ES2324601T3 - Formas de antigenos prostaticos especificos y metodos para su deteccion. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a antígeno prostático específico pro [-2] humano (pPSA) y distingue en un inmunoensayo o transferencia de Western entre [-2]pPSA y las siguientes formas de PSA humano: [-4]pPSA, [-7]pPSA y PSA maduro.

Description

Formas de antígenos prostáticos específicos y métodos para su detección.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la detección e identificación de proteínas, así como diversas formas y subunidades de proteínas, que tienen la utilidad potencial como marcadores de diagnóstico. En particular, la presente invención se refiere a la detección de formas precursoras inactivas de antígenos prostáticos específicos y anticuerpos que son capaces o que preferencialmente se unen a formas precursoras de antígenos prostáticos específicos.

Antecedentes de la invención

La medición de antígeno prostático específico (PSA) en suero se usa ampliamente para la exploración y detección temprana de cáncer prostático. El PSA en suero que se puede medir mediante inmunoensayos clínicos actuales existe principalmente como la forma libre "que no forma complejo" (PSA libre) o como un complejo con \alpha_{1}-antiquimotripsina (ACT). La proporción de PSA libre a total en suero ha demostrado que mejora significativamente la diferenciación de cáncer prostático (pCa) de enfermedades prostáticas benignas, correlacionándose proporciones mayores con un riesgo menor de cáncer prostático. Aunque la hiperplasia prostática benigna (BPH) es la enfermedad prostática benigna más común se reconoce que otras enfermedades benignas tales como prostatitis, infarto prostático y lesión prostática también pueden elevar el PSA en suero y provocar cambios en la proporción de PSA libre a total.

Se desconoce el mecanismo biológico para los niveles variables de PSA libre en suero. El PSA en suero que ha formado complejo probablemente sea relativamente homogéneo ya que el mismo representa PSA enzimáticamente activo e intacto. El PSA liberado a partir del complejo PSA-ACT en suero de cáncer prostático (pCa) e hiperplasia prostática benigna (BPH) se observó que no se podía distinguir del PSA en plasma seminal, lo cual confirma esta suposición. Se deduce que el PSA libre puede ofrecer mejor perspectiva bioquímica y una caracterización de las formas moleculares de PSA libre podría ayudar a esclarecer su origen prostático y mecanismo de liberación en el suero. Sin embargo, los intentos para purificar y caracterizar los niveles bajos de PSA a partir de suero en el intervalo diagnósticamente pertinente próximo a 10 ng/ml no se ha considerado en general factible con tecnologías actuales. Hasta ahora, los estudios se han enfocado principalmente en suero de hombres con niveles inusualmente altos de PSA, con cientos o miles de ng/ml de PSA. Sin embargo, otros grupos han fracasado en identificar pPSA en suero que contiene estos niveles elevados de PSA. Aunque los estudios que usan niveles de PSA en suero elevados son sugestivos, los mismos sufren una desventaja común en que este PSA puede no reflejar el tipo de porcentaje de PSA que está típicamente presente en las etapas tempranas de la enfermedad, donde PSA es 10 ng/ml o menos. El PSA liberado a partir de lesiones tumorales primarias grandes o enfermedad metastásica puede tener propiedades bioquímicas diferentes al PSA liberado a partir de enfermedad temprana, posiblemente de menor grado. Por lo tanto, para ser útiles para detección clínica de cáncer prostático temprano, las formas de pPSA truncadas tendrían que estar presentes en niveles significativos en suero con niveles diagnósticamente pertinentes de PSA total próximos
a 10 ng/ml.

JOCHEN Peter et al Cancer Research 61, 957-962, 1 de febrero del 2001 describe la identificación de formas precursoras de antígeno prostático específico libre en suero de pacientes con cáncer prostático mediante inmunoabsorción y espectrometría de masas. El mismo describe que F-PSA se encuentra como una mezcla de formas diferentes de pro-PSA en los sueros de pacientes con cáncer prostático. De 5 muestras de suero investigadas, todas contenían las formas [-7], [-5] y [-4] pro-PSA mientras que la [-1] y la [-2] estuvieron presentes en sólo 3 de las mismas de las cuales esas tres muestras contenían el extremo NH_{2} normal. Además, se preparó un anticuerpo monoclonal que se une a las 3 formas pro-PSA [-7, -6, -5] para desarrollar un ensayo que reconoce específicamente estas formas precursoras.

Por otra parte, Stephen D Mikolajczyket et al Cancer Research 60, 756-759, febrero del 2000 describe el examen de tejidos prostáticos para determinar el origen y especificidad de pPSA. El tejido prostático investigado incluyó cáncer de zona periférica (PZ-C); no cáncer de zona periférica y tejido benigno de la zona de transición (TZ), el sitio primario de hiperplasia prostática benigna (BPH). Se observó que pPSA estaba elevado de forma diferencial en PZ-C pero, en gran parte, indetectable en TZ. La secuenciación N-terminal reveló posteriormente que el pPSA estaba comprendido principalmente de [-2] pPSA y niveles menores de [-4] pPSA y los resultados demostraron que pPSA estaba correlacionado en mayor parte con cáncer prostático que con BPH.

Por consiguiente, existe una necesidad de caracterizar formas diferentes de PSA libre presente en suero de cáncer prostático con niveles diagnósticamente pertinentes de PSA total próximos a 10 ng/ml. También existe una necesidad de determinar el potencial de diagnóstico de estas formas de pPSA en la detección de cáncer prostático. Además, ya que cualquier caracterización de las formas de PSA libre en suero tiene que depender necesariamente del desarrollo de mAb, también existe una necesidad de desarrollar anticuerpos que sean específicos para estas formas de pPSA.

En este documento se describe la expresión satisfactoria de proteína pPSA quimérica en células de mamífero. En este documento se demuestra por primera vez que PSA se secreta en el medio usado mediante células de mamífero como proPSA. El proPSA secretado de este modo es enzimáticamente inactivo y estable en el medio. Por lo tanto, los vectores descritos en este documento se pueden usar para generar polipéptidos proPSA.

Se describe un vector de expresión quimérico que comprende una molécula de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido pPSA. La molécula de ácido nucleico preferiblemente está unida operativamente a secuencias de control que se reconocen mediante una célula hospedadora que se transforma con el vector de expresión. La célula hospedadora preferiblemente se obtiene a partir de una fuente de mamífero.

Los polipéptidos proPSA, así como variantes y subunidades de los mismos, producidos por los métodos de la presente invención se pueden usar para producir poblaciones de anticuerpos que sean específicas para proPSA, particularmente formas diferentes de proPSA. Debido a las diferencias estructurales menores entre pPSA y PSA, el desarrollo de mAb específicos para pPSA ha sido extremadamente difícil en el pasado. El PSA maduro contiene al menos seis epítopos antigénicos principales que inducen una respuesta inmune marcada en ratones e impide el desarrollo de reconocimiento de pPSA. En la bibliografía, los esfuerzos diseñados específicamente para generar mAb de pPSA no han producido mAb adecuados. Debido a la expresión satisfactoria de proteína pPSA quimérica, se pueden generar anticuerpos específicos para pPSA utilizando péptidos pPSA purificados y minimizando de este modo la interferencia de una res-
puesta inmune a PSA. La presente invención se concentra en desarrollar anticuerpos que detecten formas de [-2]pPSA.

Por tanto, un aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que se une específicamente a [-2]proPSA humano y diferencia en un inmunoensayo o transferencia de Western entre [2]pPSA y las formas siguientes de PSA humano: [-4]pPSA, [-7]pPSA y PSA maduro.

La presente invención también abarca un método para detectar [-2]pPSA en un tejido o líquido fisiológico humano. Este aspecto de la invención se basa en la observación de que [2]pPSA existe de forma estable en líquidos biológicos como parte de PSA libre y puede servir como un marcador útil de cáncer prostático. Se han identificado y detectado varias formas precursoras inactivas de PSA tales como, pero sin limitación, formas [-2], [-4] y [-7]pPSA, en suero. Las formas precursoras identificadas de PSA no forman un complejo con ACT y existen como PSA estable y libre en suero. La medición de estas formas precursoras inactivas de PSA puede proporcionar información importante con respecto a la detección, supervisión y detección de etapa del cáncer prostático.

Por lo tanto, se pueden usar polipéptidos proPSA, así como variantes y subunidades de los mismos, para producir poblaciones de anticuerpos que, a su vez, se puedan usar como la base para ensayos directos o competitivos para detectar y cuantificar polipéptidos proPSA (o "proteínas") en muestras obtenidas de líquidos fisiológicos, tales como líquido seminal, sangre o suero; tejidos, tales como carcinomas prostáticos o células, tales como células prostáticas. En particular, de acuerdo con la presente invención se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno proprostático específico pPSA donde el pPSA es [-2]pPSA.

También se describen ensayos directos y competitivos para detectar proPSA. Se describe un método para detectar proPSA en una muestra de líquido fisiológico humano que incluye proporcionar anticuerpos purificados para pPSA, poner en contacto los anticuerpos con la muestra para permitir la formación de complejos entre los anticuerpos y pPSA y determinar la presencia o cantidad de pPSA en forma de complejo con los anticuerpos.

Usando los anticuerpos e inmunoensayos descritos en este documento se ha observado que existen diferentes formas de pPSA en suero y que el [-2]pPSA es la forma más frecuente. También es un descubrimiento sorprendente de la presente invención que [-2]pPSA comprende un porcentaje significativo del PSA libre en suero de cáncer prostático.

También se describen métodos de diagnóstico para detectar y/o determinar la presencia de cáncer prostático en un sujeto o para distinguir cáncer prostático de enfermedad benigna no cancerosa en un sujeto. Los mismos incluyen un método para detectar o determinar la cantidad de pPSA en una muestra del sujeto y correlacionar la cantidad de pPSA con la presencia de cáncer prostático en el sujeto.

También se describen kits para detectar o distinguir cáncer prostático de enfermedad benigna. De acuerdo con la presente invención se proporciona un kit de diagnóstico para detectar o determinar pPSA en una muestra que comprende una cantidad conocida de un anticuerpo que se une específicamente a [-2]pPSA. El alcance de la invención se define adicionalmente mediante la materia objeto relatada en las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática de vector de expresión de PSA, pGTD-PSA.

La Figura 2 representa la expresión de PSA mediante células AV12-PSA#8. Suero que contenía medio usado de células AV12-PSA#8 se recolectó cada día durante seis días consecutivos. La concentración de PSA se midió usando ensayo de PSA Tandem®-MP. Cada día se realizó el recuento de las células viables usando azul de tripano.

La Figura 3 muestra perfiles de cromatografía de proteínas diferentes. El Panel A, perfil de cromatografía de interacción hidrófoba de las formas de pPSA purificadas a partir del medio usado de células AV12 y el Panel B, perfil de elución relativa de formas hK2, PSA y pPSA.

La Figura 4 representa el perfil cromatográfico de HIC de las formas diferentes de PSA. La Figura 4A muestra el tiempo de retención de PSA maduro y pPSA, incluyendo [-4]pPSA, [-5]pPSA y [-7]pPSA. La Figura 4B muestra el tiempo de retención de formas de PSA a partir de una muestra de suero unidas a una columna de afinidad PSM773.

La Figura 5 representa el perfil cromatográfico de una mezcla de PSA maduro purificado y pPSA. La Figura 5A muestra el perfil cromatográfico de la mezcla de proteínas sin la adición de ACT. La Figura 5B muestra el perfil cromatográfico de la misma mezcla de proteínas después de incubación con ACT durante dos horas a 37ºC.

La Figura 6 son análisis de transferencia de Western e inmunoensayo de las formas de PSA purificadas del suero de hombres con biopsia positiva y biopsia negativa a cáncer prostático: Panel A, PSA en suero total antes de la purificación; Panel B, % de PSA libre en el suero antes de la purificación; Panel C, detección por transferencia de Western de [-2]pPSA y Panel D, detección por transferencia de Western de [-4] más [-7]pPSA.

La Figura 7 muestra los resultados de tinción inmunohistoquímica de tejidos prostáticos para [-2]pPSA.

La Figura 8 es una representación de puntos que muestra los resultados de inmunoensayo de 52 hombres con BPH clínica y 92 controles.

La Figura 9 muestra la proporción de [-2]pPSA/BPSA en muestras positivas a biopsia (es decir, cáncer) y negativas a biopsia que contenían esencialmente la misma cantidad de PSA total en el suero.

La Figura 10 muestra las velocidades de activación relativas de [-2]pPSA, [-4]pPSA y [-5/-7]pPSA por hK2.

La Figura 11 es un perfil cromatográfico de interacción hidrófoba que muestra que [-2]pPSA no se activó a PSA después de incubación de 5 h con hK2 (panel A). El [-4]pPSA (panel B) y [-5/-7]pPSA se convirtieron en PSA.

La Figura 12 muestra los resultados de análisis de inmunoensayo de 3 mAb de pPSA diferentes que muestran una especificidad elevada por [-7]pPSA y especificidad no significativa por PSA maduro.

La Figura 13 son transferencias de Western de diferentes formas de PSA maduro y pro sondeadas con diferentes mAb que demuestran especificidad por [-2], [-4] y [-7]pPSA.

La Figura 14 muestra un inmunoensayo de 3 mAb diferentes, PS2X373, PS2V276 y PS2P446, que muestran sus reactividades relativas hacia [-2]pPSA, [-4]pPSA, [-4/-7]pPSA y PSA maduro.

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La identificación de formas precursoras inactivas de PSA en suero sugiere que medir concentraciones en suero de proPSA puede ser útil en la detección y supervisión de cáncer prostático. Para discernir las etapas implicadas en la biosíntesis de PSA y la activación de proPSA a PSA maduro, es necesaria la expresión de PSA en células de mamífero. Los detalles de expresar PSA en células de mamífero se proporcionan en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente, números de serie 09/251.686 y 09/302.965.

Como se usan en este documento, las expresiones "PSA" y "polipéptido PSA" se usan de manera intercambiable e incluyen polipéptidos PSA recombinantes prepro, pro y maduros. Las expresiones "proPSA", "pPSA", "polipéptido proPSA" y "polipéptido pPSA" se usan de manera intercambiable y preferiblemente abarcan todas las formas precursoras inactivas de PSA, que incluyen, aunque sin limitación, [-2]proPSA, [-4]proPSA, [-7]proPSA y [-5]proPSA.

Como se usa en este documento, "quimérico" significa que un vector comprende ADN de al menos dos especies diferentes o comprende ADN de la misma especie, que está enlazado o asociado de una manera que no se encuentra en el tipo "nativo" o silvestre de las especies.

"Secuencias de control" tiene por objeto significar secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para células procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor y, opcionalmente, una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma. Se conoce que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

"Unido operativamente" significa que los ácidos nucleicos están colocados en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, ADN para una pre secuencia o líder secretor está unido operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si influye en la transcripción de la secuencia o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado para facilitar la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas y, en caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se consigue mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Los especialistas en la técnica conocen los métodos generales para construir ADN recombinante que puede transformar células diana y las mismas composiciones y métodos de construcción se pueden utilizar para producir el ADN útil en este documento. Por ejemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (2d ed., 1989) proporciona métodos adecuados de construcción.

El ADN recombinante se puede introducir fácilmente en las células diana mediante transfección con un vector de expresión que comprende ADNc que codifica PSA, por ejemplo, mediante el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio modificado de D. Chen et al., Mol. Cell. Biol., 7, 2745 (1987). La transfección también se puede conseguir por
lipofección, usando kits disponibles en el mercado, por ejemplo, los proporcionados por BRL Life Technologies, Inc.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de PSA se obtienen a partir de organismos multicelulares. Tales células hospedadoras son capaces de actividades de procesamiento y glicosilación complejas. Sin embargo, las células de mamífero son los hospedadores preferidos para expresión de proteína de mamíferos, ya que estas células modifican y procesan la proteína recombinante de una manera estrechamente relacionada con el hospedador natural de la proteína. En principio, cualquier cultivo de células eucariotas superiores se puede emplear en la práctica de la invención, de cultivo tanto de vertebrado como de invertebrado. Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas báculovirales y variantes y células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes.

"Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", se refiere a un procedimiento o técnica en la que cantidades de un fragmento preseleccionado de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se ha descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195. En general, se emplea información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá para diseñar cebadores de oligonucleótidos. Estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a hebras opuestas del molde que se tiene que amplificar. Se puede usar PCR para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas a partir de ADN genómico total y ADNc transcrito a partir de secuencias de ARN celular total, de bacteriófago o de plásmido o similares. Véase, en general, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989).

Cuando se expresa un polipéptido PSA en una célula recombinante diferente de una de origen humano, el polipéptido PSA está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar polipéptidos PSA a partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas en cuanto a polipéptidos PSA. Por ejemplo, el medio de cultivo o lisado se puede centrifugar para retirar partículas de restos celulares. Después, las fracciones de membrana y proteína soluble se separan. Después el polipéptido PSA se puede purificar a partir de la fracción de proteína soluble y, si es necesario, de la fracción de membrana del lisado de cultivo. El polipéptido PSA después se puede purificar a partir de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes mediante fraccionación o inmunoafinidad o columnas de intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio aniónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, SEPHADEX G-75 o cromatografía de afinidad de ligando.

Una vez que se ha aislado, se puede usar un polipéptido o péptido proPSA correspondiente a la región proPSA para producir anticuerpos anti pPSA. Los polipéptidos proPSA usados para generar anticuerpos pueden incluir -7, -5, -4 y -2 proPSA. Los péptidos correspondientes a la región proPSA también se pueden usar para generar anticuerpos anti pPSA e incluyen todos los péptidos que contienen cualquier parte de la región pro del polipéptido pPSA. Estos péptidos contienen preferiblemente aproximadamente 8 a 15 aminoácidos y comprenden un epítopo inmunógeno.

De acuerdo con una realización de la presente invención, se puede usar pro péptido SRIVGGWECEK (SEC ID Nº: 3) para generar anticuerpos para [-2]proPSA. También se describe pro péptido ILSRIVGGWECEK (SEC ID Nº: 4) que se puede usar para generar anticuerpos para [-4]proPSA. La proteína recombinante purificada que consiste en el péptido líder prepro PSA se puede usar para generar anticuerpos para [-7]proPSA.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un anticuerpo que consiste básicamente en anticuerpos monoclonales combinados con diferentes especificidades epitópicas, así como diferentes preparaciones de anticuerpo monoclonal. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales contra pPSA purificado (proteína total) o los péptidos anteriores usando técnicas de cultivo de células de hibridoma conocidas, por ejemplo, como las descritas por E. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, este método implica preparar una línea celular fusionada productora de anticuerpos, por ejemplo, de células de bazo primarias fusionadas con una línea continua compatible de células de mieloma y cultivar las células fusionadas en cultivo masivo o en una especie animal a partir de la cual se obtuvo la línea de células de mieloma usada o con la que es compatible. Tales anticuerpos ofrecen muchas ventajas en comparación con los producidos por la inoculación de animales, ya que son altamente específicos y sensibles y relativamente "puros" inmunoquímicamente. Los fragmentos de anticuerpos inmunológicamente activos también están dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo, el fragmento
f(ab), ya que son anticuerpos monoclonales parcialmente humanizados.

Si se desea, los anticuerpos policlonales se pueden purificar adicionalmente, por ejemplo, uniéndolos a una elución de una matriz a la que está unido un polipéptido o un péptido para el que se generaron los anticuerpos. Los especialistas en la técnica conocerán diversas técnicas comunes en el campo de inmunología para purificación y/o concentración de anticuerpos policlonales, así como de anticuerpos monoclonales (Véase, por ejemplo, Coligan et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, incorporado como referencia).

El término "anticuerpo", como se usa en esta invención, incluye moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')_{2} y Fv, que son capaces de unir el determinante epitópico. Estos fragmentos de anticuerpo conservan alguna capacidad de unirse selectivamente con su antígeno o receptor.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno pro prostático específico pPSA donde el pPSA es [-2]pPSA. La expresión "específicamente inmunorreactivo o se une específicamente a" como se usa en este documento indica que los anticuerpos de la presente invención reconocen y se unen a determinantes antigénicos o epítopos que son únicos para proPSA y no se encuentran en PSA maduro. Los ejemplos de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a proPSA pueden incluir PS2P206, PS2P309, PS2P446, PS2P031, PS2P401, PS2P167, PS2P125, PS2P134, PS2X094, PS2X373, PS2X199, PS2X458, PS2X572, PS2V411 Y PS2V476. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal PS2P446 es específico para [-7] y [-4]pPSA por análisis de transferencia de Western, aunque específico para [-7]pPSA por inmunoensayo. PS2X373 es específico para [-2]pPSA. PS2V476 es específico para [-4]pPSA.

Los anticuerpos que incluyen los de la presente invención se pueden usar para detectar y determinar la presencia y cantidad de proPSA en una muestra. Los mismos también se pueden usar para detectar y determinar la presencia y cantidad de formas diferentes de proPSA en una muestra. En este documento también se describe el hecho de que proPSA se puede detectar en muestras de tejido de paciente mediante métodos inmunohistoquímicos y/o en muestras de líquidos del paciente mediante procedimientos de inmunoensayo in vitro.

Los métodos inmunohistoquímicos para la detección de antígenos en muestras de ensayo de tejido de pacientes son bien conocidos en la técnica y no se requiere describirlos con detalle en este documento. Por ejemplo, los métodos para la detección inmunohistoquímica de antígenos se describen en general en Taylor, Arch. Pathol. Lab. Med. 102: 113 (1978). En resumen, en el contexto de la presente invención, una muestra de ensayo de tejido obtenida a partir de un paciente que se sospecha que tiene un problema relacionado con la próstata se pone en contacto con un anticuerpo de la presente invención y el sitio al que el anticuerpo se une se determina a partir de entonces mediante tinción selectiva de la muestra de ensayo de tejido por procedimientos inmunohistoquímicos convencionales. La muestra de ensayo de tejido puede ser una muestra de ensayo de tejido obtenida a partir de la próstata de un paciente. El tejido prostático puede
ser un tejido prostático normal o benigno, un tejido prostático canceroso o un tejido de hiperplasia prostática benigna.

De forma similar, los métodos generales de la detección in vitro de sustancias antigénicas en muestras de líquido del paciente mediante procedimientos de inmunoensayo también se conocen en la técnica y no requieren repetición en este documento. Por ejemplo, los procedimientos de inmunoensayo se describen en general en Paterson et al., Int. J. Can. 37: 659 (1986) y Burchell et al., Int. J. Can. 34: 763 (1984). Un inmunoensayo para detectar proPSA en una muestra biológica puede comprender las etapas de: (a) poner en contacto un anticuerpo que se une específicamente a proPSA con la muestra en una condición que permita una formación de un complejo binario que comprenda el proPSA y el anticuerpo y (b) detectar y determinar la cantidad del complejo.

La muestra biológica puede ser cualquier muestra de líquido fisiológico humano que contenga proPSA de la presente invención. Los ejemplos de muestra de líquido fisiológico humano incluyen, aunque sin limitación, sangre, suero, líquido seminal, orina y plasma.

Se pueden usar tanto anticuerpos monoclonales como anticuerpos policlonales mientras tales anticuerpos posean la especificidad necesaria para el antígeno proporcionado por la presente invención. Preferiblemente, se usan anticuerpos monoclonales.

Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales en una fase líquida o unidos a un vehículo de fase sólida. Los anticuerpos monoclonales se pueden unir a muchos vehículos diferentes y usarse para determinar el proPSA de la presente invención. Los ejemplos de vehículos conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetitas. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para propósitos de la invención. Los ejemplos de vehículos insolubles incluyen, aunque sin limitación, una perla y una placa de microtitulación. Los especialistas en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para unir anticuerpos monoclonales o serán capaces de determinar los mismos en experimentos de rutina.

Además, los anticuerpos monoclonales en estos inmunoensayos se pueden marcar de forma detectable de diversas maneras. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden estar acoplados a haptenos de bajo peso molecular. Después estos haptenos se pueden detectar específicamente por medio de una segunda reacción. Por ejemplo, es común usar haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina o dinitrofenilo, piridoxal y fluoresceína, que pueden reaccionar con anticuerpos antihaptenos específicos. Además, los anticuerpos monoclonales de la presente invención también se pueden acoplar con un marcador detectable tal como una enzima, isótopo radiactivo, compuesto fluorescente o metal, compuesto quimioluminiscente o compuesto bioluminiscente. Además, la unión de estos marcadores a la molécula deseada se puede realizar usando técnicas convencionales comunes para los especialistas en la técnica.

Una de las maneras en las que el anticuerpo se puede marcar de forma detectable es uniéndolo a una enzima. Esta enzima, a su vez, cuando se expone posteriormente a su sustrato, reaccionará con el sustrato de una manera tal como para producir un resto químico que se puede detectar mediante, por ejemplo, un medio espectrofotométrico o fluorométrico (sistema ELISA). Los ejemplos de enzimas que se pueden usar como marcadores detectables son peroxidasa de rábano picante, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, betagalactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina esterasa.

Para sensibilidad aumentada en el sistema ELISA, los procedimientos descritos se pueden modificar usando anticuerpos biotinilados que reaccionan con conjugados de avidina-peroxidasa.

La cantidad de antígeno también se puede determinar marcando el anticuerpo con un isótopo radiactivo. La presencia del isótopo radiactivo entonces se determinaría mediante medios tales como el uso de un contador gama o contador de centelleo. Los isótopos que son particularmente útiles son ^{3}H, ^{125}i, ^{123}i, ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, ^{51}Cr, ^{36}Cl, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{75}Se,^{111}N, ^{99}mTc, ^{67}Ga y ^{90}Y.

La determinación del antígeno también es posible marcando el anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando la molécula marcada de forma fluorescente se expone a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia se puede detectar después debido a la fluorescencia del colorante. Entre los compuestos de marcaje fluorescente más importantes están isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

También se pueden usar los átomos de metales que emiten fluorescencia, tales como Eu (europio) y otros lantánidos. Los mismos se pueden unir a la molécula deseada por medio de grupos quelantes de metales, tales como DTPA o EDTA.

Otra forma en la que el anticuerpo se puede marcar de forma detectable es acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia de la inmunoglobulina marcada con compuesto quimioluminiscente se determina después detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcación quimioluminiscente particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster aromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Análogamente, también se puede usar un compuesto bioluminiscente como un marcador. La bioluminiscencia es un tipo especial de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una molécula bioluminiscente se determinaría detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para propósitos de marcaje son luciferina, luciferasa y aecuorina.

Las determinaciones cualitativas y/o cuantitativas de proPSA descritas en este documento en una muestra se pueden conseguir mediante procedimientos de inmunoensayo competitivo o no competitivo en un formato directo o indirecto. Los ejemplos de tales inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA) y el ensayo de sándwich (inmunométrico). La detección de los antígenos usando los anticuerpos monoclonales de la presente invención se puede realizar utilizando inmunoensayos que se desarrollan en los modos hacia adelante, inverso o simultáneo, incluyendo ensayos inmunohistoquímicos en muestras fisiológicas. Los especialistas en la técnica sabrán o pueden distinguir fácilmente, otros formatos de inmunoensayo sin experimentación excesiva.

Las expresiones "ensayo inmunométrico" o "inmunoensayo de sándwich" incluyen un inmunoensayo de sándwich simultáneo, de sándwich hacia adelante y de sándwich inverso. Estos términos son bien entendidos por los especialistas en la técnica. Los especialistas en la técnica también apreciarán que los anticuerpos de acuerdo con la presente invención serán útiles en otras variaciones y formas de ensayos que se conocen en el presente o que se puedan desarrollar en el futuro.

Así como ser útil como un antígeno para producir los anticuerpos anti pPSA presentes, el polipéptido pPSA aislado producido de acuerdo con los métodos descritos en este documento y sus variantes antigénicamente activas, derivados y fragmentos del mismo también se pueden usar en ensayos para proPSA en muestras obtenidas a partir de materiales biológicos que se sospecha que contienen proPSA o anticuerpos anti-proPSA.

Un ejemplo de un inmunoensayo en el contexto de la invención es la técnica de sándwich de dos anticuerpos. Estos ensayos se usan principalmente para determinar la concentración de antígeno en muestras desconocidas. Los ensayos de dos anticuerpos son rápidos y precisos y, si está disponible una fuente de antígeno puro (en este caso, proPSA), los ensayos se pueden usar para determinar las cantidades absolutas de antígeno en muestras desconocidas. El ensayo requiere dos anticuerpos que se unen a epítopos no solapantes en el antígeno. Se puede usar cualquiera de dos anticuerpos monoclonales que reconocen sitios específicos en un lote de anticuerpos policlonales purificados por afinidad.

En un ensayo de dos anticuerpos, un anticuerpo se purifica y se une a una fase sólida. Se puede usar cualquier fase sólida; sin embargo, para la mayoría de las solicitudes, se prefiere una placa de microtitulación de PVC. El anticuerpo unido (a un pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo) no está marcado y se denomina "anticuerpo de captura". La cantidad de anticuerpo que se tiene que usar dependerá del ensayo individual, pero una cantidad de aproximadamente 1 \mug/pocillo generalmente da unión máxima. También se pueden usar cantidades mayores o menores de anticuerpo de captura. Después los pocillos se pueden lavar y se puede añadir muestra a los pocillos para permitir que el antígeno (en este caso, pPSA) en la solución de ensayo se una a la fase sólida. Las proteínas no unidas se pueden retirar mediante lavado y se puede añadir un segundo anticuerpo marcado. Alternativamente, la muestra y el segundo anticuerpo marcado se pueden añadir simultáneamente. Después del lavado, el ensayo se puede cuantificar midiendo la cantidad de segundo anticuerpo marcado que se une a la fase sólida. Una realización más preferida de la presente invención utiliza un anticuerpo monoclonal como un primer anticuerpo no marcado y un anticuerpo monoclonal como un segundo anticuerpo marcado. El método de detección usado para cuantificar la cantidad de anticuerpo marcado unido depende del marcador usado. Los anticuerpos se pueden marcar de manera práctica con yodo, enzimas o biotina. Se pueden usar métodos de detección calorimétrica u otros.

Los polipéptidos proPSA descritos en este documento se pueden inmovilizar y usar como "antígenos de captura" para unir e inmovilizar anticuerpos anti-PSA a partir de una muestra que se tiene que ensayar para determinar anticuerpos anti-pPSA. El complejo bivalente de polipéptidos proPSA y anticuerpos anti-pPSA se detecta después, por ejemplo, en el caso de material fisiológico humano, haciéndolo reaccionar con un anticuerpo anti-IgG humano que comprende un marcador detectable o un sitio de unión para un marcador detectable. En el último caso, el mismo sitio de unión se hace reaccionar con un compuesto específico para el sitio de unión, que comprende en sí mismo un marcador detectable. Los marcadores detectables útiles incluyen enzimas, radio marcadores o marcadores fluorescentes. El complejo ternario o cuaternario resultante se puede detectar y/o cuantificar después a través del marcador detectable, es decir, a través de una reacción formadora de color enzima-sustrato, radioemisión, aglomeración y similares.

Alternativamente, el polipéptido proPSA se puede marcar con un marcador detectable, tal como a través de uno o más residuos peptidilo marcados radiactivamente y se pueden usar para competir con proPSA endógeno por la unión a anticuerpos anti-proPSA, es decir, como un antígeno de captura para unirse a anticuerpos anti-proPSA en una muestra de un líquido fisiológico a través de diversos formatos de inmunoensayo competitivo. Por ejemplo, un inmunoensayo competitivo para proPSA que usa anticuerpos anti-proPSA inmovilizados se realiza:

(a) proporcionando una cantidad de anticuerpos específicos de proPSA unidos a una superficie sólida;

(b) mezclando la muestra de líquido fisiológico que se tiene que ensayar con una cantidad conocida de polipéptido proPSA que comprende un marcador detectable para producir una muestra mixta;

(c) poniendo en contacto dichos anticuerpos con dicha muestra mixta durante un tiempo suficiente para permitir que sucedan reacciones inmunológicas entre dichos anticuerpos y dicho proPSA para formar un complejo anticuerpo-proPSA y entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido marcado para formar un complejo anticuerpo-polipéptido marcado;

(d) separado los anticuerpos que están unidos a proPSA y anticuerpos unidos al polipéptido marcado a partir de la muestra mixta;

(e) detectando o determinando la presencia o cantidad de polipéptido marcado unido a los anticuerpos sobre la superficie sólida o que permanecen en la muestra mixta y

(f) determinando a partir del resultado en la etapa (e) la presencia o cantidad de dicho proPSA en dicha muestra.

Tales inmunoensayos se pueden usar para detectar pPSA en muestras fisiológicas humanas, tales como suero y tejido, con el propósito de detectar y supervisar cáncer prostático. Los mismos también se pueden usar para distinguir cáncer prostático de enfermedad prostática benigna, tal como hiperplasia prostática benigna.

Se ha observado que pPSA, es decir, [-2] y [-4]pPSA, están presentes en suero y tejidos de cáncer prostático. Particularmente, es un descubrimiento sorprendente de la presente invención que [-2]pPSA no sólo está presente en suero de cáncer prostático, sino que se observa de forma más consistente y comprende un porcentaje mayor de PSA libre. Más importante, es un descubrimiento de la presente invención que el porcentaje mayor del PSA libre es [-2]pPSA en el suero de cáncer prostático de hombres con valores de PSA totales de 6-24 ng/ml. Por lo tanto, pPSA, particularmente [-2]pPSA, representa una isoforma significativa y relevante de PSA para el estudio de cáncer prostático. Es en el intervalo inferior a 10 ng/ml donde es más difícil diferenciar cáncer prostático de afecciones benignas tales como BPH ya que ambas afecciones liberan PSA en el suero. Además, mientras que las formas [-4] y [-7]pPSA parecen estar ausentes en algunas muestras del grupo de suero limitado ensayado, es posible que cada una de esas formas pueda mostrar utilidad específica en un grupo más grande. Por lo tanto, [-2]pPSA u otras formas de pPSA podrían ofrecer el mayor valor diagnóstico como el porcentaje de PSA total, como un porcentaje del PSA libre o como un indicador independiente donde niveles de pPSA superiores a determinado umbral tienen una correlación estadística alta con el cáncer. En el último caso, la presencia de pPSA podría ofrecer valor diagnóstico en suero que contiene cualquier nivel medible de pPSA y especialmente en suero con menos de 4 ng/ml de PSA
total.

Por consiguiente, se describe un método de diagnóstico para detectar o determinar la presencia del cáncer prostático en un sujeto que incluye las etapas de determinar la cantidad de pPSA en una muestra del sujeto y correlacionar la cantidad de pPSA con la presencia de cáncer prostático. De acuerdo con una realización de la presente invención, pPSA es [-2]pPSA.

La cantidad de pPSA se puede medir mediante cualquier método descrito en este documento o conocido en la técnica o desarrollado posteriormente, mientras el mismo sea capaz de realizar una medición de este tipo. El pPSA contenido en una muestra se puede medir mediante un método que incluye las etapas de poner en contacto un anticuerpo que se une con especificidad suficiente a proPSA en la muestra en una condición que permita la formación de un complejo binario que comprenda el proPSA y el anticuerpo y detectar y determinar la cantidad del complejo.

La unión de un anticuerpo a pPSA es suficientemente específica si el anticuerpo se puede usar prácticamente para conseguir la diferenciación entre pPSA y otras formas de PSA y, por lo tanto, para permitir la detección y determinación de la cantidad de pPSA en una aplicación y formato dados. Los ejemplos de tales anticuerpos pueden incluir anticuerpos que son específicos para pPSA y anticuerpos que se unen preferencialmente a pPSA. Además, se contemplan no sólo anticuerpos que se unen específicamente o preferencialmente a una forma particular, formas de pPSA, sino también anticuerpos que se unen específicamente o preferencialmente a todas las formas de pPSA. Un ejemplo de un anticuerpo de este tipo que se une específicamente o preferencialmente a todas las formas de pPSA sería un anticuerpo que detecte [-1] ó [-2]pPSA pero también detecte pPSA que contiene aminoácidos líder pro adicionales desde [-3] hasta [-7].

La expresión "se une preferencialmente a" como se usa en este documento indica que el anticuerpo se une a pPSA a un alcance mayor que la unión a otras formas de PSA. El grado o alcance al que estos anticuerpos reconocen proPSA mejor que otras formas de PSA dependerá de la aplicación específica y formato empleado. Los especialistas en la técnica conocen la evaluación y selección de anticuerpos con unión preferencial y es una parte rutinaria del desarrollo de cualquier inmunoensayo. La expresión "otras formas de PSA" como se usa en este documento incluye cualquier forma de PSA que no sea pPSA, tales como otras formas de PSA maduro recortadas o no recortadas. Los ejemplos de anticuerpos que se unen preferencialmente a pPSA incluyen, aunque sin limitación, PS1Z134, PS1Z120, PS1Z125 y PS1Z80.

Además, también se puede usar cualquier equivalente de los anticuerpos descritos anteriormente para medir la cantidad de pPSA. Cualquiera de las especies moleculares, conocidas o desarrolladas posteriormente, capaces de unirse a pPSA con especificidad suficiente se considerarán equivalentes de los anticuerpos y, por lo tanto, se pueden usar para medir la cantidad de pPSA. Tales equivalentes de los anticuerpos se pueden seleccionar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar cualquier ensayo de unión conocido para determinar la actividad de unión de cualquier molécula dada. Los ejemplos de especies moleculares potenciales pueden incluir fragmentos de unión a antígeno obtenidos de anticuerpos y aptámeros.

El anticuerpo es un anticuerpo específico para pPSA. Por ejemplo, se puede usar cualquier anticuerpo descrito en este documento que sea específico para pPSA en el método de diagnóstico descrito en este documento. El anticuerpo es un anticuerpo que preferencialmente reconoce pPSA y los ejemplos de tales anticuerpos incluyen PS1Z134, PS1Z120, PS1Z125 y PS1Z80.

La cantidad de pPSA detectado en una muestra de un paciente puede estar relacionada con la presencia de cáncer prostático de cualquier manera que genere valor diagnóstico para determinar la presencia de cáncer prostático. Por ejemplo, la cantidad de pPSA contenida en una muestra se puede comparar con el PSA total, el PSA libre, el BPSA o hK2 de una muestra. La comparación, es decir, una combinación matemática, tal como una proporción con otras formas de PSA o hK2 o la cantidad de pPSA solo se puede usar como un indicador donde los niveles de pPSA superiores a un umbral predeterminado tienen una alta correlación estadística con el cáncer. Por ejemplo, la cantidad de pPSA se puede comparar con otras formas de PSA o hK2 para generar un resultado numérico, en el que un resultado superior a un valor predeterminado es un indicio de la presencia de cáncer prostático. La expresión "combinación matemática" incluye cualquier combinación matemática que pueda generar un resultado numérico para determinar la presencia de cáncer prostático. Mientras que una proporción puede ser la combinación matemática más simple, también se pueden usar otras formas más complicadas tales como polinomios, funciones log-lógicas y redes neurales artificiales. Estas y otras formas son conocidas por los matemáticos y bioestadísticos.

Con miras a la enseñanza en este documento, un especialista en la técnica puede determinar fácilmente a través de experimentos de rutina los valores límites (el umbral) u otros parámetros analíticos necesarios para usar los resultados numéricos descritos anteriormente tales como una proporción o la cantidad de pPSA solo como un marcador para determinar la presencia de cáncer prostático. Por ejemplo, se puede comparar la proporción descrita anteriormente o pPSA en individuos diagnosticados con cáncer prostático con individuos que no tienen cáncer prostático o tienen BPH para determinar los valores límite con especificidad y sensibilidad necesaria. Después, se puede comparar la proporción o la cantidad de pPSA de una muestra con el valor límite predeterminado para determinar la presencia de cáncer prostático en un sujeto, donde el nivel más alto de pPSA puede ser un indicio de cáncer prostático. El método para determinar el valor límite con especificidad y sensibilidad necesaria se conoce en la técnica y no se necesita repetirlo.

Además, es un descubrimiento de la presente invención que pPSA, particularmente [-2]pPSA está elevado en el suero y los tejidos de pacientes con cáncer prostático cuando se compara con la cantidad del mismo en el suero o los tejidos de hombres con enfermedad prostática benigna tal como BPH. Por lo tanto, se puede usar la proporción descrita anteriormente o la cantidad de pPSA independientemente para determinar si un sujeto tiene una probabilidad mayor de cáncer prostático en lugar de una enfermedad benigna tal como BPH. Por ejemplo, se pueden examinar los niveles de pPSA en pacientes diagnosticados con cáncer prostático y en pacientes diagnosticados con enfermedad benigna para determinar un valor límite. Después, la proporción o cantidad de pPSA de una muestra de paciente desconocida se puede comparar con el valor límite predeterminado, donde el nivel más alto de pPSA en comparación con el valor límite predeterminado es un indicio de cáncer prostático.

Los métodos para medir PSA total y PSA libre se conocen en la técnica y por lo tanto no se repetirán en este documento. Para propósitos de la presente invención la expresión "PSA total" se refiere a PSA inmunológicamente detectable total. El PSA inmunológicamente detectable es en general la suma del PSA que no está en forma de complejo, libre y el PSA en forma de complejo. El PSA en forma de complejo está compuesto principalmente de PSA-ACT con cantidades menores de complejos con inhibidores diferentes a ACT. El PSA total se puede medir mediante ensayos disponibles en el mercado tales como el ensayo de PSA Hybritech® para el sistema de inmunoensayo ACCESS®. La expresión "PSA libre" como se usa en este documento se refiere a PSA enzimáticamente inactivo que circula en sangre sin estar unido a cualquier inhibidor de proteasa. El PSA libre se puede medir mediante ensayos disponibles en el mercado tales como ensayo de PSA libre Hybritech® para el sistema de inmunoensayo ACCESS®. El BPSA y los métodos de medición de BPSA se describen con detalle en las solicitudes de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente del mismo propietario números de serie 09/303.208 y 09/303.339. En resumen, BPSA se refiere a una forma de PSA que comprende al menos un recorte en Lys 182 de la secuencia de aminoácidos de una forma madura de PSA. En otras palabras, un BPSA como se describe en este documento tiene la misma secuencia de aminoácidos de una forma madura de PSA, excepto que la cadena polipeptídica del PSA descrito en este documento se ha hidrolizado entre los residuos 182 y 183. Se ha observado que mientras proPSA está elevado en los tejidos o el suero de un paciente con cáncer prostático, BPSA está elevado en los tejidos o el suero de un paciente con BPH. Por lo tanto, comparando proPSA con BPSA de un paciente, se puede distinguir cáncer prostático de BPH y determinar la presencia de cáncer prostático.

También se pueden usar anticuerpos de la presente invención en un kit de diagnóstico para determinar la presencia de pPSA contenido en una muestra. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un kit para detectar o determinar pPSA en una muestra que comprende una cantidad conocida de anticuerpo que se une específicamente a [-2]pPSA. El kit también puede comprender un soporte sólido o cantidad conocida adicional de anticuerpos específicos para pPSA. Los anticuerpos contenidos en el kit pueden estar unidos a un soporte sólido o pueden estar marcados de forma detectable o ambos respectivamente.

La invención se describe adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos detallados.

Ejemplos Materiales y Métodos Vector de expresión, línea celular y transfección

Un fragmento de ADN de 0,8 kb que incluye la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1, como se ha expuesto en la Figura 1, que codifica el ppPSA entero se clonó en el sitio Bc11 de pGT-d bajo el control de promotor GBMT (Berg et al. Nucleic Acids Res., 20: 5485-5486, 1992) dando como resultado el vector de expresión pGTD-PSA (Figura 1). Se confirmó la orientación y la secuencia del inserto. AV12-664 (ATCC CRL 9595), cultivadas en DMEM (glucosa alta) y FETAL CLONE (Hyclone, Logan, UT) al 10%, se transfectaron con pGTD-PSA usando Lipofectamina (Life Technologies, Inc.). Se seleccionaron células AV12-664 (AV12-PSA) transfectadas en metotrexato 400 nM (Sigma Chemical Company). AV12-664 transfectadas con el vector vacío (AV12-PGTD) también se seleccionaron de una manera similar para uso como un control negativo. Se aislaron clones de células únicas. La viabilidad de las células se evaluó mediante exclusión con colorante azul de tripano.

Aislamiento de formas pPSA recombinantes a partir de células de mamífero

PSA recombinante se expresó en AV12 de mamífero y el medio usado se pasó sobre el mAb específico de PSA, PSM773. Previamente, PSM773 ha demostrado que tiene especificidad por formas maduras, recortadas y precursoras de PSA (Wang, T. J., Linton, H. J., Sokoloff, R. L., Grauer, L- S., Rittenhouse, H. G., y Wolfert, R. L., Tumor Biology 20: 75-78, 1997; Finlay, J. A., Day, J. R., y Rittenhouse, H. G., Urology, 53: 746-751, 1999; Kumar, A., Mikolajczyc, S.D., Goel, A. S., Millar, L. S. y Saedi, M. S., Cancer Res, 57: 3111-3114, 1997).

La columna se lavó con 40 volúmenes de PBS que contenían Triton-X100 reducido al 0,1% y la proteína unida se eluyó con glicina 100 mM pH 2,5, que contenía cloruro de sodio 200 mM. El eluyente se neutralizó inmediatamente con Tris al 10% % vol/vol 1 M pH 8,0. El PSA purificado no contenía PSA maduro pero contenía las isoformas moleculares de pPSA [-5/-7], [-4] y [-2]pPSA que se purificaron mediante HIC-HPLC como se ha descrito más adelante.

Inmunoensayo y SDS-PAGE de PSA

La concentración de PSA en suero, medio o preparaciones purificadas se determinó mediante ensayos Tandem®-MP de PSA y Tandem®-MP de PSA libre (Hybritech Incorporated, San Diego, CA). Se realizó SDS-PAGE usando minigeles de gradiente al 4-20% (Invitrogen, Carlsbad, CA) en condiciones reductoras o no reductoras, como se ha indicado. Las muestras se sometieron a electrotransferencia sobre nitrocelulosa usando procedimientos convencionales. Se usaron mAb de pPSA primarios a 5 \mug/ml y se incubaron con las transferencias durante toda la noche a 4ºC. Las transferencias se detectaron con un cocktail de anticuerpo secundario que consiste en HRP de cadena pesada y cadena ligera anti-ratón de cabra 1:50.000 (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). Las señales inmunorreactivas se detectaron mediante sustrato SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo para la medición de actividad de PSA

La actividad enzimática de PSA se midió de acuerdo con el procedimiento publicado por Christensson, A. et al., (Christensson, A., Laurell, C. B., and Lilja, H., Eur J Biochem, 194: 755-763, 1990). En resumen, preparaciones de PSA (purificadas a partir de líquido seminal o medio usado del día 7 de células AV12-PSA#8) se incubaron con sustratos cromogénicos peptídicos derivatizados con pNA (metoxisuccinil-Arg-Pro-Tyr-pNA, S2586; Pharmacia Hepar, Inc.) 1 mM en Tris 200 mM/EDTA 5 mM (pH 8,0) a 37ºC. La actividad enzimática de PSA se determinó mediante hidrólisis de los sustratos cromogénicos peptídicos, conduciendo a un aumento en la absorbancia a 405 nm.

HIC-HPLC de PSA

Se realizó cromatografía de interacción hidrófoba de alto rendimiento (HIC-HPLC) usando una columna de polipropilaspartamida (PolyLC, distribuido por Western Analytical, Temecula, CA). La columna tenía 4,6 X 250 mm de longitud con un tamaño de poro de 1000 \ring{A}. Se aplicaron muestras en sulfato de amonio 1,5 M y se eluyeron con un gradiente: Tampón A: sulfato de sodio 1,2 M, fosfato de sodio 25 mM, pH 6,3 y Tampón B: fosfato de sodio 50 mM, 2-propanol al 5% v/v. El gradiente fue del 0-35% de B, 1 min, del 30-80% de B, 12 min, después isocrático el 80% de B durante 2 min antes de equilibrar en Tampón A. La detección de pico de alta sensibilidad se obtuvo con un detector de exploración de fluorescencia Varian Modelo 9070 usando una excitación de 232 nm y emisión de 334 nm para detectar los residuos de triptófano en proteína.

Purificación y Detección de pPSA a partir de Suero de Cáncer Prostático Combinado

Se obtuvieron 75 ml de suero humano combinado de pacientes con cáncer prostático con PSA elevado. Se añadió sulfato de amonio sólido al suero para preparar la concentración final 2 M y después la muestra se dializó frente a sulfato de amonio 2 M durante 16 horas a 4ºC. Después el suero se aclaró mediante centrifugación y la solución de sobrenadante se dializó tres veces (una hora cada vez) frente a 2 litros de fosfato de sodio 20 mM, pH 7. Después la muestra se filtró a través de un filtro de membrana de 0,2 \mu y se pasó sobre una columna de afinidad de 0,5 ml a 1 ml/min. La columna de afinidad consistió en el mAb PSM773 unido covalentemente a resina AMINOLINK (Pierce) a una concentración de 5 mg de mAb por ml de resina.

La columna de afinidad se lavó con 50 ml de PBS y el PSA se eluyó con 3 volúmenes de 1 ml de glicina 100 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 2,5. El eluyente (3 ml) se neutralizó con 300 \mul de Tris 1 M, pH 8. Se añadió sulfato de amonio al eluyente hasta una concentración final de 2 M y esta muestra se aplicó a una columna de HPLC para resolverse mediante cromatografía de interacción hidrófoba como se ha descrito anteriormente.

Desarrollo de Anticuerpos Monoclonales para pPSA

Se desarrollaron mAb para [-2] y [-4]pPSA mediante inmunización de ratón con péptidos unidos a hemocianina de lapa californiana (Pierce Chemical Co. Rockford, IL). Para [-2]pPSA, el péptido pro fue SRIVGGWECEK (SEC ID Nº: 3) y para [-4]pPSA, el péptido fue ILSRIVGGWECEK (SEC ID Nº: 4). Se produjeron hibridomas mediante metodologías^{20} habituales y los clones de anticuerpo se seleccionaron por reactividad al péptido respectivo indicado anteriormente y no reactividad para el péptido de control para PSA maduro, IVGGWECEK (SEC ID Nº: 5). Adicionalmente los clones se seleccionaron por su capacidad de reconocer proteína [-2] y [-4]pPSA purificada en transferencias de Western. Cuando se desarrolló SDS-PAGE en condiciones reductoras, PS2X373 mostró reactividad cruzada de aproximadamente el 20% a la proteína de PSA maduro por transferencia de Western. Sin embargo, la reactividad cruzada cayó al 5% o menos en condiciones no reductoras y por lo tanto estas condiciones se usaron para la detección de [-2]pPSA en la Figura 6C.

Se obtuvieron mAb para [-7]pPSA de longitud completa mediante inmunización de ratón con proteína quimérica recombinante purificada que consistía en el péptido líder prepro de PSA unido a calicreína humana 2. Se seleccionaron clones de acuerdo con su reconocimiento de PSA recombinante nativo y no reconocimiento de PSA maduro nativo. Se observó que estos mAb reconocían sólo [-7]pPSA por inmunoensayo, pero reconocían ambas proteínas [-7] y [-4]pPSA de forma equivalente en transferencia de Western.

Generación de Anticuerpos Monoclonales con selectividad Preferencial por pPSA

Se purificó PSA a partir del medio de AV12 mediante el uso de cromatografía de inmunoafinidad usando el anticuerpo anti-PSA PSM773 como se ha descrito anteriormente. Los ratones se inmunizaron una vez con 50 \mug de inmunógeno bloqueado en CFA y dos veces con 25 \mug de inmunógeno bloqueado en IFA. El sobrenadante del cultivo de hibridoma se exploró para determinar reactividad frente a pPSA. Se exploraron hibridomas añadiendo 50 \mul de sobrenadante de cultivo a los pocillos de una microplaca de estreptavidina (Wallac, Turku, Finland) y también se añadieron 50 \mul de pPSA biotinilado a 100 ng/ml. Después de una h de incubación la placa se lavó con PBS/Tween-20 al 0,1%, después se incubó con 50 \mul por pocillo de peroxidasa de rábano picante de cabra anti-Ig de ratón (1:10.000) diluido en PBS/BSA al 1% y Tween-20 al 0,1%. Después de una h de incubación, la placa se lavó y desarrolló con sustrato OPD. Para determinar la especificidad de anticuerpos monoclonales, se comparó la reactividad de 100 ng/ml de pPSA y 100 ng/ml de PSA intacto.

Desarrollo de anticuerpos monoclonales para isoformas de BPSA

Plasma seminal procesado y filtrado se diluyó 1:10 en PBS y se pasó sobre una columna de inmunoafinidad con mAb unido anti-PSA PSM773. La columna se lavó con 20 volúmenes de PBS que contenían Triton X100 reducido al 0,1% y el PSA se eluyó con glicina 100 mM pH 2,5 que contenía cloruro de sodio 200 mM. El PSA purificado se aplicó a HIC-HPLC como se ha descrito previamente en la técnica y se recogieron por separado el pico de BPSA de 8 min y el pico de PSA de 10 min. El PSA del pico de 10 min se dializó en Tris 100 mM, pH 8 y se incubó con tripsina al 1% p/p durante 30 min a 37ºC. La tripsina en la mezcla se inactivó mediante adición de una masa de aprotinina igual al doble de la tripsina añadida. La mezcla de incubación se aplicó a HIC-HPLC y se recogió el pico de BPSA in vitro resultante. Una descripción detallada de este proceso también se puede encontrar en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente del mismo propietario número de serie 09/303.208.

El BPSA in vitro se usó como un inmunógeno en ratones usando protocolos convencionales. Se seleccionaron anticuerpos de acuerdo con su capacidad de reconocer el inmunógeno antes que al PSA que no contenía los recortes en Lys 145 y Lys 182. Usando tecnologías de hibridoma convencionales, se desarrolló el anticuerpo monoclonal PS2E290, un mAb específico de BPSA. El PS2E290 se usó en un inmunoensayo de mAb dual para detectar BPSA en suero.

Inmunoensayo de BPSA

El inmunoensayo desarrollado para la medición de BPSA es el siguiente. 50 \mul de Ab anti-PSA biotinilado PSM 773 en 5 \mug/ml en diluyente de cal cero de PSA Tandem se añaden a una microplaca recubierta con estreptavidina EG&G Wallac y se deja que reaccionen a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Después la placa se lava 5 veces con lavado Tandem E. Después se añaden 50 \mul de diluyente de cal cero de PSA Tandem a la placa seguido de 50 \mul de sueros o antígeno que se tiene que ensayar. Se deja que la mezcla reaccione a temperatura ambiente durante 2 horas como anteriormente. Después la placa se lava 5 veces con lavado Tandem E. Se añaden 100 \mul de una solución 1mA de conjugado de PS2E290-fosfatasa alcalina a la placa. Se deja que la mezcla reaccione a temperatura ambiente durante 1 hora como anteriormente. Después la placa se lava 5 veces con lavado Tandem E. Se añaden 100 \mul de solución Sigma 4MU-p a cada pocillo y se deja que reaccionen a temperatura ambiente. Después de 1 hora la placa se lee en un instrumento EG&G Wallac Victor.

Secuenciación de Aminoácidos de PSA

Se realizó secuenciación N-terminal de las muestras a través de 9 ciclos en un secuenciador de aminoácidos PE-Applied Biosystems Modelo 492 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA). El PSA purificado y los picos recogidos por HIC-HPLC se aplicaron directamente a membranas PVDF usando los cartuchos Prosorb (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA), se lavaron 3 X con 0,1 ml de ácido trifluoroacético al 0,1% y se aplicaron al secuenciador Modelo 492.

Ejemplo 1 Expresión de pPSA en Células de Mamífero

El ADNc de PSA se clonó en el vector pGT-d bajo el control del promotor GBMT usando un enfoque similar al descrito para hK2 por Kumar et al. Para estudiar la expresión de PSA, se transfectaron células AV12 con el vector de expresión pGTD-PSA. Las células se seleccionaron en metotrexato 400 nM durante 2-3 semanas y se analizaron clones de células únicas para expresión de PSA usando ensayo de PSA TANDEM®-MP y en transferencias de Western usando mAb PSM773. El clon AV12-PSA#8 se seleccionó basándose en sus niveles de expresión altos de una banda inmunorreactiva de PSA a \sim32 kDa.

Para determinar el patrón de expresión de PSA en células de mamífero, se recogieron muestras de medio usado de células AV12-PSA#8 durante seis días consecutivos y se analizaron usando el ensayo de PSA TANDEM®-MP. La Figura 2 muestra que se detectó PSA en medio usado en el día 1 y se acumuló hasta >9 \mug/ml el día 6. La expresión de PSA fue mayor durante la fase logarítmica de crecimiento celular, indicando que las células secretan una forma estable de PSA a diferencia de liberarse a continuación de la muerte y lisis celular. Cuando se analizaron las mismas muestras para determinar PSA libre, se obtuvieron valores similares (datos no mostrados) indicando que las células AV12-PSA#8 expresan PSA libre o que no está en forma de complejo.

Para determinar la identidad de la proteína que se secreta a partir de las células, se recogió y concentró el medio usado de las células AV12-PSA#8. El PSA en el medio se purificó mediante cromatografía de afinidad usando PSM 773, un mAb específico de PSA. Se observó que el PSA recombinante expresado en células AV12 de mamífero se secretaba como pPSA como se ha descrito previamente en las solicitudes de patente en trámite junto con la presente del mismo propietario números de serie 09/302.965 y 08/846.408. No se observaron diferencias medibles entre el PSA purificado a partir del medio del día 1 o del día 7. El pPSA se resolvió en tres formas moleculares diferentes mediante HIC-HPLC, como se muestra en la Figura 3A. El PSA normalmente se expresa con un péptido líder pro de 7 aminoácidos que consiste en APLILSR pero una secuenciación N-terminal de los 3 picos resueltos por HIC-HPLC en la Figura 3A indicó formas truncadas de pPSA. El pico A contenía aproximadamente niveles iguales del péptido líder pro de 7 aminoácidos APLILSR ([-7]pPSA) y un péptido líder recortado truncado de 5 aminoácidos que contenía LILSR ([-5]pPSA) que no estaban resueltos entre sí. El pico B contenía el péptido líder pro de 4 aminoácidos ILSR ([-4]pPSA). El pico C contenía el péptido líder de 2 aminoácidos, SR ([-2]pPSA), además del 30% de PSA al que le faltaban los primeros 4 aminoácidos de la secuencia madura. Se podría obtener [-2]pPSA puro recogiendo la mitad posterior de este pico. La disminución en el tiempo de retención de estas proteínas que se produce a partir del truncamiento creciente del péptido líder pro se debe muy probablemente a cambios de conformación en la proteína pPSA y no se deben a los cambios de superficie menores inducidos por la remoción de los aminoácidos indicados.

La Figura 3A muestra que las formas diferentes de pPSA se pueden resolver y purificar las unas a las otras mediante HIC-HPLC. La Figura 3B es una superposición de varios desarrollos individuales y muestra las formas de pPSA purificadas además de PSA maduro y otra calicreína específica prostática, hK2. Por tanto, un único desarrollo cromatográfico puede separar y resolver todas las formas principales de proteína PSA las unas de las otras.

Ejemplo 2 Detección de pPSA en Suero de Cáncer Prostático Humano Combinado

La presencia de pPSA en suero humano indicaría lo siguiente. En primer lugar, que el PSA se secreta como la forma pPSA en tejido humano y se convierte en PSA maduro extracelularmente. En segundo lugar, que pPSA es estable en suero humano y, por tanto, puede ser un marcador de diagnóstico útil para pCa o BPH. Se evaluó la presencia de pPSA en suero humano usando en primer lugar purificación por afinidad para purificar todas las formas de PSA presente en una combinación de suero humano. A continuación se fraccionaron las formas de PSA eluídas en HPLC y se identificó cada forma de PSA basándose en su perfil de elución a partir de la columna. Este análisis indicó que pPSA está presente en suero humano.

La Figura 4A muestra el TR de patrones de las diferentes formas de PSA. Todas las formas se verificaron mediante secuenciación de aminoácidos. El pico de [-7, -5]pPSA contiene niveles aproximadamente iguales de formas [-7]pPSA y [-5]pPSA que no están resueltas entre sí. La Figura 4B muestra el perfil de formas de PSA de suero unidas a la columna de afinidad de PSM773 como se ha descrito anteriormente. Se recogieron muestras en fracciones de 0,5 ml y se ensayaron mediante ensayo de PSA libre TANDEM®-MP (ensayo fPSA, Hybritech Incorporated). El ensayo de fPSA detecta tanto pPSA como PSA libre (inactivo). El pico menor a los siete minutos se debe a la ligera reactividad cruzada del ensayo de fPSA hacia el PSA-ACT eluído a partir de la columna de afinidad. El nivel real de PSA-ACT en esta muestra es aproximadamente diez veces mayor que el nivel de PSA libre (datos no mostrados). Los picos a los 10 minutos y 12 minutos corresponden a PSA maduro y [-4]pPSA, respectivamente. Estos datos indican que al menos una forma de pPSA ([-4]pPSA) está presente en suero humano y, de acuerdo con las áreas de pico relativas, forma aproximadamente el 25% del PSA libre o que no está en forma de complejo en esta muestra de suero
combinada.

Para confirmar que las formas pro de PSA no son reactivas con ACT, se incubó una mezcla de PSA maduro purificado, [-4]pPSA y [-7, -5]pPSA, con ACT. La Figura 5A (SIN ACT) muestra el perfil cromatográfico de la mezcla de proteínas sin la adición de ACT. La Figura 5B (+ACT) muestra el perfil cromatográfico de una cantidad idéntica de la misma mezcla después de incubación con ACT durante dos horas a 37ºC. Sólo las formas de PSA maduro y ACT forman complejo. Las formas [-4], [-5] y [-7] de pPSA no formaron un complejo con ACT, ya que no mostraron disminución en el área de pico. Estos datos son consistentes con el hecho de que [-4]pPSA en suero no está formando complejo con ACT.

Ejemplo 3 Detección de Formas de pPSA Truncadas en Suero de Cáncer Prostático

También se analizaron sueros de varios hombres individuales por transferencia de Western usando mAb de pPSA desarrollados recientemente. Se purificó PSA del suero de hombres que fueron positivos a biopsia y negativos a biopsia para cáncer prostático. Los valores de PSA en suero de los 5 hombres positivos a biopsia eran 6, 9, 10, 18 y 24 ng/ml. También se analizaron 3 hombres negativos a biopsia con 7, 10 y 12 ng/ml de PSA total. Ya que el PSA libre representaba sólo del 10-20% del PSA total y no se conocía qué porcentaje del PSA libre podía estar comprendido de formas pPSA, fue necesario purificar PSA a partir de 100-200 ml de suero para asegurarse de la sensibilidad de detección adecuada para análisis de transferencia de Western. El PSA total se purificó a partir del suero mediante cromatografía de inmunoafinidad usando el mAb anti-PSA, PSM773, que reconoce todas las formas de PSA libre y PSA unido a ACT. La recuperación de PSA varió del 30-60% de las cantidades que se calculaba que estaban en el suero de partida mediante inmunoensayo. La Figura 6 muestra los análisis de transferencia de Western e inmunoensayo de estas muestras. En los paneles A-D, todas las muestras se presentan en el mismo orden. Las primeras 5 muestras fueron las muestras de Pca y las últimas 3 muestras fueron de hombres negativos a biopsia. Los paneles A y B son los ng/ml de PSA total y el % de PSA libre, respectivamente, en el suero antes de purificación por inmunoafinidad. El Panel B muestra que el % de PSA libre fue en general inferior en las muestras de cáncer en comparación con suero negativo a biopsia o benigno, lo cual concuerda con la tendencia pronosticada de que las muestras de BPH deberían contener mayor % de PSA libre. Se debe indicar que el % de PSA libre medido en el PSA purificado no cambió de los valores de suero originales, confirmando que el procedimiento de purificación no tuvo selectividad por las formas de PSA libres o que formaban complejo.

Los paneles C y D son las transferencias de Western de las mismas muestras en los Paneles A y B, sondeadas con mAb para [2]pPSA y [-4/-7]pPSA, respectivamente. En la Figura 6C, la transferencia se sondeó con PS2X373, que es específico para [-2]pPSA. Cada carril se cargó con 11 ng de PSA libre, según se determinó mediante inmunoensayo previo. El carril 1 contenía 10 ng de patrón de [-2]pPSA purificado. La Figura 6C muestra que las 5 muestras de cáncer contenían los niveles más altos de [-2]pPSA. La comparación de la intensidad de banda con el patrón de 10 ng de [-2]pPSA en el carril 1 indica que casi todo el PSA libre en el carril 2 es [-2]pPSA. Se estimó que [-2]pPSA comprendía aproximadamente la mitad del PSA libre en carriles 3-5 y que era del 25% en el carril 6 (Tabla 1). El carril 7, la primera muestra negativa a biopsia, contenía aproximadamente el 20% de pPSA. El ensayo de suero original del carril 7 midió 12 ng/ml de PSA total, en comparación con 6 ng/ml en la muestra de cáncer en el carril 6 (Panel A), aunque ambos contenían % de PSA libre comparable (Panel B). Las muestras negativas a biopsia en los carriles 8 y 9 contenían sólo niveles nominales de pPSA, quizás del 5-10%. Ya que el mAb de PS2X373 tuvo una reactividad cruzada menor de aproximadamente el 5% con PSA maduro en estas condiciones de transferencia de Western, es posible que una parte o toda la banda evidente en estos carriles se deba a reactividad cruzada de PSA.

En el panel D, se cargaron 3 ng de PSA libres en cada carril y se sondearon con PS2P446 que tenía especificidad igual por [-4]pPSA y [-7]pPSA en transferencias de Western. Los resultados de esta transferencia indicaron que estuvieron presentes otras formas de pPSA en sólo 2/5 de las muestras de cáncer. PS2P446 no tuvo reactividad cruzada con PSA maduro, así que las bandas de pPSA tenues vistas en 2/3 de las muestras negativas a biopsia indicaron niveles bajos de estas formas de pPSA. También se han desarrollado mAb con especificidad para [-4]pPSA y sin reactividad cruzada hacia otras formas maduras o pro de PSA, pero estos mAb tuvieron una reactividad débil en transferencias y, por consiguiente, un fondo elevado. Aunque PS2V476 indicó claramente la presencia de [-4]pPSA, no fueron posibles estimados de cuantificación. Por lo tanto no está claro qué proporción de las intensidades de banda en el panel D se deben a [-4]pPSA o a [-7]pPSA de longitud completa. Sin embargo, es evidente que ninguna forma de pPSA está presente de forma tan consistente en el suero de cáncer como [-2]pPSA. En experimentos de control, suero femenino, pasado sobre la columna de inmunoafinidad y trabajado de forma idéntica que el suero masculino, no mostró bandas de pPSA cuando se sondeó con los mAb específicos para pPSA anteriores.

Ejemplo 4 Tinción Inmunohistoquímica de pPSA en Tejido Prostático

Se ensayaron los mAb de pPSA para determinar tinción en tejidos prostáticos. El PS2P446 (especificidad por [-7]/[-4]pPSA) y PS2X373 (especificidad por [-2]pPSA) tuvieron intensidades de tinción similares, mientras que PS2V476 (especificidad por [-4]pPSA) no funcionó bien para inmunotinción. Tanto PS2X373 como PS2P446 mostraron un patrón de tinción generalmente similar como se ha indicado en la Figura 7A, aunque PS2X373 mostró tinción más intensa en secreciones de cáncer como se muestra en la Figura 7B. El epitelio canceroso mostró tinción epitelial consistente en los 9 cánceres ensayados. PIN también mostró tinción fuerte consistente. Los tejidos benignos se tiñeron de forma menos intensa que el cáncer en general, aunque los tejidos benignos circundantes fueron más variables. La Figura 7A demuestra que las formas de pPSA truncadas se pueden detectar en el epitelio de tejidos prostáticos fijados, lo cual proporciona apoyo adicional a que las formas de pPSA truncadas no son un resultado artificial de la extracción de tejido, sino que están presentes de forma natural en tejidos prostáticos. Ya que PS2X373 y PS2P446 reconocen formas diferentes de pPSA, la tinción comparable mediante ambos mAb (no mostrada) indica que múltiples formas de pPSA están presentes en tejidos prostáticos. La tinción más intensa del [-2]pPSA en secreciones cancerosas (Figura 7B) podría explicar la frecuencia de esta forma en el suero de cáncer.

Ejemplo 5 Inmunoensayo para BPSA en Suero Humano

Previamente se ha identificado una forma de PSA asociada a BPH denominada BPSA. También se puede encontrar una descripción detallada de este proceso en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente del mismo propietario número de serie 09/303.208. El BPSA se encuentra en tejido prostático que contiene nódulos de BPH, pero no está relacionado con tejido de cáncer prostático. Se ha desarrollado un inmunoensayo con especificidad y sensibilidad elevada por BPSA como se ha descrito en la sección de Métodos. Se ensayó suero de 52 hombres diagnosticados con hiperplasia prostática benigna clínica (BPH) para determinar BPSA por inmunoensayo. Además, también se ensayaron 92 hombres sin diagnóstico de enfermedad prostática para determinar BPSA como un grupo de control. La Figura 8 muestra los resultados de ensayo de 52 hombres con BPH clínica y 92 controles. Los hombres con BPH contenían un nivel de BPSA medio de 116 pg/ml, mientras que el nivel de BPSA medio fue inferior al límite mínimo detectable de 60 pg/ml. Estos resultados demuestran que BPSA está presente en el suero de pacientes con BPH clínicamente diagnosticada.

Ejemplo 6 La Proporción de [-2]pPSA y BPSA en Suero Humano

Las muestras de pacientes en la Figura 6 se analizaron adicionalmente para determinar BPSA por inmunoensayo. La Tabla 1 muestra los resultados de los análisis de [-2]pPSA y BPSA. Los valores de [-2]pPSA se determinaron me-
diante análisis densitométrico de las bandas de transferencia de Western y se determinó BPSA

\hbox{mediante
inmunoensayo.}

TABLA 1

1

La Figura 9 muestra 2 ejemplos diferentes de cómo la proporción de [-2]pPSA/BPSA se podría usar para detectar cáncer prostático. En cada ejemplo las muestras positivas a biopsia (es decir, cáncer) y negativas a biopsia contenían prácticamente la misma cantidad de PSA total en el suero. En el Ejemplo A, ambas muestras contenían aproximadamente 10 ng/ml de PSA total. La muestra de cáncer contenía [-2]pPSA elevado y BPSA bajo en comparación con los mismos PSA de muestra negativa a biopsia. Esto produce una proporción de [-2]pPSA/BPSA para el suero de cáncer que es 25 veces mayor que la del suero negativo a biopsia.

Las muestras de suero en el Ejemplo B contenían aproximadamente 6 ng/ml de PSA. Este valor de PSA está en la "zona gris" de diagnóstico de 4-10 ng/ml donde es muy difícil distinguir cáncer prostático de enfermedad benigna. Mientras ambas muestras contienen niveles comparables de BPSA, el [-2]pPSA estuvo significativamente elevado en el suero de cáncer. En este caso la proporción de [-2]pPSA/BPSA del suero de cáncer fue 4 veces mayor que la del suero negativo a biopsia y proporciona una relación clara con cáncer prostático.

Ejemplo 7 [-2]pPSA es una Forma estable e Inactiva de pPSA

Se ha demostrado previamente que hK2 y tripsina pueden activar [-5/-7]pPSA a PSA maduro (véase las solicitudes de patente en trámite junto con la presente del mismo propietario números de serie 09/302.965 y 08/846.408). En el estudio actual, se ensayaron las formas [-4] y [-2]pPSA para determinar si estas isoformas tenían sensibilidad alterada a la activación. Se incubó hK2 con cada una de las formas de pPSA y la proporción de cada forma se supervisó mediante HIC-HPLC como se muestra en la Figura 3B.

La Figura 10 muestra la velocidad relativa de activación de pPSA por hK2. El [-5/-7]pPSA se activó más rápidamente, mientras que el [-4]pPSA se activó más lentamente. Más significativamente, [-2]pPSA no se activó mediante hK2. La Figura 11 muestra el perfil cromatográfico de formas de pPSA después de una incubación prolongada de hK2 al 40% con la isoforma individual de pPSA. Después de 5 h de incubación a 37ºC, [-2]pPSA todavía no mostraba evidencia de conversión en PSA maduro (Figura 11A). Después de incubación durante 2 h, la mayor parte del [-4]pPSA se convirtió (Figura 11B). Por el contrario, las formas [-5] y [-7]pPSA se convirtieron en PSA maduro en menos de 1 hora (Figura 11C). Se debe indicar que la proporción de las especies [-5] y [-7]pPSA contenida dentro del pico de 12 min en el Panel C no cambió a lo largo de todo el proceso de activación, según se determinó mediante secuenciación N-terminal, indicando que estas dos especies no se podían distinguir bioquímicamente como sustratos para hK2. Por lo tanto, el cambio principal en el tiempo de retención de HIC-HPLC y en la cinética de activación de formas pPSA ocurrió tras la remoción del residuo de leucina [-5] adicional único. Estas diferencias entre las formas [-5] y [-4]pPSA sugieren que la leucina [-5] juega un importante papel en el plegado de pPSA.

Además de hK2, se ha mostrado previamente que tripsina al 1% activa rápidamente pPSA en 15 min. Por lo tanto, se ensayó la capacidad de la tripsina de activar [-2]pPSA, ya que tripsina es una proteasa mucho más activa que hK2, tiene una especificidad marcada por residuos de arginina (y lisina) y se ve poco afectada en su actividad hidrolítica por aminoácidos adyacentes al sitio de escisión P1, diferentes a prolina. Después de una incubación prolongada con tripsina, se escindieron otros sitios arginina/lisina internos (como se determinó mediante secuenciación N-terminal), pero existió poca o ninguna escisión para liberar el dipéptido SR del [-2]pPSA (datos no mostrados).

Por tanto, el dipéptido líder pro en [-2]pPSA parece ser resistente a escisión mediante proteasas que, de otra manera, son capaces de escindir los péptidos líder pro [-4] y [-5/-7]. En un experimento similar al que se muestra en la Figura 5, ninguna de las isoformas de pPSA formó un complejo con más de 4 X de ACT después de 5 h de incubación a 37ºC (datos no mostrados). Esto demostró que todas las formas de pPSA truncadas y de longitud completa fueron enzimáticamente inactivas y, por tanto, se esperaría que permanecieran como PSA libre en suero.

Ejemplo 8 Anticuerpos Monoclonales con Reactividad Preferencial hacia ProPSA

Usando los métodos descritos, se generaron los siguientes anticuerpos en fusión de PS1Z: PS1Z134, PS1Z120, PS1Z125 y PS1Z81. La Tabla 2 muestra los resultados de exploración en fases de ensayo inicial (proPSA solo), de reensayo y de expansión (comparación de respuesta de proPSA a respuesta de PSA). Estos anticuerpos monoclonales demostraron respuesta elevada hacia proPSA (aproximadamente 2 veces) sobre la respuesta hacia PSA. Esta capacidad de diferenciar proPSA de PSA se mantuvo cuando los clones se cultivaron en condiciones de cultivo a gran escala.

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TABLA 2 Análisis de especificidad de hibridomas reactivos de proPSA

3

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Ejemplo 9 Caracterización de Anticuerpos Monoclonales de pPSA Específicos para pPSA

Se prepararon anticuerpos monoclonales (mAb) contra [-7]pPSA de longitud completa mediante inmunización con la proteína recombinante quimérica que consiste en hK2 con el péptido líder pro PSA APLILSR. Ya que los primeros 17 aminoácidos N-terminal de hK2 son idénticos a PSA, la sustitución del péptido líder pro pPSA en hK2 proporciona ventajas en los procedimientos de inmunización y exploración con pPSA ya que no se inducen anticuerpos para el resto de la proteína de PSA maduro. La Figura 12 muestra el inmunoensayo de sándwich que muestra que 3 mAb, PS2P206, PS2P309 y PS2P446, tienen una especificidad elevada para pPSA en comparación con la forma madura de PSA.

Además de lo anterior, se obtuvieron mAb para las formas truncadas de pPSA, específicamente [-2]pPSA y [-4]pPSA mediante inmunización con péptidos que consistían en SRIVGGWECEK (SEC ID Nº: 3) e ILSRIVGGWECEK (SEC ID Nº: 4), respectivamente. La Figura 13, los paneles superior e intermedio, muestra la especificidad de 2 mAb cada uno. Cada transferencia se cortó por la mitad, indicado mediante la línea de puntos y se sondeó con 2 mAb diferentes (A y B). En el panel superior, se muestran los dos mAb de [-2]pPSA, PS2X094 y PS2X373. Los carriles designados -2 indican [-2]pPSA; -4, [-4]pPSA; -7, [-7]pPSA y 10' indica PSA maduro. Cada carril se cargó con 100 \mug de proteína. La transferencia muestra que cada uno de los mAb de [-2]pPSA tiene especificidad elevada por [-2]pPSA y reactividad insignificante con el [-4]pPSA, [-7]pPSA y PSA maduro. En otros experimentos, estos mAb mostraron una reactividad cruzada de aproximadamente el 20% por PSA maduro cuando los geles se desarrollaron en condiciones reductoras y aproximadamente el 5% cuando los geles se desarrollaron en condiciones no reductoras. El panel intermedio muestra transferencias idénticas sondeadas con 2 mAb de [-4]pPSA, PS2V411 y PS2V476. Estos mAb muestran sólo reactividad cruzada mínima hacia [-2]pPSA y ninguna reactividad cruzada hacia [-7]pPSA o PSA maduro. El panel inferior en la Figura 13 muestra una transferencia idéntica sondeada con 2 mAb de [-7]pPSA, PS2P309 y PS2P446. Estos son dos de los mAb descritos en la Figura 12. Esta transferencia muestra que en condiciones desnaturalizantes en una transferencia de Western, estos mAb tienen reactividades equivalentes con las formas [-4] y [-7]pPSA, pero no tienen reactividad con [-2]pPSA y PSA maduro.

Los tres mAb con especificidades de pPSA selectivas, PS2P446 (especificidad para [-7]/[-4]pPSA), PS2V476 (especificidad para [-4]pPSA) y PS2X373 (especificidad para [-2]pPSA), también se ensayaron para determinar sus reactividades relativas entre sí y hacia PSA maduro en una placa de microtitulación de ensayo de sándwich. En este caso, el Fab' biotinilado de mAb PS2J163 que se une a todas las formas de PSA estaba unido a una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina y se incubó con la forma indicada de pPSA como se ha visto en la Figura 14. Después los 3 mAb anteriores se diluyeron en serie y se incubaron con los diferentes antígenos PSA y pPSA unidos. La unión de los mAb de pPSA se detectó con anticuerpos anti-ratón HRP. La Figura 14 muestra que cada uno de los mAb de pPSA tenía especificidad por su forma indicada de pPSA. Existe alguna reactividad cruzada hacia otras formas de pPSA en algunos casos, pero todas muestran reactividad insignificante hacia PSA maduro. El resultado importante de este experimento es que muestra que mAb generados frente a tanto proteínas como péptidos pPSA son capaces de reaccionar con buena especificidad hacia el pPSA nativo apropiado en condiciones adecuadas para el desarrollo de un inmunoensayo.

El uso de tales enfoques descritos en este documento ha dado como resultado el desarrollo de mAb para detectar y diferenciar entre 3 isoformas diferentes de pPSA (Figuras 12-14). Estos mAb contenían las propiedades necesarias de sensibilidad y especificidad elevada hacia las diferentes formas de pPSA en comparación con PSA maduro.

Usando estos mAb, se pudo determinar que existen diferentes formas de pPSA en suero y que la [-2] parece ser la forma más frecuente (Figura 6). De similar importancia, se observó que [-2]pPSA comprendía un porcentaje significativo del PSA libre en suero de cáncer prostático, variando del 25-95% del PSA libre (Tabla 1). De igual importancia, esto ocurrió en el suero de hombres con valores de PSA total de 6-24 ng/ml. Por tanto, [-2]pPSA representa una isoforma significativa y relevante de PSA para el estudio de cáncer prostático. Es en el intervalo inferior a 10 ng/ml que es más difícil diferenciar Pca de afecciones benignas tales como BPH ya que ambas afecciones liberan PSA en el suero. Con frecuencia se realiza repetición de biopsias en hombres negativos a biopsia con niveles de PSA elevados. Esto es debido a que una biopsia positiva es una prueba concluyente de cáncer prostático, mientras que una biopsia negativa puede simplemente haber errado las áreas del cáncer. Por esta razón la medición de formas pPSA puede ofrecer valor diagnóstico adicional.

En este estudio, usando suero de cáncer combinado que contenía 63 ng/ml de PSA total, se ha identificado el [-4]pPSA truncado usando HIC-HPLC (Figura 4). En un estudio más detallado usando mAb de pPSA y suero de pacientes individuales se ha demostrado que [-2]pPSA puede ser la forma más predominante (Figura 6). Sin embargo, no existe conflicto entre estos resultados ya que, en la Figura 4, se usaron metodologías cromatográficas para identificar las diferentes formas de PSA. El enfoque de HIC-HPLC requirió que se recogieran fracciones de elución y el PSA se midiera mediante inmunoensayo. Debido a que PSA y [-2]pPSA se eluyen estrechamente (véase la Figura 3B), no fue posible distinguir estas dos isoformas de PSA en la Figura 4 debido a la pérdida de resolución de pico provocada por la recogida de la fracción. Por lo tanto, sólo la forma [-4]pPSA se resolvió claramente a partir del pico de PSA. No se conoce, pero es probable, que el pico de PSA en la Figura 4B contuviera algún porcentaje de [-2]pPSA.

La razón para el enriquecimiento de una forma estable y truncada de pPSA en tejidos y, en última instancia, suero se sugirió mediante los estudios de activación. Se ha demostrado previamente que pPSA se puede activar mediante hK2 y tripsina. Ya que hK2 y PSA están co-localizados en las células del epitelio columnar de la próstata, se ha especulado que hK2 puede ser la proteína endógena responsable por la activación de PSA. El proceso de activación de PSA normalmente es un proceso extremadamente eficaz ya que las formas de pPSA no son detectables en plasma seminal (datos no mostrados). La Figura 10 muestra que hK2 no tiene capacidad de activar [-2]pPSA y tiene actividad reducida sobre [-4]pPSA en comparación con [-5/-7]pPSA. Incluso tripsina, que tiene un intervalo de especificidad de sustrato mucho más amplio y activa pPSA al menos 10 X más rápidamente que hK2, no fue capaz de activar [-2]pPSA (datos no mostrados). Una incubación prolongada con tripsina dio como resultado escisión en otros sitios internos en PSA, sin escisión significativa del péptido líder pro serina-arginina. Aunque no existe evidencia directa de que hK2 es responsable de la activación de pPSA, el fallo de tanto hK2 como tripsina para activar [-2]pPSA hace menos probable que [-2]pPSA permanezca como un sustrato viable para otras proteasas de activación.

En este documento se describen los niveles relativos de diferentes formas de pPSA en suero y está en contraste directo con otros informes en la bibliografía que no fueron capaces de detectar pPSA mediante otras técnicas o fueron incapaces de desarrollar los mAb necesarios para intentar específicamente la detección de [-2]pPSA en suero.

Sin desear limitarse por la teoría, es posible que el truncamiento de pPSA a [-2]pPSA sea el resultado de escisión proteolítica post-traduccional. En este estudio de extractos tisulares, se ha observado que [-2]pPSA fue el más elevado en cáncer. En la zona de transición, el sitio de BPH, el valor medio de [-2]pPSA cayó hasta 0. Esto es importante, ya que pPSA se filtra hacia el suero como el resultado de cáncer y BPH. Ya que [-2]pPSA no estuvo presente en tejido de zona de transición de BPH, se deduce que [-2]pPSA en el suero procedía de tejidos cancerosos o tejido de zona periférica circundante. La inmunotinción de tejidos prostáticos (Figura 7) añade comprensión importante a los resultados de extracto tisular confirmando la asociación marcada de formas de pPSA con epitelio canceroso. Los resultados de la Figura 6 apoyan esta hipótesis mostrando niveles marcadamente elevados de [-2]pPSA en suero de Pca. Por el contrario, podría esperarse que el PSA liberado a partir de la zona de transición debido a BPH contuviera poco o ningún [-2]pPSA. Mientras 5/5 sueros de cáncer contenían niveles significativos de [-2]pPSA, 2/3 negativos a biopsia, es decir, suero de BPH potencial, contenían sólo niveles traza de [-2]pPSA.

Ya que se ha demostrado que los niveles elevados de PSA libre se correlacionan mejor con una enfermedad benigna, puede parecer contrario al razonamiento que el suero de cáncer contenga niveles elevados de formas pPSA, que también se observan como PSA libre. Sin embargo, la Figura 6 muestra que pPSA representa un porcentaje menor del PSA libre en enfermedad benigna y un porcentaje mayor en cáncer. Las muestras de cáncer tenían un menor % de PSA libre que las de muestras benignas, pero un porcentaje relativo mucho mayor del PSA libre era [-2]pPSA. Ya que el % de PSA libre aumentó en las muestras negativas a biopsia, aparentemente estaba comprendido de cantidades crecientes de formas de PSA inactivas diferentes a [-2]pPSA. Por tanto, pPSA forma un porcentaje progresivamente más pequeño del % de PSA libre que se obtiene a partir de una enfermedad benigna. Ya que los hombres con cáncer prostático también pueden desarrollar BPH y viceversa, será importante determinar la contribución relativa de pPSA en cada patología.

[-2]pPSA u otras formas de pPSA, podrían ofrecer el mayor valor diagnóstico como el porcentaje de PSA total, como un porcentaje del PSA libre o como un indicador independiente donde los niveles de pPSA superiores a determinado umbral tienen una relación estadística elevada con el cáncer. En el último caso, es concebible que la presencia de pPSA podría ofrecer valor diagnóstico en suero que contiene cualquier nivel medible de pPSA y especialmente en suero con menos de 4 ng/ml de PSA total.

Recientemente se ha desarrollado un inmunoensayo para detectar BPSA en suero, la forma de PSA asociada con BPH. Un inmunoensayo de pPSA en combinación con cualquier ensayo para BPSA puede añadir incluso mayor diferenciación de Pca de BPH. Los resultados de los mismos muestran que proPSA, tal como [-2]pPSA, está elevado en suero de cáncer prostático (Figura 6) y que BPSA está elevado en suero de BPH (Figura 8). En dos ejemplos de suero positivo a biopsia y negativo a biopsia con PSA total igual, la proporción de pPSA/BPSA mostró una diferencia clara entre cáncer y enfermedad benigna (Figura 9).

Es interesante indicar que la proporción [-2]pPSA/BPSA mostró un diferencial significativamente mejor entre cáncer y enfermedad benigna que el análisis de PSA libre y total (un análisis usado actualmente para distinguir cáncer prostático de BPH). En la Figura 9, Ejemplo A, cada muestra contenía PSA total próximo a 10 ng/ml, pero porcentajes muy diferentes de % de PSA Libre. El suero de cáncer contenía el 9% de PSA Libre mientras que el suero negativo a biopsia contenía el 28% de PSA Libre. En numerosos estudios, valores de % de PSA Libre menores del 10% están mucho más correlacionados con el cáncer, mientras que valores mayores del 25% tienen una correlación baja con el cáncer. Para las muestras en el Ejemplo A la proporción de [-2]pPSA/BPSA fue 25 veces mayor en el suero de cáncer en comparación con el suero negativo a biopsia.

La Figura 9, Ejemplo B presenta muestras de suero que son más difíciles de interpretar con los ensayos convencionales de PSA libre y total. El PSA total está en la "zona gris" de diagnóstico de 4-10 ng/ml y ambas muestras también contenían % de PSA Libre en la "zona gris" diagnóstica de % de PSA Libre entre el 10% y el 25%. Con protocolos de ensayo actuales que emplean sólo PSA libre y total no existe un diferencial claro ni indicio claro de cáncer prostático en ninguna muestra. Sin embargo, el [-2]pPSA estaba elevado en la muestra de cáncer y la proporción [-2]pPSA/BPSA todavía fue 4 veces mayor en la muestra del cáncer.

Estos ejemplos indican que el análisis de las isoformas de PSA [-2]pPSA y BPSA y la proporción de las mismas, puede contribuir significativamente a la detección de cáncer prostático.

<110> Beckman Coulter, Inc.

\hskip1cm

Mijolajczyk, Stephen

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Saedi, Mohammad

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Kumar, Abhay

\hskip1cm

Wolfert, Robert

\hskip1cm

Rittenhouse, Harry

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<120> Formas de Antígenos Prostáticos Específicos y Métodos para Su Detección

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<130> 1582D-451 PCT

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<140>

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<141>

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<150> US 09/792.692

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<152> 23-02-2001

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<160> 5

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 90

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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4

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<210> 2

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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5

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<210> 3

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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6

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<210> 4

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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7

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<210> 5

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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8

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Beckman Coulter, Inc.

\hskip1cm

Mijolajczyk, Stephen

\hskip1cm

Saedi, Mohammad

\hskip1cm

Kumar, Abhay

\hskip1cm

Wolfert, Robert

\hskip1cm

Rittenhouse, Harry

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<120> Formas de Antígenos Prostáticos Específicos y Métodos para Su Detección

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<130> 1582D-451 PCT

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<140>

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<141>

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<150> US 09/792.692

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<152> 23-02-2001

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<160> 5

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 90

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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9

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<210> 2

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

\hskip1cm

10

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<210> 3

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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11

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<210> 4

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

\hskip1cm

12

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<210> 5

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

\hskip1cm

13

Claims (12)

1. Un anticuerpo que se une específicamente a antígeno prostático específico pro [-2] humano (pPSA) y distingue en un inmunoensayo o transferencia de Western entre [-2]pPSA y las siguientes formas de PSA humano: [-4]pPSA, [-7]pPSA y PSA maduro.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un anticuerpo monoclonal.

3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que el péptido pro de la SEC ID Nº: 3 se usa para generar el anticuerpo.

4. Un kit de diagnóstico para detectar o determinar [-2]pPSA en una muestra que comprende una cantidad conocida de un anticuerpo como se ha indicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El kit de diagnóstico de la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo está marcado de forma detectable.

6. El kit de diagnóstico de la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo está unido a un soporte sólido.

7. El kit de diagnóstico de la reivindicación 4 comprendiendo además un segundo anticuerpo.

8. El kit de diagnóstico en la reivindicación 7, en el que el segundo anticuerpo está marcado de forma detectable.

9. El kit de diagnóstico de la reivindicación 7, en el que el segundo anticuerpo está unido a un soporte sólido.

10. El kit de diagnóstico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que la muestra es una muestra de líquido fisiológico humano.

11. El kit de diagnóstico de la reivindicación 10, en el que el líquido fisiológico se selecciona entre el grupo que consiste en sangre, suero, plasma seminal, orina o plasma.

12. El kit de diagnóstico de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que la muestra es una muestra de tejido de mamífero.