JPH02163085A - ヒト・プロテインｃの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明はヒト・プロテインＣに対してカルシウムイオン
（Ｃａ　”　”　）の非存在下では認識せず、カルシウ
ムイオン＜ｃａ　”　”　＞存在下で認識するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ及びヒト・プロテ
インＣの分離方法に関する。

ｂ、従来技術 プロティンＣはビタミンに依存性血漿蛋白質すなわちγ
−カルボキシグルタミン酸含有蛋白のつであり、血管内
皮細胞表層のトロンボモジュリン存在下トロンビンによ
り活性されて［Ｅ　ｓｍｏｎ。

Ｃ，Ｔ　　＆　　Ｏｗｅｎ　、　Ｗ、　Ｇ　：　Ｐｒｏ
ｃ　、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７８：　　２２４９
−２２５１（１９８１）参照］活性化プロティンＣ（Ａ
ＰＣ）となる。活性化プロティンＣはセリンプロテアー
ゼの一種であり、血液凝固系の補酵素である第Ｖ因子（
ＦＶ。

ＦＶａ）と第■囚子（Ｆ■、Ｆ１ａ）を分解し、強い抗
凝固作用［５ｕｚｕｋｉ、に、　ｅｔ、　ａｌ、　　：
　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５８：　　１９１４−１９２
０（１９８３）　、　Ｖｅｈａｒ。

Ｇ、　Ａ、　＆　　Ｄａｖｉｅ、　Ｅ、　Ｗ、　　：　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

坦：　　４０１−４０９　（１９８０）参照］を示すと
共に血管壁からプラスミノーゲン・アクチベータを放出
させ、線溶系を促進させる［ＣＯｍＤ、Ｐ、　Ｃ，＆　
　Ｅｓｍｏｎ。

Ｃ，Ｔ　　：　　Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、ｌ　ｎｖｃｓｔ、
６８：　　１２２１−１２２８＜　１９８１　）参照］
ことが知られている。

さらにプロティンＣ欠損症は重度の血栓症を呈すること
も報告されており、［ＧｒＮｆｉｎ、Ｊ、Ｈ。

ｅｔ　ａｔ　　：　、Ｊ　、　Ｃｌ１ｎ　、　　ｌ　ｎ
Ｖｅｓｔ、、　６８．　１３７０−１３７３（１９８０
）　、　Ｂｅｒｔｉｎａ、　Ｒ，Ｍ、　ｅｔ　ａｌ　　
：　Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、、４８　１〜５　（１９８２）　
］ブブチティンは血液凝固線溶系の重要ならす御因子で
あることが明らかにされている。

したがってプロティンＣの作用機構を明らかにすること
、また、プロティンＣの血中における抗原１、活性量を
測定し、その動向を把握することができれば、それは基
礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な意味を持
つと考えられる。

一方モツクローナル抗体は単一の抗原決定基にたいして
特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的
に産生できるという利点から抗原蛋白質の機能および構
造の解析、あるいは免疫測定（ＥＩＡ、ＲＩΔ）に近時
一般的に広く利用されるようになって来た。特に抗原蛋
白質の檄能解析、分子解析には抗原蛋白の機能に関与す
る部位、または特殊な構造部位を認識する抗体を見出す
ことが有力な手段となり得る。

ヒト・プロテインＣの構造は、分子量的４１０００のＨ
鎖と分子量的２１０００のし鎖がｓ−８架橋で結合され
ており、Ｈ鎖にセリンプロテアーゼ活性部位を有し、ま
た、Ｌ−鎖アミン末端には、９個のカルシウムイオン結
合性アミノ酸、すなわち、γ−カルボキシグルタミンＩ
！（Ｇｌａ）残基を含むＧｌａｌミドメイン在すること
が知られている。

Ｇｌａｌミドメインする血液凝固因子は、プロティンＣ
を含め、第■因子（プロトロンビン）、第ＶＩ因子、第
１Ｘ囚子、第Ｘ因子いずれもカルシウムイオン（Ｃａ＋
＋）存在下でＱｌａに依存した立体的構造変化を生じる
ことが知られており、この機構は、血液凝固系発現の上
で重要な役割を果していることが知られている。

従来、ヒト・プロテインＣのモノクロナール抗体は枠木
らにより作成されたことが報告されており［枠木宏治　
他：パ血液と脈管”　、　１５：　　１７１１７４　（
１９８４）参照］、この抗体はヒト・プロテインＣの抗
原υの測定、活性の測定に利用されているが、カルシウ
ムイオン（Ｃａ　”　”　’）存在下で構造変化を受け
たヒト・プロテインＣを認識するモノクロナール抗体に
ついての報告はまだなされていない。

そこで本発明者らは、プロティンＣがカルシウムイオン
＜ｃａ”＞存在下で立体的構造変化を受けることに着目
し、カルシ「クムイオン（Ｃａ″＋）の存在下で構造変
化を受けたプロティンＣを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体について研究を進めた結果本発明に到達した。

Ｃ０発明の構成 すなわち、本発明は、カルシウムイオン（Ｃａ　”　＋
）の非存在下ではヒト・プロテインＣに対して認識せず
且つカルシウムイオン（Ｃａ”）の存在下ではヒト・プ
ロテインＣに対して特異的にＨ％１するヒト・プロテイ
ンＣに対するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリド
ーマである。

さらに他の本発明は、カルシウムイオン（Ｃａ　”　”
　）の非存在下では、ヒト・プロテインＣに対してＩｎ
せず且つカルシウムイオン（Ｃａ＋“）の存在下ではヒ
ト・プロテインＣに対して特異的に認識するヒト・プロ
テインＣに対するモノクローナル抗体を不溶性担体と結
合させた吸着体に、ヒト・プロテインＣ含有混合物を、
カルシウムイオン（Ｃａ　”　”　）の存在下に接触せ
しめて、該吸着体にヒト・プロテインＣを結合せしめる
ことを特徴とするヒト・プロテインＣ含有混合物からの
ヒト・プロテインＣの分離法である。

本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
細胞はケーラーとミルシュタインの方法［Ｋａｈｌｅｒ
　＆　　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　　：　　２
５６４９５−４９７　（１９７５）　］として知られた
方法によって得られる。すなわち、ヒト・プロテインＣ
でマウスを免疫した侵、このマウスの肺臓細胞をマウス
・ミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ
細胞はマイクロタイタープレートに固定されたヒト・プ
ロテインＣと反応する抗体に対し、系統的に検査し、選
択される。この際に、カルシウムイオン（Ｃａ”）存在
下における検査と、カルシウムイオン非存在下における
検査を同時に行い前者においてのみ陽性を示すハイブリ
ドーマを選別することにより、目的とする抗体を合成し
分泌するハイブリドーマを単離することができる。

かかる新規なハイブリトーマ細胞が産生ずる産生物から
得られるモノクローナル抗体は、カルシウムイオン（Ｃ
ａ　”　”　）の存在下におけるヒト・プロテインＣ分
子上の特定の抗原決定基に対して単一特異的に作用する
。

本発明によって得られるモノクローナル抗体はその特性
からヒト・プロテインＣの精製に利用する場合非常に有
利である。すなわち、不溶性担体に本発明によってＩＪ
られるモノクローナル抗体を固定化し、カルシウムイオ
ン（Ｃａ　”　”　）が存在する溶液中で血漿（カルシ
ウムイオン存在下で凝固しないように調製したもの）ま
たは、他のヒト・プロテインＣを含む原料、あるいはそ
れらの粗抽出物、粗ｍ製物および溶液からヒト・プロテ
インＣを吸着・分離しカルシウムイオン（Ｃａ”）存在
下で洗浄後、溶液をカルシウムイオンを含まないものく
例えばＥＤＴへが存在する溶液）に冒き換えて、ヒト・
プロテインＣを溶出することができる。この方法によれ
ば、従来の不溶化・抗体による抗原蛋白質の精製のよう
に、過激な条件下（例えば、０．２Ｍグリシン塩酸ある
いは８Ｍ尿素のような）に蛋白質をさらすことなく、穏
和な条件下で精製を行うことができる。

また、ヒト・プロテインＣその他のγ−カルボキシグル
タミン酸含有蛋白質にはＱｌａを含まず、Ｇｌａに依存
する構造変化を受けない異常分子が存在することが知ら
れているが、本発明によって得られるモノクローナル抗
体を用いることにより、この異常分子の測定が可能にな
ると考えられる。

すなわち、カルシウムイオン（Ｃａ＋＋）の存在の有無
に拘らず、ヒト・プロテインＣを認識する抗０体を用い
て免疫学的手段（例えばＥＩＡ、ＲＩＡ）により血漿そ
の他の試料中のヒト・ブＯティンＣ抗原伍を測定し、更
に本発明によるモノクローナル抗体を用いて、血漿、そ
の他の試料中のヒト・プロテインＣをカルシウムイオン
存在下で免疫学的手法（ＥＩＡ、ＲＩＡ＞により測定す
れば、その測定値の差から、異常ヒト・プロテインＣの
量を把握することができる。

次に本発明によって得られるモノクローナル抗体を作成
する具体的方法について詳細に説明する。

Ａ、抗原の単離・精製： 抗原に用いるヒト・プロテインＣは枠木らの方法［３ｕ
ｚｕｋｉ、ｌ（、ｅｔ　ａｔ　、　Ｊ　、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、ユ阻：１９１４−１９２０　（１９８３）　］
によりヒト・血漿から単離・精製される。

Ｂ、ヒト・プロテインＣによるマ　スの　疫：ｌｉ［３
ａｌｂ／Ｃマウスを用いることができるが他の系（Ｓｔ
ｒａｉｎ）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計
画、及びヒト・プロテインＣの濃度は十分な量の抗原刺
戟を受けた、リンパ球が形成されるよう選ばれるべきで
ある。例えばマウスに５０μ３のヒト・プロテインＣを
２週間間隔で腹腔に３回投与の後、さらに３０μ９を静
脈に投与する。

最終免疫の数日後に融合の為に肺臓細胞をとり出す。

Ｃ１細胞融合； 上記の如く免疫したマウスの肺臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの肺臓ｍ胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。肺臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０８個の肺臓細胞について０．５〜１．５ｒｎ
ｌの融合媒体の使用が適当である。

細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良く知られてい
るが、本発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ａ（１８−Ｕ１細胞
（Ｐ３−Ｌｌｌ　）　　［Ｙｅｌｔｏｎ、Ｄ、　Ｅ　ｅ
ｔａｌ、　Ｃｕｒｒｅｎｔ、　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　　
ｌｙｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ、　　８１１（１９７８）参照］を用いた。

好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子［１０
００〜４０００のポリエチレングリコールを有利に使用
できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を使
用することもできる。本発明においては、平均分子ｌ　
１５４０のポリエチレングリコールを用いた。

Ｄ、融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の肺臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地は
未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えば
ＨΔＴ培地）が使用される。この選択培地中では、未融
合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の肺臓細胞は非
腫瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅す
る。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と、親牌細胞の性質を合わせ持つため、選択培地
中で生存できる。

Ｅ、各容器中のヒト・プロテインＣ抗体の確認；かくし
て、ハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養上清
を採取し、ヒト・プロテインＣに対する抗体について酵
素免疫定石法（Ｅ　ｎｚｙｍｅｌ　１ｎｋｅｄ　ｌ　ｍ
ｌｌ１ｕｎｏｓｏｂｃｎｔ　Ａ　５ｓａｙ）によりスク
リーニングする。この際、培養上清、酵素標識抗体溶液
および洗浄液に一定濃度の（：、ａｃ１２を加えた条件
下の測定と、ＣａＣｆｚを加えない条件下の測定の両方
を行い、前者に対してのみ陽性を示すハイブリドーマを
選択することにより、カルシウムイオン非存在下では、
ヒト・プロテインＣをＨ’ｔＡせず、カルシウムイオン
存在下で、ヒト・プロテインＣを認識する抗体を産生、
分泌するハイブリドーマを選別することができる。

目的の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれば
、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生ずるモノクローナル抗体を得ることができる。

第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺伝子
、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射すること
ができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中
より、そのハイブリドーマ細胞の産生ずるモノクローナ
ル抗体を得ることができる。

本発明によって得られるモノクローナル抗体は、前記し
た如く、カルシウムイオン（Ｃａ＋＋）の非存在下では
ヒト・プロテインＣに対して認識せず、且つカルシウム
イオン（Ｃａ”）の存在下ではヒト・プロテインＣに対
して特異的に認識するという性質を有しているので、こ
の性質を利用して、ヒト・プロテインＣを含有している
混合物（例えばヒト血漿など）からヒト・プロテインＣ
を簡単に分離することができる。

そのため、先ず前記ヒト・プロテインＣに対するモノク
ローナル抗体を不溶性担体に固定化又は結合させて吸着
体を得る。その際使用される不溶性担体としては、モノ
クローナル抗体を用いた測定試薬又は測定用キットの基
材として一般的使用されるものであればよい。例えば材
質としてアガロース、ポリアクリルアミド、セルロース
、デキストラン、またはマレイン酸ポリマー或いはこれ
らの混合物が好ましく用いられる。これら不活性担体の
形態としては、粉末状９粒状、ペレット状。

ビーズ状、フィルム状、ｌｌｌ状状ど種々の形態である
ことができる。また一般に血漿、またはその分画成分の
測定や分離に用いられる多数の凹状のくぼみを有するプ
レート（ウェル）を用いることが有利である。

前記吸着体を用い、これにヒト・プロテインＣ含有混合
物を、カルシウムイオン（Ｃａ　”　”　）の存在下に
接触せしめると、該吸着体に固定化したモノクローナル
抗体とヒト・プロテインＣとが結合して、結果的にヒト
・プロテインＣが該吸着体に結合する。かくすることに
よりヒト・プロテインＣを分離、除去することが可能で
ある。

又前記の如くしてヒト・プロテインＣを吸着体に結合さ
せ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、次いで吸
着体に結合したヒト・プロテインＣをカルシウムイオン
（Ｃａ　”　＋’）を実質的に含まない液体と接触又は
洗滌すると、ヒト・プロテインＣは該吸着体から離脱し
、これを取得することによって、ヒト・プロテインＣを
単離することができる。

かくして前記本発明の分離法によれば、ヒト・プロテイ
ンＣを含有する混合物からのヒト・プロテインＣの除去
、該混合物からのヒト・プロテインＣの分離及び精製、
該混合物中のヒト・プロテインＣの含有量の測定などが
極めて簡単な操作で達成される。

以下実施例を上げ本発明の詳細な説明する。以下実施例
ではプロティンＣをＰＣと略称することがある。

実施例１゜ 精製したヒト・ＰＣ＠ｆｆ［のＢａ１ｂ／Ｃマウス（４
週齢）２匹に対して１４日間隔で４回免疫した。

初回の免疫はＰＢＳに溶解した。５０μびのヒト・ＰＣ
を等量のフロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅ
ｔｅ　Ｆ　ｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ　）と混
合し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与した（　０．
５ｒｙｔ／ｈｅａｄ）　、２回目、３回目は、同ｔ；　
＜　５０ｕ　９　（７）　Ｅニド・ＰＣを７０インドの
不完全アジュバント（Ｆ　ｒｅｕｎｄ’ｓ　ｉｎｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合し、同じく腹腔
内に投与した。最終免疫は３０μりのヒト・ＰＣをＰＢ
Ｓ溶液のまま、マウス尾静脈から投与した。最終免疫の
３日後に免疫したマウスの肺臓細胞を細胞融合に用いた
。

免疫したマウスの肺臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（Ｐ３Ｕ１）を約２：１〜約１５＝１の割合で混合し、
５０％ポリエチレングリコール１５４０（和光）を融合
促進剤としてＫ　ｏｈｌｅｒとＭ　１ｌｓｔｅｉｎの方
法に従い細胞融合を行った。融合後の細胞は、１ｘ　１
０’　ｃｅｌｌ／ｒｄの細胞濃度となるように１０％Ｆ
Ｃ８−ＲＰＭ　ｌ−１６４０培地に懸濁し、９６ｗｅｌ
ｌｓ　？イクロプレート（Ｃｏｓｔｅｒ　）に１ウェル
当り　１００μΩずつ分注した。

融合細胞は、Ｃ○２インキュベーター（５％Ｃ０２，３
７℃）中で培養し、ヒボキサンヂン、アミノプテリン；
チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培地交換を行い、
ＨＡＴ培地中で増殖させて、稗臓細胞と、骨髄Ｂ細胞か
ら成るハイブリドーマのスクリーニングを行った。

ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒト・ＰＣを
コーティングしたマイクロタイタープレートを用いＥＬ
ＩＳＡ法により検出した。第２抗体には、アルカリホス
ファターゼ標識ウサギ抗マウスＩ（ＩＧ抗体を用い、カ
ルシウムイオン存在下非存在下におけるヒト・ＰＣとの
結合の違いを見るため、一方の培養上清には５１Ｍ　Ｃ
ａ　Ｃ１２を添加したＴＢＳ　（０，０２Ｍ　　Ｔｒｉ
ｓ　／ＨＣｊ、　　０．１４Ｍ　　ＮａＣｆ、　　ｐＨ
７，４）またもう一方にはＴＢＳを加えた。更に第２抗
体の希釈液、および洗浄液ニＧｅｔ、５１１１Ｍ　　Ｃ
ａ　Ｃ１ｚ添加Ｔ　Ｂ　Ｓ　、　　０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０．　０．０２％Ｎａ　Ｎ３またはＴＢＳ。

０．０５％Ｔ　ｗｅｅｎ２０．　０．０２％Ｎａ　Ｎ３
を使用した。

融合細胞をまいた合計５４１のウェルのうち５２３のウ
ェルにコロニーの形成が認められ。このうち抗体産生陽
性ウェルは下記表−１に示すようにカルシウムイオン存
在下で４４．カルウシムイオン非存在下で３２であった
。

これらの抗体産生陽性ウェルのうら１２のウェルにって
い限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行な
い、１３個のクローンを得た。得られたクローンは９０
％ＦＣ８−１０％ＤＭＳＯ中に懸濁させ液体窒素中に保
存した。

各クローンの産生するモノクローナル抗体はクローンを
Ｂａ１ｂ／Ｃマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からブ
ｏ　７−　インＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　　４　Ｂカラ
ムを用いて精製した。

表　−１（細胞融合） って判定した。

各性質について得られた結果を下記表−２に示した。カ
ルシウムイオン依存性抗体はいずれも［鎖結合性であり
、ヒト・ＰＣの活性には影響を及ぼさなかった。

表−２１ｇＧの性質 実施例２．（精製したＩａＧの性質） マウス腹水から精製した各クローンのＩＱＧについてサ
ブクラス、ヒト・ＰＣ活性へのｉｅＬｍあるいはＨａへ
の結合性を調べた。

サブクラスは、各クラス特異性の抗マウス抗血清を用い
て、オフタロニー法により決定した。ヒト・ＰＣ活性へ
の影響は、ヒト・ＰＣに１ｇＧをモル比１：５で加えて
４℃で一夜インキユベーションし、トロンビン−トロン
ボモジュリンコンプレックスによりヒトＰＣを活性化し
、その活性は次の合成基質の分解活性を測定することに
より測定した。この合成基質としてはＨ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕＡ　ｒ　（Ｉ　　Ｎ　Ｈｕ　Ｎ　Ｏ２・２　ｔ−Ｉ　
Ｃ１［ここでＶｅｌはＤ形の光学活性のバリン、１−ｅ
ｕはし形の光学活性のロイシン、ＡｒａはＬ形の光学活
性のアルギンを示す。Ｋａｂｌ　Ｖｉｔｒｕｍ　ＡＢ　
（スウェーデン）社製の３−２２６６を用いた］を使用
した。Ｌ鎖、Ｈ鎖への結合性は、ヒト・ＰＣを還元条件
で電気泳動し、ニトロセルロース膜及びＨＲＰ標識Ｑｏ
ａｔ　ａｎｔｉｍｏｕｓｅ　Ｉ　ａ　Ｇを用いたイムノ
ブロッティングを行実施例３．（カルシウムイオンの影
響）ヒト・ＰＣと精製したＩｏＧとの反応に及ぼすカル
シウムイオンの影響について検問した。

ヒト・ＰＣをコーティングしたＥＬＩＳＡ法においてカ
ルシウムイオン依存性の抗体７Ｂ１２及び１０Ｅ１２を
５　　ｍＭ　　Ｃａ　（Ｊｚ添加Ｔ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅ
ｅｎ（０，０２Ｍ　　Ｔｒｉｓ　／Ｉ−ＩＣＬ　　Ｏ，
１４Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１゜ｐ）ｌ　　７．４０．０５％Ｔ
　ｗｅｅｎ２０．　０，０２％Ｎａ　Ｎ３　）またはＴ
　Ｂ　Ｓ　−Ｔ　ｗｅＣｎで希釈してヒト・ＰＣと反応
させアルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マウスＩＩＪ
Ｇを用いた発色から結合量を測定すると、５１ＢＭ　　
ＣａＣ１ｚを添加したバッファーで希釈した場合には抗
体８１ａに依存したヒト・ＰＣとの結合を示したが、Ｃ
ａＣｆｚを添加しないバッファーで希釈した場合には、
抗体濃度を高くしても結合は認められなかった。その結
集を下記表−３に示した。

なお、カルシウムイオン非依存性の抗体６Ｂ　Ｔ。

−１及び１０Ｈ１１を用いて同様にカルシウムイオンの
影響について調べた結果も同表−３に併記して示した。

実施例４．（カルシウムイオン濃度の彰￥１）前記実施
例３におけるカルシウムイオン依存性の抗体７Ｂ１２及
び１０Ｅ　１２を用い、それらの濃度を一定（１μｇ／
Ｉｄ）とし、抗体溶液中のカルシウムイオン濃度を変化
させたところ、ヒト・ＰＣとの結合はＣａＣｌｚａ度が
高まるにつれて増加し、約１１ＩＭの濃度で飽和となっ
た。その結果を下記衣−４に示した。またカルシウムイ
オン非依存性の抗体６Ｅ２を用い同様にＣａｌＪｚｌｌ
度の変化の影響を調べた結果を、下記衣−５に示した。

表５の結果からカルシウムイオン非存在性の抗体では、
カルシウムイオン依存性に影響なく、ヒト・ＰＣとの結
合はほぼ一定の値を示していることがわかる。

なお、測定は、所定濃度のＣａｃｌｚを含むＴＢ３−　
Ｔｗｃｅｎで１μｚ／ｄｌＯＧ溶液を調製し、１００μ
ｐを、ヒト・ＰＣをコーティングしたｗｅｌｌに加えて
行った。インキュベーション後のｗｅｌｌの洗浄にも各
濃度のＣａＣ１ｚを含むＴ　Ｂ　Ｓ　−Ｔ　ｗｅｅｎを
用いた。

表−４ （カルシウムイオン濃度の影響） 表 実施例５゜ （１）抗体の不溶性担体への固定化ニ ブロムシアン活性化セファロース４８（ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ社製）の乾燥ゲル０．５９を、Ｇ
３グラスフィルター上で１００ｄの１１Ｍ　　ト１ｃｆ
を用いて膨潤、洗浄し、更にカップリングバッファ’　
　（０，５Ｍ　　ＮａＣｆを含む０．１ＭＮａ　ＨＣＯ
ａ　ｐＨ８，３）で洗浄した。カップリングバッファー
を吸引除去した後、直ちにゲルを抗体（６Ｈ２）のカッ
プリングバッファー溶液（３Ｉｎｇ／ｄ）２−中に加え
て懸濁させ、４℃で一夜ゆるやかに振とうした。次にゲ
ルを１Ｍエタノールアミン−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ８，ｏ、　
２ａｅ）中に移し、室温で２時間振とうして残存する活
性基をブロックした。

ブロッキング後、抗体結合セファロースゲルをグラスフ
ィルター上で、０．５Ｍ　　ＮａＣ１を含む０．１Ｍ酢
Ｒハ：ｔファー　ｐ）−１４，０，と０，５Ｍ　　Ｎａ
Ｃｌを含む０．１Ｍホウ酸バッファーｐｉ−１８，０を
交互に用いて洗浄した。濾液の２８Ｏｎｌｌにおける吸
光度が０．０１以下になったところで、５ｍＭＣａＣｊ
ｚ、および１　１１１Ｍベンザミジンを含む０．０５　
ＭＴｒｉｓ　／ＨＣｊ　ｐｌ−１７，４で平衡化し、カ
ラムに充てんした。このようにして調製した抗ヒトＰＣ
モノクローナル抗体（６Ｈ２）結合セファロース４Ｂカ
ラムを用いてアフィニティクロマトを行った。

（２プロティンＣの抗体結合セファロース４Ｂへの吸着
、溶出； 血漿１００ｄに１Ｍ　　ＢａＣ第２溶液８−を加え４℃
で１時間攪拌した。沈澱を遠心分離して集め５ＩＩＩＭ
　　３ａ　Ｃ１２、５１１Ｍベンザミジンを含む０．１
ＭＮａＣｌで洗浄した後、１５ａｔｅの５　ｍＭベンザ
ミジンを含む０．２Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　吐１７．
４で沈澱物を溶解し、バリウム吸着分画を得た。このバ
リウム吸着分画を１　　ｍＭベンザミジンを含む０，０
５　ＭＴｒｙｓ　／ＨＣｊ　　ｐＨ７，４に透析し、終
濃度５　ｍＭとなるようにＣａＣｌ２溶液を加え、５１
１１ＭＣａＣ１２１３よび１　　ｍＭベンザミジンを含
む０．０５　ＭＴｒｉｓ／ＨＣオで平衡化した抗体（６
Ｈ２）結合カラムにかけた。５　１１１Ｍ　　Ｃａ　Ｃ
１２，Ｉ　　１１１ＭベンザミジンおよびＩＭ　　Ｎａ
Ｃオを含む０．０５　ＭＴｒｉｓ／ＨＣｆで洗浄し、５
０１ｕＭ　　ＥＤＴＡおよび１　　ｍＭベンザミジンを
含む０．０５　Ｍ　　Ｔｒｉｓ　／ＨＣ１で溶出したと
ころ、ＰＣを含むシングルビークが得られた。抗体セフ
ァ０一ス４Ｂ溶出分画中のＰＣはバリウム吸着分画に比
べ約５２倍に精製されており、回収率は約４８．２％で
あった。

特許出願人　帝　人　株　式　会　社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　カルシウムイオン（Ｃａ＾＋＾＋）の非存在下では、
   ヒト・プロテインＣに対して認識せず且つカルシウムイ
   オン（Ｃａ＾＋＾＋）の存在下ではヒト・プロテインＣ
   に対して特異的に認識するヒト・プロテインＣに対する
   モノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた吸着体に
   、ヒト・プロテインＣ含有混合物を、カルウシムイオン
   （Ｃａ＾＋＾＋）存在下に接触せしめて、該吸着体にヒ
   ト・プロテインＣを結合せしめることを特徴とするヒト
   ・プロテインＣ含有混合物からのヒト・プロテインＣの
   分離方法。