JPH02163085A - ヒト・プロテインcの分離方法 - Google Patents

ヒト・プロテインcの分離方法

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JPH02163085A
JPH02163085A JP1288684A JP28868489A JPH02163085A JP H02163085 A JPH02163085 A JP H02163085A JP 1288684 A JP1288684 A JP 1288684A JP 28868489 A JP28868489 A JP 28868489A JP H02163085 A JPH02163085 A JP H02163085A
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human protein
human
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hpc
antibody
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健司 若林
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芳彦 鷲見
Yataro Ichikawa
市川 弥太郎
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淳 三室
Nobuo Aoki
青木 延雄
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 a、産業上の利用分野 本発明はヒト・プロテインCに対してカルシウムイオン
(Ca ” ” )の非存在下では認識せず、カルシウ
ムイオン<ca ” ” >存在下で認識するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ及びヒト・プロテ
インCの分離方法に関する。
b、従来技術 プロティンCはビタミンに依存性血漿蛋白質すなわちγ
−カルボキシグルタミン酸含有蛋白のつであり、血管内
皮細胞表層のトロンボモジュリン存在下トロンビンによ
り活性されて[E smon。
C,T  &  Owen 、 W、 G : Pro
c 、 Natl。
Acad、  Sci、USA、 78:  2249
−2251(1981)参照]活性化プロティンC(A
PC)となる。活性化プロティンCはセリンプロテアー
ゼの一種であり、血液凝固系の補酵素である第V因子(
FV。
FVa)と第■囚子(F■、F1a)を分解し、強い抗
凝固作用[5uzuki、に、 et、 al、  :
 J。
Biol、Chem、 258:  1914−192
0(1983) 、 Vehar。
G、 A、 &  Davie、 E、 W、  : 
Biochemistry。
坦:  401−409 (1980)参照]を示すと
共に血管壁からプラスミノーゲン・アクチベータを放出
させ、線溶系を促進させる[COmD、P、 C,& 
 Esmon。
C,T  :  J、  Cl1n、l nvcst、
68:  1221−1228< 1981 )参照]
ことが知られている。
さらにプロティンC欠損症は重度の血栓症を呈すること
も報告されており、[GrNfin、J、H。
et at  : 、J 、 Cl1n 、  l n
Vest、、 68. 1370−1373(1980
) 、 Bertina、 R,M、 et al  
: Thromb。
Haemostas、、48 1〜5 (1982) 
]ブブチティンは血液凝固線溶系の重要ならす御因子で
あることが明らかにされている。
したがってプロティンCの作用機構を明らかにすること
、また、プロティンCの血中における抗原1、活性量を
測定し、その動向を把握することができれば、それは基
礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な意味を持
つと考えられる。
一方モツクローナル抗体は単一の抗原決定基にたいして
特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的
に産生できるという利点から抗原蛋白質の機能および構
造の解析、あるいは免疫測定(EIA、RIΔ)に近時
一般的に広く利用されるようになって来た。特に抗原蛋
白質の檄能解析、分子解析には抗原蛋白の機能に関与す
る部位、または特殊な構造部位を認識する抗体を見出す
ことが有力な手段となり得る。
ヒト・プロテインCの構造は、分子量的41000のH
鎖と分子量的21000のし鎖がs−8架橋で結合され
ており、H鎖にセリンプロテアーゼ活性部位を有し、ま
た、L−鎖アミン末端には、9個のカルシウムイオン結
合性アミノ酸、すなわち、γ−カルボキシグルタミンI
!(Gla)残基を含むGlalミドメイン在すること
が知られている。
Glalミドメインする血液凝固因子は、プロティンC
を含め、第■因子(プロトロンビン)、第VI因子、第
1X囚子、第X因子いずれもカルシウムイオン(Ca+
+)存在下でQlaに依存した立体的構造変化を生じる
ことが知られており、この機構は、血液凝固系発現の上
で重要な役割を果していることが知られている。
従来、ヒト・プロテインCのモノクロナール抗体は枠木
らにより作成されたことが報告されており[枠木宏治 
他:パ血液と脈管” 、 15:  171174 (
1984)参照]、この抗体はヒト・プロテインCの抗
原υの測定、活性の測定に利用されているが、カルシウ
ムイオン(Ca ” ” ’)存在下で構造変化を受け
たヒト・プロテインCを認識するモノクロナール抗体に
ついての報告はまだなされていない。
そこで本発明者らは、プロティンCがカルシウムイオン
<ca”>存在下で立体的構造変化を受けることに着目
し、カルシ「クムイオン(Ca″+)の存在下で構造変
化を受けたプロティンCを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体について研究を進めた結果本発明に到達した。
C0発明の構成 すなわち、本発明は、カルシウムイオン(Ca ” +
)の非存在下ではヒト・プロテインCに対して認識せず
且つカルシウムイオン(Ca”)の存在下ではヒト・プ
ロテインCに対して特異的にH%1するヒト・プロテイ
ンCに対するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリド
ーマである。
さらに他の本発明は、カルシウムイオン(Ca ” ”
 )の非存在下では、ヒト・プロテインCに対してIn
せず且つカルシウムイオン(Ca+“)の存在下ではヒ
ト・プロテインCに対して特異的に認識するヒト・プロ
テインCに対するモノクローナル抗体を不溶性担体と結
合させた吸着体に、ヒト・プロテインC含有混合物を、
カルシウムイオン(Ca ” ” )の存在下に接触せ
しめて、該吸着体にヒト・プロテインCを結合せしめる
ことを特徴とするヒト・プロテインC含有混合物からの
ヒト・プロテインCの分離法である。
本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
細胞はケーラーとミルシュタインの方法[Kahler
 &  Milstein、Nature  :  2
56495−497 (1975) ]として知られた
方法によって得られる。すなわち、ヒト・プロテインC
でマウスを免疫した侵、このマウスの肺臓細胞をマウス
・ミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ
細胞はマイクロタイタープレートに固定されたヒト・プ
ロテインCと反応する抗体に対し、系統的に検査し、選
択される。この際に、カルシウムイオン(Ca”)存在
下における検査と、カルシウムイオン非存在下における
検査を同時に行い前者においてのみ陽性を示すハイブリ
ドーマを選別することにより、目的とする抗体を合成し
分泌するハイブリドーマを単離することができる。
かかる新規なハイブリトーマ細胞が産生ずる産生物から
得られるモノクローナル抗体は、カルシウムイオン(C
a ” ” )の存在下におけるヒト・プロテインC分
子上の特定の抗原決定基に対して単一特異的に作用する
本発明によって得られるモノクローナル抗体はその特性
からヒト・プロテインCの精製に利用する場合非常に有
利である。すなわち、不溶性担体に本発明によってIJ
られるモノクローナル抗体を固定化し、カルシウムイオ
ン(Ca ” ” )が存在する溶液中で血漿(カルシ
ウムイオン存在下で凝固しないように調製したもの)ま
たは、他のヒト・プロテインCを含む原料、あるいはそ
れらの粗抽出物、粗m製物および溶液からヒト・プロテ
インCを吸着・分離しカルシウムイオン(Ca”)存在
下で洗浄後、溶液をカルシウムイオンを含まないものく
例えばEDTへが存在する溶液)に冒き換えて、ヒト・
プロテインCを溶出することができる。この方法によれ
ば、従来の不溶化・抗体による抗原蛋白質の精製のよう
に、過激な条件下(例えば、0.2Mグリシン塩酸ある
いは8M尿素のような)に蛋白質をさらすことなく、穏
和な条件下で精製を行うことができる。
また、ヒト・プロテインCその他のγ−カルボキシグル
タミン酸含有蛋白質にはQlaを含まず、Glaに依存
する構造変化を受けない異常分子が存在することが知ら
れているが、本発明によって得られるモノクローナル抗
体を用いることにより、この異常分子の測定が可能にな
ると考えられる。
すなわち、カルシウムイオン(Ca++)の存在の有無
に拘らず、ヒト・プロテインCを認識する抗0体を用い
て免疫学的手段(例えばEIA、RIA)により血漿そ
の他の試料中のヒト・ブOティンC抗原伍を測定し、更
に本発明によるモノクローナル抗体を用いて、血漿、そ
の他の試料中のヒト・プロテインCをカルシウムイオン
存在下で免疫学的手法(EIA、RIA>により測定す
れば、その測定値の差から、異常ヒト・プロテインCの
量を把握することができる。
次に本発明によって得られるモノクローナル抗体を作成
する具体的方法について詳細に説明する。
A、抗原の単離・精製: 抗原に用いるヒト・プロテインCは枠木らの方法[3u
zuki、l(、et at 、 J 、Biol、C
hem、ユ阻:1914−1920 (1983) ]
によりヒト・血漿から単離・精製される。
B、ヒト・プロテインCによるマ スの 疫:li[3
alb/Cマウスを用いることができるが他の系(St
rain)のマウスを使用してもよい。その際、免疫計
画、及びヒト・プロテインCの濃度は十分な量の抗原刺
戟を受けた、リンパ球が形成されるよう選ばれるべきで
ある。例えばマウスに50μ3のヒト・プロテインCを
2週間間隔で腹腔に3回投与の後、さらに30μ9を静
脈に投与する。
最終免疫の数日後に融合の為に肺臓細胞をとり出す。
C1細胞融合; 上記の如く免疫したマウスの肺臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの肺臓m胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。肺臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約20:1〜約2:1の範囲であ
る。約108個の肺臓細胞について0.5〜1.5rn
lの融合媒体の使用が適当である。
細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良く知られてい
るが、本発明では、P3−X63−A(18−U1細胞
(P3−Lll )  [Yelton、D、 E e
tal、 Current、 Topics in  
lylicrobiology andImmunol
ogy、  811(1978)参照]を用いた。
好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子[10
00〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用
できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を使
用することもできる。本発明においては、平均分子l 
1540のポリエチレングリコールを用いた。
D、融合した細胞の選択; 別の容器内(例えばマイクロタイタープレート)で未融
合の肺臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間(約1週間)培養する。培地は
未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、(例えば
HΔT培地)が使用される。この選択培地中では、未融
合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の肺臓細胞は非
腫瘍性細胞なので、ある一定期間後(1週間後)死滅す
る。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と、親牌細胞の性質を合わせ持つため、選択培地
中で生存できる。
E、各容器中のヒト・プロテインC抗体の確認;かくし
て、ハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養上清
を採取し、ヒト・プロテインCに対する抗体について酵
素免疫定石法(E nzymel 1nked l m
ll1unosobcnt A 5say)によりスク
リーニングする。この際、培養上清、酵素標識抗体溶液
および洗浄液に一定濃度の(:、ac12を加えた条件
下の測定と、CaCfzを加えない条件下の測定の両方
を行い、前者に対してのみ陽性を示すハイブリドーマを
選択することにより、カルシウムイオン非存在下では、
ヒト・プロテインCをH’tAせず、カルシウムイオン
存在下で、ヒト・プロテインCを認識する抗体を産生、
分泌するハイブリドーマを選別することができる。
目的の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を適当な方法
(例えば限界希釈法)でクローン化すると、抗体は2つ
の異なった方法で産生される。その第1の方法によれば
、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生ずるモノクローナル抗体を得ることができる。
第2の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺伝子
、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射すること
ができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中
より、そのハイブリドーマ細胞の産生ずるモノクローナ
ル抗体を得ることができる。
本発明によって得られるモノクローナル抗体は、前記し
た如く、カルシウムイオン(Ca++)の非存在下では
ヒト・プロテインCに対して認識せず、且つカルシウム
イオン(Ca”)の存在下ではヒト・プロテインCに対
して特異的に認識するという性質を有しているので、こ
の性質を利用して、ヒト・プロテインCを含有している
混合物(例えばヒト血漿など)からヒト・プロテインC
を簡単に分離することができる。
そのため、先ず前記ヒト・プロテインCに対するモノク
ローナル抗体を不溶性担体に固定化又は結合させて吸着
体を得る。その際使用される不溶性担体としては、モノ
クローナル抗体を用いた測定試薬又は測定用キットの基
材として一般的使用されるものであればよい。例えば材
質としてアガロース、ポリアクリルアミド、セルロース
、デキストラン、またはマレイン酸ポリマー或いはこれ
らの混合物が好ましく用いられる。これら不活性担体の
形態としては、粉末状9粒状、ペレット状。
ビーズ状、フィルム状、lll状状ど種々の形態である
ことができる。また一般に血漿、またはその分画成分の
測定や分離に用いられる多数の凹状のくぼみを有するプ
レート(ウェル)を用いることが有利である。
前記吸着体を用い、これにヒト・プロテインC含有混合
物を、カルシウムイオン(Ca ” ” )の存在下に
接触せしめると、該吸着体に固定化したモノクローナル
抗体とヒト・プロテインCとが結合して、結果的にヒト
・プロテインCが該吸着体に結合する。かくすることに
よりヒト・プロテインCを分離、除去することが可能で
ある。
又前記の如くしてヒト・プロテインCを吸着体に結合さ
せ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、次いで吸
着体に結合したヒト・プロテインCをカルシウムイオン
(Ca ” +’)を実質的に含まない液体と接触又は
洗滌すると、ヒト・プロテインCは該吸着体から離脱し
、これを取得することによって、ヒト・プロテインCを
単離することができる。
かくして前記本発明の分離法によれば、ヒト・プロテイ
ンCを含有する混合物からのヒト・プロテインCの除去
、該混合物からのヒト・プロテインCの分離及び精製、
該混合物中のヒト・プロテインCの含有量の測定などが
極めて簡単な操作で達成される。
以下実施例を上げ本発明の詳細な説明する。以下実施例
ではプロティンCをPCと略称することがある。
実施例1゜ 精製したヒト・PC@ff[のBa1b/Cマウス(4
週齢)2匹に対して14日間隔で4回免疫した。
初回の免疫はPBSに溶解した。50μびのヒト・PC
を等量のフロイントの完全アジュバント(Comple
te F reund’s adjuvant )と混
合し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与した( 0.
5ryt/head) 、2回目、3回目は、同t; 
< 50u 9 (7) Eニド・PCを70インドの
不完全アジュバント(F reund’s incom
plete adjuvant)と混合し、同じく腹腔
内に投与した。最終免疫は30μりのヒト・PCをPB
S溶液のまま、マウス尾静脈から投与した。最終免疫の
3日後に免疫したマウスの肺臓細胞を細胞融合に用いた
免疫したマウスの肺臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
(P3U1)を約2:1〜約15=1の割合で混合し、
50%ポリエチレングリコール1540(和光)を融合
促進剤としてK ohlerとM 1lsteinの方
法に従い細胞融合を行った。融合後の細胞は、1x 1
0’ cell/rdの細胞濃度となるように10%F
C8−RPM l−1640培地に懸濁し、96wel
ls ?イクロプレート(Coster )に1ウェル
当り 100μΩずつ分注した。
融合細胞は、C○2インキュベーター(5%C02,3
7℃)中で培養し、ヒボキサンヂン、アミノプテリン;
チミジンを含む培地(HAT培地)で培地交換を行い、
HAT培地中で増殖させて、稗臓細胞と、骨髄B細胞か
ら成るハイブリドーマのスクリーニングを行った。
ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒト・PCを
コーティングしたマイクロタイタープレートを用いEL
ISA法により検出した。第2抗体には、アルカリホス
ファターゼ標識ウサギ抗マウスI(IG抗体を用い、カ
ルシウムイオン存在下非存在下におけるヒト・PCとの
結合の違いを見るため、一方の培養上清には51M C
a C12を添加したTBS (0,02M  Tri
s /HCj、  0.14M  NaCf、  pH
7,4)またもう一方にはTBSを加えた。更に第2抗
体の希釈液、および洗浄液ニGet、5111M  C
a C1z添加T B S 、  0.05%Twee
n20. 0.02%Na N3またはTBS。
0.05%T ween20. 0.02%Na N3
を使用した。
融合細胞をまいた合計541のウェルのうち523のウ
ェルにコロニーの形成が認められ。このうち抗体産生陽
性ウェルは下記表−1に示すようにカルシウムイオン存
在下で44.カルウシムイオン非存在下で32であった
これらの抗体産生陽性ウェルのうら12のウェルにって
い限界希釈法によるクローニングを2回繰り返して行な
い、13個のクローンを得た。得られたクローンは90
%FC8−10%DMSO中に懸濁させ液体窒素中に保
存した。
各クローンの産生するモノクローナル抗体はクローンを
Ba1b/Cマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からブ
o 7− インA−3epharose  4 Bカラ
ムを用いて精製した。
表 −1(細胞融合) って判定した。
各性質について得られた結果を下記表−2に示した。カ
ルシウムイオン依存性抗体はいずれも[鎖結合性であり
、ヒト・PCの活性には影響を及ぼさなかった。
表−21gGの性質 実施例2.(精製したIaGの性質) マウス腹水から精製した各クローンのIQGについてサ
ブクラス、ヒト・PC活性へのieLmあるいはHaへ
の結合性を調べた。
サブクラスは、各クラス特異性の抗マウス抗血清を用い
て、オフタロニー法により決定した。ヒト・PC活性へ
の影響は、ヒト・PCに1gGをモル比1:5で加えて
4℃で一夜インキユベーションし、トロンビン−トロン
ボモジュリンコンプレックスによりヒトPCを活性化し
、その活性は次の合成基質の分解活性を測定することに
より測定した。この合成基質としてはH−Val−Le
uA r (I  N Hu N O2・2 t−I 
C1[ここでVelはD形の光学活性のバリン、1−e
uはし形の光学活性のロイシン、AraはL形の光学活
性のアルギンを示す。Kabl Vitrum AB 
(スウェーデン)社製の3−2266を用いた]を使用
した。L鎖、H鎖への結合性は、ヒト・PCを還元条件
で電気泳動し、ニトロセルロース膜及びHRP標識Qo
at antimouse I a Gを用いたイムノ
ブロッティングを行実施例3.(カルシウムイオンの影
響)ヒト・PCと精製したIoGとの反応に及ぼすカル
シウムイオンの影響について検問した。
ヒト・PCをコーティングしたELISA法においてカ
ルシウムイオン依存性の抗体7B12及び10E12を
5  mM  Ca (Jz添加T B S −Twe
en(0,02M  Tris /I−ICL  O,
14M  Na C1゜p)l  7.40.05%T
 ween20. 0,02%Na N3 )またはT
 B S −T weCnで希釈してヒト・PCと反応
させアルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マウスIIJ
Gを用いた発色から結合量を測定すると、51BM  
CaC1zを添加したバッファーで希釈した場合には抗
体81aに依存したヒト・PCとの結合を示したが、C
aCfzを添加しないバッファーで希釈した場合には、
抗体濃度を高くしても結合は認められなかった。その結
集を下記表−3に示した。
なお、カルシウムイオン非依存性の抗体6B T。
−1及び10H11を用いて同様にカルシウムイオンの
影響について調べた結果も同表−3に併記して示した。
実施例4.(カルシウムイオン濃度の彰¥1)前記実施
例3におけるカルシウムイオン依存性の抗体7B12及
び10E 12を用い、それらの濃度を一定(1μg/
Id)とし、抗体溶液中のカルシウムイオン濃度を変化
させたところ、ヒト・PCとの結合はCaClza度が
高まるにつれて増加し、約11IMの濃度で飽和となっ
た。その結果を下記衣−4に示した。またカルシウムイ
オン非依存性の抗体6E2を用い同様にCalJzll
度の変化の影響を調べた結果を、下記衣−5に示した。
表5の結果からカルシウムイオン非存在性の抗体では、
カルシウムイオン依存性に影響なく、ヒト・PCとの結
合はほぼ一定の値を示していることがわかる。
なお、測定は、所定濃度のCaclzを含むTB3− 
Twcenで1μz/dlOG溶液を調製し、100μ
pを、ヒト・PCをコーティングしたwellに加えて
行った。インキュベーション後のwellの洗浄にも各
濃度のCaC1zを含むT B S −T weenを
用いた。
表−4 (カルシウムイオン濃度の影響) 表 実施例5゜ (1)抗体の不溶性担体への固定化ニ ブロムシアン活性化セファロース48(ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ社製)の乾燥ゲル0.59を、G
3グラスフィルター上で100dの11M  ト1cf
を用いて膨潤、洗浄し、更にカップリングバッファ’ 
 (0,5M  NaCfを含む0.1MNa HCO
a pH8,3)で洗浄した。カップリングバッファー
を吸引除去した後、直ちにゲルを抗体(6H2)のカッ
プリングバッファー溶液(3Ing/d)2−中に加え
て懸濁させ、4℃で一夜ゆるやかに振とうした。次にゲ
ルを1Mエタノールアミン−H(J (pH8,o、 
2ae)中に移し、室温で2時間振とうして残存する活
性基をブロックした。
ブロッキング後、抗体結合セファロースゲルをグラスフ
ィルター上で、0.5M  NaC1を含む0.1M酢
Rハ:tファー p)−14,0,と0,5M  Na
Clを含む0.1Mホウ酸バッファーpi−18,0を
交互に用いて洗浄した。濾液の28Onllにおける吸
光度が0.01以下になったところで、5mMCaCj
z、および1 111Mベンザミジンを含む0.05 
MTris /HCj pl−17,4で平衡化し、カ
ラムに充てんした。このようにして調製した抗ヒトPC
モノクローナル抗体(6H2)結合セファロース4Bカ
ラムを用いてアフィニティクロマトを行った。
(2プロティンCの抗体結合セファロース4Bへの吸着
、溶出; 血漿100dに1M  BaC第2溶液8−を加え4℃
で1時間攪拌した。沈澱を遠心分離して集め5IIIM
  3a C12、511Mベンザミジンを含む0.1
MNaClで洗浄した後、15ateの5 mMベンザ
ミジンを含む0.2M  E D T A  吐17.
4で沈澱物を溶解し、バリウム吸着分画を得た。このバ
リウム吸着分画を1  mMベンザミジンを含む0,0
5 MTrys /HCj  pH7,4に透析し、終
濃度5 mMとなるようにCaCl2溶液を加え、51
11MCaC1213よび1  mMベンザミジンを含
む0.05 MTris/HCオで平衡化した抗体(6
H2)結合カラムにかけた。5 111M  Ca C
12,I  111MベンザミジンおよびIM  Na
Cオを含む0.05 MTris/HCfで洗浄し、5
01uM  EDTAおよび1  mMベンザミジンを
含む0.05 M  Tris /HC1で溶出したと
ころ、PCを含むシングルビークが得られた。抗体セフ
ァ0一ス4B溶出分画中のPCはバリウム吸着分画に比
べ約52倍に精製されており、回収率は約48.2%で
あった。
特許出願人 帝 人 株 式 会 社

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1.  カルシウムイオン(Ca^+^+)の非存在下では、
    ヒト・プロテインCに対して認識せず且つカルシウムイ
    オン(Ca^+^+)の存在下ではヒト・プロテインC
    に対して特異的に認識するヒト・プロテインCに対する
    モノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた吸着体に
    、ヒト・プロテインC含有混合物を、カルウシムイオン
    (Ca^+^+)存在下に接触せしめて、該吸着体にヒ
    ト・プロテインCを結合せしめることを特徴とするヒト
    ・プロテインC含有混合物からのヒト・プロテインCの
    分離方法。
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