JP2750732B2 - ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター複合体の免疫学的測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用分野 本発明は、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターイ
ンヒビター・１とヒトプラスミノーゲンアクティベータ
ーインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクテ
ィベーター複合体の免疫学的測定試薬系、測定キット、
測定方法、それらのために用いられるモノクローナル抗
体及びその抗体の利用に関する。

本発明の明細書において下記用語或いは略号は、それ
ぞれ下記の意味を有する。

PAI・1; プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１ tPA; 組織プラスミノーゲンアクティベーター PAI・１−tPA複合体； ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・
１とヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターとの複
合体 尚、tPA・PAI・1complexと表わすことがある。

MCA; モノクローナル抗体 PAI・１−MCA; ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・
１に対するモノクローナル抗体 tPA−MCA; ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターに対するモ
ノクローナル抗体 b.従来技術 tPAは線溶系におけるプラスミノーゲンを活性化する
酵素であって、tPAを血栓溶解剤として使用すること及
びそのtPAの生物工学的に製造することが開発されつつ
ある。

一方ヒトtPAの活性を抑制する因子としてヒトプラス
ミノーゲンアクティベーターインヒビター（ヒトPAI・
１）、Urokinase inhibitor（PAI・２）及びUrokinase
inhibitor like（PAI・３）の３種の存在が知られてい
る。

このPAI・１は、セリンプロテアーゼインヒビターの
一種であり、ヒトtPAと速やかに反応して複合体を形成
し、tPAの線溶活性を抑制することがしられている［Lev
in,E.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,80,6804−6808（198
6）,Philips M.et al.Biochem.Biophys.Acta.,802,99−
110（1984）参照］。また、PAI・１−tPA複合体はヒト
血漿中にも存在することが知られている［Booth,N.A.et
al.Thromb.Res.,38,261−267（1985）参照］。さら
に、血中PAI活性値と血栓症との相関が示唆されており
［Nilsson,et al Brit.Med.J.,290,1453−1456（198
5）,Paramo,J.A.et al Thromb.Haemost.,54,713−716
（1985）参照］。かくしてヒトPAI・１は血液線溶系に
おいてプラスミノーゲンからプラスミンの形成における
初期の段階での重要な制御因子であることが明らかにな
されている。

また血中のPAI・１−tPA複合体と血栓症との関係につ
いても知られている［Amiral J.et al Thromb.Res.Supp
lement VII 99−113（1988）参照］。

従ってヒトtPA、ヒトPAI・１及びPAI・１−tPA複合体
は、いずれも血栓の形成と溶解の場合に現われる重要な
指標であり、血中におけるこれらの濃度を正確に測定す
ることができれば、血栓の形成及び溶解の抑制の状態を
的確に知ることが可能となるであろうと考えられる。

c.発明の目的 そこで本発明の目的は、ヒト検体中のPAI・１−tPA複
合体を測定するための免疫学的測定方法を提供すること
にある。

本発明の他の目的は、ヒト検体中のPAI・１−tPA複合
体の含有量を正確に測定することが可能な免疫学的測定
方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、ヒト検体中のPAI・１−tPA
複合体を正確に且つ簡便に測定することが可能であり、
しかも安定した測定精度を有する免疫学的測定方法を提
供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記PAI・１−tPA複合体の
測定に使用されるヒトPAI・１に対するモノクローナル
抗体及びそれを産生するハイブリドーマを提供すること
にある。

本発明の更に他の目的は、前記PAI・１−tPA複合体の
測定に使用されるヒトtPAに対するモノクローナル抗体
及びそれを産生するハイブリドーマを提供することにあ
る。

本発明の更に他の目的は、ヒト検体中のPAI・１−tPA
複合体の含有量を測定し、それによって血栓症の判定方
法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、ヒトPAI・１に対するモノ
クローナル抗体を使用した血栓溶解促進剤を提供するこ
とにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から更に明らか
となるであろう。

d.発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的及び利
点は、ヒト検体中のPAI・１−tPA複合体を、不溶性固体
担体に結合した第１抗体及び標識化された第２抗体を使
用して免疫学的に測定する方法であって、一方の抗体が
ヒトPAI・１に対するモノクローナル抗体JTI−３または
JTI−４或いはこれらと同等の断片であり、他方の抗体
がヒトtPAに対するモノクローナル抗体JTA−１またはそ
れと同等の断片であることを特徴とする免疫学的測定方
法によって達成されることがわかった。

従来、ヒトPAI・１に対するモノクローナル抗体は、
ヒト血漿由来PAIを抗原としたもの［Urden,G.et al.Thr
omb.Haemost.,55,383−387（1986）］、ヒト胎盤由来PA
Iを抗原としたもの［Philips M.et al.Thromb.haemos
t.,55,213−217（1986）参照］、ヒトFibrosarcoma cel
l line由来PAIを抗原としたもの［Nielsen,L.S.et al.T
hromb.Haemost.,55,206−212（1986）参照］が報告され
ている。

そこで本発明者は、ヒト血管壁内皮細胞由来PAIを抗
原としたモノクローナル抗体を多数作製した。一方ヒト
tPAに対するモノクローナル抗体を多数作製した。

本発明者らは、PAI・１−tPA複合体を測定するための
手段の選択、各種モノクローナル抗体の選別、及びモノ
クローナル抗体の組合せについて、数多くの研究を行っ
た。その結果、数多く得られるヒトPAI・１−MCA及びヒ
トtPA−MCAが必ずしもすべて本発明の目的とするPAI・
１−tPA複合体の免疫学的測定に利用できるものでない
ことがわかった。すなわち、PAI・１−tPA複合体の測定
に利用しうることができ、しかもその測定精度が高く安
定性が高い測定系を組むためにはヒトPAI・１−MCA及び
ヒトtPA−MCAのそれぞれのMCAが有するエピトープ及び
結合力、ヒトPAI・１−MCAとヒトtPA−MCAとの組合せに
よる両MCAのAffinity、不溶性固体担体に結合される第
１抗体または標識化された第２抗体として上記２種のMC
Aの適合性などを調べ、それら条件が充分に満足したも
のである必要がある。

かくして本発明者らの研究によれば、ヒト検体中に微
量含有するPAI・１−tPA複合体を高い感度でしかも安定
に測定し得るモノクローナル抗体として、PAI・１に対
するモノクローナル抗体JTI−３またはJTI−４と、tPA
に対するモノクローナル抗体JTA−１との組合せが見出
された。

従って本発明のPAI・１−tPA複合体の免疫学的測定に
おいては、下記２つの態様がある。

（ｉ）不溶性固体担体に結合させる第１抗体がPAI・１
に対するモノクローナル抗体JTI−３またはJTI−４であ
り、標識化された第２抗体がtPAに対するモノクローナ
ル抗体JTA−１である態様、 （ii）不溶性固体担体に結合させる第１抗体がtPAに対
するモノクローナル抗体JTA−１であり、標識化された
第２抗体がPAI・１に対するモノクローナル抗体JTI−３
またはJTI−４である態様、 本発明においては、前記態様のうち前者の（ｉ）の態
様がより感度及び安定性の点から優れており、またPAI
・１に対するモノクローナル抗体としてJTI−４を選択
するのが一層好ましい結果を与える。かくして本発明に
おいて最も好ましい態様は、不溶性固体担体に結合させ
る第１抗体がPAI・１に対するモノクローナル抗体であ
り、標識された第２抗体がtPAに対するモノクローナル
抗体である組合せである。

本発明によれば、PAI・１−tPA複合体の免疫学的測定
に測定されるPAI・１に対するモノクローナル抗体JTI−
３及びJTI−４とtPAに対するモノクローナル抗体とこれ
らを産生するハイブリドーマが提供される。以下これら
モノクローナル抗体について説明する。

PAI・１−MCA・JTI−3; このPAI・１に対するモノクローナル抗体JTI−３は、
それを産生するハイブリドーマが、ブダペスト条約に基
づく国際寄託機関である微工研（Fermentation Researc
h Institute）に1988年11月22日にFERM p−10405として
寄託され、その後1989年３月２日に国際寄託に変更され
た（国際寄託;No.BP−2317）。

このPAI・１−MCA・JTI−３は、サブクラスがIgG₁で
ありPAI・１にtPAが結合した場合（すなわち、PAI・１
−tPA複合体に対して）でもPAI・１に対して結合を阻害
されないが、PAI・１に対して結合した場合、tPAは結合
を阻害されるような抗原決定部位を認識する特性を有し
ている。

PAI・１−MCA−JTI−4; このPAI・１に対するモノクローナル抗体JTI−４は、
それを産生するハイブリドーマが、上記微工研に1988年
11月22日にFERM p−10406として寄託され、その後1989
年３月２日に国際寄託に変更された（国際寄託;No.BP−
2318）。

このPAI・１−MCA−JTI−４は、サブクラスがIgG₁で
あり、PAI・１にtPAが結合してもPAI・１に対する結合
を阻害されない。

tPA−MCA−JTA−1; このtPAに対するモノクローナル抗体JTA−１は、それ
を産生するハイブリドーマが、上記微工研に1988年11月
22日FERM p−10399として寄託され、その後、1989年３
月２日に国際寄託に変更された（国際寄託No.BP−231
6）。

このtPA−MCA−JTA−１は、tPA・１が結合した場合
（すなわち、PAI・１−tPA複合体に対して）でもtPAに
対して結合を阻害されない。

本発明のPAI・１−tPA複合体の免疫学的測定において
は、前述したMCAを組合せて使用されるが、MCAは、それ
自体のみならず、それと同等のMCA断片（fragment）で
も同様に使用し得る。ここで“同等のMCA断片”とは、
当該MCAに由来するFab、Fab′、または（Fab′）₂を意
味する。本発明において、tPA−MCAまたはPAI・１−MCA
をFab′フラグメントとして使用する場合、それ自体知
られた方法でFab′フラグメントを調製することができ
る。すなわち、tPA−MCAまたはPAI・１−MCAをペプシン
で分解することによってＦ（ab′）₂フラグメントを
得、次いでこれを還元処理することによってFab′フラ
グメントを得ることができる。このFab′フラグメント
の調製法は下記文献を参照することができる。

（ｉ）A.Nisonoff et al.,Arch Biochem.Biophys,89,23
0（1960）． （ii）P.Parham.J.Immunolo,131,2893（1983）． 本発明において、PAI・１−tPA複合体の免疫学的測定
の対象となるヒト検体としては、一般にヒト由来の臨床
サンプル、例えば、血清或いは血漿形態の血液、関節
液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、細胞組織液、骨髄
液または尿の如きPAI・１−tPA複合体が含有されている
かまたは含有が予測される体液を挙げることができる。
前述したようにPAI・１−tPA複合体は、血栓の形成或い
は溶解に密接に関係しているので、血清或いは血漿形態
の血液を検体として使用するのが有利である。殊に血栓
症の診断或いは治癒の判定のためには血清または血漿、
特に血漿を使用するのが適している。

以下本発明におけるPAI・１−tPA複合体の免疫学的測
定方法及びそのキットについて、更に詳細に説明する。

（Ａ−１）PAI・１−tPA複合体の測定方法； 前述した通り、本発明によればヒト検体中のPAI・１
−tPA複合体を、不溶性固体担体に結合した第１抗体及
び標識された第２抗体を使用して免疫学的に測定する方
法であって、一方の抗体がPAI・１−MCA JTI−３または
JTI−４或いはこれらと同等の断片であり、他方の抗体
がtPA−MCA JTA−１またはそれと同等の断片であること
を特徴とする免疫学的測定方法が提供される。

かかる測定方法において、不溶性固体担体に結合させ
る第１抗体がPAI・１−MCA JTI−３またはJTI−４或い
はこれらと同等の断片であり、標識化された第２抗体が
tPA−MCA JTA−１またはそれと同等の断片である組合せ
が好ましく、殊にPAI・１−MCAとしてはJTI−４を使用
するのが好ましい。最も好ましい態様は、第１抗体がPA
I・１−MCA JTI−４（whole）であり、第２抗体がtPA−
MCA JTA−１のFab′フラグメントを用いる組合せであ
る。

前記測定方法における不溶性固体担体としては、一般
に免疫学的測定試薬のために使用されているものが使用
される。かかる固体担体を形成する材質としては、天然
からの重合体またはその誘導体と合成重合体またはその
誘導体のいずれでもよく、また有機または無機のいずれ
であってもよい。前記固体担体としては具体的にはプラ
スチック容器、プラスチックビーズ、プラスチックステ
ック、ラテックスビーズ、ガラスビーズまたは金属粒子
であることができる。

前記固体担体を形成する重合体について説明すると、
例えばセルロース、セファデックスセルロース、カルボ
キシメチルセルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロ
ース、デキストランの如き天然の多糖類またはその誘導
体；ガラスまたはシリカゲルの如き無機重合体；ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ABS、ポリフ
ッ化ビニル、ポリアミン、メチルビニルエーテル−マレ
イン酸共重合体またはエチレン−マレイン酸共重合体の
如きビニル系重合体;6−ナイロン、6,6−ナイロンのよ
うなポリアミド、ポリエチレンテレフタレートのような
ポリエステルまたはアミノ酸重合体の如き縮合系重合体
を例示することができる。

不溶性固体担体の形状としては、具体的には試薬管、
マイクロタイタープレート、ビーズ、ステック（スプー
ン状、円筒状）または膜状物（Membrance）であること
ができる。

前述した不溶性固体担体に、第１抗体を結合させるに
は、それ自体知られた方法で行うことができる。例えば
物理的吸着法例えば不溶性固体担体を該第１抗体の溶液
に浸漬する方法；イオン結合法例えばイオン交換樹脂或
いはアミノ基、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基
などのイオン化する官能基をもった固体担体を用いる方
法；あるいは化学反応による共有結合法例えばカルボキ
シ・クロライド法、カルボジイミド法、無水マレイン酸
誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化
多糖法、ジアゾ法、活性エステル法、架橋試薬による担
体結合法（架橋試薬としてグルタールアルデヒド、ヘキ
サメチレンイソシアナート、コハク酸イミド・マレイミ
ド化合物など）が使用される。さらには、tPAまたはPAI
・１に対しては結合能はないが第１抗体に対して生物学
的反応により結合し得る物質を介して結合する方法例え
ばプロティンＡ結合固体担体を用いる方法などがある。

一方、本発明において、第２抗体に結合させる標識物
質としては、通常免疫学的測定に使用される酵素、蛍光
物質、発光物質または放射性物質が同様に用いられる。
これらの具体例を示すと、酵素として例えばリゾチウム
マレート・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォス
フェート・デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、グル
コース・オキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ル
シフェラーゼ、ベーターガラクトシダーゼ等；蛍光物質
として例えばフルオレセイン、ローダミン、ウンブベリ
フェロン、ランタニド・キレート等；発光物質として例
えばルミノール、アクリニジウム・エステル、ルシフェ
リン等；また放射性物質として例えばヨウ素−125、ヨ
ウ素−131、トリチウム、炭素−13などを例示すること
ができる。これらのなかでも標識物質としては、酵素が
好ましい。

これら標識物質と、第２抗体またはその断片とを結合
させる方法は、例えばグルタルアルデヒド法、過ヨーソ
酸法またはマレイミド法などの通常の方法に従って行う
ことができるが、マレイミド法がより好ましく使用され
る。

酵素のマレイミド化は公知の方法により行なうことが
できる（例えば、石川栄治編「酵素免疫測定法」、第80
〜83頁、1989年第３版、医学書院参照）。すなわち例え
ばサクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン カーボネート（SMCC）、スルホサクシン
イミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン カーボネート（スルホSMCC）、サクシンイミジル−
メタ マレイミドベンゾエート（MBS）、サクシンイミ
ジル ６−マレイミドヘキサノエート（EMCS）などによ
り行うことができる。

第２抗体またはそのフラグメントとマレイミドか標識
物質との反応は一般に前記記載の方法、例えば反応温度
４〜30℃、第２抗体またはそのフラグメントとマレイミ
ドか標識物質のモル比は1:1、反応時間20時間の条件に
従うことができる。この場合には主として、抗体または
そのフラグメントの硫黄原子を介して標識物質が抗体ま
たはそのフラグメント１分子当り１分子標識されたもの
を得ることができる。

前記した方法に従ってPAI・１−tPA複合体を高感度で
測定することができる標識化されたFab′フラグメント
を得ることができる。

（Ａ−２）PAI・１−tPA複合体測定のためのキット； 更に本発明によれば、 （ｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体、 （ii）標識化された第２抗体、 （iii）溶解剤、 （iv）洗浄剤及び （ｖ）酵素で標識化された抗体を使用する場合には、 酵素活性を測定するための基質及び反応停止剤を組合
せてなるヒト検体中のPAI・１−tPA複合体を測定するた
めのキットであって、前記一方の抗体がPAI・１に対す
るモノクローナル抗体JTI−３またはJTI−４あるいはこ
れらと同等の断片であり、他方の抗体がtPAに対するモ
ノクローナル抗体JTA−１またはそれと同等の断片であ
ることを特徴とする免疫学的測定キットが提供される。

かかる本発明のキットにおいて、（ｉ）不溶性固体担
体に結合した第１抗体及び（ii）標識化された第２抗体
としては、前記（Ａ−１）PAI・１−tPA複合体測定のた
めの試薬系の項において、説明したものと同じものが使
用され、且つ好ましいものとして示したものが同様に好
ましい。従ってここでは、これらの説明は省略する。

前記本発明の測定キットを構成する（iii）溶解剤と
しては、免疫学的測定において通常使用されるものであ
ればよい。該溶解剤として免疫反応に悪影響を与えない
ものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸
緩衝液、酢酸緩衝液などのpHが6.0〜8.0の範囲のものが
主として使用される。

また（iv）の洗浄剤としては、同様に免疫学的測定に
おいて通常使用されるものが使用される。その例を示す
と、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢
酸緩衝液などやこれらに界面活性剤、例えばトリトンＸ
−100、ツィーン20、Brig35などの非イオン性界面活性
剤やドデシル硫酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤
を上記緩衝液に溶解したものが用いられる。

さらに前記測定キットにおいて、第２抗体における標
識物質として酵素を使用する場合には、（ｖ）酵素活性
を測定するための基質及び反応停止剤が組合される。か
かる基質及び反応停止剤は、標識物質としての酵素の種
類に対応して、免疫学的測定において通常知られている
ものを使用することができる。その例としては、ペルオ
キシダーゼの基質として2,2′−アジノ−ジ−［３エチ
ルベンツチアゾリンスルフォン酸］ジアンモニウム塩
（ABTS）、オルトフェニレンジアミン（OPD）、3,3′,
5,5′−テトラメチルベンヂジン（TMB）等があり、停止
剤としてはH₂SO₄、HCl、酢酸、グリシン緩衝液（PH10.
3）等がある。

アルカリフォスファターゼの基質としては４−ニトロ
フェニルフォスフェート、４−メチルウンベリフェリル
フォスフェート、NADP等がある。停止剤としては1NNaOH
などがある。

β−ガラストシダーゼの基質としては２−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−ガラクトシド等がある。停止剤として
は、0.1M Na₂CO₃などがある。

（Ａ−３）ヒト検体中のPAI・１−tPA複合体の免疫学的
測定方法； 本発明によれば、前記（Ａ−１）で説明したPAI・１
−MCAであるJTI−３またはJTI−４あるいはこれらと同
等の断片、及びtPA−MCAまたはこれと同等の断片を第１
抗体及び第２抗体のいずれかとして使用することによ
り、 （ｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体にヒト検体を
接触させ、洗浄後、次いで標識化された第２抗体を接触
させるか、或いは （ii）不溶性固体担体に結合した第１抗体、標識化され
た第２抗体及びヒト検体を同一系に存在せしめる ことによりヒト検体中のPAI・１−tPA複合体を免疫学的
に測定する方法が提供される。

この測定方法は、前記した本発明において選択された
抗体或いはその断片を使用することを除けば、基本的に
は通称サンドウィッチ法として知られた手法である。従
って前記（Ａ−１）の測定試薬及び（Ａ−２）の測定の
ためのキットにおいて説明した不溶性固体担体に結合し
た第１抗体、標識化した第２抗体、溶解剤及び洗浄剤な
どを使用し、通常知られた手法に従ってヒト検体中のPA
I・１−tPA複合体を測定することができる。

すなわち、前記（ｉ）の手法の如く、測定しようとす
る検体と、不溶性固体担体に結合した第１抗体とを反応
させて洗浄後、標識化された第２抗体を反応させ、洗浄
後発色反応させる２段法と、前記（ii）の手法の如く、
測定しようとする検体、不溶性固体担体に結合した第１
抗体及び標識化された第２抗体を一緒に反応溶液中に共
存させて一定時間インキュベーションした後洗浄し、発
色反応させるまたはまず検体と不溶性担体に結合した第
１抗体を反応させてから標識化された第２抗体を反応さ
せる。またはまず検体と標識化された第２抗体を反応さ
せてから第１抗体に反応させる１段法とがある。

本発明は、上記１段法または２段法のいずれでもヒト
検体中のPAI・１−tPA複合体を感度よく測定することが
可能であるが、ヒト検体中にtPAが比較的多量存在する
か或いは多量存在することが予想される場合は、概して
前記２段法を採用するのが好ましい。

測定は１段法及び２段法いずれも一般に50℃以下、好
ましくは約４〜45℃の範囲の温度条件下、約５分〜20時
間、好ましくは約10分〜約３時間反応させることによっ
て行われる。

（Ｂ−１）PAI・１及びPAI・１−tPA複合体の測定方
法； 本発明者らの研究によれば、本発明によって開発され
たPAI・１に対するモノクローナル抗体JTI−３及びJTI
−４を組合せて使用することによって、ヒト検体中の遊
離のPAI・１及びPAI・１−tPA複合体の合計量を簡単に
測定する測定方法及びそのキットが見出された。この測
定によればヒト検体中に含まれる遊離のPAI・１及び上
記複合体の合計量を検出できるのでtotal PAI・１を測
定することが可能であり、また前記（Ａ−３）の測定方
法と組合せれば遊離のPAI・１を測定することも可能と
なる。

すなわち本発明によれば、ヒト検体中のPAI・１及びP
AI・１−tPA複合体を不溶性固体担体に結合した第１抗
体及び標識化された第２抗体を使用して免疫学的に測定
する方法であって、一方の抗体がPAI・１に対するモノ
クローナル抗体JTI−３またはそれと同等の断片であ
り、他方の抗体がPAI・１に対するモノクローナル抗体J
TI−４またはそれと同等の断片であることを特徴とする
免疫学的測定方法が提供される。

この方法において、モノクローナル抗体JTI−３及びJ
TI−４は、どちらが第１抗体であってもよいが、第１抗
体がモノクローナル抗体JTI−４またはそれと同等の断
片であり、第２抗体（標識化抗体）がモノクローナル抗
体JTI−３またはその断片である組合せが測定感度が高
く好ましい。

この（Ｂ−１）の方法において、不溶性固体担体、第
１抗体をそれに結合させる方法、標識物質及び第２抗体
の標識化方法は、前記（Ａ−１）の項において説明した
試材と方法がそのまま適用でき、また（Ａ−１）で説明
した好ましい試材と方法が好ましい態様として適用され
る。

（Ｂ−２）PAI・１及びPAI・１−tPA複合体測定のため
のキット； さらに本発明によれば、前記（Ｂ−１）で説明した不
溶性固体担体に結合した第１抗体及び標識化された第２
抗体を使用することによって、 （ｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体、 （ii）標識化された第２抗体、 （iii）溶解剤、 （iv）洗浄剤及び （ｖ）酵素で標識化された抗体を使用する場合には、 酵素活性を測定するための基質及び反応停止剤を組合
せてなるヒト検体中のPAI・及びPAI・１−tPA複合体の
合計量を測定するキットが提供される。

上記測定キットにおいて、（iii）溶解剤、（iv）洗
浄剤、及び（ｖ）酵素活性を測定するための基質及び反
応停止剤は、それぞれ前記（Ａ−２）の測定キットにお
いて説明したものと同じものをそのまま使用することが
できる。

（Ｂ−３）ヒト検体中のPAI・１及びPAI・１−tPA複合
体の免疫学的測定方法； 本発明によれば、前記（Ｂ−１）の項において説明し
た不溶性固体担体に結合した第１抗体及び標識化された
第２抗体を組合せて使用し、 （ｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体にヒト検体を
接触させ、洗浄後、次いで標識化された第２抗体を接触
させるか、或いは、 （ii）不溶性固体担体に結合した第１抗体、標識化され
た第２抗体及びヒト検体を同一系に存在せしめる、 ことにより、ヒト検体中のPAI・１及びPAI・１−tPA複
合体の合計量を免疫学的に測定する方法が提供される。

この（Ｂ−３）の測定方法は、前記（Ｂ−１）で説明
した第１抗体及び第２抗体の組合せを使用することを除
けば、前記（Ａ−３）説明した手法及び試材が同様に適
用される。

前記した（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）の測定方法及びその
キットを用いることによってヒト検体中のPAI・１及びP
AI・１−tPA複合体の合計量を高い感度及び精度で測定
することができる。測定されたこの合計量は、ヒト検体
中の遊離の全PAI・１及び複合体中のPAI・１を測定して
いることになるので、ある意味では、ヒト形態中の全PA
I・１を測定していることを意味する。

従ってこの（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）によって測定され
た値から、前記（Ａ−１）〜（Ａ−３）によって測定さ
れたPAI・１−tPA複合体の含有量の値を引くと、その値
はヒト検体中の遊離のPAI・１の含有量を意味すること
になる。

（Ｃ）免疫吸着体； 本発明による不溶性固体担体にPAI・１に対するモノ
クローナル抗体JTI−３またはJTI−４或いは、これらと
同等の断片を結合させた免疫吸着体に新規であり、前記
（Ａ−１）または（Ｂ−１）の測定方法における要素と
して使用されるばかりでなく、後述するように、（ａ）
PAI・１及びPAI・１−tPA複合体を含む混合物、（ｂ）t
PA及びPAI・１−tPA複合体を含む混合物または（ｃ）PA
I・１、tPA及びPAI・１−tPA複合体を含む混合物から、
各成分を分離回収するための免疫吸着体として利用でき
る。以下、上記免疫吸着体を使用する各成分の分離回収
方法について説明する。

上記（ａ）〜（ｃ）の各混合物は、前記したヒト検
体、殊に血清または血漿の如き血液であってもよく、ま
たヒト血管壁内皮細胞の如きヒトPAI・１産生細胞の培
養生成物（例えば、培養上清）にヒトtPAを添加するこ
とによって得られた混合物であってもよい。かかる混合
物としては、少なくともPAI・1,tPA及び／またはPAI・
１−tPA複合体が含まれている限り、その含有量に関係
なく、使用される。

分離・回収方法−I; この方法−Ｉは、PAI・１及びPAI・１−tPA複合体を
含む原料混合物を、 （１）前記免疫吸着体と接触せしめて、該吸着体にPAI
・１及びPAI・１−tPA複合体を選択的に結合せしめ、 （２）得られた結合吸着体を前記混合物から分離し、 （３）該結合吸着体に溶出液を接触させてPAI・１及びP
AI・１−tPA複合体を該溶出液中に溶出させ、 （４）かくしてPAI・１及びPAI・１−tPA複合体を含有
する混合溶液を得、 （５）該混合溶液をtPAに対する抗体またはそれと同等
の断片を不溶性固体担体に結合させた免疫吸着体と接触
せしめ、PAI・１−tPA複合体を選択的に該吸着体に結合
せしめ、 （６）得られた前記PAI・１−tPA複合体の結合吸着体
を、前記混合溶液を分離し、 （７）分離されたPAI・１−tPA複合体の結合吸着体に、
溶出液を接触させて、PAI・１−tPA複合体を該溶出液中
へ溶出させ、 （８）得られた溶出液からPAI・１−tPA複合体を回収す
る、 （９）また必要ならば、前記（６）の工程で分離された
溶液からPAI・１を回収する、 ことよりなる前記原料混合物からPAI・１−tPA複合体ま
たはそれとPAI・１の分離回収方法である。

前記方法−Ｉにおいて、工程（５）における“tPAに
対する抗体”としては、tPA・１に対するモノクローナ
ル抗体であってもよく、またポリクローナル抗体であっ
てもよい。またtPAに対するモノクローナル抗体として
は、種々のモノクローナル抗体であってもよいが、前記
したJTA−１であることもできる。

また前記（６）から分離された混合溶液からPAI・１
を回収することもでき、この方法も本発明に包含され
る。

さらに前記工程（３）及び（７）の溶出液としては、
例えば酸として0.2M酢酸（pH2.8）、1M酢酸（pH3.0）、
0.2M酢酸−塩酸（pH1.8）、50mMグリシン−塩酸（pH2.
4）、0.1Mグリシン−塩酸（pH2.2）、0.1Mクエン酸ナト
リウム/1M NaCl（pH2.2）、10mM塩酸・0.15M NaCl（pH
2.2）等があり、アルカリとして50mMジエチルアミン−
塩酸（pH11.5）、50mMジエチルアミン−塩酸/0.5％DOC
（pH11.5）、1Mアンモニア水があり、カオトロビックイ
オンとして2.5M MgCl₂/0.2Mホウ酸ナトリウム/0.1％TRI
TON X−100（pH6.5）、3M NH₄SCN、3M KSCN、2M KBr、2
M NaI/50mMリン酸/0.1％Triton X−100（pH7）等があ
り、タンパク質変性剤として、4M尿素/10mMリン酸/0.9
％NaCl（pH7.8）、６〜8M尿素/25mMトリス−塩酸（pH7.
4）、8M尿素/10mMリン酸（pH6.0）、6M尿素（中性）、
0.1−4M塩酸グアニジン（pH3.2）、6M塩酸グアニジン
（pH1.5）等があり、界面活性剤として0.5％DOC/10mMト
リス/0.14M NaCl（pH8.0）、0.05％Triton X−100/0.1M
リン酸（pH7.0）等があり、その他として50％エチレン
グリコール/5mMリジン−KOH（pH11.5）/0.14M NaCl、蒸
留水等が使用される。

上記方法−Ｉにより、PAI・１及びPAI・１−tPA複合
体を含む原料混合物（この混合物はさらにtPAが含まれ
ていても差支えない）から、PAI・１−tPA複合体及び／
またはPAI・１を高純度でしかも高い回収率で分離する
ことが可能であり、分離されたPAI・１−tPA複合体及び
／またはPAI・１は、それぞれ免疫学的測定のための標
準試料として、またその他実験用の試料として有効に使
用される。

分離・回収方法−II; この方法−IIは、tPA及びPAI・１−tPA複合体を含む
原料混合物を、 （１）tPAに対する抗体またはそれと同等の断片を不溶
性固体担体に結合させた免疫吸着体と接触させて、該吸
着体にtPA及びPAI・１−tPA複合体を選択的に結合せし
め、 （２）得られた結合吸着体を前記混合物から分離し、 （３）該結合吸着体に溶出液を接触させて、tPA及びPAI
・１−tPA複合体を該溶出液中に溶出させ、 （４）かくしてtPA及びPAI・１−tPA複合体を含有する
混合溶液を得、 （５）該混合溶液を、前記不溶性固体担体にPAI・１に
対するモノクローナル抗体JTI−３またはJTI−４或いは
これらと同等の断片を結合させた免疫吸着体と接触せし
めて、該吸着体にPAI・１−tPA複合体を選択的に結合せ
しめ、 （６）得られた前記PAI・１−tPA複合体の結合吸着体
を、前記混合溶液から分離し、 （７）分離された前記PAI・１−tPA複合体の結合吸着体
に溶出液を接触させて、PAI・１−tPA複合体を該溶出液
中へ溶出させ、 （８）得られる溶液から、PAI・１−tPA複合体を回収す
る、 （９）また必要ならば、前記（６）の工程で分離された
溶液からtPAを回収する、 ことよりなる前記原料混合物からPAI・１−tPA複合体ま
たはそれとtPAの分離回収方法である。

前記方法−IIにおいて、工程（１）における“tPAに
対する抗体”としては、tPAに対するモノクローナル抗
体であってもよく、またポリクローナル抗体であっても
よい。またtPAに対するモノクローナル抗体としては、
種々のモノクローナル抗体であってもよいが、前記した
JTA−１であることもできる。

また前記工程（６）から分離された混合溶液からtPA
を回収することもでき、この方法もまた本発明に包含さ
れる。

さらに前記工程（３）及び（７）の溶出液としては、
前記方法−Ｉで説明した溶出液と同じものを使用するこ
とができる。

上記方法−IIにより、tPA及びPAI・１−tPA複合体を
含む原料混合物（この混合物はさらにPAI・１が含まれ
ていても差支えない）から、PAI・１−tPA複合体及び／
またはtPAを高純度でしかも高回収率で分離することが
可能であり、分離されたPAI・１−tPA複合体及び／また
はtPAは、それぞれ免疫学的測定のための標準試料とし
て、またその他実験用の試料として有効に使用される。

（Ｄ）PAI・１に対するモノクローナル抗体JTI−３の血
栓溶解促進剤としての利用； 本発明における２種のPAI・１に対するモノクローナ
ル抗体のうち、JTI−３は、それと同等の断片を含め
て、血栓溶解促進剤として使用することができる。すな
わち、前記したようにPAI・１に対するモノクローナル
抗体JTI−３は、PAI・１にtPAが結合した場合（すなわ
ち、PAI・１−tPA複合体に対して）でも、PAI・１に対
して結合を阻害されないが、PAI・１に対して結合した
場合、tPAは結合を阻害されるような抗原決定部位を認
識している。従ってこのJTI−３またはそれと同等の断
片を血栓を有してヒトの血液中に注入すると、それらが
PAI・１に結合して複合体を形成し、tPAがPAI・１に結
合して複合体を形成することが阻害され、また複合体に
も結合しない。かくして血中のtPAの作用が阻害される
ことがなくなるので結果としてプラスミンの形成が活性
化され血栓の溶解が促進されることになる。

本発明の血栓溶解促進剤は、PAI・１に対するモノク
ローナル抗体JTI−３またはそれと同等の断片（好まし
くはFab′断片）を有効成分として含有し、その他薬学
的に許容し得るCarrierが含まれていればよい。一般的
には静注用製剤として使用される。通常モノクローナル
抗体JTI−３またはそれと同等の断片は水性媒中に溶解
乃至分散された状態で使用されるが、その濃度はmg/Kg
のオーダーであるのが好ましい。

（Ｅ）血栓症の病状の判定； 前記（Ａ−３）で説明した方法に従って、ヒト検体、
殊にヒト血液中のPAI・１−tPA複合体の含有量を測定す
ることによって、その値から、検体提供者の血栓の病状
を判定することができる。すなわち、PAI・１−tPA複合
体がある程度以上含まれていると、血栓症を患っている
か或いは血栓症に進行しつつあることを判定でき、また
血栓症にかかった人であってその治療中に、前記複合体
の量を測定することにより、その値がある一定の値（約
9ng/ml）以下になることによって血栓症の治癒の判定を
行なうことができる。

また前記（Ａ−３）で説明した方法に従って、ヒト検
体、殊にヒト血液中のPAI・１−tPA複合体の含有量を測
定し、一方前記（Ｂ−３）で説明した方法に従って、ヒ
ト検体、殊にヒト血液中のPAI・１及びPAI・１−tPA複
合体の合計の含有量を測定し、その双方の値からまたは
その差であるPAI・１の含有量の値から、前記した血栓
症の病状の判定を一層正確に行なうことができる。

次に本発明におけるPAI・１−MCAを作製する方法につ
いて詳細に説明する。

A.抗原の単離・精製 抗原に用いるPAI・１はvan Mourik J.A.らの方法［va
n Mouurik J.A.et al.,J.Boil.Chem.,259,14914−14921
（1984）参照］を応用しヒト血管壁内皮細胞の培養上清
から単離・精製した。

B.PAI・１によるマウスの免疫 雌Balb/Cマウスを用いることができるが他の系（Stra
in）のマウスを使用することもできる。その際、免疫計
画、及びPAI・１の濃度は、十分な量の抗原刺激をうけ
たリンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。例え
ばマウスに50μｇのPAI・１を２週間間隔で腹腔に３回
免疫の後、さらに30μｇを静脈に投与する。最終免疫の
数日後に融合の為に脾臓細胞をとり出す。

C.細胞融合 上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に取り出
し、そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細
胞を適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合
促進剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20:1〜約2:1の範囲であ
る。約10⁸個の脾臓細胞について0.5〜1.5mlの融合媒体
の使用が適当である。

細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、よく知られて
いるが、本発明では、P3−X63−Ag8−U1細胞（P3−U1）
［Yelton,D.T.et al,Current.Topics in Microbiology
and Immunology,81,1（1978）参照］を用いた。

細胞融合の際使用される好ましい融合促進剤として
は、例えば、平均分子量1000〜4000のポリエチレングリ
コールを有利に使用できるが、この分野で知られている
他の融合促進剤を使用することもできる。本発明におい
ては、平均分子量4000のポリエチレングリコールを用い
た。

D.融合した細胞の選択 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未
融合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞及び融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未
融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばHA
T培地）が使用される。この選択培地中では、未融合の
骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫瘍
性なので、ある一定期間後（約１週間後）死滅する。こ
れらに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と
親脾臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中で生存
できる。

E.各容器中野PAI・１に対する抗体の確認 かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培
養上清を採取し、PAI・１に対する抗体について酵素免
疫定量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）によ
りスクリーニングする。

F.PAI・１に対する活性を持つ抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞のクローン化 目的の工程を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方
法（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異なった方法のいずれでも産生される。その第１の
方法によればハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培
地で培養することにより、その培養上清からそのハイブ
リドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を得ること
ができる。第２の方法によればハイブリドーマ細胞は同
質遺伝子、または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注
射することができる。一定時間後の宿主動物の血液中及
び腹水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノ
クローナル抗体を得ることができる。

G.PAI・１含有液からのPAI・１の分離 まず前記PAI・１に対するMCAを不溶性担体に固定化ま
たは結合させて吸着体を得る。その際使用される不溶性
担体としては、MCAを用いた測定試薬または測定用キッ
トの基材として一般的使用されるものであればよい。例
えば材質としてセファロース、ポリアクリルアミド、セ
ルロース、デキストラン、またはマレイン酸ポリマーあ
るいはこれらの混合物が好ましく用いられる。これら不
活性担体の形態としては、粉末状、粒状、ペレット状、
ビーズ状、フイルム状、繊維状など種々の形態であるこ
とができる。また一般に血漿、またはその分画成分の測
定や分離に用いられる多数の凹状のくぼみを有するプレ
ート（ウエル）を用いることが有利である。

前記吸着体を用い、これにPAI・１含有混合物を接触
せしめると、該吸着体に固定化したMCAとPAI・１とが結
合して、結果的にPAI・１が該吸着体に結合する。かく
することによりPAI・１を分離、除去することが可能で
ある。

また前記の如くしてPAI・１を吸着体に結合させ、で
きれば残余の混合物を洗浄して除去する。次いで吸着体
に結合したPAI・１を酸性条件（0.2Mグリシン塩酸）で
離脱し、これを取得することによってPAI・１単離する
ことができる。

かくして前記MCAを結合させた吸着体の使用により、P
AI・１を含有する混合物からのPAI・１の除去、該混合
物からのPAI・１の分離及び精製、該混合物中のPAI・１
の含有量の測定などが極めて簡単な操作で達成される。

H.PAI・１−tPA複合体含有液からのヒトPAI・１の分離 まず前記PAI・１に対するMCAを不溶性担体に固定化ま
たは結合させて吸着体を得る。その際使用される不溶性
担体としては、モノクローナル抗体を用いた測定試薬ま
たは測定用キットの基材として一般的使用されるもので
あればよい。例えば材質としてセファロース、ポリアク
リルアミド、セルロース、デキストラン、またはマレイ
ン酸ポリマー或いはこれらの混合物が好ましく用いられ
る。これら不活性担体の形態としては、粉末状、粒状、
ペレット状、ビーズ状、フイルム状、繊維状など種々の
形態であることができる。また一般に血漿、またはその
分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹状のくぼみ
のプレート（ウエル）を用いることが有利である。

前記吸着体を用い、これにPAI・１−tPA複合体含有混
合物を、接触せしめると、該吸着体に固定化したMCAとP
AI・１−tPA複合体とが結合して、結果的にPAI・１−tP
A複合体が該吸着体に結合する。かくすることによりPAI
・１−tPA複合体を分離・除去することが可能である。
また前記の如くしてPAI・１−tPA複合体を吸着体に結合
させ、できれば残余の混合物を洗浄して除去する。次い
で吸着体に結合したPAI・１−tPA複合体を酸性条件（0.
2Mグリシン塩酸）で離脱し、これを取得することによっ
てPAI・１−tPA複合体を単離することができる。

かくして前記MCAを吸着させた吸着体の使用により、P
AI・１−tPA複合体を含有する混合物からのPAI・１−tP
A複合体の除去、該混合物からのPAI・１−tPA複合体の
分離及び精製、該混合物中のPAI・１−tPA複合体量の含
有量の測定などが極めて簡単な操作で達成される。

（寄託） PAI・１に対するモノクローナル抗体JTI−３は、それ
を産生するハイブリドーマが、ブダペスト条約に基づく
国際寄託機関である微工研（Fermentation Research In
stitute）に1988年11月22日にFERM p−10405として寄託
され、その後1989年３月２日に国際寄託に変更された
（国際寄託;No.BP−2317）。

PAI・１に対するモノクローナル抗体JTI−４は、それ
を産生するハイブリドーマが、上記微工研に1988年11月
22日にFERM p−10406として寄託され、その後1989年３
月２日に国際寄託に変更された（国際寄託No.BP−231
8）。

tPAに対するモノクローナル抗体JTA−１は、それを産
生するハイブリドーマが、上記微工研に1988年11月22日
FERM p−1099として寄託され、その後、1989年３月２日
に国際寄託に変更された（（国際寄託No.BP−2316）。

上記以外のPAI・１−MCAを産生するハイブリドーマ
は、それぞれJTI−１（FERM P−10403）,JTI−２（FERM
P−10404）,JTI−５（FERM P−10407）として、また抗
tPA−MCAを産生するハイブリドーマはそれぞれJTA−２
（FERM P−10400）,JTA−３（FERM P−10401）,JTA−４
（FERM P−10402）として微工研に1988年11月22日に寄
託されている。

以下実施例を掲げて本発明を詳述するが、本発明はこ
れらに限定されるわけではない。

e.実施例 実施例１−（１） （抗原の単離・精製） 抗原に用いるPAI・１はvan Mourik J.A.らの方法［va
n Mourik J.A.et al.,J.Biol.Chem.,259,14914−14921
（1984）参照］を応用し、ヒト血管壁内皮細胞の培養上
清から単離・精製した。

すなわち、ウシ血清を含まないヒト血管内皮細胞培養
上清をCon A.Sepharose吸着体に接触させ、上清中のPAI
・１を含む画分を吸着させた。吸着体を洗浄後、1M α
−Methylmannosideを含むバッファーで吸着画分を溶出
した。この溶出画分をSDS−ポリアクリルアミドスラブ
ゲル電気泳動法を用いて分子量分画を行ない、PAI・１
に相当する分子量部分のゲルを切り出し、このゲル断片
よりタンパク質を抽出して抗原とした。

実施例１−（２） （MCAの取得） 実施例１−（１）の方法で精製したPAI・１を雌のBal
b/Cマウス（４周齢）２匹に対して14日間隔で４回免疫
した。初回の免疫はPBSに溶解した。50μｇのPAI・１を
等量のフロイントの完全アジュバント（Complete Freun
d's adjuvant）と混合し、そのエマルジョンを、一匹あ
たり50μｇとなるように腹腔内に投与した、２回目、３
回目は、同じく50μｇのPAI・１をフロイントの不完全
アジュバント（Freund's imcomplete adjuvant）混合
し、同じく腹腔内に投与した。最終免疫は10μｇのPAI
・１をPBS溶液のまま、マウス尾静脈から追加投与し
た。最終免疫の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細
胞融合に用いた。

免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細
胞（P3U1）を約2:1〜約15:1の割合で混合し、50％ポリ
エチレングリコール4000（Merck）を融合促進剤として
ＫhlerとMilsteinの方法に従い細胞融合を行なった。
融合後の細胞は、１×10⁶cell/mlの細胞濃度となるよう
に10％FCS・−RPMI−1640培地に懸濁し、96wellsマイク
ロプレート（Coster）に１ウエル当り100μｌずつ分注
した。

融合細胞は、CO₂インキュベーター（５％CO₂,37℃）
中で培養し、ヒポキサンチン、アミノプテリン；チミジ
ンを含む培地（HAT培地）で培地交換を行ない、HAT培地
中で増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞からなるハイ
ブリドーマのスクリーニングを行なった。

ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原PAI・１を
コーティングしたマイクロタイタープレートを用いELIS
A法により検出した。第２抗体には、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（以降HRPと略す）標識ウサギ抗マウスIgG抗
体を用いた。

融合細胞をまいた合計570のウエルのうち511のウエル
にコロニーの形成が認められる。このうち抗体産生陽性
ウエルは下記表１に示すように８ウエルであった。これ
らの抗体産生陽性ウエルについて限界希釈法によるクロ
ーニングを２回繰り返して行ない５個のクローンを得
た。このクローンから産生されるMCAをそれぞれJTI−1,
JTI−2,JTI−3,JTI−4,JTI−５とする。得られたクロー
ンは90％FCS−10％DMSO中に懸濁させて液体窒素中保存
した。各クローンの産生するMCAは、クローンをBalb/C
マウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロティンＡ−
Sepharose4Bカラムを用いて精製した。

（ドデシル硫酸ナトリウム活性化PAI・１とMCAとのエン
ザイムイムノアッセイ法での結合能） ドデシル硫酸ナトリウム（以後SDSと略す）で活性化
したPAI・１へのMCA結合能を、抗原固定化エンザイムイ
ムノアッセイ法を用いて検定した。quiescent PAI・１
溶液に、終濃度0.1％となるようにSDSを加え、37℃で１
時間保温した。その後終濃度１％となるようにトライト
ンＸ−100を加え、氷冷上で１時間静置した。この操作
でSDS活性化PAI・１が得られた。

このSDS活性化PAI・１を抗原とし、また比較のために
PAI・１−tPA複合体、quiscent PAI・１も抗原とし、エ
ンザイムイムノアッセイを行なった。

各々の抗原を１μg/mlのタンパク濃度に調製しポリス
チレンプラスチックウエルに１夜４℃で、これをコーテ
ィングした。表２に示すように抗原との結合能を検定し
た。ウエルを洗浄し、BSAでブロックし、37℃で２時
間、５μg/mlのタンパク濃度に調製した５種のMCAとと
もに保温した。洗浄後、HRP標識ウサギ抗マウスととも
に保温した。洗浄後、ウエルに残存しているペルオキシ
ダーゼ活性を定量し、結合能を検定した。５種のMCAと
ともにPAI・１−tPA複合体、quiscent PAI・１、SDS活
性化PAI・１に結合能を示したが、JTI−１はquiscent P
AI・１への結合がより強く、JTI−２はSDS活性化PAI・
１への結合がより強かった。JTI−3,−４はともに３種
の抗原に強く結合した。JTI−５はPAI・１−tPA複合体
に結合した。

（ドデシル硫酸ナトリウム活性化PAI・１とMCAとのイム
ノブロッティングでの結合能） PAI・１またはPAI・１−tPA複合体の各々300ngを、SD
Sスラブゲル電気泳動し、この後電気的にニトロセルロ
ースメンブレン上にタンパクを転移した。このニトロセ
ルロースメンブレンをBSAでブロックし、洗浄後、室温
で２時間10μg/mlのタンパク濃度になるように調製した
JTI−１〜５それぞれの溶液中で保温した。洗浄後HRP標
識ウサギ抗マウス抗体とともに保温した。洗浄後、ニト
ロセルロース上に、抗原と結合して残存しているHRP標
識抗体のペルオキシダーゼ活性を検出した。結果を表２
に示した。

JTI−２〜４は、PAI・１単独、PAI・１−tPA複合体と
もに結合能を示した。

また、抗原固定化法で、MCAの抗原への結合能を分析
した結果、表３に示した解離定数（Dissociation Const
ant,以後Kdと略す）を得た。

（JTI−２のイムノブロッティングでの結合能） PAI・１またはPAI・１−tPA複合体の各々300ngを、SD
Sスラブゲル電気泳動し、この後電気的にニトロセルロ
ースメンブレン上にタンパクを転移した。このニトロセ
ルロースメンブレンをBSAでブロックし、洗浄後、室温
で２時間10μg/mlのタンパク濃度になるよう調製した。
JTI−２溶液中で保温した。洗浄後HRP標識ウサギ抗マウ
ス抗体とともに保温した。洗浄後、ニトロセルロース上
に、抗原と結合して残存しているHRP標識抗体のペルオ
キシダーゼ活性を検出した。結果を図１に示した。JTI
−２は、PAI・１単独、PAI・１−tPA複合体ともに結合
能を示した。

実施例２ （抗tPA・MCAの作成） Rijken D.C.らの方法［Rijken D.C.et al,J.Biol.Che
m.,256,7035−7041（1981）］を応用し、ヒトメラノー
マ細胞の培養上清から単離・精製したtPAを高原として
用い、実施例１と同様にして下記のような抗tPA・MCA産
生ハイブリドーマ及び抗tPA・MCAを作成した。

得られたMCAをそれぞれJTA−1,JTA−2,JTA−3,JTA−
４とする。tPAとMCAとのエンザイムイムノアッセイ法で
の結合能及びイムノブロッティングでの結合能は実施例
１と同様に行なった。結果は表４及び表５に示した。

実施例３ （種々の抗体の組合せの検討１） PAI・１−tPA複合体量を測定する系を作製するため
に、種々の抗体の組合せでの二抗体サインドイッチ法を
検討した。まず一次抗体を抗PAI・１・MCAとし、二次抗
体を抗tPA・MCAとした組合せを検討した。

JTI−1,−2,−３或いは−４を、10μg/mlのタンパク
濃度の溶液とし、これを各々ポリスチレンプラスチック
ウエルに４℃１夜静置してコーティングした。ウエルを
洗浄し、BSAでブロックした後、それぞれ0,10,20,40ng/
mlのタンパク濃度になるよう調製したPAI・１−tPA複合
体と37℃、３時間保温した。洗浄後、HRP標識したJTA−
１を２μg/mlのタンパク濃度になるように調製した溶液
と37℃、３時間保温した。洗浄後ウエルに残存するペル
オキシダーゼ活性を定量し、サンドイッチ法での高原結
合能を検定した。その結果を図２に示した。

このことにより、最も高い結合能を示したものは、一
次抗体にJTI−３或いはJTI−４を用いたものであった。

実施例４ （種々の抗体の組合せの検討２） 一次抗体を抗tPA・MCAとし、二次抗体を抗PAI・１・M
CAとして検討した。

JTA−1,−2,−３或いは−４を10μg/mlのタンパク濃
度の溶液とし、これを各々ポリスチレンプラスチックウ
エルに４℃１夜静置してコーティングした。ウエルを洗
浄し、BSAでブロックした後、それぞれ0,10,20,40ng/ml
のタンパク濃度になるよう調製したPAI・１−tPA複合体
と37℃、３時間保温した。洗浄後、HRP標識したJTI−1,
−2,−３或いは−４を２μg/mlのタンパク濃度になるよ
うに調製した溶液と37℃、３時間保温した。洗浄後ウエ
ルに残存するペルオキシダーゼ活性を定量し、サンドイ
ッチ法での抗原結合能を検定した。その結果を図３に示
した。

このことにより、最も高い結合能を示したものは、一
次抗体にJTA−１、二次抗体にJTI−４を用いたものであ
った。

実施例５ （一次抗体としてJTA−１、二次抗体としてJTI−４を用
いたサンドイッチ法へ、遊離tPAが及ぼす影響） 実施例４で得た組合せにおいて、PAI・１−tPA複合体
を定量する場合、同時に遊離のtPAが存在したときに複
合体の定量値が妨害をうけるか否かを検討した。

JTA−１を10μg/mlのタンパク濃度溶液とし、これを
各々ポリスチレンプラスチックウエルに４℃１夜静置し
てコーティングした。ウエルを洗浄し、BSAでブロック
した後、PAI・１−tPA複合体10ng/mlの溶液に、遊離tPA
を各々0,50,100,1,000ng/mlの終濃度となるように加え
たものと、37℃、３時間保温した。洗浄後、HRP標識し
たJTI−４を２μg/mlのタンパク濃度となるように調製
した溶液と37℃３時間保温した。洗浄後ウエルに残存し
ているペルオキシダーゼ活性を定量し、遊離tPAによる
妨害の程度を検定した。その結果を図４に示した。

このことより、このサンドイッチ系では遊離tPA濃度
が、PAI・１−tPA複合体濃度の10倍程度あると、PAI・
１−tPA複合体測定値への妨害をうけることがわかっ
た。

実施例６ （一次抗体としてJTI−３或いは−４、二次抗体としてJ
TA−１を用いたサンドイッチ系へ、遊離PAI・１が及ぼ
す影響） 実施例３で得た組合せにおいて、tPA・PAI・１複合体
を定量する場合、同時に遊離のPAI・１が存在したとき
に複合体の定量値が妨害をうけるか否かを検討した。

JTA−３或いは−４を10μg/mlのタンパク濃度溶液と
し、これを各々ポリスチレンプラスチックウエルに４℃
１夜静置してコーティングした。ウエルを洗浄し、BSA
でブロックした後、PAI・１−tPA複合体10ng/mlの溶液
に、遊離PAI・１を各々0,100,200,300,400,500ng/mlの
濃度となるように加えた溶液と、37℃、３時間保温し
た。洗浄後、HRP標識したJTA−１を２μg/mlのタンパク
濃度となるように調製した溶液と37℃３時間保温した。
洗浄後ウエルに残存しているペルオキシダーゼ活性を定
量し、遊離PAI・１による妨害の程度を検定した。その
結果を図５に示した。

このことより、このJTI−３を一次抗体としたこのサ
ンドイッチ系では遊離PAI・１が、PAI・１−tPA複合体
の10倍程度存在するだけで大きく妨害を受けることがわ
かった。また、JTI−４を一次抗体とした場合も、遊離P
AI・１がPAI・１−tPA複合体の数10倍程度存在すると妨
害を受けることがわかった。

実施例７ （固相担体をビーズとし、一次抗体としてJTI−４、二
次抗体としてJTA−１を用いたサンドイッチ系へ、遊離P
AI・１が及ぼす影響） 実施例６において、比較的良好な結果を示した一次抗
体をJTI−４、二次抗体をJTA−１とした組合せにおい
て、一次抗体の量を増加させるため、ポリスチレンプラ
スチックウエルのかわりにポリスチレンビーズを用いた
系を検討した。

JTI−４を50μg/mlのタンパク濃度溶液とし、この中
にポリスチレンビーズを入れ、４℃１夜静置してコーテ
ィングした。洗浄した後、各々のビーズをプラスチック
チューブに１個ずついれ、BSAでブロックした。洗浄後P
AI・１−tPA複合体13.2ng/mlの溶液に遊離PAI・１を各
々0,500,1000ng/mlの終濃度となるように加えた溶液と
４℃、１夜静置した。静置ごHRP標識したJTA−１を２μ
g/mlのタンパク濃度となるように調製した溶液と37℃３
時間保温した。洗浄後ビーズに残存しているペルオキシ
ダーゼ活性を定量し、遊離PAI・１による妨害の程度を
検定した。その結果を図６に示した。

このことより、一次抗体をコーティングする濃度を50
μg/mlとし、固相担体をポリスチレンビーズとして系で
は遊離PAI・１の妨害を受けないことがわかった。

実施例８ （PAI・１単独とPAI・１−tPA複合体との全PAI・１抗原
量の測定） JTI−３をタンパク濃度50μg/mlでポリスチレンプラ
スチックウエル上に４℃で１夜静置し、コーティングし
た。次に１％BSAを含むトリス塩酸緩衝液（以後TBSと略
す）を加え、37℃で２時間静置した後0.05％Tween20を
含むトリス塩酸緩衝液（以後TBS−Twと略す）で４回洗
浄した。次にPAI・１或いはPAI・１−tPA複合体を、タ
ンパク濃度10,20或いは40ng/mlになるようにTBS−Twで
希釈した溶液を加え37℃で２時間静置した。TBS−Twで
４回洗浄後、ペルオキシダーゼで標識したJTI−４を、T
BS−Twで２μg/mlになるように希釈した溶液を加え、37
℃で２時間静置した。TBS−Twで４回洗浄後、ペルオキ
シダーゼ基質溶液を加え室温で反応後、波長495nmで吸
光度を測定した。結果を図７−１に示す。この図より、
PAI・１単独でのタンパク濃度或いはPAI・１−tPA複合
体のタンパク濃度と吸光度の関係は、同様の直線関係に
なることが示された。以上のことから、この測定系で
は、PAI・１単独とPAI・１−tPA複合体をあわせた全PAI
・１抗原量を測定しうることが示された。

（一次抗体:JTI−３、二次抗体JTI−４の組合せと一次
抗体:JTI−４、二次抗体JTI−３の組合せとの比較） 上記実験と同様な要領で、JTI−３をポリスチレンプ
ラスチックウエルにコーティングし、一次抗体として使
用し、ペルオキシダーゼで標識したJTI−４を二次抗体
として使用した場合と、JTI−４を一次抗体とし、JTI−
３を二次抗体とした場合との比較を行なった。この際PA
I・１とPAI・１−tPA複合体との間で抗体の結合に違い
があるか否かをみるために検体中のPAI・１とPAI・１−
tPA複合体の混合比を下記のように変化させた。

結果を図７−２、図７−３に示す。図７−２と図７−
３を比較してわかるように、一次抗体JTI−４、二次抗
体JTI−３の組合せのほうが測定感度がよい。また複合
体を形成しているPAI・１と単独のPAI・１との測定値の
差がなくPAI・１の量を適確に測定している。

実施例９ （抗PAI・１・MCAによる、試験管内でのPAI・１−tPA複
合体形成抑制） Quiscent PAI・１を、SDSを用いて活性化し、SDS活性
化PAI・１を得た。このSDS活性化PAI・1100ngにJTI−1,
−2,−3,−4,マウスIgG或いはウサギ抗PAI・１ポリクロ
ーナル抗体をモル比にして10倍または100倍加え37℃で
１時間静置した。次に¹²⁵I標識化tPAを0.1ng（１×10⁴c
pm）を加え、37℃で30分間静置した。このものをSDSス
ラブゲル電気泳動し、ゲルを乾燥後オートラジオグラフ
ィーを行なった。ここで検出されたtPA単独或いはPAI・
１−tPA複合体に相当する放射活性を測定し、tPA単独と
PAI・１−tPA複合体の放射活性の比を百分率表示で表６
に示した。表に示されたように、抗PAI・１ポリクロー
ナル抗体をPAI・１の100倍モル量加えた場合、ほぼ完全
に複合体形成が抑制された。またJTI−３を10倍量或い
は100倍量加えた場合も、強く複合体形成が抑制され
た。またJTI−２も複合体形成を抑制する傾向を示し
た。以上のことより少くともJTI−３は試験管内でのPAI
・１−tPA複合体形成を抑制することが示された。

実施例10 （抗PAI・１・MCAによる、PAI・１のtPA依存性プラスミ
ノーゲン活性化阻害の抑制） Quiscent PAI・１を、SDSを用いて活性化し、SDS活性
化PAI・１を得た。このSDS活性化PAI・1 20ngに、JTI−
1,−2,−3,−４或いはウサギ抗PAI・１ポリクローナル
抗体をモル比にして10倍または100倍加え、37℃で１時
間静置した。次にtPAを0.25ng加え、37℃で30分間静置
した。次にプラスミノーゲン22μｇ、プラスミンの合成
発色基質であるＳ−2251を0.15mMになるように加え、37
℃で３時間静置した後、波長405nmで吸光度を測定し
た。なお、ここで用いたSDS活性化PAI・１の量は、tPA
活性の90％を阻害する量だった。結果を表７に示した。
表７は残存するtPA活性が、SDS活性化PAI・１を含まな
い場合の何％に当るかを表示した。表に示されたように
抗PAI・１ポリクローナル抗体をPAI・１の100倍モル量
加えた場合、tPA活性はほぼ完全に回復した。またJTI−
３を100倍モル量加えた場合も約50％tPA活性が回復し
た。以上のことよりJTI−３はSDS活性化PAI・１によるt
PA依存性プラスミノーゲン活性化阻害を抑制することが
示された。

実施例11 （抗PAI・１・MCAによる、血管壁内皮細胞上でのPAI・
１−tPA複合体形成の抑制） 血管壁内皮細胞を、直径35mmの細胞培養皿上にコンフ
ルエントになるように培養した。細胞を無血清199培地
で洗浄後2mlの無血清199培地、終濃度100ng/mlのtPA及
び終濃度10μg/mlのJTI−1,−2,−3,−4,マウスIgG或い
はウサギ抗PAI・１ポリクローナル抗体を加えて37℃で
３時間静置し、上清を回収した。この上清をSDSスラブ
ゲル電気泳動を行なった後フィブリンオートグラフィー
で分析した。結果を図８に示した。図８において記号１
〜５はそれぞれ以下の場合を示す。

1;JTI−１を加えた場合、2;JTI−３を加えた場合、3;
ポリクローナル抗体を加えた場合、4;JTI−４を加えた
場合、5;実験に用いたtPA。

図８より、ウサギ抗PAI・１ポリクローナル抗体を加
えた場合、PAI・１−tPA複合体形成は完全に抑制された
ことがわかる。またJTI−1,JTI−３を加えた場合もPAI
・１−tPA複合体形成の抑制がみられた。以上のことか
ら、JTI−1,JTI−３は血管壁内皮細胞が作る活性形KPAI
・１によるPAI・１−tPA複合体形成を抑制することがわ
かった。

実施例12 （JTI−３による線溶促進効果） JTI−３による線溶促進効果を解析するために、¹²⁵I
−Fibrin plate法を用いて以下の実験を行なった。

（１）一定量のtPA（0.0025U/ml）に、このtPA活性をほ
とんど阻害する量のSDS活性化PAI・１（6ng/ml）と、種
々の濃度のJTI−３（PAI・１とJTI−３のモル比にして
1:1から1:1,000までの量）を同時に加えた。37℃で20分
間保温した後、¹²⁵I−Fibrinをcoatingした24wellポリ
スチレンプレートにいれ、同時にplasminogenを加え
た。37℃で２時間保温した後、上清中の¹²⁵I−放射活性
及びプレートに残存している¹²⁵I−放射活性の両方を測
定し、この二者の比からFibrin溶解度（％lysis）を求
めた。図９ではsimultaneouslyと表示した。

（２）SDS活性化PAI・１（6ng/ml）にJTI−３（PAI・１
とJTI−３の、モル比にして1:1から1:1,000までの量）
を加え、37℃で30分間保温した。ここに一定量のtPA
（0.0025U/ml）を加え、さらに37℃で20分間保温した。

このものを¹²⁵I−Fibrinをcoatingした24wellポリス
チレンプレートにいれ、同時にplasminogenを加えた。3
7℃で２時間保温した後、上清中の¹²⁵I−放射活性及び
プレートに残存している¹²⁵I−放射活性の両方を測定
し、この二者の比からFibrin溶解度（％lysis）を求め
た。図９ではsequentiallyと表示した。

この実験により、tPA活性をほぼ完全に阻害する量のP
AI・１が存在している場合でも、JTI−３を加えること
によりJTI−３の濃度依存的にPAI・１によるtPA活性阻
害が抑制されてゆき、最終的にJTI−３がPAI・１の500
倍量程度存在すると、PAI・１によるtPA活性阻害が大部
分抑制されることがわかった。

実施例13 （正常人、患者検体測定） PAI・１−tPA Complex測定系を用い、正常人及び各種
疾患患者のPlasma中PAI・１−tPA complex濃度を測定し
た（図10）。正常人21例においては約9ng/mlを最高値と
して、平均値5.3ng/mlであった。これに対し血栓症患者
５例においては約14ng/mlを最高値として平均値8.5ng/m
lとなり正常人とはあきらかな差がみられた。このこと
により、PAI・１−tPA complexを測定することが血栓症
の診断・治療に役立つことが示された。また他の疾患患
者においても20ng/mlをこえるような値もみられ、血栓
症以外の患者の診断・治療に役立つ可能性も示された。

実施例14 （ヒト血管壁内皮細胞PAI・１の精製） ヒト血管壁内皮細胞培養上清１に、pH7.0に調製し
た飽和硫安１を、１時間かけ氷冷攪拌しながら加え
た。すべての硫安溶液を加えおえたのち、２時間攪拌を
する。この溶液を10,000×Ｇ、30分間４℃で遠心分離
し、沈澱を分離した。

この沈澱を20mM Tris・HCl pH7.4−0.15M NaCl−0.01
％Tween 80（以後Tw 80と略す）に1mM Benzamidine緩衝
液100mlに溶解し同緩衝液に対して４℃で透析した。

透析を終えた試料を、前記抗PAI・１・MCAJ TI−１
を、1mg/ml・抗体の濃度で結合させた抗体−担体結合体
10mlと混合、攪拌し４℃、18時間の反応を終えた抗体−
担体結合体を集め、これを100mlの10mM Tris・HCl−1.0
M NaCl−0.01％Tw 80−1mM Benzamidin緩衝液で洗浄
し、さらに20mM Tris・HCl−0.15M NaCl 0.01％Tw 80−
1mM Benzamidine緩衝液100mlで洗浄する。PAI・１を吸
着している抗体・担体結合体から0.2Mグリシン・塩酸pH
2.5−0.01％Tw 80緩衝液を用いてPAI・１を溶出した。

カラムからの溶出液は3mlずつ分画した。また溶出後
各分画は1M Tris pH9.0を加えてpH7.4に調製した。

得られた試料に存在するPAI・１−tPA複合体を除くた
めに抗tPAポリクローナル抗体を不溶化した担体と４
℃、18時間攪拌しその上清を得た。

上記の実施例において、PAI・１の精製を確認のため
のSDS電気泳動を行ない、タンパク染色と抗PAI・１・MC
A JTI−２及びHRP標識化ウサギ抗マウスIgGを用いたイ
ムノブロッティングの結果を図11に示した。

図11において記号Ａ〜Ｆはそれぞれ以下の銀染色を示
す。

A;培養上清、B;抗体カラム素通り、C;分画１、D;分画
２、E;分画３、F;分画４。またＧはイムノブロッティン
グ発色を示す。

上記の実験において、JTI−１を1mg/ml・抗体の濃度
で結合させた抗体−担体結合体のかわりにJTI−３を1mg
/ml・抗体の濃度で結合させた抗体−担体結合体を用い
る以外は同じ要領で実験を行なったところ同様の結果が
得られた。

実施例15 （PAI・１−tPA Complexの精製） ヒト血管壁内皮細胞を単層培養（monolayer cultur
e）し、無血清199培地で洗浄した。ここに無血清199培
地、終濃度１μg/mlのタンパク量のtPA及び終濃度３％
のLKB社製ウルトロセラＧを加え一夜培養した。上清を
回収し、タイパク分解酵素阻害剤を加え、JTI−３を固
定化したセファロース4B樹脂と４℃一夜保温した。樹脂
を洗浄後、結合した物質を0.2Mグリシン・塩酸pH2.5の
酸性条件で溶出した。溶出された画分を中和後、さらに
抗tPAポリクローナル抗体を固定化したセファロース4B
樹脂と４℃、一夜保温した。樹脂を洗浄後0.2Mグリシン
・塩酸で溶出し中和した。得られた画分の銀染色像を図
12に示した。

この図より、単一のPAI・１−tPA Complexが得られて
いるのがわかった。また、抗tPAポリクローナル抗体の
かわりにJTA−１を用いても同様の結果が得られた。

図12において記号Ａ〜Ｅはそれぞれ以下の銀染色を示
す。

A;培養上清、B;JTI−３カラム素通り、C;抗tPA抗体カ
ラム溶出画分１、D;画分２、E;画分３。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１−（２）におけるJTI−２のPAI・１、PA
I・１−tPA複合体への結合能を示すイムノブロッティン
グ結果である。 図２は実施例３における各抗体のPAI・１−tPA複合体へ
の結合能を示すものである。 図３は実施例４における抗体の組合せにおける抗体結合
能を示したものである。 図４は実施例５の遊離tPAの測定系へ及ぼす影響を示し
たものである。 図５は実施例６における測定系への遊離PAI・１の及ぼ
す影響を示したものである。 図６は実施例７における、固相担体をビーズとした場合
の測定系への遊離PAI・１の影響を示したものである。 図７は実施例８の全PAI・１抗原量の測定結果を示した
ものである。 図８は実施例11の抗PAI・１・MCAのPAI・１−tPA複合体
形成の抑制能を示したものである。 図９は実施例12のJTI−３による線溶促進効果を示した
ものである。 図10は実施例13における正常人及び各種疾患患者のPlas
ma中のPAI・１−tPA Complex濃度の測定結果を示す。 図11は実施例14のPAI・１の精製結果を示す。 図12は実施例15のPAI・１−tPA Complexの精製結果を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１０４００ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１０４０２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１０４０３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１０４０４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１０４０７ (56)参考文献 特表 昭63−500564（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａ ｅｍｏｓｔａｓｉｓ 55［２］（1986) ｐ．206−212 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａ ｅｍｏｓｔａｓｉｓ 55［２］（1986) ｐ．213−217 Ｂｌｏｏｄ 71 ［１］ ［1988，Ｊ ａｎ］ｐ．220−225 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａ ｅｍｏｓｔａｓｉｓ 54［３］（1985) ｐ．684−687

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアクテ
   ィベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲ
   ンアクティベーター複合体を、不溶性固体担体に結合し
   た第１抗体及び標識化された第２抗体を使用して免疫学
   的に測定する方法であって、一方の抗体がヒトプラスミ
   ノーゲンアクティベーターインヒビター・１に対するモ
   ノクローナル抗体JTI−３またはJTI−４、或いはこれら
   に由来するFab、Fab′、もしくは（Fab′）₂であり、他
   方の抗体がヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター
   に対するモノクローナル抗体JTA−１またはこれに由来
   するFab、Fab′、もしくは（Fab′）₂であることを特徴
   とする免疫学的測定方法。
2. 【請求項２】第１抗体がヒトプラスミノーゲンアクティ
   ベーターインヒビター・１に対するモノクローナル抗体
   JTI−３またはJTI−４、或いはこれらに由来するFab、F
   ab′、もしくは（Fab′）₂であり、第２抗体がヒト組織
   プラスミノーゲンアクティベーターに対するモノクロー
   ナル抗体JTA−１またはこれに由来するFab、Fab′、も
   しくは（Fab′）₂である請求項１記載の免疫学的測定方
   法。
3. 【請求項３】ヒトプラスミノーゲンアクティベーターイ
   ンヒビター・１に対するモノクローナル抗体が、JTI−
   ４である請求項１または２記載の免疫学的測定方法。
4. 【請求項４】ヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアクテ
   ィベーターインヒビター・１及びヒトプラスミノーゲン
   アクティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミ
   ノーゲンアクティベーター複合体を、不溶性固体担体に
   結合した第１抗体及び標識化された第２抗体を使用して
   免疫学的に測定する方法であって、一方の抗体がヒトプ
   ラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１に対
   するモノクローナル抗体JTI−３またはこれに由来するF
   ab、Fab′、もしくは（Fab′）₂であり、他方の抗体が
   ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・
   １に対するモノクローナル抗体JTI−４またはこれに由
   来するFab、Fab′、もしくは（Fab′）₂であることを特
   徴とする免疫学的測定方法。
5. 【請求項５】第１抗体がヒトプラスミノーゲンアクティ
   ベーターインヒビター・１に対するモノクローナル抗体
   JTI−３またはこれに由来するFab、Fab′、もしくは（F
   ab′）₂であり、第２抗体がヒトプラスミノーゲンアク
   ティベーターインヒビター・１に対するモノクローナル
   抗体JTI−４またはこれに由来するFab、Fab′、もしく
   は（Fab′）₂である請求項４記載の免疫学的測定方法。
6. 【請求項６】ヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアクテ
   ィベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲ
   ンアクティベーター複合体を請求項１の方法に従って測
   定し、その含有量の値により血栓症の病状を判定する方
   法。
7. 【請求項７】ヒト検体中の （ｉ）ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター
   複合体を請求項１記載の方法に従って測定し、一方 （ii）ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１及びヒトプラスミノーゲンアクティベーターイ
   ンヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベ
   ーター複合体を請求項４記載の方法に従って測定し、 上記（ｉ）及び（ii）の結果により、血栓症の病状を判
   定する方法。