JPS61500226A

JPS61500226A - コンホメ−ション特異性抗体を用いる血液凝固タンパク質の精製および単離法

Info

Publication number: JPS61500226A
Application number: JP59504143A
Authority: JP
Inventors: フユーリー，ブルース・イー; フユーリー，バーバラ・シー; リーブマン，ハワード・エイ; ルイス，リチヤード・エム
Original assignee: ニュ−・イングランド・メディカル・センタ−・ホスピタルズ・インコ−ポレ−テッド
Priority date: 1983-10-28
Filing date: 1984-10-29
Publication date: 1986-02-06
Also published as: EP0162078A4; DE3486350T2; JPH0577679B2; ATE111490T1; EP0162078B1; WO1985001941A1; DE3486350D1; EP0162078A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】コンホメーション特異性抗体を用いる血液凝固ターンバク質の精製および単離法〔技術分野〕本出願は１９８３年１０月２８日付で出願した米国出願Ｓ、Ｎ５４６．３６４号の部分継続出願である。

本発明は一般的に体液中のタンパク質の混合物から例えば血液凝固タンパク質のごときタンパク質の分離法に関する。タンパク質は通常免疫アフィニティー・クロマトグラフィーにより精製され、そとではタンパク質含有混合物を固定化された特定のタンパク質に対する抗体と接触せしめ、その後タンパク質−抗体複合体を分裂させる非特異的な苛酷な条件を用いてタンパク質を溶出せしめる。

免疫アフィニティーが試みられているタンパク質の一つの種類は血液凝固過程に関与するタンパク質である。血液凝固の一般的な全過程には二つの段階が含まれる：多くの因子およびカルシウムイオンの作用により前酵素プロトロンビンがその活性酵素型でおるトロンビンに変換される活性化段階、タンパク分解性酵素トロンビンがフィブリノーゲンに作用して、生成した血液要素を保持する３次元網状組織を形成するフィブリンを生成する変換段階である。

血液凝固の必須な因子はすべてタンパク質であり、そのいくつかは構造および機能においていくつかの類似性を共有し、一方あるものは他のいずれとも異る８１個の部分をもつ。例えば、次の４つの血液凝固タンパク質（ｎビタミンに一依存タンパク質ｉ）はそれらの完全な合成のためビタミンＫを必要とする：因子■、因子Ｘ、因子■およびプロトロンビン。

これらの１つの群のタンパク質はアミノ酸配列に顕著な相同性を共有し、制限タンパ之分解によりチモーゲンから活性酵素型へ活性化され、新規の金属結合アミノ酸、γ−カルボキシグルタミン酸を含有する。これらの血液凝固タンパク質は多くの２価および３価陽イオンと結合できる独特な種類の金属イオン結合タンパク質の代表である。カルシウム、マグネシウム、マンガンおよびガドリニウムイオンのごとき金属イ万ンとの結合により、これらのタンパク質はペプチド主鎖の変化および特定のアミノ酸残基の露出の変化を含む構造的コンホメーション遷移を起こし、それは螢光５円偏光二色性または免疫化学的技術によシモニターできる。

他の血液凝固タンパク質もまた金属イオンに結合するこの能力を持っている。因子■（プロアクセレリン）はプロトロンビンのトロンビンへの転化に必須で、１、また、それは非常に不安定なタンパク質であり、保存された血漿からは急速に消滅する。因子■（抗血友病性因子）はトロンビンを作るのに必須であり、古典的血友病のヒトの血漿において欠乏している。血友病は先天性であり、血友病者の血液は因子■の欠乏を除いて凝固機構に関して正常であるように思われる。

後天的には、肝臓疾患、ビタミンに欠乏、およびワルツアリビタミンに依存タンパク質が欠乏する。血友病Ｂは因子■の遺２５．０００人が血友病であり、その約１０−１２％が血友病Ｂに後天的または遺伝的血液凝固タンパク質欠乏の疾病を持つ患者の治療は高い危険性を持つ高価な療法が続けられている。例えば血友病Ｂは現在次の２通りの方法で治療されている：新鮮な凍結血漿の使用または因子■の市販製品の使用。後者の物質は正常ヒト血漿の部分分画により得られた濃縮製剤であシ、最もよいものでも中程度の純度である。凍結血漿および不純な因子■濃縮製剤を使う両方の療法とも、患者への肝炎の著しい危険性が存在するが、因子■濃縮製剤はプールされたヒト血漿から製造されるのでよシ大きな感染の危険性がある。これらの血漿製品の両方を多く投与されるすべての血友病患者は事実上肝炎にさらされてきており、そのような暴露の血清学的証拠が示される。

臨床的には多くはある種の型の異常な肝臓機能を持っている。しかしながら不純な因子■濃縮製剤は伝染性脈管向凝固、血栓症および肝炎のごとき主要な合併症の危険を増加させ、特に調製製剤中の不純物により直接に起こされるかまたは悪化させられると信じられている。最近では高度に致死性の後天的免疫欠乏症候群（ＡＩＤＳ）の発現に対する危険の増加が血漿濃縮製剤を受けている血友病患者において報告されている。血漿タンパク質注入療法はこれらの疾病における特別の治療法ではあるが、そのような注入療法の合併症が調製製剤中の不純物により直接起こされる事が明らかであるのでその使用および有効性が減少している。この理由のため、血液凝固血漿タンパク質を実質的に純粋に濃縮した形のものを供給する方法は、現在の注入療法。好ましくない医学合併症をなくすが、または著しく減少させる。そのような進歩は長く認識されている要求を満足させ更なる利点を提供するので、血友病患者によりその疾病に伴うタンパク質欠乏を減少または除くため規則的および予防的に注入療法が使用されるであろう。

〔背景技術〕

上記のごとく、血漿中の血液凝固タンパク質を精製する一般的な過程は知られており、通常ビーズ型のセファロースのごとき不活性なマトリックス支持体に単離すべき因子の抗体を結合せしめたアフィニティクロマトグラフィーカラムを通して血漿を通過せしめる。因子は特異的に固定化抗体と複合体を形成しその後因子（抗原）をカラムから溶出する。しかしながら本発明以前には血液凝固因子をうまく溶出する事が非常に困難であったのでこの方法により、治療上有益な純度で所望の血液凝固因子を得る事は非常に困難な事であった。これはタンパク質から抗体を分離するのに必要な化学または物理条件がタンパク質の機能も破壊するためである。

従って、構造的および機能的に完全なタンパク質を残し、タンパク質が定量的に回収できる、個々の血液凝固因子を含むタンパク質の単離のための方法を提供する事が非常に望まれる。

〔発明の開示〕

一般に、本発明は配位子と複合体を形成した場合コンホメーション変化（即ち３次元構造の変化）を起こすタンパク質を単離するための非常に有効な方法を特徴とする。本方法は、タンパク質−配位子複合体と特異的に反応し、配位子不在下では実質的にタンパク質と反応しない、または配位子なしのタンパク質と特異的に反応し、配位子と複合体を形成したタンパク質とは実質的に反応しないいづれかの抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を用いる（タンパク質は一般的に配位子にょ９安定化されるので、配位子と複合体形成したタンパク質を以後ときどき１１配位子−安定化１１コンホーマーと称する）。

本発明に使用する抗体が単離しようとするタンパク質の配位子−安定化コンホーマーに特異的な場合は、本方法で固定支持体上に抗体を固定化し、その後配位子存在下、タンパク質を含有する混合物を固定化抗体と接触せしめ、配位子−安定化タンパク質を固定化抗体に結合せしめる。タンパク質の放出させるため、タンパク質−抗体複合体をタンパク質の配位子に対する親和力よりも強い配位子への結合親和力を持つ化合物と接触せしめる；この強い親和力の化合物はタンパク質がら配位子を除去し、タンパク質のコンホメーションを変化せしめ、抗体はもはやそれに結合せず、このようにしてタンパク質が放出される。

この放出段階は特異的で緩和な条件下実施され、タンパク質を通常免疫アフィニティカラムから溶出する非特異的な苛酷な条件に付随する変性および機能の損失の危険性がな（高度に精製できる。

本方法に使用する抗体が非配位子安定化タンパク質に特異的な場合は、本方法は固体支持体上に抗体を固定化し、その後タンパク質を含有する混合物を配位子不在下（または配位子がタンパク質に結合しない条件下）、固定化抗体と接触せしめ、タンパク質を固定化抗体に結合せしめる。タンパク質の放出のためには、タンパク質−抗体複合体を配位子と接触せしめ、それによりタンパク質のコンホメーションが変化し、もはや抗体とは結合しなくなる。配位子−安定化タンパク質に特異的な抗体を使用する方法の場合は、放出段階は特異的で緩和であり、そのため変性は起こらない。

本発明の方法はさらに非常に重要な利点を提供する：例えばヒト血液凝固に関与するタンパク質のごときタンパク質は混合物中の他のタンパク質からだけではなく同様に混入ウィルスからも分離される。この事はしばしば通常の因子■および因子■濃縮製剤からのＢ型肝炎に接触する血友病患者にとって非常に重要な事である。

さらに、本発明の方法はわずかな単純な工程で高度な精製を提供し、低価な自動化および規模拡大を行い易い。

本発明の他の特徴および利点は、以下に記載する良好な実施態様および請求の範囲から明らかになるであろう。

〔発明を実施する為の最良の形態〕

第１に図を記載する。

旦図１は塩化カルシウム中（・）およびエチレンジアミン四酢酸（０）中でのコンホメーション特異性抗−因子■ポリクローナルウサギ抗体の因子■への結合を示すグラフでアシ；図２は塩化カルシウムの存在および不在下でのコンホメーション特異性抗−因子■モノクローナル抗体（ＨＬ１２−２１）の因子■への直接結合を示すグラフであり；図３はコンホメーション特異性抗−因子［：　Ｃａ＋１ポリクロ−クル抗体の特異性を示すグラフである。因子■（°）による置換が観察されるが因子Ｘ（Ａ）またはプロトロンビン（ｏ）では観察されない。

図４は本発明の方法を用いる部分精製血漿からのヒト因子■の精製および単離を示すグラフである。

図５は、塩化カルシウム存在下のコンホメーション特異性抗−プロトロンビンモノクローナル抗体のプロトロンビンへの結合およびエチレンジアミン四酢酸によるその溶出を示すグラフである。

図６は、本発明の方法を用いた、Ｂ型肝炎−浪人血漿からのＢ型肝炎表面抗原の除去を示すグラフである。カラムからの分画顛つきタンパク質濃度（２８０ｎｍでの吸収・）およびＢ型肝炎表面抗原を競合ラジオイムノアッセイ（ＨＢＳＡｇ　ｏ　）により検定した。肝炎ウィルスの定量的存在はＲＩＡにおけるｃｐｍの増加により表現される（非特異的結合は１２４　ｃｐｍであり、陽性試料は２５０　ｃｐｍ　以上である）。

タンパク質および配位子本発明の方法はタンパク質が配位子と複合体形成した場合そのコンホメーションが変化する任意のタンパク質の単離に使用できる。

そのようなタンパク質の一つの種類は血液凝固に関連するヒトおよび他の浦乳類の血漿タンパク質である（即ち、因子■。

■、■＋　ＩＸ　＋　Ｘ　＋　プロトロンビン、タンパク質Ｓおよびタンパク質Ｃ）。これらのタンパク質はある種の低分子量（＜３，０００）の配位子、特にＣａ＋＋、　Ｍｇ＋＋、　ＧＯ＋＋およびＧｄ＋＋＋のごとき二価または三価の金属イオンと複合体形成した場合にコンホメーション変化を起こす。これらのタンパク質のいくつかは（例えば、プロトロンビンおよび因子■）は金属イオン結合部位含有Ｖγ−カルボキシグルタミン酸を持つが、他のタンパク質（例えばγ −カルボキシグルタミン酸を含まない因子）も金属イオンと複合体形成によりコンホメーション変化を起こす。

本発明の方法を用いて精製できる他のタンパク質は、配位子と複合体形成して安定な複合体を形成でき、その複合体の３次元構造が非複合体形成の酵素のそれと異なるような酵素である。

そのような配位子の例は非常に希少な基質；阻害基質（即ち、酵素により活性化され酵素と共有結合を形成するような基質）：阻害剤として機能する基質類似体；および酵素阻害剤である。

抗体産生本方法で使用される抗体は常法により産生されるポリクローナルおよびモノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体の産生に使用する抗原の性質はどの一般的精製技術を用いるかに依存している。もし抗体が配位子−安定化コンホーマーに特異的であるべきなら、タンパク質の配位子−安定化コンホーマーを用いて免疫し、またはもし、配位子がすでに免疫化動物に存在していれば、配位子なしのタンパク質単独で使用できる；動物に存在する配位子が免疫化タンパク質とインビボで複合体になり、配位子−安定化コンホーマーに対する抗体を産生ずる。例えば、動物血液中にカルシウムは存在するので、因子■のごときＣａ＋＋−安定化ヒト血液タンパク質に対する抗体は、Ｃａ＋＋と複合体形成していない因子■で免疫して発生できる。一方、もし例え９　特表口ａ（ｉ！−５００２２６（４）は酵素の基質のごと（免疫動物の血清に存在しない配位子なら、配位子−安定化タンパク質を用いて免疫化を実施する。

タンパク質の非配位子安定化コンホーマーに対し特異的な抗体を用いるタンパク質単離法では、もし配位子が免疫動物妬存在しない場合は配位子の不在下、タンパク質で免疫化を実施する。もし免疫動物に配位子が存在するならば（例えばもし配位子がＣａ　であり、タンパク質がプロトロンビンのごときＧａ＋＋−安定化ヒト血漿タンパク質ならば）天然に存在する配位子と複合体形成を行わないであろうタンパク質の抗原性類似体を用いて免疫化を実施しなければならない。正常の状態では、配位子結合部位含有γ−カルボキシグルタミン酸を持つ血液タンパク質の場合、タンパク質の異常なデス丁γ−カルボキシグルタミン酸型を用いて免疫化を実施できる（プロトロンビンおよび因子■のごときビタミンに依存性タンパク質の場合、異常なデスーγ−カルボキシグルタミン酸型のタンパク質がビタミン欠乏症の患者の血液から単離できる）。もしくは、免疫化抗原は配位子と複合体形成するには小さすぎるタンパク質の部分に対応するペプチドから成り立たせる事も出来；もし必要であれば、ペプチドをウシ血清アルブミンまたはキーホールアオガイヘモシアニンのごときより大きな分子で担持する事もできる。

抗体スクリーニングおよび精製通常のスクリーニング技術を用い、タンパク質の一つのコンホーマーに結合し、他のものには結合しない能力で抗体をスクリーニングする。抗体は抗体が特異的であるタンパク質のコンホーマーが結合したアフィニティカラムを用い精製する；もし、カラムが配位子−安定化コンホーマーに対する抗体を含むなら、配位子に対しより強い親和力を持つ化合物で溶出し、またはもしカラムが非−配位子− 安定化コンホーマーに対する抗体を含むなら配位子で溶出する。

固体支持体への結合精製抗体をタンパク質精製技術で使用される通常の任意の固体支持体に結合する、例えば交叉アガロース、ポリアクリルアミドまたはセルロースが例えば臭化シアノジエン、カルボジイミドまたはタンパク質Ａを通して結合されたアフイニテイクロマトグラフイーカラム。例えば種々の重合ビーズのごとき通常の固体支持体が非−クロマトグラフイーアフイニテイ精製法に同様に使用できる。

タンパク質単離タンパク質含有混合物を適当な支持体−結合抗体と適当な配位子の存在または不在下（方法に依存して）接触せしめ、タンパク質を単離する。免疫複合体の分裂は配・位子の除去または添加による結合タンパク質のコンホメーション変化により達成される。結合タンパク質が金属イオン−安定化の場合、分裂はＩＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸塩、シュウ酸塩またはリン酸塩のご　−とき金属キレータ −を用いて良好に達成される。

以下の特定の実施例は本発明をより特別に指摘しようとするものであり、その範囲を制限するものではない。

精製ヒト因子■濃縮製剤の製造因子■は新鮮凍結ヒト血漿から、ローゼンベルク（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、（１９７４）ジエイ、バイオロ、ケム、　（Ｊ　、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　。

２５０　：１６０７−１６１７；およびミレチヒ（Ｍｉｌｅｔｉｃｈ　）ら、（１９７８）ジエイ、バイオロ、ケム、（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、）、　２５３：６９０８−６９１６に記載された方法に従ってＩＩ）ＥＡＥ　セファデックスクロマトグラフィー、ＤＫＡＥセルロースクロマトグラフィーおよびヘパリン− セファロースクロマトグラフィーの連続的なりエン酸バリウム吸着および溶出により単離される。精製因♀■はドデシル硫酸によるポリアクリルアミドゲルでの電気泳動で単一のバンドとして移動する。因子■活性は因子■−欠乏血漿を用いる２段階検定により決定し、１８０−２００単位／〜の比活性を持つ事が示された。

精製因子■は臭化シアノジエン−活性化セファロース４Ｂにセファロースｍｌ当り４．３Ｉｎ９の濃度で結合せしめる（総量４ｍｌセニュージーランド白色ウサギを因子■で免疫する。因子■の金属−安定化コンホーマーに対して特異的な抗体（抗−因子■：ｃ、＋＋）はタイ（Ｔ！Ｌｉ）ら（１９８０）ジエイ、ノくイオロ、ケム。

（Ｊ、Ｂｉｏｌ、０ｈａｍ、）　、　２５５　：　２７９０−２７９５　による技術を改良したヒト因子■−セファロースカラム（１，５Ｘ３Ｃ＋＋＋）上のアフイニテイクロマトグラフイーにより以下のごとく精製した。

抗血清は０．０５Ｍ）す７．ＨＣｌ；ｐＨ７，４、０，１４Ｍ　Ｎ２ＬＣ４，３ｍＭＣａＣｔ２．０．０５％　ＮａＮ５（ＴＢＳ／ＣａＣ４）−で−夜透析する。因子■−セファロースカラムを同一の緩衝液で平衝化し、抗血清をカラムにかける。カラムを徹底的にＴ　Ｂ　Ｓ／Ｃ，ａｃｉｔ２で洗浄し、非結合タンパク質を除去する。抗−因子■；ｃ、＋＋抗体はＴＢＳ１５ｍＭ　ＥＤＴＡで溶出する。金属イオン不在で因子■と結合する結合・抗−因子■抗体は４ＭグアニジンＨＧｔで溶出する。

５ｍｊｑ　ＥＤＴＡで溶出する抗体（ｃ　ａ＋　＋−安定化コンホーマー特異性）をプールし、限外濾過により濃縮する；これらは抗血清中、約２０％の抗体を示す。ウサギ抗−因子［：　Ｃ’ａ”＋抗体ハ臭化シアノジエンー活性化セファロース４Ｂにセファロースｍｌｌ当り３．３９の濃度で（総容量２ｍｌセファロース）カトレヵサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ　）ら、（１９６９）ピーエヌエイエス・ニーニスエイ（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ）、６１　：６３６−６４３　の方法に従って結合する。

モノクローナルコンホメーション特異性抗−因子■抗体の調製Ｂ　ａ　１　ｂ／ｃマウスを最初５０μ２のヒト因子■抗原を含む完全フロインドアジュバントを腹腔に注射して免疫する。これらのマウスはその後２５ｐ？の因子■を含む完全７０インド補助液で２週間ごとＶＣ３ケ月免疫する。続いての１ケ月間は更なる免疫化を行なわず、次の引き続いての細胞融合−先立つ３日間はこれらのマウスに２５μｔの因子■を含む０．１５　Ｍ　ＮａＣ７溶液を静脈内に注射する。

免疫マウスからの牌臓細胞（約５×１０７細胞）を５ｐ２１０血漿細胞株（２８係ボエチレングリコール５０００．シグマ（Ｓｉｇｍａ　）社、中５Ｘ１０６細胞）とコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ　）およびミルシュタイン（Ｍ　１ｌｓｔａｉｎ　）　Ｃコーラ−７Ｇ、らネイチャー（ロッドｙ）　（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ））　、２５６　：４９５−４９７（１９７５）：］の方法を用いて融合する。融合細胞はＲＰＭＩ　１６４０，１５％ドナー（Ｄｏｎｏｒ　）ウシ血清、１０ｍμヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液、４ｍμグルタミンおよび２０μ？／ｍｌ　のゲンタマイシンから成る完全培地に懸濁し、この培地中４８時間増殖させる。細胞懸濁液を微量力価トレーの個々の二重のウェル中へ、細胞増殖を続ける為ウェル当り約３Ｘ１０５細胞を含むように分配する。数週間後裔々のウェルからの上澄み液の抗−因子抗体産生を検定する。選択された培養細胞を限外希釈法〔マツケルン（Ｍｃｋｅａｒｎ）　。

ｊ、ｊら、モノクローナルーアンテイボディーズ（Ｍ　ｏｈｏｃｌｏｒ＋ａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）　、プレナム・ブレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）　、　＝：ｘ−−ヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　］によりクローン化する。因子■ に反応性のあるモノクローナル抗体を産生ずる多くのクローンが同定されるが、単一のクローン（ＨＬ１２−２１と称される）が金属イオン存在下でのみ因子■ と反応し、金属イオン不在下では因子■と反応しないコンホメーション−特異性抗体を産生ずる。

抗−因子■抗体の評価のための検定固相酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）法をポリクローナルウサギおよびモノクローナルネズミ抗−因子■：　Ｃ＆＋＋抗体の評価のために使用した。微量力価プレートの適当な数のウェルを０．０５Ｍホウ酸（ｐＨ１３，５）中２０μｂ冷ｌ　の濃度のヒト因子■で４℃にて１６時間覆う。プレートを徹底的に５＋）ｍ＋Ａ）ＩＪスＨＯｔ（ｐＨ７，２）　、　０．１４　Ｎ　ＮａＣｚおよび０．０５　％　ＮａＮ３からなる緩衝液Ａで洗浄し、２％ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液Ａを２４℃で３０分間添加する。緩衝液Ａのみでよく洗浄した後、５０μｌの組織培養上澄み液またはポリクローナル抗−因子■抗−血清を各々、個々のウェルに添加し、その後プレートを３７℃にて１時間インキュベートする。

各々のウェルを５０ｍμ　トリスＨＣ１（ｐＨ７，２）　＋　Ｏｌｌ　４　Ｎ　ＮａＣｔ、１．５　ｍｐＭｇＣ１２，２ｍμベーターメルカプトエタノール、　、　０．０５　ＮａＮ３゜および０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ　）　２０からなる緩衝液Ｂで徹底的に洗浄する。ヒツジで作成された抗マウスエｐのＦａｂフラグメント（５０μｔ）を緩衝液Ｂ中でベーターガラクトシダーゼと結合させ、各々のウェルに添加する。プレートを再び２４℃で２時間インキュベートした後、緩衝液Ｂで３回以上洗浄する。ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトシド（０，０５Ｍリン酸ナトリウム：ｐＨ７，２，中５０μ’　）　、　１．５　＋ｎ μＭｇＣｌ２および１００ｍμベークーメルカプトエタノールから成る酵素基質を各々のウェルに添加し、２４℃にて３０から６０分間の間反応せしめる。反応生成物はダイナチック（Ｄｙｍａｔｅｃｈ　）　Ｍ　Ｒ５８０微量−ＥＬＩＳＡ自動読み自動機を使用して４０５ナノメータの吸光度を測定する事によりモニターする。

価するこれらの研究のためＥＬＩ８Ａ過程に追加の工程を加える。

因子■被覆ウェルでモノクローナル抗体をインキュベート後グレートを５０ｍμ トリスＨＯＩ−、０，１４Ｍ　Ｎｈｏｌ　、　ｐＨ７，２、１０ｍμＥＤＴＡかまたは５．ｍＰ０２ＬＣ１２を含有する緩衝液で洗浄する。

Ｃ２ＬＣｔ２またはＥＤＴＡ含有緩衝液で２回洗浄後、結合マウス免疫グロブリンを前記のごとく検出、定量する。

さらに、ポリクローナルウサギ抗体を用いる実験においては、ヒツジで高められた抗−ウサギＩ＃（５０μｔ）をアルカリホスファートとβ−メルカプトエタノールなしの緩衝液Ｂ中で結合し、この液を適当なウェルに添加し、続いて２４° Ｃにて２時間インキュベートする。ウェルを緩衝液Ｂで洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム（５０μｔ）を含む１Ｍグリシン、１．５ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２＋　ｐ　Ｈｌｏ　＋を各々のウェルに添加し２４℃にて６０分間反応を進行させ３　Ｎ　ＮａＯＨで反応を停止する。反応生成物は４０５　ｎｍにおける吸光度でモニターし測定する。

ポリクローナルおよびモノクローナルコンホメーション特異性抗−因子［：　Ｃ，＋　＋抗体を評価した結果はグラフにより図１および２に図示しである。図１はＣａＣｌ２かまたはＥＤＴＡ　存在下のウサギ抗−因子■：Ｃａ＋＋ポリクローナル抗体の結合能力を示しており、図から明らかなように、因子■抗原に結合するこれらのコンホメーション特異性抗体の能力ばＥＤＴＡ　存在下で本質的に減少している。図２は連続的に希釈したカルシウムイオンまたはＥＤＴＡの存在下での因子■抗原に対するＨＬ１２−２１ネヅミモノクローナル抗体の直接結合を図示している。

一つの抗体クローン、ＨＬ１２−２１はＥＤＴＡ存在下ではコンホメーション特異性モノクローナル抗体が因子■抗原に結合する能力がない事を明確に示している。

コンホメーション特異性抗−因子■抗原ネズミモノクローナルおよびウサギポリクローナル抗体の抗原特異性の決定は２つの型の検定を利用する。第１の検定は混合した２ｏμｔ７ｍｌのヒトプロトロンビン、因子Ｘまたは因子■で被覆されたウェルを持つ微量力価プレートを用い、コンホメーション特異性抗体色反応せしめる。試験した抗体母集団のすべてが（ネズミモノクロ−ナルコンホメーション特異性抗体およびポリクローナルウサギコンホメーション特異性抗体）ヒト因子■抗原と独占的に反応および結合した事が観察された。第２の検定においては（図３）、ヒトプロトロンビン、因子Ｘおよび因子■を個々に−別々のウェル中濃度を変化させて、一定量のネズミモノクローナルまたはウサギポリクローナルコンホメーション特異性抗体に添力ける。最初の３０分間の反応時間に続いてプロトロンビン、因子■または因子Ｘからなるこれらのウェルの反応液は次いで因子■抗原で被覆した他の微量力価プレートのウェルに添加する。コンホメーション特異性抗−因子■：Ｃａ←抗体を含有する最初の反応液と固定化因子■抗原のかわりの他の血漿タンパク質との相互作用は因子■含有固定化固相へ結合する免疫グロブリンの量の減少としてモニターする。結果はグラフにより図３に図示してあり、ウサギポリクローナル抗−因子■：Ｃａ＋＋抗体がヒトプロトロンビンまたは因子Ｘと競合せずもしあったとしてもごくわずか（１０，０ＯＯＸ以下）である事がカルシウムイオン存在下因子■に対するこれらのコンホメーション特異性抗体の特異性を決定的に示している。

コンホメーション特異性ポリクローナルまたはモノクローナル抗−因子■の結合特異性は確立された方法〔カトレヵサスＰ。

らプロス、ナトル、アカド、サイ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃｄ、Ｓｃｉ　）ＵＳＡ、６１：６３６（１９６９））を用いネズミモノクローナル抗−因子■；　Ｃａ”＋抗体またはウサギポリクローナル抗−因子■：Ｃａ”＋抗体が臭化シアノジエン−活性化セファロースに結合したものからなるアフィニティマトリックスへ精製ヒト因子■。

因子Ｘまたはプロトロンビンを加える事により示され、る。これらのビタミンに依存性凝固タンパク質の精製調製試料は１ｍｉ”ｌＣａ１１２および１ｍ！（のベンズアミジン（ｐＨ７，５）を含有する緩衝液Ａに対して透析し、この透析液で平衝化したアフィニティマトリックスカラムへ注−ぐ。因子■タンパク質はアフィニティマトリックスへ結合するが、一方因子Ｘおよびプロトロンビンタンパク質は透析溶液により溶出される。続いてアフィニティマトリックスに結合している因子■タンパク質を１ｍ７・、ベンズアミジンおよび３ｍハＥＤＴＡを含む緩衝液Ａ（ｐＨ７，５）で溶出する。回収された因子■タンパク質は１０ｍバリン酸ナトリウム＋　０．１４　ＮＮａＣ１ｔ（ｐｉ（７，０）に対して透析し、 −７０’ＣＴ凍結する。アフィニティマトリックスからの各々の血漿タンパク質の分離および個々の溶出は２８０　ｎｍでの吸光度の測定によりモニターする。

アフィニティマトリックスがら単離された精製ヒト因子■タンパク質の分画活性は検定により評価する。すべての場合、精製因子■タンパク質は構造的に無傷で機能的に活性である事が観察された。さらに、アフィニティマトリックスカラムを通った最初の溶出溶液中に回収された因子Ｘおよびリン凝固法を用いて因子Ｘ −■または因子１−■欠乏ラン血漿の凝固を促進する各々のタンパク質の能力を試験する事により検定した。ＤＥＡＥセファセル（５ｅｐｈａｃｅｌ　）により更に精製されたクエン酸バリウム吸着血漿または市販のグロブレックス■（Ｐｒｏｐｌｅｘ■）濃縮製剤からのヒト因子■の選択的精製の他の実証を前記の方法により実施した。この溶出液を用いて得られるタンパク質分画の納置を図４に図式的に示した。ＥＤ’ｒＡ　含有液により溶出さ゛れる因子■タンパク質分画（図４）の純度はドデシル硫酸含有ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により評価し、アフイニテイカラムに注がれた部分的精製血漿タンパク質物質の電気泳動ゲルと比較し、ＣａＣ４２含有溶出溶存在下ではカラムに結合しない図４の流れ通っただけの溶出タンパク性物質と比較した。一部分精製血漿タンパク質物質中のヒト因子■タンパク質の比活性はタンパク質ｑ当り１２６単位であった。

ウサギポリクローナル抗−因子■：Ｃａ＋＋抗体から成るアフイニテイマトリックスカラムからＥＤＴＡ　含有溶出液を用いてヒト因子■タンパク質を単離した後は、因子■タンパク質の比活性（透析後）は１５２単位／■でおった。この１３倍の純度の増加は以前に知られている多段階技術により得られた因子■タンパク質の場合と等しいかより以上である。この方法は他のタンパク質同様混入している因子Ｘおよびプロトロンビン活性をほとんど除去し、あってもごくわずかである。結果を表１に示した。理由はまだ完全には明らかでないが、モノクローナル抗体を用いるよりポリクローナル抗体を用いた方がより良好な結果が得られた。

この精製法によシ得られる主要な利点としては以下のような事が挙げられる：現在知られている古典的な多段階精製技術よりかなり簡単なアフイニテイマトリックス精製過程を一貫して用いる事により著しく純粋な（９５−１０Ｃ）％の間の均一性を持つ）濃縮製剤を得る事ができる；現在入手可能な血漿注入療法製品およびコニン■（Ｋｏｎｙｎｅ■）または他の市販濃縮製剤と比較して、２０から１２，０００倍純度の高い純粋タン・バク質製品を得る事ができる。当事者はこの方法論が、商業規模への拡大が血漿注入製品の製造の価格の大きな低下をまねき、また現在の血漿注入療法の結果目下起こっている望ましくない合併症を除去するであろう優れた製品を提供する事を理解するであろう。

Ｂ型肝炎ウィルスから因子■の分離血友病Ｂの治療に使用されている部分精製因子■濃縮製剤は肝炎ウィルス混入の高い危険性を伴っている。我々は免疫アフィニティークロマトグラフィーにより製造された精製因子■にはウィルス混入がないかどうかを問題にした。Ｂ型肝炎表面抗原による検定によりＢ型肝炎ウィルスが豊富な事が測定された原発性肝細胞癌の患者からの腹水（１ｍｌ）を新鮮凍結血漿（２００ｍｌ）尾添加する。抗 −因子■：ｃ　、＋　＋−セファロースを使用して因子■を免疫アフイニテイクロマトグラフイーによシ前記のごとく精製する。カラム分画中のウィルス表面抗原をラジオイムノアッセイにより測定する。すべてのＢ’Ｗ肝炎表面抗原はマフイニテイマトリックスに結合−しなかった。因子■を含有するＥＤＴＡ　溶出液中に検出できるほどの肝炎ウィルスは存在しない（図６）。因子■分画を５０倍濃縮後も肝炎ウィルスは検出されなかった。これらの結果は、検出限界内において、因子■がその精製中に肝炎ウィルスから分離された事を示している。

ヒトプロトロンビンはプロトロンビンのＣａ＋＋−安定化コンホーマーに特異的な固定化抗体を用いるか、またはＣａ１−安定化コンホーマーに反応しない異常デス−γ−カルボキシグルタミン酸プロトロンビンに特異的な固定化抗体を用いて単離できる。前者の抗体はプロトロンビンで免疫して、後者は異常プロトロンビンで免疫して作られる。因子■精〜製の場−合のごとく、第１段階は免疫法のための抗原の調製である。

ヒトプロトロンビンは新鮮凍結血漿から以下の順序のタンパク質沈殿の確立された方法を用いて調製される：クエン酸バリウム吸着、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィーおよび硫酸デキストラン−アガロースクロマトグラフィー〔ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　）　、　Ｊ　、Ｓ　、ら、ジエイ、バイオロ。

ケム、　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　）　、　２５０　：１６０７−１７　（１９７４）およびミレツチ（Ｍｉｌｅｔｃｈ）　、Ｊ、Ｐ、ら、ジエイ、パイオロ、ケム。

（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５３：６９０８＝６９１４（１９７８））。

この方法で得た精製プロトロンビンは凝固検定により１０単位／ηの比活性を持つ事が示すれた〔フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）　、に、Ｗ。

ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、２：１９５（１９４０）：］。

プロトロンビンに対するポリクローナルコンホメーション特異性抗体は実施例１に記載した方法でニューシーラント白色ウサギの免疫法により高められる。静脈穿刺による血液の採取だよび遠心分離の後、血清分画を抗体源として使用し、゛それは続いてカラムマトリックス上のアフイニテイクロマトグラフイーにより除去する。ブフイニテイマトリックスは確立された方法を用いて臭化シアノジエシー活性化セファロースに共有結合的に結合されているプロトロンどンから成っている。抗−プロトロンビン：　Ｏａ”＋抗体はアフイニテイマトリックスからＥＤＴＡ含千律向軸夜Ａを用いて溶出される。

ネズミモノクローナルコンホメーション特異性抗−プロトロンビン抗体の調製およびそのようなコンホメーション特異性抗体の評価は一般的に実施例１に各々示されたそれぞれの記載に続（ＥＬＩＳＡ方法論によシなされる。

モノクローナル抗体特異性の評価ＥＬ工ＳＡ方法論に基づく競合検定を用い、ＲＬｌ、３およびＲＬｌ、９と同定されたクローンから誘導された数種のモノクローナル抗体の抗原特異性が評価された。これらのクローンからの抗体は同定化ヒトプロトロンビンに結合する事が示された；さらに抗体のための固定化プロトロンビンンビ合する遊離プロトロンビンをその後加える。この競合検定を使用し、これらのモノクローナル抗体とプロトロンビンフラグメント１．異常（デスーγ−カルボキシグルタミン酸）プロトロンビン、トロンビン、プロトロンビン１およびウシプロトロンビンとの相互作用を試験した。両方の型のモノクローナル抗体（ＲＬｌ、、３およびＲ，Ｌｌ、９）はフラグメント１（プロトロンビンのＮＨ２−末端の１４の部分）と結合するが、一方両方ともプロトロンビン１（プロトロンビンのＣ０ＯＨ末端の％の部分）に結合しないという結果が示された。

これらの抗体は少しもトロンビン（前もってｐ−アミジノフェニルメタンスルホニルフルオリドで処理した）と結合しない。

抗体−固定化プロトロンピン相互作用の５０チ阻害にはプロトロンビンに比較して著しい高濃度の（２倍から１０倍の範囲）のプロトロンビンフラグメント１が必要とされる。さらに、これらのモノクローナル抗体型の両方ともにウシプロトロンビンとは結合しない。

３つのハイプリドーマ培養上澄み液からのモノクローナル抗体がカルシウムイオン存在または不在下でのプロトロンビン結合活性を試験された。クローンＲＬ　１．３　、　ＲＬ　１．９およびＨＬｌ　０．６カ５　ｍＭ　ＣａＣ２，、存在下プロトロンビンと結合するが００１ＭＥＤＴＡ存在下では有意な結合を示さないコンホメーション特異性抗プロトロンビン抗体を産生じた。クローンＲＬ１．３はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　’Ｃ’ｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ　Ｔ　Ｃ−Ｃ）に供託され、ＡＴＣＣ１受入れ番号第ＨＢ８３７号を受けた。

プロトロンビン抗体の精製種々の抗−プロトロンビン抗体産生ノ・イブリッドクローンを確立された方法〔ルイス（Ｌｅｗｉｓ）、Ｒ９ら、バイオケミスト１）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、２２：９４８−９５４（１９８３）］を用いて多量の培養液中で増殖させる。いく２かの型の抗体がアクイニテイクロマトグラフイーによりその液の５０係硫酸アンモニウム分画から精製される。トリス−ＨＣＩＣｐＨ７，５）　、　０．５　Ｍ　Ｎ２ＬＣ１および５ＩＩ］ハＬＣ−ａｃｔ２からなる溶出液で前もって平衝化されたアガロースに共有結合で結合されたプロトロンビンからなる２×６ｃｒｎカラムアフイニテイマトリツクスに抗体プールを応用する（図５）。このアフイニテイマトリックスを通った後得られる溶出分画は分画の２８０　ｎｍにおける吸光度を測定する事によりモニターされる。非結合タンパク質がなくなるまでアフイニテイマトリックスを洗浄した後、結合タンパク質分画は０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（＋）Ｎ７．５）　、　０．５Ｍ　ＮａＣＡおよび１０町員ＥＤＴＡから成る溶出液で溶出する。この溶出液のタンパク質を、０．０５Ｍトリス−ＨＯ２（ｐＨ７，５）　−、０，１５Ｍ　ＮａＣ１７および０゜０２チアジ化す）　ＩＪウムから成る透析液に対して１６時間透析し、続いて一２０℃ で保存する。

ＲＬｌ、３から得られたモノクローナル抗体とプロトロンビンとの相互作用は広い範囲のカルシウムイオン濃度でＥＬＩＳＡ法を用いて研究した。この検定において重大な誤りの源となる混入カルシウムイオンを除くため固定化プロトロンビンを含む微量力価プレートはＥＤＴＡ　を含む緩衝液で洗浄し、金属イオンを含まない水で調製された０、０５Ｎ）リス−ａｃｚ（ｐＨ７，５）および０．１５　Ｍ　ＮａＣ４からなる液体で徹底的に洗浄する。結果は、固定化プロトロンビンへのモノクローナル抗体結合のすべてがカルシウム依存である事を示している。最大結合は、０．９ｍ／＝ＪＮａ（ｔ２　の農産で観察され、最大の半分の結合は０．１　ｍ、ｈ　ＣａＣｌ２濃度で観察された。同様に、ＲＬｌ、３抗体の不溶化プロトロンビンへの結合が過剰のプロトロンビンで被覆した微量力価プレートへ種々の濃度のＲＬｌ、３抗−プロトロンビン抗体を加えて測定した。得られた経験的データを用いて、スカツチャード（Ｓ　ｃａｔｃｈａｒｄ　）　プロットヲ行い、モノクローナル抗−プロトロンビンコンホメーション特異性抗体の結合定数（Ｋａ）は２３×１０９　Ｍ　”’　ｌと計算された。評価した範囲の全部の範囲で結合回線が直線的であり、モノクローナル特異性抗体調製に期待される抗体結合部位の単一の母集団が含まれている事を示している事が注目される。

精製プロトロンビンの単離のためのモノクローナルまたはオリゴクローナルアフイニテイマトリックスの調製カルシウムイオンと結合してプロトロンビンのカルシウムイオン安定化型を形成するプロトロンビンタンパク質の単離のためのアフイニテイマトリックスの調製にこれらのモノクローナル、コンホメーション特異性抗−ブロトロンピン抗体を使用する。ポリクローナルまたはモノクローナル抗 −因子［：’ｃ、＋＋アフイニテイマトリックスの使用に関しては、使用する方法は前に英症例ＩＫ記載した方法と同様である。）・イブリドーマ産生モノクローナル抗−プロトロンビン抗体の一つの主要な利点は、明白に異ったモノクローナル抗体母集団（各々プロトロンビンのカルシウムイオン安定化型に対してコーホメーション特異性である）をわかっている部分で結合でき、純粋な分子として結合プロトロンビンが続いて溶出される最適のプロトロンビン結合素質を提供するオリゴクローナル抗体プールが形成できる点である。このオリゴクローナル抗体のプールをモノクローナルまたはポリクローナル抗血清と同一の方法で臭化シアノジエン−活性化アガロースへ結合し、アフイニテイマトリックスを形成する。プロトロンビン含有液または調製分画を５ｍＭ０　ａ　Ｃ’　２　存在下アフイニテイマトリックスに適用し、続いてカルシウムイオン含有緩衝液を用いて非結合物質を溶出する；アフイニテイマトリックスはその後クエン酸緩衝液またはｌＱｍＭＥＤＴＡ　含有溶出液で洗う。アフイニテイマトリックスに結合しているプロトロンビンの金属イオン安定化型中めカルシウムイオンは優先的にクエン酸緩衝液またはＥＤＴＡ　に結合するようになり、その結果、アフイニテイマトリックス表面で、プロトロンビイ−抗−プロトロンビン複合体が解離する。この優先的な金属陽イオン（この例ではカルシウムイオン）のＥＤＴＡまたはクエン酸緩衝液への結合がプロトロンビン−抗体複合体の解離および同時にプロトロンビンの金属イオン安定化型の付随した解離を起こす事が理解されるであろう。使用された金属イオンが正確に同一であるのかと無関係に、および単離された血液凝固血漿タンパク質が同一であるかどうかと無関係に、すＡＢｏｏ”　４０５分画番号国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．固体支持体上の固定された抗体であつて、前記抗体は配位子と複合体を形成したタンパク質に反応性があり、前記配位子と複合体を形成していない前記タンパク質とは本質的に反応しない抗体。
２．タンパク質含有混合物から前記タンパク質を単離する方法であつて、前記方法は配位子と複合体を形成した前記タンパク質と反応性があり、前記配位子と複合体を形成していない前記タンパク質とは本質的に反応しない、固体支持体上に固定化した抗体を提供し、前記配位子の存在下で前記混合物を前記固定化抗体と接触せしめ、前記配位子と複合体を形成せしめて、前記タンパク質を前記固定化抗体に結合して免疫複合体を形成せしめ、および前記免疫複合体を、前記配位子に対して前記タンパク質より高い結合親和力を持つ化合物と接触せしめ、前記固定化抗体から前記タンパク質を放出せしめる事を特徴とする方法。
３．前記タンパク質が血液凝固に関連するタンパク質であり、前記配位子が３，０００以下の分子量を持つ化合物である請求の範囲第２項記載の方法。
４．前記配位子が２価または３価の金属陽イオンである請求の範囲第２項記載の方法。
５．前記陽イオンがＣａ＋＋，Ｍｎ＋＋，Ｃｏ＋＋，Ｇｄ＋＋またはＭｇ＋＋である請求の範囲第４項記載の方法。
６．前記高い結合親和力を持つ化合物が金属キレート剤である請求の範囲第４項記載の方法。
７．前記タンパク質がγ−カルボキシグルタミン酸を含有し、前記配位子が２価または３価の金属陽イオンであり、前記陽イオンが前記タンパク質と前記γ−カルボキシグルタミン酸含有結合部位で複合体を形成する請求の範囲第２項記載の方法。
８．前記タンパク質が哺乳類タンパク質因子Ｖ，因子ＶＩＩ，因子ＶＩＩＩ，因子ＩＸ，因子Ｘ，ブロトロンビン，タンパク質Ｃ，タンパク質Ｓまたは血清アルブミンの１つである請求の範囲第２項記載の方法。
９．前記タンパク質が酵素である請求の範囲第２項記載の方法。
１０．タンパク質を該タンパク質を含有する混合物から単離する方法であつて、前記方法は、固体支持体上に固定化した抗体を提供し、前記タンパク質と反応性があるが配位子と複合体を形成している前記タンパク質とは本質的に反応しない、固体支持体上に固定化した抗体を提供し、前記混合物を前記配位子が前記タンパク質と複合体を形成しない条件下で前記固定化抗体と接触せしめ、前記タンパク質を前記固定化抗体に結合せしめて免疫複合体を形成し、および前記免疫複合体を前記配位子が前記タンパク質に複合体を形成できる条件下で前記配位子と接触せしめ、前記固定化抗体から前記タンパク質を放出せしめる事よりなる方法。
１１．前記タンパク質が哺乳類ビタミンＫ−依存性タンパク質であり、前記配位子が３，０００以下の分子量を持つ化合物である請求の範囲第１０項記載の方法。
１２．前記配位子が２価または３価の金属陽イオンである請求の範囲第１０項記載の方法。
１３．前記陽イオンがＣａ＋＋，Ｍｎ＋＋，Ｃｏ＋＋，Ｇｄ＋十またはＭｇ＋＋である請求の範囲第１２項記載の方法。
１４．前記タンパク質がγ−カルボキシグルタミン酸含有の配位子結合部位を持ち、前記配位子が２価または３価の金属陽イオンであり、および前記陽イオンが前記タンパク質と前記結合部位で複合体を形成する請求の範囲第１０項記載の方法。
１５．前記タンパク質がヒトタンパク質因子Ｖ，因子ＶＩＩ，因子ＶＩＩＩ，因子ＩＸ，因子Ｘ，ブロトロンビン，タンパク質Ｃ，タンパク質Ｓまたは血清アルブミンの１つである請求の範囲第１０項記載の方法。
１６．前記タンパク質が酵素である請求の範囲第１０項記載の方法。