JP2002000273A - プロテインｃインヒビターと肝細胞増殖因子アクチベーターとの複合体およびその測定方法並びに臓器障害の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 臓器障害の状態を測定する方法を提供する。 【解決手段】 臓器障害の患者から採取された生体試料
中のプロテインＣインヒビターと肝細胞増殖因子アクチ
ベーターとの複合体を、臓器障害の状態の指標として測
定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臓器障害に関連す
る新規複合体、その測定法および測定キットに関する。
また、臓器障害の検出方法に関する。さらに、新規複合
体に対するモノクローナル抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】腎臓、肝臓、心臓、肺等の臓器や血管等
の組織の修復・再生を目指す医療が臓器移植などの再生
医療を中心に普及しつつある。この臓器移植や障害臓器
を対象とした治療においては、その治療の有効性の評
価、すなわち移植あるいは治療した臓器の再生の状態を
正確に診断する検査法の確立が重要である。こうした検
査法において、従来、臓器からの穿刺吸引による細胞診
断が実施されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の臓器か
らの穿刺吸引による細胞診断は侵襲的で苦痛を伴う。ま
た従来のその他の、臓器の機能を診断する検査法（臓器
固有の酵素の活性や代謝機能の測定、臓器の死細胞から
遊離する酵素や代謝産物の測定から関係臓器の状態を類
推する方法等）の感度や特異性は必ずしも充分でない。
そのため、鋭敏で特異性が高く、採取が容易な血液検体
を用いることのできる、臓器再生状況等の臓器の状態の
測定方法の開発が望まれる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、生体内に
種々存在して、タンパク質、ペプチド中のペプチド結合
を加水分解する機能を有するタンパク質すなわちプロテ
アーゼやその活性を抑制するタンパク質であるプロテア
ーゼインヒビターに焦点をあて、臓器や組織の修復・再
生時におけるそれらの血中濃度に関して検討を行った。

【０００５】具体的には生体内に存在する各種プロテア
ーゼまたはプロテアーゼインヒビターを免疫抗原として
用い、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモ
ット、ニワトリ等の動物に対して通常行われる免疫操作
を実施してポリクローナル抗体またはモノクローナル抗
体を作成した。次にこの得られた各種抗体を組み合わ
せ、２抗体サンドイッチ法を用いた酵素標識抗体測定法
（enzyme-linked immunosorbent assay；以下ＥＬＩＳ
Ａと略する）を用い、種々の臓器障害の患者の血液（血
漿または血清）における反応性を解析した。すなわち
（１）各種プロテアーゼまたはプロテアーゼインヒビタ
ーに対する抗体の固相プレートへの個別の吸着（２）固
相の過剰なタンパク結合部位のブロッキングと洗浄
（３）固相プレートに吸着させた抗体と各種ヒト血液
（血漿または血清）との反応および洗浄（４）各種プロ
テアーゼまたはプロテアーゼインヒビターに対する抗体
を西洋ワサビペルオキシダーゼ等で酵素標識した標識抗
体の反応（５）未反応標識抗体の除去と洗浄（６）酵素
標識抗体と酵素基質による酵素（発色）反応（７）吸光
操作を実施し、種々の臓器障害にあって臓器再生中の患
者の血液と反応するプロテアーゼおよびプロテアーゼイ
ンヒビターに対する抗体およびその組合せを探した。

【０００６】その結果、驚いたことに、血液凝固・線溶
系に関与するプロテアーゼインヒビターの１つであるプ
ロテインＣインヒビター（以下ＰＣＩと略す）に対する
抗体とセリンプロテアーゼの一種である肝細胞増殖因子
アクチベーター（HepatocyteGrowth Factor Activato
r、以下ＨＧＦＡと略す）に対する抗体との組合せが臓
器障害の患者の血液、例えば肝臓や腎臓の手術後の患者
の血液と強く反応性を有すること、そして、ＰＣＩとＨ
ＧＦＡが複合体を形成し、その量が臓器障害の患者の血
液で著しく増加することを初めて見出すに至った。

【０００７】本発明は、上記の知見に基づいてなされた
ものであり、以下のものを提供する。 １．ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体。

【０００８】２．ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を測定す
る方法であって、（１）ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を
認識する抗体、および、ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体中
のＰＣＩを認識する抗体のいずれか又は両方を含む試薬
を検体中のＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体と反応させ、免
疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離し
た後、免疫反応物中のＨＧＦＡを認識する標識抗体と反
応させる工程、及び（３）免疫反応物に結合した標識抗
体を測定する工程を含む方法。

【０００９】３．ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を測定す
る方法であって、（１）ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を
認識する抗体、および、ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体中
のＨＧＦＡを認識する抗体のいずれか又は両方を含む試
薬を検体中のＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体と反応させ、
免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離
した後、免疫反応物中のＰＣＩを認識する標識抗体と反
応させる工程、及び（３）免疫反応物に結合した標識抗
体を測定する工程を含む方法。

【００１０】４．ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体をＰＣＩ
とＨＧＦＡとの複合体に対する抗体と反応させることを
含む、ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を測定する方法。

【００１１】５．検体が、臓器障害の患者から採取され
た生体試料である上記２〜４のいずれかに記載の方法。

【００１２】６．ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を認識す
る抗体、および、ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体中のＰＣ
Ｉを認識する抗体の少なくとも一つである第１の抗体
と、第１の抗体およびＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体の反
応により生成する免疫反応物中のＨＧＦＡを認識する第
２の抗体とを含む、ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体の測定
キット。

【００１３】７．ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を認識す
る抗体、および、ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体中のＨＧ
ＦＡを認識する抗体の少なくとも一つである第１の抗体
と、第１の抗体およびＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体の反
応により生成する免疫反応物中のＰＣＩを認識する第２
の抗体とを含む、ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体の測定キ
ット。

【００１４】８．ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を認識す
る抗体を含む、ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体の測定キッ
ト。

【００１５】９．上記２〜４のいずれかに記載の方法に
よりＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を測定し、測定された
結果に基づき臓器障害を検出することを含む、臓器障害
の検出方法。

【００１６】１０．ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を認識
するモノクローナル抗体。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。

【００１８】＜１＞ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体 ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体（以下、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ
複合体ともいう）を形成するＰＣＩおよびＨＧＦＡは特
に限定されず、例えば、天然に存在する形態のものでよ
い。

【００１９】ＰＣＩは分子量約57,000（57kDa）の一本
鎖糖蛋白質で、主に活性化されたプロテインＣ（Activa
ted protein C、以下ＡＰＣと略す）に対して分子比が
１対１のアシル結合複合体を形成することによりその活
性を阻害することが知られている。またＰＣＩはＡＰＣ
以外にも、トロンビン、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、カ
リクレイン、ウロキナーゼ、組織中プラスミノーゲン活
性化因子も阻害すること報告されており（鈴木, Method
s in Enzymology, 222, 385-399, 1993）、血液・尿・
精漿・滑液等に広く存在することから血液凝固系の制御
のみならず、多彩な生理機能があると考えられている。

【００２０】ＨＧＦＡはセリンプロテアーゼの一種で分
子量約98,000（以下98kDa HGFAと示す）を示すものとそ
のＮ末端から数えたアミノ酸残基数で372番目のアルギ
ニンと373番目のバリン間で限定分解をうけたＣ末端側
のペプチドである分子量約34,000（以下34kDa HGFAと略
す）を示すものが存在することが知られている。各ＨＧ
ＦＡは98kDa HGFAのＮ末端から数えたアミノ酸残基数で
407番目のアルギニンと408番目のイソロイシン間で限定
分解を受けることにより活性化しセリンプロテアーゼと
しての活性を有する。活性化したＨＧＦＡは増殖因子の
一種として知られている肝細胞増殖因子（Hepatocyte G
rowth Factor；以下ＨＧＦと略す）に作用してこれを特
異的に活性化させることが知られている（下村ら, The
Journal of Biological Chemistry, 268, 22972-22932,
1993）。

【００２１】ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体は、ＰＣＩおよび
ＨＧＦＡを適切な溶液中で混合し、両方を反応させるこ
とで得ることができる。溶液としては、生理的リン酸緩
衝水溶液が挙げられる。混合の条件は、通常には、ＨＧ
ＦＡが１０〜１００μｇ／ｍｌ、ＰＣＩが１０〜１００
０μｇ／ｍｌの濃度で、ＨＧＦＡとＰＣＩの比はモル比
で１：１〜１：１０である。反応の温度および時間は、
通常には、２０〜４０℃で０．５〜６時間である。

【００２２】ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体は、臓器の障害に
続く再生時に生成され、従って臓器傷害の特異的マーカ
ーとして極めて有用である。また、ＨＧＦＡ−ＰＣＩの
測定における標準物質または競合イムノアッセイにおけ
る標識抗原として使用できる。

【００２３】＜２＞ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の測定方法 ＰＣＩまたはＨＧＦＡまたはＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を
認識する抗体を使用して、生体試料中のＨＧＦＡ−ＰＣ
Ｉ複合体を定性または定量的に測定することが可能であ
る。その方法としては、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を検出
する目的であれば特に限定されない。例えば、酵素免疫
測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、
化学発光免疫測定法、イムノブロッティング法、イムノ
クロマト法、ラテックス凝集法などが挙げられる。また
本発明で使用する抗体はそのまま用いてもよいし、定法
によりＦａｂまたはＦ（ａｂ'）₂化した形態の抗体を用
いてもよい。なお、本明細書において、抗体が「認識す
る」とは、抗体が特異的に結合することを意味する。

【００２４】このような方法として具体的には、（１）
ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を認識する抗体、および、
ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体中のＰＣＩを認識する抗体
のいずれか又は両方を含む試薬を検体中のＰＣＩとＨＧ
ＦＡとの複合体と反応させ、免疫反応物を生成させる工
程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中のＨ
ＧＦＡを認識する標識抗体と反応させる工程、及び
（３）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を
含む、または、（１）ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体を認
識する抗体、および、ＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体中の
ＨＧＦＡを認識する抗体のいずれか又は両方を含む試薬
を検体中のＰＣＩとＨＧＦＡとの複合体と反応させ、免
疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離し
た後、免疫反応物中のＰＣＩを認識する標識抗体と反応
させる工程、及び（３）免疫反応物に結合した標識抗体
を測定する工程を含む、２抗体サンドイッチ法が挙げら
れる。

【００２５】以下、２抗体サンドイッチ法を用いたＥＬ
ＩＳＡ法を例として説明するが、標識が酵素に限定され
るものではない。

【００２６】まずマイクロタイターウェルやマイクロ磁
気ビーズなどの固相に対してＨＧＦＡまたはＰＣＩまた
はＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認識するポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体を定法により固定化する。
次にこの抗体固定化表面の過剰なタンパク結合部位をウ
シ血清アルブミンまたはスキムミルクまたはゼラチン等
でブロッキングする。この後、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体
を含む可能性のある検体を添加して固相上で免疫反応物
を形成させた後に洗浄する。固相に抗ＰＣＩポリクロー
ナル抗体またはモノクローナル抗体を使用した場合、次
に免疫反応物中のＨＧＦＡまたはＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合
体を認識する標識ポリクローナル抗体または標識モノク
ローナル抗体を添加して反応させる。固相に抗ＨＧＦＡ
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用し
た場合、次に免疫反応物中のＰＣＩまたはＨＧＦＡ−Ｐ
ＣＩ複合体を認識する標識ポリクローナル抗体または標
識モノクローナル抗体を添加して反応させる。固相に抗
ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体ポリクローナル抗体またはモノ
クローナル抗体を使用した場合、次に免疫反応物中のＰ
ＣＩまたはＨＧＦＡまたはＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認
識する標識ポリクローナル抗体または標識モノクローナ
ル抗体を添加して反応させる。さらに洗浄後、免疫反応
物に結合した標識抗体を定量することにより、生体中の
ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体量を測定することが出来る。こ
こで使用するポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体の標識とはアルカリホスファターゼ、西洋わさびペ
ルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、
グルコースオキシダーゼなどの酵素でもよいしフルオレ
ッセイン誘導体やローダミン誘導体などの蛍光物質でも
よい。またアクリジニウムエステル等の化学発光物質で
あってもよいし¹²⁵Ｉなどのラジオアイソトープでもよ
い。すなわち発色、蛍光、化学発光、放射活性等により
測定可能な標識であればよい。

【００２７】ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を検出する検体は
特に限定されず、血清、血漿、尿、漿液、髄液、細胞組
織の抽出液等の生体試料のいずれも適切な前処理を必要
により行うことによって使用可能である。特にＨＧＦＡ
−ＰＣＩ複合体は腎臓、肝臓、心臓、肺等の臓器や血管
等の組織の修復・再生中の患者血液中で増加するので、
血液や、血清、血漿等の血液由来画分が検体として好ま
しい。

【００２８】また、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認識する
抗体を用いる場合は、２抗体サンドイッチ法に限定され
ない。すなわち、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体をＨＧＦＡ−
ＰＣＩ複合体に対する抗体と反応させることを含む方法
であればよい。このような方法としては、競合法として
知られるものがあり、例えば、一定量の抗体と一定量の
標識したＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を、測定すべきＨＧＦ
Ａ−ＰＣＩ複合体と共存させ、共存した測定すべきＨＧ
ＦＡ−ＰＣＩ複合体による、抗体と結合する標識したＨ
ＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の量の減少を指標として測定すべ
きＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を定量する方法や、標識した
抗体を、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を固定化した固相へ結
合させる際に、測定すべきＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体と共
存させ、共存した測定すべきＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体に
よる、固相と結合する標識した抗体の量の減少を指標と
して測定すべきＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を定量する方法
などが挙げられる。

【００２９】ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体またはこの複合体
中のＨＧＦＡもしくはＰＣＩを認識する抗体は、ＨＧＦ
ＡまたはＰＣＩまたはＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を抗原と
して使用し、通常行われる免疫学的方法で取得すればよ
い。また特開平11-124399に記載された活性型プロテイ
ンＣ（ＡＰＣ）とＰＣＩの複合体を抗原として使用する
ことも出来る。ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の作成は上述の
通りである。免疫に使用する動物は特に限定されないが
ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、
ニワトリ等はいずれも使用できる。抗原の接種は皮下、
筋肉内、腹腔内に完全フロイントアジュバントや不完全
フロイトアジュバントとよく混和して行う。投与は２〜
５週間ごとに実施し、抗原に対する免疫動物の抗体価が
充分に上昇するまで続ける。この後、免疫動物に対して
抗原のみの静脈注射を行い３〜７日後に血清を取得す
る。モノクローナル抗体を取得する際は、免疫を行った
動物より抗体産生細胞を含むと考えられる脾臓またはリ
ンパ節を採取し、この脾臓細胞またはリンパ細胞と腫瘍
細胞との細胞融合を行う。この後、細胞融合して不死化
した抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を単離する。ここ
で使用する腫瘍細胞は一般的に免疫を行った動物から調
製される脾臓細胞またはリンパ細胞と同一種のものであ
ることが望ましいが、異種動物のものでも可能である。
例えば腫瘍細胞としてｐ３（p3/x63-Ag8）、P3-U1、NS-
1、MPC-11、SP2/0、FO、x63.6.5.3、S194、R210等の骨
髄腫細胞が使用される。細胞融合は一般に行われている
方法、例えば「単クローン抗体実験マニュアル」（講談
社サイエンティフィック 1987年出版）に記載の方法に
従って実施すればよい。細胞融合促進剤としてはセンダ
イウイルスや平均分子量1000〜6000のポリエチレングリ
コールなどが挙げられる。この際、更に融合効率を高め
るためにジメチルスルホキシド等の補助剤やＩＬ−６等
のサイトカインを添加することも出来る。免疫を行った
脾臓細胞またはリンパ細胞に対する腫瘍細胞の混合比
は、例えば腫瘍細胞に対し、脾臓細胞またはリンパ細胞
を約１〜１０倍程度用いればよい。上記融合培地として
はERDF培地、RPMI-1640培地、MEM培地等の通常の各種培
地を使用することが出来、融合時は通常、牛胎児血清
（ＦＣＳ）等の血清を抜いておくのがよい。融合は上記
の免疫を行った脾臓細胞またはリンパ細胞と腫瘍細胞と
の所定量を上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に
加温しておいたポリエチレングリコール溶液を２０〜５
０％程度加え、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分程
度反応させることによって実施する。以降、適当な培地
を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰り返
す。目的とするハイブリドーマは通常の選択培地、例え
ばＨＡＴ培地（ヒポキチンサン、アミノプテリン及びチ
ミジンを含む培地）で培養する。このＨＡＴ培地での培
養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細
胞等）が死滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間行
えばよい。さらに得られたハイブリドーマの選別は、Ｈ
ＧＦＡまたはＰＣＩまたはＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認
識する抗体産生を種々の免疫化学的方法で解析すること
により可能である。例えばＨＧＦＡまたはＰＣＩまたは
ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を抗原としてハイブリドーマ培
養上清中に分泌される抗体との結合をＥＬＩＳＡ法等の
酵素免疫測法（Enzyme Immunoassay、以下ＥＩＡ法と略
す）、ウエスタンブロッティング法などで解析し、目的
とするＨＧＦＡまたはＰＣＩまたはＨＧＦＡ−ＰＣＩ複
合体を認識する抗体を分泌しているハイブリドーマを選
択することが出来る。この様な方法で目的とする抗体産
生能を確認した後、例えば限界希釈法により単一のモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを得
ることが出来る。このハイブリドーマクローンは、あら
かじめＦＣＳ中に含まれるウシ抗体（ＩｇＧ）を除いた
ＦＢＳを１〜５％程度加えた培地を用いて培養を行い、
得られた培養上清を目的のモノクローナル抗体を精製す
る原料とする。あるいは得られたハイブリドーマクロー
ンをあらかじめプリステンを投与したBalb/Cマウスまた
はBalb/c(nu/nu)マウスの腹腔内に移植し、１０〜１４
日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取
し、目的のモノクローナル抗体を精製する原料としても
よい。先の方法によって調製した抗血清よりＨＧＦＡま
たはＰＣＩまたはＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認識するポ
リクローナル抗体を精製したり、ハイブリドーマの培養
上清またはその腹水よりモノクローナル抗体を精製した
りする際は通常の免疫グロブリン精製法を用いればよ
く、例えば、硫安分画法、ポリエチレン分画法、エタノ
ール分画法、陰イオン交換クロマトグラフィー、プロテ
インＡまたはプロテインＧが結合したアフィニティーク
ロマトグラフィー等により実施することが出来る。

【００３０】上記のように取得された抗体の中から、２
抗体サンドイッチ法に用いるのに適した２抗体を選択す
ることは当業者に容易である。

【００３１】ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の測定結果は、臓
器障害の状態の指標として利用できる。

【００３２】＜３＞ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の測定キッ
ト ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の測定キット（本発明測定キッ
ト）は、上記のＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の測定方法に使
用できるものであり、その態様としては以下の抗体を含
むものが挙げられる。

【００３３】（１）ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認識する
抗体、および、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体中のＰＣＩを認
識する抗体の少なくとも一つである第１の抗体と、第１
の抗体およびＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の反応により生成
する免疫反応物中のＨＧＦＡを認識する第２の抗体とを
含む測定キット。

【００３４】（２）ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認識する
抗体、および、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体中のＨＧＦＡを
認識する抗体の少なくとも一つである第１の抗体と、第
１の抗体およびＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の反応により生
成する免疫反応物中のＰＣＩを認識する第２の抗体とを
含む測定キット。

【００３５】（３）ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認識する
抗体を含む測定キット。

【００３６】各抗体は、上記のＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体
の測定方法に関して説明した通りである。

【００３７】本発明測定キットは、上記の抗体の他、標
識抗体、標準抗原（ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体）、酵素、
基質などをさらに含んでもよい。使用する抗体と酵素が
同時に含まれる場合には両者が結合した状態でもよい
し、使用する抗体を認識する酵素標識抗体を用いてもよ
い。また測定の都合により、適切な抗原希釈液、反応希
釈液、基質溶液、反応停止液等が含まれていてもよい。

【００３８】＜４＞細胞障害の検出方法 細胞障害の検出方法（本発明検出法）は、上記のＨＧＦ
Ａ−ＰＣＩ複合体の測定方法によりＨＧＦＡ−ＰＣＩ複
合体を測定し、測定された結果に基づき臓器障害を検出
することを含む。

【００３９】ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体は、臓器や組織の
修復・再生の指標であるため、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体
の測定結果に基づいて臓器障害を検出できる。測定結果
に基づく臓器障害の検出は、健常人で得られる測定結果
と比較することによって行うことができる。

【００４０】本発明において、臓器障害とは、臓器切
除、臓器炎症、臓器移植等の、臓器や組織の修復・再生
をその後に伴う疾患を意味する。

【００４１】本発明検出法は、特にＨＧＦＡ−ＰＣＩ複
合体は腎臓、肝臓、心臓、肺等の臓器や血管等の組織の
修復・再生中の患者血液中で増加するので、これらに関
連する臓器障害の検出に有利に用いることができる。

【００４２】＜５＞ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認識する
モノクローナル抗体 ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を認識するモノクローナル抗体
は、上記のＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の測定方法、本発明
測定キットおよび本発明検出法に使用できる。この抗体
は、上記の測定方法について説明したようにして取得す
ることができる。

【００４３】

【実施例】以下に実施例を挙げ本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４４】

【調製例１】 ＰＣＩの精製およびＨＧＦＡ（34kDa HG
FAおよび98kDa HGFA）の精製 ＰＣＩの精製は、鈴木らの文献（The Journal of Biolo
gical Chemistry, 258, 163-168, 1983）に従って行っ
た。ヒト新鮮血漿４Lに、塩酸ベンズアミジン（10m
M）、ジイソプロピルフルオロリン酸(DFP)（1mM）、フ
ェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)（1mM）およ
び大豆トリプシンインヒビター（50mg/L）を加え、１Ｍ
の塩化バリウムを320ml滴下した。混合液を１時間攪拌
後、5000rpm/minで30分間遠心し、上清を採取し、固形
ポリエチレングリコール（PEG6000）を60g/Lになるよう
に加えた。１時間攪拌後、5000rpm/minで30分間遠心
し、沈殿を除去した。上清にはさらに固形ポリエチレン
グリコール（PEG6000）を60g/Lになるように加え、１時
間攪拌後、5000rpm/minで30分間遠心して沈殿を採取し
た。この沈殿に0.1Mの塩化アンモニウム、10mMの塩酸ベ
ンズアミジン、1mMのDFPおよび1mMのPMSFを含む0.05Mの
トリス塩酸緩衝液（pH7.5）を加えて溶解した。同一の
緩衝液で平衡化したDEAE-セファロースCL-6Bカラムにか
け素通り画分を採取した。採取液に硫酸アンモニウム粉
末を加え50%飽和とし、１時間攪拌後、8000rpm/minで15
分間遠心し、沈殿を採取した。この沈殿に0.1Mの塩化ア
ンモニウム、10mMの塩酸ベンズアミジン、1mMのDFPおよ
び1mMのPMSFを含む0.05Mのトリス塩酸緩衝液（pH6.0）
を加えて溶解し、同一緩衝液に対して透析した。この試
料をデキストラン硫酸アガロースカラムにかけてＰＣＩ
画分を回収し、この画分に対して硫酸アンモニウム粉末
を加えて80%飽和とした。10000rpm/minで15分間遠心し
て沈殿を採取して、溶解可能な最小容量の、0.15Mの塩
化ナトリウムを含む0.05Mのトリス塩酸緩衝液（pH7.5）
に溶解した後、Ultrogel AcA44カラムにかけ、PCI画分
を集めて0.05Mのトリス塩酸緩衝液（pH9.0）に対して透
析した。その後DEAE-セファロースCL-6Bにかけ精製ＰＣ
Ｉ画分を得た。

【００４５】ＨＧＦＡの精製は、下村らの文献（The Jo
urnal of Biological Chemistry, 268, 22927-22932, 1
993）に従って行った。10mM EDTA, 10mMベンズアミジ
ン、100μMナファモスタットメシレート、0.1mg/L大豆
トリプシンインヒビター、1000KIU/mlアプロチニンを含
むプロテアーゼインヒビターを添加した状態で取得した
ヒト血漿４Lを蒸留水で３倍に希釈した後、50mM NaClを
含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化し
たヘパリン-セファロースCL-6Bカラムにかけた。10mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中の50mMから700mMのNa
Clの直線勾配で溶出し、HGFA画分（100-250mM NaCl画
分）を回収した。回収した画分と等容量の2M硫酸アンモ
ニウム溶液を添加後、2M硫酸アンモニウム溶液で平衡化
したフェニル-セファロースCL-6Bカラムにかけた。この
後１Mから0Mまでの硫酸アンモニウム濃度を減少させた
直線勾配で溶出し、HGFA画分（400-100mM NaCl画分）を
回収した。得られた画分は150mM NaClを含む10mMのトリ
ス塩酸緩衝液（pH8.0）に対して透析後、A6モノクロー
ナル抗体アフィニティカラムにかけ、50mMグリシン-HCl
(pH3.0)緩衝液で溶出を行った。得られたHGFA画分は100
mM NaClおよび0.05%CHAPSを含む10mMリン酸ナトリウム
緩衝液（pH7.3）に置換した後、一部はＨＧＦＡに対す
る重量比で1/100量のプラズマカリクレインおよびトロ
ンビンを添加し37℃下で充分反応させた。また一部はＨ
ＧＦＡに対する重量比で1/100量のトロンビンのみを添
加し37℃下で充分反応させた。反応させた画分について
は、再度A6モノクローナル抗体アフィニティーカラムに
て精製後、100mM NaClおよび0.05%CHAPSを含む10mMリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.3）で平衡化したGS520カラム
を使用したHPLC操作を実施し、精製34kDa HGFAおよび精
製98kDa HGFAを得た。

【００４６】

【実施例１】 ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の形成とその検
出 調製例１で調製した分子量約57kDaを示すＰＣＩおよび
ＨＧＦＡ（34kDa HGFAまたは98kDa HGFA）を150mM NaCl
を含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中で混合
し（ＰＣＩ濃度：100μg/ml、ＨＧＦＡ濃度：100μg/m
l）、37℃で30分間反応させた後、非還元下のSDS-PAGE
にて解析を行った結果、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体を示す
約91kDa複合体（34kDa HGFA−ＰＣＩ複合体）及び約155
kDa複合体（98kDa HGFA−ＰＣＩ複合体）が検出され
た。さらにＰＣＩがＨＧＦＡに対してＨＧＦＡ−ＰＣＩ
複合体を形成することによりＨＧＦＡ活性を阻害してい
ることを確認するために、上記操作でＰＣＩおよびＨＧ
ＦＡ（34kDa HGFAまたは98kDaHGFA）を混合して37℃下
で反応させる際、経時的にそのＨＧＦＡ活性を解析した
結果、ＰＣＩ添加により34kDa HGFAおよび98kDa HGFAの
活性が抑制されることが解った（図１）。ＨＧＦＡ活性
は、合成基質（Ac-AKTKQLR(配列番号１)-MCA）を用い
て、分解反応により生じたＡＭＣ（7-アミノ-4-メチル
クマリン）量を励起波長380 nm、蛍光波長460 nmの条件
で測定することにより測定した。

【００４７】

【実施例２】 抗ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体モノクローナ
ル抗体および標識抗ＨＧＦＡポリクローナル抗体の調製 実施例１で作成したＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体100μg（34
kDa HGFA−ＰＣＩ複合体及び98kDa HGFA−ＰＣＩ複合体
の各50μgの混合物）を含む溶液を同容量のフロイント
完全アジュバントとともに、Balb/cマウスの腹腔内に２
週間間隔で５回投与した。マウスの血清中に抗体が産生
していることを確認後、100μgのＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合
体を含む溶液を尾静脈内に投与した。３日後に脾臓を取
り出し、「単クローン抗体実験マニュアル」（講談社サ
イエンティフィック 1987年出版）に従い、ポリエチレ
ングリコール1500を使用して脾臓細胞をミエローマ細胞
P3U1と細胞融合させた。その後、ＨＧＦＡ−ＰＣＩを抗
原として、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを実施し、34
kDa HGFA−ＰＣＩ複合体及び98kDa HGFA−ＰＣＩ複合体
の両方に特異的に反応するモノクローナル抗体を得た。

【００４８】またＨＧＦＡに対するポリクローナル抗体
は調製例１で調製した精製34kDa HGFAおよび精製98kDa
HGFAを各100μg混合し、抗原としてウサギ皮下へ２週間
間隔で５回投与した。血清中に抗体が産生していること
を確認後、100μgの抗原を脈内に投与し、３日後に抗血
清を取得してさらに定法の精製操作により抗ＨＧＦＡポ
リクローナル抗体を作成した。次に得られた抗ＨＧＦＡ
ポリクローナル抗体を「免疫生化学研究法」（１９８６
年出版 日本生化学会編集 東京化学同人出版）107-11
2頁に従いペルオキシダーゼ標識することにより標識抗
ＨＧＦＡポリクローナル抗体を調製した。

【００４９】

【実施例３】 ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の形成とその測
定系の構築 実施例２で作成した抗ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体モノクロ
ーナル抗体を3μg/mlの濃度になるように0.1M炭酸−重
炭酸緩衝液（ｐＨ9.3）に溶解して一次抗体溶液を調製
した。一次抗体溶液を９６ウェルプレートのウェルに添
加し、４℃にて一昼夜（12時間程度以上）おいた。この
ようにして得られた一次抗体付着プレートより一次抗体
溶液を除き、５% BSAを含むPBS(-)をウェルに添加して
４℃にて一昼夜（12時間程度）または37℃にて２時間以
上おくことによりブロッキングを行った。

【００５０】次に、200nMの、調製例１で作成した34kDa
-HGFAまたは98kDa-HGFAを、種々の濃度の、調製例１で
作成したＰＣＩと、100mM NaCl, 2mM CaCl₂および0.05%
CHAPSを含む50mM HEPES緩衝液中で３７℃下２時間反応
させた後、先にブロッキングを行ったプレートからブロ
ッキング溶液を除いたウェルに添加し、３７℃下で２時
間反応させた。次に0.05% Tween 20を含むPBS(-)液（以
下PBST液と略す）を用いて洗浄を行なった後、実施例２
で作成した標識抗ＨＧＦＡポリクローナル抗体１μg/ml
および１％BSAを含むPBS(-)をウェルに添加し、さらに
３７℃で１時間反応させた。再びPBST液で洗浄操作を行
った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sig
ma社P-9029）および0.015-0.03%過酸化水素溶液を含む
クエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を添加して室温にて
充分反応させ、発色を行なった。この後１ＮH₂SO₄溶液
を添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス
波長650nmにて測定を行ない、ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体
の定量を行った（図２）。この測定系によりＨＧＦＡ−
ＰＣＩ複合体の定量が可能であることが確認された。

【００５１】

【実施例４】 健常人および肝臓切除患者血漿中におけ
るＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の測定 健常人の血漿２０検体および手術にて肝臓切除を行ない
肝再生時にある患者の血漿２０検体中に存在するＨＧＦ
Ａ−ＰＣＩ複合体を実施例３で構築したＨＧＦＡ−ＰＣ
Ｉ複合体測定系を用いて測定した。その結果、患者血漿
中に高い濃度のＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体が存在すること
が解った（図３）。

【００５２】

【発明の効果】本発明によりＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体お
よびその測定方法が提供される。また、ＨＧＦＡ−ＰＣ
Ｉ複合体の測定に基づく臓器障害の検出方法が提供され
る。

【００５３】

【配列表】 <110> 三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corporation) <120> プロテインＣインヒビターと肝細胞増殖因子アクチベーターとの複合体お よびその測定方法並びに臓器障害の検出方法 <130> J05315 <160> 1 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg 5

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＰＣＩ存在下におけるＨＧＦＡの活性変化を
示す図である。

【図２】 ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体の定量の結果を示す
図である。

【図３】 健常人および肝臓切除患者の血漿中における
ＨＧＦＡ−ＰＣＩ複合体量を測定した結果を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 GA03 HA15 4B050 CC10 LL03 LL10 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA86 DA89 EA50 FA20 FA71 FA72 HA06 HA07

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロテアーゼＣインヒビターと肝細胞増
   殖因子アクチベーター（ＨＧＦＡ）との複合体。
2. 【請求項２】 プロテインＣインヒビターとＨＧＦＡと
   の複合体を測定する方法であって、（１）プロテインＣ
   インヒビターとＨＧＦＡとの複合体を認識する抗体、お
   よび、プロテインＣインヒビターとＨＧＦＡとの複合体
   中のプロテインＣインヒビターを認識する抗体のいずれ
   か又は両方を含む試薬を検体中の前記複合体と反応さ
   せ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を
   分離した後、免疫反応物中のＨＧＦＡを認識する標識抗
   体と反応させる工程、及び（３）免疫反応物に結合した
   標識抗体を測定する工程を含む方法。
3. 【請求項３】 プロテインＣインヒビターとＨＧＦＡと
   の複合体を測定する方法であって、（１）プロテインＣ
   インヒビターとＨＧＦＡとの複合体を認識する抗体、お
   よび、プロテインＣインヒビターとＨＧＦＡとの複合体
   中のＨＧＦＡを認識する抗体のいずれか又は両方を含む
   試薬を検体中のプロテインＣインヒビターとＨＧＦＡと
   の複合体と反応させ、免疫反応物を生成させる工程、
   （２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中のプロテ
   インＣインヒビターを認識する標識抗体と反応させる工
   程、及び（３）免疫反応物に結合した標識抗体を測定す
   る工程を含む方法。
4. 【請求項４】 プロテインＣインヒビターとＨＧＦＡと
   の複合体をプロテインＣインヒビターとＨＧＦＡとの複
   合体に対する抗体と反応させることを含む、プロテイン
   ＣインヒビターとＨＧＦＡとの複合体を測定する方法。
5. 【請求項５】 検体が、臓器障害の患者から採取された
   生体試料である請求項２〜４のいずれか１項に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 プロテインＣインヒビターとＨＧＦＡと
   の複合体を認識する抗体、および、プロテインＣインヒ
   ビターとＨＧＦＡとの複合体中のプロテインＣインヒビ
   ターを認識する抗体の少なくとも一つである第１の抗体
   と、第１の抗体およびプロテインＣインヒビターとＨＧ
   ＦＡとの複合体の反応により生成する免疫反応物中のＨ
   ＧＦＡを認識する第２の抗体とを含む、プロテインＣイ
   ンヒビターとＨＧＦＡとの複合体の測定キット。
7. 【請求項７】 プロテインＣインヒビターとＨＧＦＡと
   の複合体を認識する抗体、および、プロテインＣインヒ
   ビターとＨＧＦＡとの複合体中のＨＧＦＡを認識する抗
   体の少なくとも一つである第１の抗体と、第１の抗体お
   よびプロテインＣインヒビターとＨＧＦＡとの複合体の
   反応により生成する免疫反応物中のプロテインＣインヒ
   ビターを認識する第２の抗体とを含む、プロテインＣイ
   ンヒビターとＨＧＦＡとの複合体の測定キット。
8. 【請求項８】 プロテインＣインヒビターとＨＧＦＡと
   の複合体を認識する抗体を含む、プロテインＣインヒビ
   ターとＨＧＦＡとの複合体の測定キット。
9. 【請求項９】 請求項２〜４のいずれか一項に記載の方
   法によりプロテインＣインヒビターとＨＧＦＡとの複合
   体を測定し、測定された結果に基づき臓器障害を検出す
   ることを含む、臓器障害の検出方法。
10. 【請求項１０】 プロテアーゼＣインヒビターとＨＧＦ
    Ａとの複合体を認識するモノクローナル抗体。