JP2569196B2

JP2569196B2 - 抗ヒト・ｓｌｐｉ抗体およびヒト・ｓｌｐｉの免疫測定法

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Publication number: JP2569196B2
Application number: JP2081591A
Authority: JP
Inventors: 孝杉山; 孝上村; 賢一益田; 孝司石井; 健治細田; 貴明窪田; 仁美本田
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1990-03-29
Filing date: 1990-03-29
Publication date: 1997-01-08
Anticipated expiration: 2012-01-08
Also published as: JPH03279862A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野本発明は、ヒト・SLPIのＣ末端ドメイン（Asn⁵⁵−Ala
¹⁰⁷）部分を特異的に認識する抗ヒト・SLPI抗体または
それと同様のフラグメント、及びこれらを用いたヒト・
SLPIまたはそのフラグメントの免疫学的測定方法等に関
する。

（ロ）従来技術 SLPI（Secretory Leukocyte Protease Inhibitor）
は、気管支粘液，唾液，精液，子宮頚部粘液，鼻汁など
の外分泌液に存在する低分子量プロテアーゼ・インヒビ
ターとして知られている。近年、耳下腺液より精製され
たインヒビター:SLPI構造が明らかとなり（R.C.Thompso
nら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,6692−6696,1986;特
表昭62−501291）、また精液より精製されたインヒビタ
ー:HUSI−Ｉ（Human Seminal Proteinase Inhibitor
I）の構造も同定され（U.Seemllerら、FEBS Lett.,19
9,43−48,1986）、いずれも同一物質で分子量約14,000
の107アミノ酸残基よりなる蛋白であることが明らかと
なった。またその構造上の特徴として、SLPIは２つのド
メインより構成され、Ｎ末端のドメイン（Ser¹−Pr
o⁵⁴）がトリプシン阻害活性を、Ｃ末端ドメイン（Asn⁵⁵
−Ala¹⁰⁷）がキモトリプシン，好中球エラスターゼ，カ
テプシンＧ阻害活性を担っていると推定された。

最近では、遺伝子工学手法によって、Ｃ末端ドメイン
ポリペプチド類が生産され、キモトリプシン阻害活性
（特開昭62−259591）及び好中球エラスターゼ阻害活性
（W089/06239,Bio/Technology,7,55−60,1989,Am.Rev.R
espir.Dis.,139,A201,1989）の存在が明らかとされつつ
ある。

ところで、炎症部位で活性化された好中球から放出さ
れる好中球エラスターゼによる自己組織損傷がクローズ
アップされているが、前述のようにSLPIは強力な好中球
エラスターゼ阻害活性を有するので、炎症部位において
SLPIが生理的なインヒビターとして機能している可能性
が高い。

このSLPIの測定に関しては、いくつかのグループがチ
ャレンジしている。K.Ohlssonら（Hoppe−Seyler′s Z.
Physiol.Chem.,362,1273−1277,（1981））は、ヒト・S
LPIに対するポリクローナル抗体を用いて、競合法によ
りラジオイムノアッセイを報告し、さらにその測定系を
用いて憎悪期の肺炎患者の血清中では健常人よりSLPIが
上昇することを報告している（Eur.J.Respir.Dis.,65,2
01（1984））。また、J.A.Krampsら（Am.Rev.Respir.Di
s.,129,959−963（1984））は、ヒト・SLPIに対するポ
リクローナル抗体を用いて、酸素標識抗体を作成し、サ
ンドイッチ法による測定系を報告し、気道感染症患者の
喀痰中での推移を測定している（Chest,89,731（198
6））。

これらの方法はいずれの方法も抗原として２つのドメ
インよりなるヒト・SLPI全分子を用いて取得した抗体を
用いて測定系を構築していることになる。

（ハ）発明が解決しようとする課題しかしながら、従来の測定法はいくつかの問題点をか
かえている。すなわち、問題点の第１は、２つのドメイ
ンよりなるヒト・SLPIに対するポリクローナル抗体を用
いている点である。炎症症疾患においては、活性化され
た好中球から放出されるリソゾーム酵素である好中球エ
ラスターゼ，カテプシンＧによる自己組織損傷が問題で
ある。したがってそれら酵素に対するインヒビターの測
定に際しては、阻害活性部位を有するSLPI分子種を正確
に測定する必要がある。SLPIに分子は分子内で切断を受
けた分子種が生理的にも存在することが報告されている
が（Pulmonary Emphysema and Proteolysis,p297（198
6）Academic Press Inc.）、従来の方法ではSLPI全分子
を測定しているため、例えば、好中球エラスターゼ阻害
活性を有するＣ末端ドメインあるいはその一部分を欠失
した分子種も検出されることになる。従って測定すべき
好中球エラスターゼ阻害活性を有している分子種の量を
正確に検出することが困難であろう推定され、従来の方
法ではヒト・SLPIの炎症疾患における生理的意義を正確
に反映しえないことになる。

従って、ヒト・SLPIの好中球エラスターゼ阻害活性を
任うＣ末端ドメインポリペプチドに対する特異性が高
く、より高感度で測定できる免疫学的測定法が望まれて
いた。

（ニ）課題を解決するための手段そこで、本発明者らは、かかる従来技術の課題に鑑み
て、ヒト・SLPIのＣ末端ドメインポリペプチドを特異的
に認識する抗体を開発すべく鋭意検討した結果、ヒト・
SLPIのＣ末端ドメインのアミノ酸配列（Asn⁵⁵−Al
a¹⁰⁷）を有するペプチドを遺伝子工学手法を用いて合成
し（W089/06239）、これを抗原に用いることにより、ヒ
ト・SLPIのうち、Ｃ末端ドメインを有する分子種を特異
的に認識する抗体を提供することを可能とし本発明に到
達した。

すなわち本発明は下記式（Ｉ） NPTRRKPGKCPVTYGQCLMLNPPNFCEMDGQCKRDL KCCMGMCGKSCVSPVKA …（Ｉ）で表わされ、その分子中に存在すCysによって１〜４個
のジスルフィド結合を有し好中球エラスターゼ阻害活性
を有する、ヒト・SLPIのＣ末端ドメインポリペプチドを
特異的に認識する抗ヒト・SLPI抗体またはそのFab′若
しくはＦ（ab′）_２フラグメント、及び試料中のヒト・
SLPIまたはそのフラグメントの免疫学的測定方法におい
て、かかる抗ヒト・SLPI抗体またはそのFab′若しくは
Ｆ（ab′）_２フラグメントを用いることを特徴とするヒ
ト・SLPIまたはそのフラグメントの測定方法である。

ここで上記式（Ｉ）中、アルファベットはアミノ酸の
一文字略字を示し、Ａはアラニン,Cはシステイン,Dはア
スパラギン酸,Eはグルタミン酸,Fはフェニルアラニン,G
はグリシン,Kはリジン,Lはロイシン,Mはメチオニン,Nは
アスパラギン,Pはプロリン,Qはグルタミン,Rはアルギニ
ン,Sはセリン,Tはスレオニン,Vはバリン,Yはチロシンを
それぞれ意味する。

本発明の抗ヒト・SLPI抗体は、前記式（Ｉ）で表わさ
れるヒト・SLPIのＣ末端ドメインポリペプチドを抗原と
して得られる。

かかるヒト・SLPIのＣ末端ドメインポリペプチドは、
天然に存在するヒト・SLPIを分離精製し、それを酵素分
解すること等によって得ることができる。あるいは、前
述の如き遺伝子工学的手法（WO89/06239）によって得る
こともできるが、前記式（Ｉ）で表わされるヒト・SLPI
のＣ末端ドメインポリペプチドである限り、その由来は
問わない。

本発明の抗ヒト・SLPI抗体は、上記のような抗原を用
いて得られるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗
体である。

モノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタインに
よる細胞融合法（G.Khler and Milstein,Nature（Lon
don），256,495−497（1975））により作製されたハイ
ブリドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離す
ることにより調製される。すなわち、前記式（Ｉ）で表
わされるヒト・SLPIのＣ末端ドメインポリペプチドでマ
ウスを免疫した後、このマウスのリンパ球をマウス・ミ
エローマ細胞と融合させハイブリドーマを作製し、得ら
れたハイブリドーマをクローニングし、このクローン化
ハイブリドーマから抗ヒト・SLPIモノクローナル抗体を
分離する。

ポリクローナル抗体は通常行われている方法、たとえ
ば「日本生化学会編，続生化学実験講座,5巻,1−10頁，
東京化学同人,1986」記載の方法によって得られる。

免疫動物としては、特に限定されるものではないが、
山羊，ウサギ，モルモット，ラット，ウマ，ニワトリあ
るいはマウス等が挙げられる。

本発明においては、抗体の入手容易性，測定感度の点
から、ポリクローナル抗体が好ましい。また免疫動物と
してウサギが好ましい。

本発明のFab′若しくはＦ（ab′）_２フラグメントと
は、抗ヒト・SLPI抗体の抗原結合活性と免疫学的測定法
において支障のない範囲で同程度の活性を有するFab′
若しくはＦ（ab′）_２フラグメントの意であり、かかる
Fab′若しくはＦ（ab′）_２フラグメントは、上述のよ
うにして得られたポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体を公知の方法、例えば該抗体をペプシンで消化
切断の後分離してＦ（ab′）_２フラグメントとなすか、
更にＦ（ab′）_２フラグメントを還元処理することによ
ってFab′フラグメントとなすことにより得られる（A.N
isonoff et al.,Arch.Biochem.Biophys.,89,230（196
0）:P.Parham.,J.Immunol.,131,2895（1983）など）。

ところで、酵素阻害活性のうちでもポリペプチドに由
来する酵素阻害活性は、ポリペプチドの一時構造のみな
らずその高次構造も活性発現に必要な要件であることが
知られている。

従って、前記式（Ｉ）で表わされるヒト・SLPIのＣ末
端ドメインについても、その分子内に存在する複数のCy
sによって、分子内ジスルフィド結合し、その結果高次
構造を形成することが予想され、実際に本発明者らによ
ればスルホ化誘導体は分子内ジスルフィド結合したもの
に比べ、極めて弱いエラスターゼ阻害活性を有するにす
ぎなかったことが確認されている。

そこで、本発明の抗ヒト・SLPI抗体またはそれとFa
b′若しくはＦ（ab′）_２フラグメントとしては、抗原
として前記式（Ｉ）で表わされるヒト・SLPIのＣ末端ド
メインポリペプチドであって、そのスルホ化酸誘導体に
限定されず、分子内ジスルフィド結合してエラスターゼ
阻害活性を有するもの、あるいはヒト・SLPIのＣ末端ド
メインポリペプチドの部分ペプチドであってエラスター
ゼ阻害活性を有するものを用いて得られる抗体またはそ
れとFab′若しくはＦ（ab′）_２フラグメントも含まれ
る。なかでも本発明の抗ヒト・SLPI抗体またはそれとFa
b′若しくはＦ（ab′）_２フラグメントとしては、分子
内ジスルフィド結合によって高次構造を形成し、好中球
エラスターゼ阻害活性を有する抗原を用いて得られる抗
体等が炎症疾患等における測定意義の点から好ましい。

このようにして得られる本発明の抗ヒト・SLPI抗体等
のうちでも、ヒト・SLPIのＣ末端ドメインポリペプチド
でかつ分子内ジスルフィド結合による高次構造を認識す
るポリクローナル抗体は、ヒト・SLPIと同様に好中球エ
ラスターゼ阻害活性を有する血中インヒビターのα_１−
プロテイナーゼインヒビター及びα_２−マクログロブリ
ンは認識せず、特異的にヒト・SLPIまたはそのフラグメ
ントを認識するので、以下に述べる本発明の１つである
ヒト・SLPIまたはそのフラグメントの測定方法は、特に
血液および血液が存在する検体を用いる測定において、
エラスターゼ阻害活性測定法に比べて、特異的にヒト・
SLPIまたはそのフラグメントを測定できる点で優れてい
る。

本発明においては、前述の抗ヒト・SLPI抗体またはそ
れとFab′若しくはＦ（ab′）_２フラグメント（以下、
「抗体等」と略す）を用いて、試料中に存在するヒト・
SLPIまたはそのフラグメントを免疫学的に測定する方法
が提供される。免疫学的測定方法としては、例えば「酵
素免疫測定法」（第２版、石川栄治他著、医学書院198
2）などに記載されているそれ自体公知の方法、競合
法、サンドイッチ法等を用いることができる。

これらのなかでも本発明の免疫学的測定方法として
は、サンドイッチ法が好ましい。

サンドイッチ法の場合には、本発明の抗体等（第１抗
体）を適当な不溶性担体（例えばプラスチック容器）に
固定化する（以下これを“固定化抗体”という）。不溶
性担体としては、例えばポリスチレン，ポリエチレン，
ポリプロピレン，ポリエステル，ポリアクリロニトリ
ル，弗素樹脂，架橋デキストラン，ポリサッカライドな
どの高分子、その他紙，ガラス，金属，アガロース及び
これらの組合せなどを例示することができる。

また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状，球
状，繊維状，棒状，盤状，容器状，セル，試験管などの
種々の形状であることができる。ついで不溶性担体と測
定しようとする試薬または検体試料との非特異的結合を
避けるために適当な物質（例えば牛血清アルブミン）で
不溶性担体の表面を被覆する。

このようにして得られた第１抗体が固定化された不溶
性担体を検体試料と、一定時間及び温度で接触させ反応
させる。この間に固相抗体（第１抗体）と検体試料中の
ヒト・SLPIが結合する。測定する検体試料としては、ヒ
ト血漿，血清をはじめ喀痰，唾液，鼻汁，精液，子宮粘
液，涙，尿，汗，便などの体液，組織ホモジネート，肺
胞洗浄液などの臓器洗浄液などが挙げられる。また、実
験動物由来の上記生体試料を検体試料として用いること
もでき、その場合には、本発明の免疫学的測定法は医薬
品開発における前臨床評価の測定系としても使用でき
る。

ついで適当な洗浄液で洗った後、適当な標識物質（例
えば酵素）で標識した本発明の抗体等（第２抗体）の溶
液（例えば１％BSA,0.1％スキムミルクを含有する水溶
液）を、不溶性担体における固相抗体に結合したヒト・
SLPIと一定時間及び温度で接触させ第２抗体と反応させ
る。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上の
固相抗体とヒト・SLPIを介して結合して存在する第２抗
体に標識された標識物質の量を測定する。

洗浄液としては、各種界面活性剤、体液ないしはタン
パク液等を挙げることができる。例えばベタイン型，ス
ルホベタイン型，リン酸塩型の両性界面活性剤を好まし
く挙げることができる。好ましくはアンヒトールであ
り、洗浄液としてかかる界面活性剤を洗浄液中のその濃
度が１％（W/W）以下、例えばアンヒトールの場合0.0
5％含有せしめるのが好ましい。

ここで、標識抗体の標識物質としては、酵素，蛍光物
質，発光物質及び放射性物質等を使用するのが有利であ
る。酵素としては、ペルオキシダーゼ，アルカリフォス
ファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、蛍光物質とし
てはフルオレッセインイソチオシアネート，フイコビリ
プロテイン等、発光物質としてはイソルシノール，ルシ
ゲニン等、そして放射性物質としては¹²⁵I,¹³¹I,¹⁴C,³H
等を用いることができるが、これらは例示したものに限
らず、免疫学的測定法に使用し得るものであれば、他の
ものでも使用できる。

特に、標識物質が酵素である場合には、その活性を測
定するために基質、必要により発色剤が用いられる。

酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質
としてH₂O₂を用い、発色剤として2,2′−アジノジ−
［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウ
ム塩（ABTS）,5−アミノサリチル酸,O−フェニレンジア
ミン,4−アミノアンチピリン,3,3′,5,5′−テトラメチ
ルベンジジン等、酵素にアルカリフォスファターゼを用
いる場合は基質としてＯ−ニトロフェニルフォスフェー
ト等、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は
基質としてフルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド）,4−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド等を用いることができる。

なお上記反応は、固相抗体、標識抗体およびヒト・SL
PIを含有する検体試料を同時に混合し、一定時間及び温
度でこれら三者を同時に接触させて反応させることもで
きる。

かくしてその値から検体試料中のヒト・SLPIの量を算
出することができる。

以上はサンドイッチ法について述べたが、競合法にお
いても本発明の抗体またはそれと同時のフラグメントを
同様にして使用して検体試料中のヒト・SLPIの測定がで
きる。

また、本発明の抗体は、ヒト・SLPIのＣ末端ドメイン
ポリペプチドへの特異性が高いため、他の抗体との組
合せによって、従来報告されている抗ヒト・SLPIでは不
可能であった測定が可能となる。例えば組合せる抗体と
して、本発明と同様の手法で得られるヒト・SLPIのＮ末
端ドメインを認識する抗体を用いれば、試料中のヒト・
SLPIの分子種を選別定量できる。また、ヒト・SLPIのＮ
末端ドメインと複合体を形成するトリプシン様プロテア
ーゼ（例えば、膵トリプシン，トロンビン，プラスミ
ン，カリクレンなど）やＣ末端ドメインと複合体を形成
するキモトリプシン様プロテアーゼ（例えば、膵キモト
リプシン，膵エラスターゼ，好中球エラスターゼ，カテ
プシンG,キマーゼなど）の抗体を組合せることで、試料
中のヒト・SLPIと各プロテアーゼとの複合体の存在様式
を検出できる。

本発明のヒト・SLPIの免疫学的測定用の測定試薬は、
前述した固相抗体と、標識抗体とからなる。

また、本発明のヒト・SLPIの免疫学的測定用のキット
は、上記の測定試薬と、これら測定試薬を能率よく且つ
簡便に利用するための補助剤として、例えば固体状の試
薬または液状の検体を溶解させるための溶解剤、不溶性
担体の非特異的に結合した抗原，抗体を洗浄するために
使用される洗浄剤、及び酵素で標識化した抗体を用いる
場合には、酵素活性を測定するための基質及びその反応
停止剤、その他の免疫学的測定用のキットとして通常使
用されるものが挙げられる。

かくして得られる抗ヒト・SLPI・ポリクローナル抗体
及びそれとFab′若しくはＦ（ab′）_２フラグメント
は、免疫吸着剤として利用することによってヒト・SLPI
を精製することができる。例えば、本発明のポリクロー
ナル抗体をデキストランゲル，アガロースゲル，ポリビ
ニルゲル等の不溶性担体に結合させ、該ポリクローナル
抗体結合担体を免疫吸着剤として用い、カラムクロマト
グラフィーにより、ヒト・SLPIまたはそのフラグメント
であるペプチドを分離・精製することができる。不溶性
担体とポリクローナル抗体との結合は、通常の方法、例
えばブロムシアン法やエポキシ，アミノ，カルボキシ
ル、もしくはホリミル基等を介して結合させることがで
きる。このポリクローナル抗体結合担体を充填したカラ
ムに粗ヒト・SPL Iを添加し、カラムに吸着したヒト・S
LPIを通常の方法で溶出させることにより高純度のヒト
・SLPIが得られる。

また、本発明の抗ヒト・SLPI抗体、例えばポリクロー
ナル抗体は、直接標識するかあるいは標識した第２抗体
を用いて、免疫組織染色に使用できる。標識法として
は、蛍光物質，酵素，発光物質及び放射性物質等を使用
するのが有利である。

（ホ）発明の効果本発明の抗体は、好中球エラスターゼ阻害活性を担う
ヒト・SLPIのＣ末端ドメインポリペプチドに対して特異
的に結合する抗体及びそれとFab′若しくはＦ（ab′）
_２フラグメントである。従って、この抗体等を用いるこ
とにより、炎症性疾患、特に肺疾患の診断・治療に有用
なヒト・SLPIの免疫測定法の提供が可能となる。

さらに、本発明のポリクローナル抗体は、ヒト・SLPI
のＣ末端ドメインポリペプチドに対して特異的に結合す
るため、従来の方法に比較して炎症性疾患のより正確な
測定方法となる。

また本発明の抗体等によって免疫組織染色法におい
て、特異性高く、高感度でヒト・SLPIを検出でき、さら
にヒト・SLPIの分離精製にも利用でき、迅速に高純度の
ヒト・SLPIを得ることができる。

（ヘ）実施例以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこ
れら実施例に限定されるものではない。実施例中の％は
重量％を意味する。

実施例１ポリクローナル抗体の取得（１）抗原の作成本発明者らが、先に提案した遺伝子工学的方法（WO89
/06239）を用いて、ヒト・SLPIのＣ末端ドメインAsn⁵⁵
−Ala¹⁰⁷のヒト好中球エラスターゼ阻害活性を有するポ
リペプチドを抗原として作成した。

（２）抗体の作成上記ポリペプチドを初回500μg/shot、追加200μg/sh
otの量をフロイト完全アジュバンと混合して、家兎に免
疫した。２週間,3週間の間隔で３回免疫後、抗体価が上
昇したため採血し、抗血清をプロテインＡ・Sepharose
に通し、目的とする抗体を精製した。

実施例２測定系の構成（１）ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）
標識抗体の調製実施例１で得られたポリクローナル抗体の1.67mg/ml
のPBS溶液6mlに1Mのクエン酸緩衝液（pH3.7）300μと
200μｇのペプシン（Sigma社,P6887）を40μの同緩衝
液に溶解して加え、37℃,2時間反応させた。1NNaOHを50
0μ加えてpH6.4として、反応終了後100mM PB（pH6.
0）の緩衝液でトーソーG3000SWカラムを用いるゲル瀘過
HPLCにてＦ（ab′）_２画分を精製した。画分を限外過
濃縮後Ｆ（ab′）_２の1.95mg/ml 0.1MPB（pH6.0）溶液
1.54mlにMBS10mg/mlのジメチルホルムアミド溶液75μ
を添加し、30℃で30分間反応させ、0.1mM PB（pH6.0）
の緩衝液でトーソーG3000SWカラムを用いるゲル過HPL
Cにて未反応MBSと分離し、マレイミド化Ｆ（ab′）_２画
分を得た。

一方、HRPの10mg/mlの0.1MPB（pH6.5）溶液2mlにＳ−
アセチルメルカプト無水コハク酸の60mg/mlジメチルホ
ルムアミド溶液120μを加え、25℃で２時間反応させ
た。

次に0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）を800μ、0.
1MEDTA160μ、1Mヒドロキシルアミン1.6mlを加え、０
℃で４分間反応させた。その後、反応液をコロジオンバ
ッグに入れ、0.1MPB（pH6.0）、5mMEDTA含有溶液を用い
て、４℃で３日間透析し、チオール化HRPを得た。

次にマレイミド化Ｆ（ab′）₂3mgとチオール化HRP6mg
とを0.1MPB（pH7.2）中で混合し、氷冷下で限外過を
用いて10mlから300μまで濃縮し、４℃で21時間反応
させ、0.1MPB（pH7.2）の緩衝液でトーソーG3000SWカラ
ムを用いるゲル過HPLCにてHRP標識抗体を2.83mg得
た。

（２）抗体固定化プレートの調製ポリスチレン96穴プレート（住友ベークライト社製）
に、実施例１で得られた抗体の20μg/mlの濃度の10mMリ
ン酸緩衝液（pH7.2）を50μ／ウエルずつ分注し、37
℃で１時間放置したのち10mMPBS（pH7.2）で洗浄し、１
％牛血清アルブミン（BSA）の10mMPBS（pH7.2）溶液を1
50μ／ウエルずつ分注し、37℃で１時間放置してポス
トコーティング処理して、抗体固定化プレートを得た。

（３）測定系の構成実施例２−（１），（２）で調製した、HRP標識抗体
（Ｆ（ab′）_２）及び抗体固定化プレートと、精製した
ヒト・SLPIのＣ末端ドメイン（Asn⁵⁵−Ala¹⁰⁷）ポリペ
プチド（標準物質）を０〜10ng/mlの範囲で含有する１
％BSAと0.1％スキムミルクを含有10mMPBS（pH7.2）溶液
50μとを、抗体固定化プレートのウエルに添加して、
37℃の温度で１時間インキュベートした。次に各ウエル
内の溶液を吸引除去した後、0.05％アンヒトール含有
10M PBS（pH7.2）で洗浄してから、3,3′,5,5′−テト
ラメチルベンジジン塩酸塩0.02％あるいはH₂O₂2.5mMを
含有する0.1Mリン酸／クエン酸緩衝液（pH4.3）を50μ
ずつ各ウエルに加え、25℃の温度で15分間反応させた
後、反応停止剤として1N硫酸水溶液を50μずつ加えて
酵素反応を停止させた、次いで、この溶液を分光光度計
を用いて450nmの波長における吸収強度を測定し、これ
を標準物質濃度０〜10ng/mlに対応してプロットするこ
とにより濃度依存性の高い検量線を得た。検量線を第１
図に示す。

実施例３特異性の検討実施例２によって確立した測定系を用いて血中インヒ
ビターα_１−プロティナーゼ・インヒビター（α_１−P
I）およびα_２−マクログロブリン（α_２−Ｍ）に対す
る反応性を調べ、その結果を第１表に示した。

第１表のごとく、血中インヒビターα_１−PIおよびα
_２−Ｍは好中球エラスターゼ阻害活性を有するにもかか
わらず、本測定系では反応しなかった。この結果より本
測定法はヒト・SLPIに特異性の高い測定系である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の抗ヒト・SLPI抗体を用いて得られたヒ
ト・SLPI測定用の検量線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/563 Ｇ０１Ｎ 33/563 (72)発明者石井孝司東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内 (72)発明者細田健治東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内 (72)発明者窪田貴明東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内 (72)発明者本田仁美東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内 (56)参考文献Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ，129 ｐ959−963（1984) ＦＥＢＳＬｅｔｔ． 199，１，ｐ 43−48（1986)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式（Ｉ） NPTRRKPGKCPVTYGQCLMLNPPNFCEMDGQCKRDL KCCMGMCGKSCVSPVKA …（Ｉ）で表わされ、その分子中に存在すCysによって１〜４個
のジスルフィド結合を有し好中球エラスターゼ阻害活性
を有する、ヒト・SLPIのＣ末端ドメインポリペプチドを
特異的に認識する抗ヒト・SLPI抗体またはそのFab′若
しくはＦ（ab′）_２フラグメント。
【請求項２】抗体がポリクロナール抗体である請求項１
に記載の抗ヒト・SLPI抗体またはそのFab′若しくはＦ
（ab′）_２フラグメント。
【請求項３】試料中のヒト・SLPIまたはそのフラグメン
トの免疫学的測定方法において、抗ヒト・SLPI抗体とし
て請求項１に記載の抗ヒト・SLPI抗体またはそのFab′
若しくはＦ（ab′）_２フラグメントを用いることを特徴
とするヒト・SLPIまたはそのフラグメントの測定方法。
【請求項４】免疫学的測定方法がサンドイッチ法であっ
て、かつ標識抗体および固相抗体に請求項１記載の抗ヒ
ト・SLPI抗体またはそのFab′若くはＦ（ab′）_２フラ
グメントを用いることを特徴とする請求項３に記載の測
定方法。