｓ中に再懸濁させ、そしてつぎにＰＢＳに対して徹底的
に透析する。透析バッグ内に現われる凝固物質は、２０
℃で遠心分離により除去する。透析したＩｇＧは、これ
を室温で、水酸化アルミニウムの５％水溶液と撹拌し、
吸着後２０℃で遠心分離することによって吸着させる。
吸着処理は、第１回の処理後の各処理ごとに、２．５％
水酸化アルミニウム溶液を用いて少なくともあと３回繰
返す。吸着されたＩｇＧは、４℃にして、１回、上記の
ようにＳＡＳで再沈殿する。沈殿ペレットは、使用まで
−２０℃で保存するとよい。
【００２０】Ｂ．免疫吸着剤の調製 免疫吸着剤は、結合のための単クローンＩｇＧを調製
し、結合のための固体基質を調製し、そして前者が後者
と結合するよう両成分を反応させることによって調製さ
れる。
【００２１】（i）結合用ＩｇＧの調製 新たに沈殿したＩｇＧを使用することができ、または、
予め凍結した沈殿物を解凍して使用してもよい。沈殿物
はつぎにＰＢＳに対して透析し、そしてなおＰＢＳ中に
ある間に、容積とＩｇＧ濃度（Ａ280／１．４＝ｍｇ／
ｍｌ ＩｇＧ）を測定する。ＩｇＧは、つぎに、ＩｇＧ
溶液５０ｍｌ当り、１０〜３０マイクロリットル好まし
くは２０マイクロリットルの量のフッ化燐酸ジイソプロ
ピルで処理する。生ずる溶液を室温で３０分間、フード
内で撹拌し、そして処理したＩｇＧを、使用直前に、結
合用緩衝液に対して一晩中透析する。最適と認められる
結合用緩衝液は、好ましくは水酸化ナトリウムによりｐ
Ｈ９に調節した０．２５Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液であ
る。
【００２２】（ii）結合用固体基質の調製 単クローン抗体は、蛋白質、とくに因子VIII自体に対し
て高度の親和性をもたないいかなる物質に結合させても
よいが、ガラス・ビーズ、アガロースおよびその誘導体
のような物質が好ましい。もっとも好ましい物質は、Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ２Ｂ（ニュージャージー州Ｐｉ
ｓｃａｔｗａｙ市ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ社製品の商標名）として知られるゲルとし
て市販されている架橋アガロースである。
【００２３】好ましい免疫吸着樹脂の調製方法は、一般
に、Ｊ．Ｐｏｒａｔｈら、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨ
ＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ，８６巻，６３〜５６頁（１
９７３年）の方法のような、文献に発表された同一の方
法である。最適と認められる方法は、つぎの通りであ
る。すなわち、約２リットル容量のＳｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ２Ｂを、酸で洗浄された２リットル容量の焼結ガラ
ス・フィルタ漏斗中に置く。樹脂を水で洗浄し、そして
濾過して湿潤ケーキにする。洗浄した樹脂を、磁気撹拌
棒を備える大きな（約４リットル）ガラス・ビーカ内に
置く。つぎに５Ｍの二塩基性燐酸カリ溶液１部と５Ｍの
三塩基性燐酸カリ溶液２部を混合して調製した冷燐酸カ
リ緩衝溶液７５０ｍｌを樹脂に添加する。冷却された水
を加え、最終容量を３リットルとする。つぎに混合物を
４℃に冷却し、磁気撹拌板上に置いた氷−水浴中で４〜
１０℃に保持する。フード内で臭化シアンを、磁気撹拌
棒を含むストッパ付きガラスびん内の水３００ｍｌに添
加する。溶液を生ずるまで、混合物を迅速に撹拌する。
つぎに臭化シアン溶液を、２分間にわたって撹拌しなが
ら、冷Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ混合液に添加する。撹拌をさ
らに８分間続けて、つぎに４リットル容量の真空フラス
コに支持される冷した２リットル容量の焼結ガラス・フ
ィルタに移す。臭化シアンで処理した樹脂を、つぎに約
２０リットルの冷水によるか、または濾液のｐＨが中性
となるまで洗浄する。洗浄した樹脂をつぎに速やかに、
冷結合用緩衝液で平衡化させて、つぎに大型の磁気撹拌
棒を備える４リットル容量のプラスチック・ビーカに移
す。
【００２４】（iii）単クローン抗体の固体基質への結
合 上記にしたがって調製した固体基質樹脂は、結合用緩衝
液で平衡化されると、使用するばかりの状態になってい
るから、その後に保存してはならない。したがって、樹
脂混合物を、先に一晩中結合用緩衝液に対して透析され
たＩｇＧと結合させる。結合させた樹脂／ＩｇＧの懸濁
混合液を、約２４時間、４℃で撹拌する。上澄み結合液
の希釈しない試料Ａ280を、標準として牛の血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、または標準としてＢＳＡを使用するバ
イオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）プロテイン アセイ（ブ
ラッドフォード試薬）を用いて測定しうる。次に結合さ
れた配位子の百分率が計算できる。上記の手順にしたが
うと、この百分率は通常約９５％である。抗体に結合さ
れない樹脂の残留活性座は、焼結ガラス・フィルタ漏斗
上で、０．１Ｍグリシンを含有する冷結合用緩衝液を用
いて樹脂を洗浄することによってブロックできる。つぎ
に樹脂をこの溶液中に再懸濁させて、それぞれの結合用
緩衝液中で樹脂と抗体が結合されたときの容積に等しい
最終容積にする。懸濁液を４℃で一晩中、ゆっくりと撹
拌する。つぎに樹脂を、以下に示す組成のVIII：Ｃ緩衝
液で十分に洗浄する。つぎに結合され、ブロックされた
樹脂を、好ましくは塩化カルシウムとしての０．５Ｍカ
ルシウム・イオンをさらに含むVIII：Ｃ緩衝液で予備溶
離する。樹脂を再びVIII：Ｃ緩衝液だけ洗浄し、使用す
るまで、４℃で、または室温で連続的にポンプ送りされ
るカラム中に保存する。ＩｇＧのＳＥＰＨＡＲＯＳＥに
対する結合密度は、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥリットル当り２
〜５ｇ、好ましくは３〜４ｇとする。
【００２５】Ｃ．VIII：Ｃの分離と精製 人間および動物血漿、および市販の因子VIIIの濃縮液の
ような因子VIIIの試料調製物を、この発明で用いること
ができ、かつこの方法は、特定型の物質に限られるもの
ではない。好ましい物質、および良好な結果を示した物
質は、豚および人間の血漿、および市販されている人間
の因子VIIIの濃縮液例えば、Ａｒｍｏｕｒ Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ社から発売されているＦＡＣＴＯＲ
ＡＴＥである。以下の記述は、豚の血漿、または例えば
ＦＡＣＴＯＲＡＴＥのような市販の人間の濃縮液を用い
ての詳細を示すものである。
【００２６】すなわち、ＦＡＣＴＯＲＡＴＥを、VIII：
Ｃの緩衝液２５ｍｌ部を、ボトル当り４００−５００
VIII：Ｃ単位を含む２０ボトル（２５ｍｌ／ボトル）の
それぞれの内容物に加えることによって戻す。混合液
を、VIII：Ｃ緩衝液によって最終容量１リットルに調節
する。０．５ｍｌで区分された試料の分析のため除くこ
とができ、そして残余の物質を、免疫吸着カラムに、約
６０ｍｌ／時の割合で一晩中加えることができる。
【００２７】新鮮な状態で取り出さない場合、豚の血漿
は、従来の方法でくえん酸処理して、凍結保存する。使
用する場合には、これを３５〜４０℃の間、好ましくは
３７℃の温度で解凍して、直接６０ｍｌ／時の割合でカ
ラムに加える。
【００２８】この発明の記述は、クロマトグラフィ・カ
ラム中の免疫吸着剤が結合された粒子の使用に言及し、
かつ主としてこれらの使用を指向しているが、抗体結合
樹脂粒子を、適当な容器に入れ、そして上記にしたがっ
て、また下記にさらに詳述するように、戻した濃縮液、
または血漿を加えてから、バッチ方式でVIII：Ｃの分離
を行なうことは、この発明の範囲内であることに注目す
べきである。
【００２９】クロマトグラフィ法により、この方法を実
施する場合には、以下の実施態様が好ましい。
【００３０】すなわち、樹脂を、Ａｍｉｃｏｎ８６００
１（マサチュセッツ州レキシントン市Ａｍｉｃｏｎ社製
品商標名）のような、蠕動ポンプを備え、かつ流れヘッ
ドの高いカラム内に入れる。因子VIII源として濃縮液を
使用する場合には、２０ボトルの希釈濃縮液に対して、
上記にしたがって調製した樹脂約１．５リットルを用い
る。豚の血漿を使用するときは、血漿リットルごとに１
５０ｍｌの樹脂を使用する。
【００３１】試料をカラムに施してから、これを１リッ
トルのVIII：Ｃ緩衝液で洗浄し、続いて、さらに０．５
ＭのＮａＣｌを含むVIII：Ｃ緩衝液により第２洗浄す
る。因子VIIIが濃縮液として与えられるときは、約２０
リットルの塩水緩衝液を用い、豚の血漿を用いるとき
は、２０床容積の緩衝液を用いる。１リットル／ｈｒの
流速で最適の結果がえられる。
【００３２】精製VIII：Ｃの溶離は、カルシウム・イオ
ンを含むVIII：Ｃ緩衝液で行なわれる。上記のＴｕｄｄ
ｅｎｂｒａｍらによって示されるように、線型勾配で良
好に行なえるが、この点は、この発明の目的を達成する
ためには必要ない。固定された濃度のカルシウム・イオ
ンを有する溶液が、きわめて適切である。かくて、濃縮
液からえられるVIII：Ｃが溶離されているときは、塩化
カルシウムに関して０．２５〜０．５Ｍ、好ましくは
０．３５ＭのVIII：Ｃ緩衝液が、流速４５０〜７５０ｍ
ｌ／時、好ましくは６００ｍｌ／時として有利に使用さ
れる。VIII：Ｃが豚の血漿からえられるときは、溶離
は、塩化カルシウム濃度０．３５〜０．７Ｍの間、好ま
しくは０．５ＭのVIII：Ｃ緩衝溶液で、かつ流速１０〜
３０ｍｌ／時の間、好ましくは２０ｍｌ／時で行なわれ
る。１２ｍｌおよび３ｍｌのフラクションを、それぞれ
濃縮液および豚の血漿からえられるVIII：Ｃ用に集め
る。少なくとも１．０単位／ｍｌのVIII：Ｃ活性を含む
フラクションをプールし、そしてプールの総容量と活性
を測定する。
【００３３】VIII：Ｃプールを最初に圧力限外濾過のよ
うな標準的な方法によって１０〜２０ｍｌに濃縮する。
この目的に、５０ｐｓｉの窒素圧の下におけるＹＭ−１
０メンブレンを含むＡｍｉｃｏｎ撹拌セルが良好に作用
することがわかった。窒素圧を解放してから、３０分間
ゆっくりと撹拌を続け、そして濃縮プールの容積と活性
を測定する。プールは、温度が４℃に維持されるかぎ
り、短期間、例えば、一晩中保存できる。
【００３４】上記した免疫吸着カラムは、流速約０．５
〜１リットル／時で３Ｍのチオシアン酸ナトリウム水溶
液２床容量で処理してVIII：ＲＰを溶離すると再生でき
ることに注目してよい。
【００３５】Ｄ．精製VIII：Ｃの濃縮 免疫吸着カラムによるVIII：ＲＰからの分離によって回
収されたVIII：Ｃは、高度に精製されているが、治療上
に利用するためには、未だ稀薄すぎる。これ以上の濃縮
は、以下の方法で調製され、かつ使用されるアミノヘキ
シル・アガロース・カラムを用いて行なわれる。
【００３６】（i）アミノヘキシル・アガロース・カラ
ムの調製および（または）調整 アミノヘキシル・アガロースは、１，６−ジアミノヘキ
サンと反応したアガロースであって、そのそれぞれに端
末アミノ基をもつ多数の６炭素原子鎖をもつアガロース
樹脂を生ずる。このアガロース樹脂は、上記Ａｕｓｔｅ
ｎによって記述された方法にしたがって調製でき、また
は供給業者から入手できる。この発明で、好首尾に使用
された上記物質の１つは、ＡＨ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ
４Ｂ（ニュージャージ州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ市Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製品の
商標名）の名称のもとで入手できる。
【００３７】調製したものであれ、購入したものであ
れ、樹脂は、使用前に調整しなければならない。これは
以下のようにして行なわれる。容積、量、および寸法は
濃縮対象物質の量に比例して調整される。
【００３８】約１ｇのアミノヘキシル・アガロースを、
焼結ガラス・フィルタ漏斗に入れ、撹拌しながら、少な
くとも２００ｍｌの０．５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄す
る。つぎに樹脂をVIII：Ｃ緩衝液で平衡化させて、約
０．９ｃｍ径のカラムに充填する。ここで考慮される使
用の型には、流れアダプタ付きのＢｉｏ−Ｒａｄ Ｅｃ
ｏｎｏカラムが極めて適当であることがわかった。充填
カラムの床容量は約４ｍｌである。
【００３９】（ii）アミノヘキシル・アガロース・カラ
ムへの適用とその使用法 上記のようにして調製した濃縮プールを、前節で述べた
樹脂量およびカラム寸法を使用する場合、最終濃度１０
０〜２００ｍｌまで、VIII：Ｃ緩衝液で１：１０に希釈
する。希釈プールを、流速２００ｍｌ／時でカラムに適
用する。
【００４０】つぎにカラムを、好ましくは塩化カルシウ
ムからのカルシウム・イオンを含むVIII：Ｃ緩衝液で洗
浄する。溶液は、カルシウムイオンに関して、０．０１
Ｍ〜０．０３Ｍの間、好ましくは０．０２５Ｍとする。
【００４１】濃縮VIII：Ｃの溶離は、先の洗浄段階で用
いたより高濃度のカルシウム・イオンを含むVIII：Ｃ緩
衝液により、流速５〜２０ｍｌ／時、好ましくは１０ｍ
ｌ／時で行なう。この場合もまた、塩化カルシウムは、
０．２５〜０．５Ｍの間、好ましくは０．３Ｍ濃度の好
ましいカルシウム・イオン源である。１ｍｌ容積のフラ
クションを集め、そして下記にしたがって検定する。集
められたフラクションは、４℃でまたは凍結して保存で
きる。豚の血漿源からえられたVIII：Ｃの調製物は、貯
蔵前に５〜１０％の人間血清アルブミンにより安定化さ
れる。
【００４２】検定は、フラクションを、必要に応じてVI
II：Ｃ緩衝液で希釈し、そしてさらに基質へ添加する前
に、フラクションを検定緩衝液で１：１００に希釈して
行なう。標準部分トロンボプラスチン時間検定法が用い
られる。
【００４３】緩衝液の組成は以下のとおりである。
【００４４】燐酸塩緩衝塩水溶液 燐酸ナトリウム１．６ｇ 一塩基性−水和物 燐酸ナトリウム８．４ｇ 二塩基性無水物 塩化ナトリウム６１．４ｇ 水で７リットルとする。緩衝液のｐＨは７．２である。
【００４５】VIII：Ｃ緩衝液 ｍｌ ０．０２Ｍ イミダゾール ｍｌ ０．１５Ｍ 塩化ナトリウム ｍｌ ０．１０Ｍ リジン ｍｌ ０．０２％ アジ化ナトリウム 緩衝液のｐＨは、濃塩酸で６．８に調整する。
【００４６】表Iおよび表IIに挙げるデータは、上記し
たこの発明にしたがってえられた代表的なデータであ
る。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】好ましい実施態様のみが、この明細書にと
くに例示され、かつ記述されているが、この発明の多数
の変形および変更が、上記の教示に照して、またこの発
明の精神と意図する範囲から離れることなく、付記のク
レームの範囲内で、可能であることが認められるであろ
う。
【００５０】
【発明の効果】本発明に従い、VIII：ＲＰやその他の血
漿蛋白質を含まない、高い力価および高い比活性を有す
るヒトのVIII：Ｃ製剤が提供される。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年５月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カーラル アン フルチャー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ ラ ジョラ ボール エバート 7543

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １３４〜１１７２単位／ｍｌの力価を有
    し、且つ本質的にVIII:ＲＰを含まないことを特徴とす
    るヒトのVIII：Ｃ製剤。
  2. 【請求項２】 VIII：Ｃの濃度が血漿中におけるVIII：
    Ｃに対して少なくとも１６０，０００倍精製されている
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製剤。
  3. 【請求項３】 VIII：ＲＰに対するVIII:Ｃの比が血漿
    中における比の１００，０００倍以上であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項に記載の精製。
  4. 【請求項４】 上記VIII：ＣがVIII：Ｃ／VIII：ＲＰか
    ら単離され、且つVIII：ＲＰの９０〜１００％が除去さ
    れていることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
    の製剤。
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