JPH02291263A - ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター複合体の免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ，産業上の利用分野 本発明は、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターイン
ヒビター・１とヒトプラスミノーゲンアクティベーター
インヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティ
ベーター複合体の免疫学的測定試薬系、測定キット、測
定方法、それらのために用いられるモノクローナル抗体
及びその抗体の利用に関する。

本発明の明細書において下記用話或いは略号は、それぞ
れ下記の意味を有する。

ＦＡＩ・１； プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１ ｔＰＡ； 組織プラスミノーゲンアクティベーターＰＡＩ・１−ｔ
ＰＡ複合体； ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・
１とヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターとの複
合体 尚、ｔ　ＰＡ　−　ＰＡ　Ｉ　−　１　ｃｏｍｐｌｅｘ
と表わすことがある。

ＭＣＡ　． モノクローナル抗体 ＦＡＩ　　・　１　−ＭＣＡ　； ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・
１に対するモノクローナル抗体ｔＰＡ−ＭＣＡ． ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターに対するモ
ノクローナル抗体 ｂ．従来技術 ｔＰＡは線溶系におけるブラスミノーゲンを活性化する
酵素であって、ｔＰＡを血栓溶解剤として使用すること
及びそのｔＰＡの生物工学的に製造することが開発され
つつある。

一方ヒトｔＰＡの活性を抑制する因子としてヒトプラス
ミノーゲンアクテイベーターインヒビター｛１：｝ＦＡ
Ｉ　　−１）、Ｕｒｏｋｌｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ　　（ＰＡＩ　・２）及びＵｒｏｋｉｎａｓｅ　ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ　ｌｉｋｅ　（ＰＡＩ　　・３）の３柱
の存在が知られている。

このＰＡＩ　　・１は、セリンプロテアーゼインヒビタ
ーの一種であり、ヒトｔＰＡと速やかに反応して複合体
を形成し、ｔＰＡの線溶活性を抑制することがしられて
いる［Ｌｅｖｉｎ，　Ｌ　Ｇ．　，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．，　　ＵＳＡ，　　８０
．　　６８０４−６８０８　（１９８６１Ｐｈｉｌ！ｐ
ｇ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．　Ａｃｔａ．８０２．　９９−１１０　（１９
８４）参照］。マタ、ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体は
ヒト血漿中にも存在することが知られている［Ｂｏｏｔ
ｈ，　　Ｎ．Ａ．　　ｅｔ　ａｌ．　　Ｔｈｒｏｍｂ．
　Ｒｅｓ．，　　３８，２６１−２６７　＋１９８５）
参照］。さらに、血中ＰＡＩ活性値と血栓症との相関が
示唆されており［Ｎｉｌｓｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ　Ｂｒｌ
ｔ．　Ｍｅｄ．　Ｊ．，　２９０．　１４５３−１４５
６　（１９８５），Ｐａｒａｍｏ，　Ｊ．Ａ．　ｅｔ　
ａｌ　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｈａｅｍｏｓｔ．，　５４，　
７１３−７１６　＜１９８５１参照］。かくしてヒトＰ
ＡＩ　　・１は血液線溶系においてブラスミノーゲンか
らプラスミンの形成における初期の段階での重要な制御
因子であることが明らかになされている。

また血中のＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体と血栓症との
関係についても知られている［＾ｍｉｒａ［　Ｊ．　ｅ
ｔ　ａｌＴｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．　Ｓｕｐｐｌｅｍｅ
ｎｔ　ＶＩＩ　９９−１１３　（１９８８）参照コ　。

従ってヒトｔＰＡ　，ヒトＰＡＩ　　・１及びＰＡＩ　
　・１一ｔＰＡ複合体は、いずれも血栓の形成と溶解の
場合に現われる重要な指標であり、血中におけるこれら
の濃度を正確に測定することができれば、血栓の形成及
び溶解の抑制の状態を的確に知ることが可能となるであ
ろうと考えられる。

ｃ６発明の目的 そこで本発明の目的は、ヒト検体中のＦＡＩ　　・１一
ｔＰＡ複合体を測定するための免疫学的測定試薬系、キ
ット及び測定方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、ヒト検体中のＦＡＩ　　・１−ｔ
ＰＡ複合体の含有量を正確に測定することが可能な免疫
学的測定試薬系、キット及び測定方法を提供することに
ある。

本発明の更に他の目的は、ヒト検体中のＰＡＩ１−ｔＰ
Ａ複合体を正確に且つ簡便に測定することが可能であり
、しかも安定した測定精度を有する免疫学的測定試薬系
、キット及び測定方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記ＰＡＩ　・１−ｔＰＡ複
合体の測定に使用されるヒトＦＡＩ　　・１に対するモ
ノクローナル抗体及びそれを産生ずるハイブリドーマを
提供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ
複合体の測定に使用されるヒトｔＰＡに対するモノクロ
ーナル抗体及びそれを産土するハイブリドーマを提供す
ることにある。

本発明の更に他の目的は、ヒト検体中のＰＡＩ１−ｔＰ
Ａ複合体の含有量を測定し、それによって血栓症の診断
方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、ヒトＰＡＩ　　・１に対する
モノクローナル抗体を使用した血栓溶解促進剤を提供す
ることにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から更に明らかと
なるであろう。

ｄ．発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的及び利点
は、ヒト検体中のＦＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体を、不
溶性固体担体に結合した第１抗体及び標識化された第２
抗体を使用して免疫学的に測定するための試薬系であっ
て、一方の抗体がヒトＦＡＩ　　・１に対するモノクロ
ーナル抗体ＪＴＩ−３またはＪＴＩ−４或いはこれらと
同等の断片であり、他方の抗体がヒトｔＰ人に対するモ
ノクローナル抗体ＪＴＡ−１またはそれと同等の断片で
あることを特徴とする免疫学的測定試薬系によって達成
されることがわかった．従来、ヒトＦＡＴ　・ｌに対す
るモノクローナル抗体は、ヒト血漿由来ＰＡＩを抗原と
したもの［Ｕｒｄｅｎ，　Ｇ．　ｅＬａｌ．　Ｔｈｒｏ
ｍｂ．　Ｈａｅｍｏｇｔ．，　５５，　３８３−３８７
　（１９８６）　］　，ヒト胎盤由来ＦＡＩを抗原とし
たもの［Ｐｈｉｌ！ｐｇ，　Ｍ．　　ｅｔ　ａｔ．　Ｔ
ｈｒｏｍｂ．　　Ｈａｅｍｏｓｔ．，５５，　　２１３
−２１７　＜１９８６）参照］、ヒトＦｉｂｒｏｓａｒ
ｃｏｍａｃｅｌｌ　Ｉｌｎｅ由来ＰＡＩを抗原としたも
の［Ｎｉｅｌ＋ｅｎ，Ｌ．Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｒ
ｏｍｂ．　Ｈａｅｍｏｓｔ．，　５５．　２０６−２１
２（１９８６）参照］が報告されている。

そこで本発明者は、ヒト血管壁内皮細胞由来ＦＡＩを抗
原としたモノクローナル抗体を多数作製した．一方ヒト
ｔＰＡに対するモノクローナル抗体を多数作製した。

本発明者らは、ＦＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体を測定す
るための手段の運択、各種モノクローナル抗体の遷別、
及びモノクローナル抗体の組合せについて、数多くの研
究を行った。その結果、数多く得られるヒトＰＡＩ　　
・１−ＭｅＡ及びヒトｔＰＡ−ＭＣＡが必ずしもすべて
本発明の目的とするＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の免
疫学的測定に利用できるものでないことがわかった。す
なわち、ＦＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の測定に利用し
うろことができ、しかもその測定精度が高く安定性が高
い測定系を組むためにはヒトＰＡＩ　　・１−ＭＣＡ及
びヒトｔＰＡ−ＭＣＡのそれぞれのＭＣＡが有するエビ
トーブ及び結合力、ヒトＰＡＩ　・１−ＭＣＡとヒトｔ
ＰＡ−ＭＣＡとの組合せによる両ＭＣＡのＡｆｆｉｎｉ
ｔｙ、不溶性固休担体に結合される第１抗体または標識
化された第２抗体として上記２種のＭＣＡの適合性など
を調べ、それら条件が充分に満足したものである必要が
ある。

かくして本発明者らの研究によれば、ヒト検体中に微量
含有ずるＰＡ＋　　・１−ｔＰＡ複合体を高い感度でし
かも安定に測定し得るモノクローナル抗体として、ＰＡ
Ｉ　　・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ一３また
はＪＴＩ−４と、ｔＰＡに対するモノクローナル抗体Ｊ
ＴＡ−１との組合せが見出された。

従って本発明のＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の免疫学
的測定においては、下記２つの態様がある。

（ｉｌ　　不溶性固木担休に結合させる第１抗体がＰＡ
Ｉ・１に対するモノクローナル抗木ＪＴｌ３またはＪＴ
ｌ４であり、標識化された第２抗体がｔＰＡに対するモ
ノクローナル抗体ＪＴＡ−１である態様、（！ｉ］　　
不溶性固体担体に結合させる第１抗体がｔＰＡに対する
モノクローナル抗体ＪＴＡ−１であり、標識化された第
２抗体がＰＡＩ　　・１に対するモノクローナル抗体Ｊ
Ｔｉ３またはＪＴｉ４である態様、本発明においては、
前記態様のうち前者の（１］の態様がより感度及び安定
性の点から優れており、またＦＡＩ　　・１に対するモ
ノクローナル抗体としてＪＴＩ−４を選択するのが一層
好ましい結果を与える。

かくして本発明において最も好ましい態様は、不溶性固
体担体に結合させる第１抗体がＰＡＩ．１に対するモノ
クローナル抗体であり、標識された第２抗体がｔＰＡに
対するモノクローナル抗体である組合せである。

本発明によれば、ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の免疫
学的測定に使用されるＰＡＩ　　・１に対するモノクロ
ーナル抗体ＪＴＩ−３及びＪＴＩ−４とｔＰＡに対する
モノクローナル抗体とこれらを産土するハイブリドーマ
が提供される。以下これらモノクローナル抗体について
説明する。

ＰＡＩ　　・１−ＭＣＡ　−　ＪＴＩ−３：このＰＡＩ
　　・１に対するモノクローナル抗体ＪＴｉ３は、それ
を産生するハイブリドーマが、ブダペスト条約に基づく
国際寄託機関である微工研（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に１９８８
年１１月２２日にＦＥＲＭ　ｐ−１０４０５として寄託
され、その後１９８９年３月２日に国際寄託に変更され
た（国際寄託；　Ｎｏ．　ＢＰ−２３１７）。

このＰＡＩ　　・１−ＭＣＡ　．　ＪＴｉ３は、サブク
ラスがＩｇＧｔでありＰＡＩ　　・１にｔＰＡが結合し
た場合（すなわち、Ｐ．ＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体に
対して〉でもＰＡＩ・１に対して結合を阻害されないが
、ＰＡＩ　　・１に対して結合した場合、ｔＰＡは結合
を阻害されるような抗原決定部位を認識する特性を有し
ている。

ＰＡＩ　　・１−ＭＣＡ−ＪＴＩ−４　；このＰＡＩ　
　・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−４は、それ
を産生するハイブリドーマが、上記微工研に１９８８年
１１月２２日にＦＥＲ！Ｉ！　ｐ−１０４０６として寄
託され、その後１９８９年３月２日に国際寄託に変更さ
れた（国際寄託Ｎｏ．　ＢＰ−２３１８）このＰＡＩ　
　・１−ＭＣＡ−ＪＴＩ−４は、サブクラスがＩｇＧｔ
であり、ＰＡＩ　　・１にｔＰＡが結合してもＰＡＩ・
１に対する結合を阻害されない。

１、ＰＡ−ＭＣＡ−ＪＴＡ−１・ このｔＰＡに対するモノクローナル抗体ＪＴＡ−１は、
それを産生するハイブリドーマが、上記微工研に１９８
８年１１月２２日ＦＢＲＭ　ｐ−１０３９９として寄託
され、その後、１９８９年３月２日に国際寄託に変更さ
れたく国際寄託Ｎｏ．　ＢＰ−２３１６） このｔＰＡ−ＭＣＡ−ＪＴＡ−１は、ｔＰＡ　・１が結
合した場合（すなわち、ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体
に対して）でもｔＰＡに対して結合を阻害されない。

本発明のＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の免疫学的測定
においては、前述したＭＣＡを組合せて使用されるが、
ＭＣＡは、それ自体のみならず、それと同等のＭＣＡ断
片（　ｆｒａｇｍｅｎｔ）でも同様に使用し得る。ここ
で“同等のＭＣＡ断片“とはＭＣＡと同じような結合特
性を有するか、ＭＣＡの本質的結合能が、維持されてい
る断片を恵昧する。具体的にはユニバレント抗体、Ｆａ
ｂ，　Ｆａｂ’，　Ｆａｃｂ，或いは（Ｆａｂ’）２を
断片の例として示すことができる。

本発明において、ｔＰＡ−ＭＣＡまなはＰＡＩ　　・１
−ＭＣＡをＦａｂ’フラグメントとして使用する場合、
それ自体知られた方法でＦａｂ’フラグメント・を調製
することができる。すなわち、ｔＰＡ−ＭＣＡまたはＰ
ＡＩ　　・１一ＭｅＡをペプシンで分解することによっ
てＦ（ａｂ’）２フラグメントを得、次いでこれを還元
処理することによってＦａｂ’フラグメントを得ること
ができる。

このＦａｂ’フラグメントの調製法は下記文献を参照す
ることができる。

（ｉｌ　　Ａ．　Ｎｉｓｏｎｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ．，　
Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，　８９．
　２３０　（１９６０）．（ｉｉ）　　Ｐ．　Ｐａｒｈ
ａｔ　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ，　１３１．　２８９３
　（１９８３）．本発明において、ＰＡＩ　　・ｌ−ｔ
ＰＡ複合体の免疫学的測定の対象となるヒト検体として
は、一ｍにヒト由来の臨床サンプル、例えば、血清或い
は血漿形態の血液、関節液、リンパ液、胸腺水、腹水、
羊水、細胞組織液、骨髄液または尿の如きＰＡＩ１−ｔ
ＰＡ複合体が含有されているかまたは含有が予測される
体液を挙げることができる。前述したようにＰＡＩ　　
・１−ｔＰＡ複合体は、血栓の形成或いは溶解に密接に
関係しているので、血清或いは血漿形態の血液を検体と
して使用するのが有利である。

殊に血栓症の診断或いは治癒の判定のためには血清また
は血漿、特に血漿を使用するのが適している。

以下本発明におけるＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の免
疫学的測定のための試薬系、キット及び方法について、
更に詳細に説明する。

（Ａ−１）　ＰＡＩ　・１−ｔＰＡ　　Ａ体測　のため
の試薬系；前述した通り、本発明によればヒト検体中の
ＰＡ１　．　１−ｔＰＡ複合体を、不溶性固体担体に結
合した第１抗体及び標識された第２抗体を使用して免疫
学的に測定するための試薬系であって、一方の抗体がＰ
ＡＩ　　．　１−ＭＣＡ　ＪＴＩ−３またはＪＴＩ−４
或いはこれらと同等の断片であり、他方の抗体がｔＰＡ
−ＭＣＡＪＴＡ−１またはそれと同等の断片であること
を特徴とする免疫学的測定試薬系が提供される。

かかる測定試薬系において、不溶性固体担体に結合させ
る第１抗体がＰＡＩ　・１−ＭＣＡ　ＪＴＩ−３または
ＪＴＩ−４或いはこれらと同等の断片であり、標識化さ
れた第２抗体がｔＰＡ−ＭＣＡ　ＪＴＡ−１またはそれ
と同等の断片である組合せが好ましく、殊にＦＡＩ−１
−ＭＣＡとしてはＪＴＩ−４を使用するのが好ましい。

最も好ましい態様は、第１抗体がＰＡＩ　−　１−ＭＣ
Ａ　ＪＴＩ−４　（ｗｈｏｌｅｌであり、第２抗体がｔ
ＰＡ−ＭＣＡ　ＪＴＡ−１のＦａｂ’フラグメントを用
いる組合せである。

前記測定試薬系における不溶性固木担体としては、一最
に免疫学的測定試薬のために使用されているものが使用
される。かかる固体担体を形成する材質としては、天然
からの重合体またはその誘導体と合成重合体またはその
誘導体のいずれでもよく、また有機または無機のいずれ
であってもよい。前記固体担体としては具体的にはプラ
スチック容器、プラスチックビーズ、プラスチックステ
ック、ラテックスビーズ、ガラスビーズまたは金属粒子
であることができる。

前記固体担体を形成する重合体について説明すると、例
えばセルロース、セファデックスセルロース、カルボキ
シメチルセルロース、ニトロセｌレロース、酢酸セルロ
ース、デキストランの如き天然の多糖類またはその誘導
休；ガラスまたはシリカゲルの如き無機重合体；ボリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ、ポリ
フッ化ビニル、ポリアミン、メチルビニルエーテルーマ
レイン酸共重合体またはエチレンーマレイン酸共重合体
の如きビニル系重合体；６−ナイロン、６．６ーナイロ
ンのようなボリアミド、ポリエチレンテレフタレートの
ようなポリエステルまたはアミノ酸重合体の如き縮合系
重合体を例示することができる。

不溶性固体担体の形状としては、具体的には試験管、マ
イクロタイタープレート、ビーズ、ステック（スプーン
状、円筒状）または膜状物（Ｍｅｍｂｒａｎｃｅ）であ
ることができる。

前述した不溶性固体担体に、第１抗体を結合させるには
、それ自体知られた方法で行うことができる。例えば物
理的吸着法例えば不溶性固体担休を該第１抗体の溶液に
浸漬する方法；イオン結合法例えばイオン交換樹脂或い
はアミン基、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基な
どのイオン化する官能基をもった固休担体を用いる方法
；あるいは化学反応による共有結合法例えばカルボキシ
・クロライド法、カルボジイミド法、無水マレイン酸誘
導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多
糖法、ジアゾ法、活性エステル法、架橋試薬による担体
結合法（架橋試薬としてグルタールアルデヒド、ヘキサ
メチレンイソシアナート、コハク酸イミド・マレイミド
化合物など）が使用される。さちには、ｔＰＡまたはＰ
ＡＩ　　・１に対しては結合能はないが第１抗体に対し
て生物学的反応により結合し得る物質を介して結合する
方法例えばプロテインＡ結合固体担体を用いる方法など
がある。

一方、本発明において、第２抗体に結合させる標識物買
としては、通常免疫学的測定に使用される酵素、蛍光物
買、発光物質または放射性物質が同様に用いられる。こ
れらの具体例を示すと、酵素として例えばりゾチウムマ
レート・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフ
ェート・デヒドロゲナーゼ、ベルオキシダーゼ、グルコ
ース・オキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシ
フェラーゼ、ベーターガラクトシダーゼ等；蛍光物質と
して例えばフルオレセイン、ローダミン、ウンブベリフ
ェロン、ランタニド・キレート等：発光物質として例え
ばルミノール、アクリニジウム・エステル、ルシフェリ
ン等；また放射性物質として例えばヨウ素−１２５、ヨ
ウ素−１３１　、｝リチウム、炭素−１３などを例示す
ることができる。

これらのなかでも標識物質としては、酵素が好ましい。

これら標識物質と、第２抗体またはその断片とを結合さ
せる方法は、例えばグルタルアルデヒド法、過ヨーソ酸
法またはマレイミド法などの通常の方法に従って行うこ
とができるが、マレイミド法がより好ましく使用される
。

酵素のマレイミド化は公知の方法により行なうことがで
きる（例えば、石川栄治編「酵素免疫測定法」、第８０
〜８３頁、１９８９年第３版、医学書院参照）。すなわ
ち例えばサクシンイミジル　４（Ｎ−マレイミドメチｌ
レ）シクロヘキサン　カーボネート（ＳＭＣＣ），スル
ホサクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサンカーボネート（スルホＳＭＣＣ）　、サクシ
ンイミジルーメタ　マレイミドベンゾエート（ＭＢＳ＞
、サクシンイミジル　６−マレイミドヘキサノエート（
ＥＭＣＳ）などにより行うことができる。

第２抗体またはそのフラグメントとマレイミドか標識物
質との反応は一般に前記記載の方法、例えば反応温度４
〜３０℃、第２抗体またはそのフラグメントとマレイミ
ドか標識物質のモル比は１二１、反応時間２０時間の条
件に従うことができる。

この場合には主として、抗体またはそのフラグメントの
硫黄原子を介して標識物質が抗体またはそのフラグメン
ト１分子当り１分子標識されたものを得ることができる
。

前記した方法に従ってＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体を
高感度で測定することができる標識化されたＦａｂ’フ
ラグメントを得ることができる。

（Ａ−２）　ＦＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体測定のため
のキット；更に本発明によれば、 （ｉ）　　不溶性固体担体に結合した第１抗体、（１１
）標識化された第２抗体、 １ｉｉ）　　溶解剤、 （ｉｖｌ　　洗浄剤及び Ｍ　酵素で標識化された抗体を使用する場合には、酵素
活性を測定するための基質及び反応停止剤を組合せてな
るヒト検体中のＰＡＩ　　・］−ｔＰＡ複合体を測定す
るためのキットであって、前記一方の抗体がＰＡＩ　　
・１に対するモノクローナル抗休ＪＴｌ３またはＪＴＩ
−４あるいはこれらと同等の断片であり、他方の抗体が
ｔＰＡに対するモノクローナル抗木ＪＴＡ−１またはそ
れと同等の断片であることを特徴とする免疫学的測定キ
ットが提供される。

かかる本発明のキットにおいて、（ｉ）不溶性固体担体
に結合した第１抗体及び（ｉｉｌ標識化された第２抗体
としては、前記（Ａ−１１　ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複
合体測定のための試薬系の項において、説明したものと
同じものが使用され、且つ好ましいものとして示したも
のが同様に好ましい。従ってここでは、これらの説明は
省略する。

前記本発明の測定キットを構成する（ｉｉｉｌ溶解剤と
しては、免疫学的測定において通常使用されるものであ
ればよい。該溶解剤として免疫反応に悪影響を与えない
ものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸
緩衝液、酢酸！！衝液などのｐｉ｛が６．０〜８．０の
範囲のものが主として使用される。

また（ｉｖ）の洗浄剤としては、同様に免疫学的測定に
おいて通常使用されるものが使用される。その例を示す
と、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩酸Ｍ街液、酢
酸Ｍ街液などやこれらに界面活性剤、例えばトリトンＸ
−１００　、ツィーン２０，　Ｂｒｉｇ３５などの非イ
オン性界面活性剤やドデシル硫酸ナトリウムなどのイオ
ン性界面活性剤を上記緩衝液に溶解したものが用いられ
る。

さらに前記測定キットにおいて、第２抗体における標識
物質として酵素を使用する場合には、（Ｖｌ酵素活性を
測定するための基質及び反応停止剤が組合される。かか
る基質及び反応停止剤は、標識物質としての酵素の種類
に対応して、免疫学的測定において通常知られているも
のを使用することができる。その例としては、ベルオキ
シダーゼの基質として２．２′−アジノージー［３エチ
ルベンツチアゾリンスルフォン酸］ジアンモニウム塩（
ＡＢＴＳ）、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３
．　３’　，　５．　５’　−テトラメチルベンヂジン
（ＴＭＢ）等があり、停止剤としてはＨ　２　Ｓ　Ｏ　
ａ、ＨＣＩ、酢酸、グリシン桜街液（　ＰＨ１０．　３
＋等がある。

アルカリフォスファターゼの基貰としては４一二トロフ
ェニｌレフ才スフェート、４−メチｌレウンベリフェリ
ルフォスフェート、ＮＡＤＰ等がある。

停止剤としてはＩＮＮａＯＨなどがある。

β−ガラストシダーゼの基質としては２−ニトロフェニ
ルーβ−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリ
ルーβ一Ｄ−ガラクトシド等がある。停止剤としては、
０．　ＩＩＪ　　Ｎａ２Ｃ　Ｏ　３などがある。

（Ａ−３）ヒト検体中のＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体
の免疫学的測定方法； 本発明によれば、、前記（Ａ−１）で説明しなＰＡＩ１
−ＭＣＡであるＪＴＩ−３またはＪＴＩ−４あるいはこ
れらと同等の断片、及びｔＰＡ−ＭＣＡまなはこれと同
等の断片を第１抗体及び第２抗体のいずれがとして使用
することにより、 （ｉ）　　不溶性固体担体に結合した第１抗体にヒト検
体を接触させ、洗浄後、次いで標識化された第２抗体を
接触させるか、或いは Ｃ１１｝　　不溶性固体担体に結合した第１抗体、標識
化された第２抗体及びヒト検体を同一系に存在せしめる ことによりヒト検体中のＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体
を免疫学的に測定する方法が提供される。

この測定方法は、前記した本発明において泗択された抗
体或いはその断片を使用することを除けば、基本的には
通称サンドウィッチ法として知られた手法である。従っ
て前記（Ａ−１＋の測定試薬及び（Ａ−２＋の測定のた
めのキットにおいて説明した不溶性固体担体に結合した
第１抗体、標識化した第２抗体、溶解剤及び洗浄剤など
を使用し、通常知られた手法に従ってヒト検体中のＰＡ
（　　・１−ｔＰＡ複合体を測定することができる。

すなわち、前記（１１の手法の如く、測定しようとする
検体と、不溶性固体担体に結合した第１抗体とを反応さ
せて洗浄後、標識化された第２抗体を反応させ、洗浄後
発色反応させる２段法と、前記（ｉｉ）の手法の如く、
測定しようとする検体、不溶性固体担体に結合した第１
抗体及び標識化された第２抗休を一緒に反応５Ｖ液中に
共存させて一定時間インキユベーションした後洗浄し、
発色反応させるまたはまず検体と不溶性担体に結合した
第１抗体を反応させてから凛識化された第２抗体を反応
させる。またはまず検体と標識化された第２抗体を反応
させてから第１抗体に反応させる１段法とがある。

本発明は、上記１段法または２段法のいずれでもヒト検
体中のＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体を感度よく測定す
ることが可能であるが、ヒト検体中にｔＰＡが比較的多
量存在するか或いは多量存在することが予想される場合
は、概して前記２段法を採用するのが好ましい。

測定は１段法及び２段法いずれも一最に５０℃以下、好
ましくは約４〜４５℃の範囲の温度条件下、約５分〜２
０時間、好ましくは約１０分〜約３時間反応させること
によって行われる。

（Ｂ−１）　ＰＡＩ　　・１及びＰＡＩ　　・１−ｔＰ
Ａ複合体測定のための試薬系； 本発明者らの研究によれば、本発明によって開発された
ＦＡＩ　　・１に対するモノクローナル抗＃ＪＴＩ〜３
及びＪＴｉ４を組合せて使用することによって、ヒト検
体中の遊離のＰＡＩ　　・１及びＰＡＩ　　・１−ｔＰ
Ａ複合木の合計量を簡単に測定するための試薬系、キッ
ト及び方法が見出された。この測定によればヒト検体中
に含まれる遊離のＰＡＩ　　・１及び上記複合体の合計
量を検出できるのでｔｏｔａｌ　ＰＡＩ　　・１を測定
することが可能であり、また前記（Ａ−３１の測定方法
と組合せれば遊離のＰＡ４　　・１を測定することも可
能となる。

すなわち本発明によれば、ヒト検体中のＰＡＩ１及びＰ
ＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体を不溶性固体担木に結合し
た第１抗体及び凛識化された第２抗体を使用して免疫学
的に測定する試薬系であって、一方の抗体がＰＡＩ　　
・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３またはそれ
と同等の断片であり、他方の抗体がＰＡＩ　　・１に対
するモノクローナル抗体ＪＴＩ−４またはそれと同等の
断片であることを特徴とする免疫学的測定試薬系が提供
される。

この試薬系において、モノクローナル抗体ＪＴＩ−３及
びＪＴＩ−４は、どちらが第１抗体であってもよいが、
第１抗体がモノクローナル抗体ＪＴＩ−４またはそれと
同等の断片であり、第２抗体く標識化抗体）がモノクロ
ーナル抗体ＪＴＩ−３またはその断片である組合せが測
定感度が高く好ましい。

この（Ｂ−１１の試薬系において、不溶性固体担体、第
１抗体をそれに結合させる方法、標識物質及び第２抗体
の標識化方法は、前記（Ａ−１＋の項において説明しな
試材と方法がそのまま適用でき、またｆ人−１＋で説明
した好ましい試材と方法が好ましい態様として適用され
る。

ｆＢ−２）　ＰＡＩ　　・１及びＰＡＩ　　・１−ｔＰ
Ａ複合体測定のためのキット； さらに本発明によれば、前記（Ｂ−１１で説明した不溶
性固体担体に結合した第１抗体及び標識化された第２抗
体を使用することによって、（ｉｌ　　不溶性固体担体
に結合した第１抗体、（１１）標識化した第２抗体、 （…｝　溶解剤、 Ｇｖｌ　　洗浄剤及び Ｍ　　酵素で標識化された抗体を使用する場合には、酵
素活性を測定するための基貫及び反応停止剤を組合せて
なるヒト検体中のＰＡＩ　　・１及びＰＡＩ１−ｔＰＡ
複合体の合計量を測定するキットが提供される。

上記測定キットにおいて、（ｉｉｉｌ溶解剤、ｆｌｖｌ
洗浄剤、及び〜）酵素活性を測定するための基質及び反
応停止剤は、それぞれ前記（Ａ−２＋の測定キットにお
いて説明したものと同じものをそのまま使用することが
できる。

本発明によれば、前記（Ｂ−１）の項において説明した
不溶性固休担体に結合した第１抗体及び標識化された第
２抗体を組合せて使用し、 （１）不溶性固体担体に結合した第１抗体にヒト検体を
接触させ、洗浄後、次いで標識化された第２抗体を接触
させるか、或いは、 （１１）　　不溶性固体担体に結合した第１抗体、標識
化された第２抗体及びヒト検体を同一系に存在せしめる
、 ことにより、ヒト検体中のＰＡＩ　　・１及びＰＡＩ　
　・１−ｔＰＡ複合体の合計量を免疫学的に測定する方
法が提供される。

この（Ｂ−３１の測定方法は、前記（Ｂ−１＋で説明し
た第１抗体及び第２抗体の組合せを使用することを除け
ば、前記（Ａ−３１説明した手法及び試材が同様に適用
される。

前記した（Ｂ−１１〜（Ｂ−３１の試薬系キット及び方
法を用いることによってヒト検体中のＰＡＩ　　・１及
びＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の合計量を高い感度及
び精度で測定することができる。測定されたこの合計量
は、ヒト検体中の遊離の全ＰＡＩ　　・１及び複合体中
のＰＡＩ　　・１を測定していることになるので、ある
意味では、ヒト形態中の全ＦＡＩ　　・１を測定してい
ることを意味する。

従ってこの（Ｂ−１）〜（Ｂ−３＋によって測定された
値から、前記（Ａ−１）〜（Ａ−３）によって測定され
たＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の含有量の値を引くと
、その値はヒト検体中の′ｉ１１離のＰＡＩ　　・１の
含有量を意味することになる。

（Ｃ）免疫吸着体； 本発明による不溶性固体担体にＰＡＩ　　・１に対する
モノクローナル抗体ＪＴＩ−３またはＪＴＩ−４或いは
、これらと同等の断片を結合させた免疫吸着体は新規で
あり、前記（Ａ−１）または（Ｂ−１１の測定試薬系に
おける要素として使用されるばかりでなく、後述するよ
うに、（ａ）　ＦＡＩ　　−　１及びＰＡＩ　　・１−
ｔＰＡ複合体を含む混合物、（ｂ）　ｔＰＡ及びＰＡＩ
　　・１−ｔＰＡ複合体を含む混合物または（ｃ）　Ｐ
ＡＩ　　・１　、ｔＰＡ及びＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複
合体を含む混合物から、各成分を分離回収するための免
疫吸着体として利用できる。

以下、上記免疫吸着体を使用する各成分の分離回収方法
について説明する。

上記（ａ）〜（Ｃ）の各混合物は、前記したヒト検体、
殊に血清または血漿の如き血液であってもよく、またヒ
ト血管壁内皮細胞の如きヒトＰＡＩ１産生細胞の培養生
成物（例えば、培養土清）にヒトｔＰＡを添加すること
によって得られた混合物であってもよい。かかる混合物
としては、少なくともＰＡＩ　・ｌ，　ｔＰＡ及び／ま
なはＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体が含まれている限り
、その含有量に関係なく、使用される。

分離・回収方法一■； この方法−■は、ＰＡＩ　　・１及びＰＡＩ　・１−ｔ
ＰＡ複合体を含む原料混合物を、 （１）前記免疫吸着体と接触せしめて、該吸着体にＰＡ
Ｉ　　・１及びＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体を選択的
に結合せしめ、 （２）得られた結合吸着体を前記混合物から分離し、（
３）該結合吸着体に溶出液を接触させてＰＡＩ　　・１
及びＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体を該溶出液中に溶出
させ、 （４）かくしてＰＡＩ　　・１及びＰＡＩ　　・１−ｔ
ＰＡ複合体を含有する混合溶液を得、 ｛５｝該混合溶液をｔＰＡに対する抗体またはそれと同
等の断片を不溶性固体担体に結合させた免疫吸着体と接
触せしめて、ＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体を選択的に
該吸着体に結合せしめ、 （６）得られた前記ＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体の結
合吸着体を、前記混合溶液から分離し、 （７）分離されたＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の結合
吸着体に、溶出液を接触させて、ＰＡＩ　　・１−ｔｐ
Ａ複合体を該溶出液中へ溶出させ、 （８）得られた溶出液からＰＡＩ　・１−ｔＰＡ複合体
を回収する、 （９）また必要ならば、前記（６）の工程で分離された
溶液からＰＡＩ　　・１を回収する、ことよりなる前記
原料混合物からＰＡＩ　　・１−ｔｐＡ複合体またはそ
れとＰＡＩ　　・１の分離回収方法である。

前記方法−■において、工程｛５｝における“ｔＰＡに
対する抗体″としては、ｔＰＡ　・１に対するモノクロ
ーナル抗体であってもよく、またポリクローナル抗体で
あってもよい。またｔＰＡに対するモノクローナル抗体
としては、種々のモノクローナル抗体であってもよいが
、前記したＪＴＡ−１であることもできる。

また前記（６）から分離された混合溶液からＦＡＩ・１
を回収することもでき、この方法も本発明に包含される
。

さらに前記工程（３）及び｛７｝の溶出液としては、例
えば酸として０．　２Ｍ酢酸（　ｐＨ２．　８）、ＩＭ
酢酸（ｐＨ３．０）、０．２Ｍ酢酸一塩酸（　ｐＨ１．
　８）、５０ｍＭグリシン塩酸（　ｐ１｛２。４｝、０
，ＩＭグリシンー塩酸（ｐＨ２．２＋、０．１Ｍクエン
酸ナトリウム／　ＬＭ　Ｎａｉｌ（ｐＨ２．２）　、１
０ｍＭ塩酸・０．　１５Ｍ　Ｎａｉｌ　（　ｐＨ２．　
２）等があり、アルカリとして５０ｍＭジエチルアミン
ー塩酸＜ｐＨ１１．５）、５０ｍＭジエチルアミンー塩
′ｖｉ／０．　５％ＤＯＣ（ｐＨ１１．５＞、ＬＭアン
モニア水があり、カオトロビックイオンとして２．５Ｍ
　　ＭｇＣｌ２／０．２Ｍホウ酸ナトリウム／０．　１
％ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００　（　］）｝＋６．　５１
、３Ｍ　ＮＨ４ＳＣＮ、３Ｍ　ＫＳＣＮ、２Ｍ　ＫＢｒ
、２Ｍ　Ｎａ工／５０ｍＭリン酸／０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００　＜ｐＨ７）等があり、タンパク質変性
剤として、４Ｍ尿素／１０ｍＭリン酸／０．９％Ｎａｅ
ｌ　（ｐＨ７．８）、６〜８Ｍ尿素／２５ｍＭ｝リスー
塩酸（ｐＨ７．４１、８Ｍ尿素／１０ｍＭリン酸（ｐＨ
６．０）、６Ｍ尿素（中性）　、０．　１−４Ｍ塩酸グ
アニジン（　ｐＨ３．　２１、６Ｍ塩酸グアニジン（ｐ
Ｈ１．５＋等があり、界面活性剤として０．５％ＤＯＣ
／１０ｍＭ｝リス／０．　１４Ｍ　ＮａＣＩ　（　ｐＨ
８．　Ｏ）、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／０
．　１Ｍリン酸（ｐＨ７．０）等があり、その他として
５０％エチレングリコール／５ｍＭリジンーＫ　Ｏ　Ｈ
　（　ｐＨ’ｌｌ．　５）／０．　１４Ｍ　ＮａＣＩ、
蒸留水等が使用される。

上記方法一工により、ＰＡＩ　　・１及びＰＡＩ　　・
１一ｔＰＡ複合体を含む原料混合物（この混合物はさら
にｔＰＡが含まれていても差支えない）から、ＰＡＩ・
１−ｔＰＡ複合体及び／またはＰＡＩ　　・１を高純度
でしかも高い回収率で分離することが可能であり、分離
されたＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体及び／まなはＰＡ
Ｉ・１は、それぞれ免疫学的測定のための標準試料とし
て、またその他実験用の試料として有効に使用される。

分離・回収方法一■； この方法一■は、ｔＰＡ及びＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複
合体を含む原料混合物を、 （１）　ｔＰＡに対する抗体またはそれと同等の断片を
不溶性固体担体に結合させた免疫吸着体と接触させて、
該吸着体にｔＰＡ及びＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体を
選択的に結合せしめ、 （２）得られた結合吸着体を前記混合物から分離し、（
３）該結合吸着体に溶出液を接触させて、ｔＰ人及びＰ
ＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体を該溶出液中に溶出させ、
（４）かくしてｔＰＡ及びＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合
体を含有する混合溶液を得、 （５）該混合溶液を、前記不溶性固体担体にＰＡＩ１に
対するモノクローナル抗休ＪＴＩ−３またはＪＴｉ４或
いはこれらと同等の断片を結合させた免疫吸着体と接触
せしめて、該吸着体にＰＡＩ１−ｔＰＡ複合体を選択的
に結合せしめ、（６）得られた前記ＰＡＩ　　・１−ｔ
ＰＡ複合体の結合吸着体を、前記混合溶液から分離し、 （７）分離された前記ＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体の
結合吸着体に溶出液を接触させて、ＰＡＩ　　・１−ｔ
ＰＡ複合体を該溶出液中へ溶出させ、 （８）得られる溶液から、ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合
体を回収する、 （９）また必要ならば、前記（６）の工程で分離された
溶液からｔＰＡを回収する、 ことよりなる前記原料混合物からＰＡＩ　　・１−ｔＰ
Ａ複合体またはそれとｔＰＡの分離回収方法である。

前記方法−■において、工程（１）における”ｔＰＡに
対する抗体″としては、ｔＰＡに対するモノクローナル
抗体であってもよく、またポリクローナル抗体であって
もよい。またｔＰＡに対するモノクローナル抗体として
は、種々のモノクローナル抗体であってもよいが、前記
したＪＴＡ−１であることもできる。

また前記工程（６）から分離された混合溶液からｔＰＡ
を回収することもでき、この方法もまた本発明に包含さ
れる。

さらに前記工程（３）及び（７）の溶出液としては、前
記方法一■で説明した溶出液と同じものを使用すること
ができる。

上記方法一■により、ｔＰＡ及びＰＡＩ　　・１−ｔＰ
Ａ複合体を含む原料混合物（この混合物はさらにＰＡＩ
・１が含まれていても差支えない）から、ＰＡＩ１−ｔ
ＰＡ複合体及び／またはｔＰＡを高純度でしかも高回収
率で分離することが可能であり、分離されたＦＡＩ　　
・ｌ−ｔＰＡ複合体及び／またはｔＰＡは、それぞれ免
疫学的測定のための標準試料として、またその他実験用
の試料として有効に使用される。

本発明における２種のＰＡＩ　　・１に対するモノクロ
ーナル抗体のうち、ＪＴｉ３は、それと同等の断片を含
めて、血栓溶解促進剤として使用することができる。す
なわち、前記したようにＰＡＩ　　・１に対するモノク
ローナル抗体ＪＴＩ−３は、ＰＡＩ　　・１にｔＰＡが
結合した場合（すなわち、ＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合
体に対して）でも、ＰＡＩ　　・１に対して結合を阻害
されないが、ＰＡＩ　　・１に対して結合した場合、ｔ
ＰＡは結合を阻害されるような抗原決定部位を認識して
いる。従ってこのＪＴｉ３またはそれと同等の断片を血
栓を有するヒトの血液中に注入すると、それらがＰＡＩ
　　・１に結合して複合体を形成し、ｔＰＡ　：６”Ｐ
ＡＩ　　・１に結合して複合体を形成することが阻害さ
れ、また複合体にも結合しない。かくして血中のｔＰＡ
の作用が阻害されることがなくなるので結果としてブラ
スミンの形成が活性化され血栓の溶解が促進されること
になる。

本発明の血栓溶解促進剤は、ＰＡＩ　　・１に対するモ
ノクローナル抗体ＪＴＩ−３またはそれと同等の断片（
好ましくはＦａｂ’断片）を有効成分として含有し、そ
の他薬学的に許容し得るＣａｒｒｉｅｒが含まれていれ
ばよい。一般的には靜注用製剤として使用される。通常
モノクローナル抗木ＪＴＩ−３またはそれと同等の断片
は水性媒中に溶解乃至分散された状態で使用されるが、
その濃度はｍｇ／Ｋｇのオーダーであるのが好ましい。

（Ｅ）血栓症の病状の診断： 前記（Ａ−３１で説明した方法に従って、ヒト検体、殊
にヒト血液中のＦＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体の含有量
を測定することによって、その値から、検体提供者の血
栓の病状を診断することができる。すなわち、ＰＡＩ　
　・１−ｔＰＡ複合体がある程度以上含まれていると、
血栓症を患っているか或いは血栓症に進行しつつあるこ
とを診断でき、また血栓症にかかった人であってその治
療中に、前記複合体の量を測定することにより、その値
がある一定の値（約９ｎｇ／　ｍｌ　）以下になること
によって血栓症の治癒の診断を行なうことができる。

また前記＋Ａ−３＋で説明した方法に従って、ヒト検体
、殊にヒト血液中のＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の含
有量を測定し、一方前記（Ｂ−３１で説明した方法に従
って、ヒト検体、殊にヒト血液中のＰＡＩ　　・１及び
ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の合計の含有量を測定し
、その双方の値からまたはその差であるＰＡＩ　　・１
の含有量の値から、前記した血栓症の病状の診断を一層
正確に行なうことができる。

次に本発明におけるＰＡＩ　　・１−ＭＣＡを作製する
方法について詳細に説明する。

Ａ．抗原の単離・精製 抗原に用いるＦＡＩ−１はｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ　Ｊ．
Ａ．　らの方法［ｖａｎ　Ｍｏｕｕｒｉｋ　Ｊ．　Ａ．
　ｅｔ　ａｔ．，　Ｊ．　Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．，　２
５９．　１４９１４−１４９２１　（１９８４）参照］
を応用しヒト血管壁内皮細胞の培養上清から単離・精製
した。

Ｂ．　ＰＡＩ・１によるマウスの免疫 ｉＢａｌｂ／Ｃマウスを用いることができるが他の系（
Ｓｔｒａｉｎ）のマウスを使用することもできる。その
際、免疫計画、及びＦＡＩ　　・１の濃度は、十分な量
の抗原刺激をうけたリンパ球が形成されるよう選ばれる
べきである。例えばマウスに５０μｇのＰＡＩ−１を２
３！１間間隔で腹腔に３回免疫の後、さらに３０μｇを
静脈に投与する。最終免疫の数日後に融合の為に牌臓細
胞をとり出す。

Ｃ．細胞融合 上記の如く免疫したマウスの牌臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの牌臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。牌１ｉＩｉ細胞対、
骨髄腫細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２＝１の範
囲である。約１０８個の牌！ｌ細胞について０．５〜１
．５ｍｌの融合媒体の使用が適当である。

細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、よく知られてい
るが、本発明では、Ｐ３−Ｘ６３一λｇ８−０１細胞（
Ｐ３−０１）　［Ｙｅｌｔｏｎ，　Ｄ．　Ｔ．　ｅｔ　
ａｔ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
　８１．　１（１９７８＋参照］を用いた。

細胞融合の際使用される好ましい融合促進剤としては、
例えば、平均分子量１０００〜４０００のポリエチレン
グリコールを有利に使用できるが、この分野で知られて
いる他の融合促進剤を使用することもできる。本発明に
おいては、平均分子量４　０　０　０のポリエチレング
リコールを用いた。

Ｄ．融合した細胞の選択 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の牌臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞及び融合した
ハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫細
胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅
させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地は、
薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未融合
のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばＨＡＴ
培地）が使用される。この選択培地中では、未融合の骨
髄腫細胞は死滅する。この未融合の牌朦細胞は非腫瘍性
なので、ある一定期間後（約１週間後）死滅する。これ
らに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親
牌臓細胞の性質をあわせ持つために選択倍地中で生存で
きる。

Ｅ，各容器中野ＰＡ！　　・１に対する抗体の確認かく
してハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養上清
を採取し、ＦＡＩ　　・１に対する抗体について酵素免
疫定量法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｔｏｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ
Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）によりスクリーニングす
る。

目的の工程を産土するハイブリドーマ細胞を適当な方法
く例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法のいずれでも産生される。その第１の方
法によればハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地
で培養することにより、その培養上清からそのハイブリ
ドーマ細胞の産土するモノクローナル抗体を得ることが
できる。

第２の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子、
または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射すること
ができる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中よ
り、そのハイブリドーマ細胞の産生ずるモノクローナル
抗体を得ることができる。

Ｇ．　　ＦＡＩ　　・１含有液からのＰＡＩ−１の分離
まず前記ＰＡＩ　　・１に対するＭＣＡを不溶性担木に
固定化または結合させて吸着体を得る。その際使用され
る不溶性担体としては、ＭＣＡを用いた測定試薬または
測定用キットの基材として一殻的使用されるものであれ
ばよい。例えば材舅としてセファロース、ポリアクリル
アミド、セルロース、デキストラン、またはマレイン酸
ボリマーあるいはこれらの混合物が好ましく用いられる
。これら不活性担体の形態としては、粉末状、粒状、ペ
レット状、ビーズ状、フイルム状、繊維状など種々の形
態であることができる。まな一殻に血漿、またはその分
画成分の測定や分離に用いられる多数の凹状のくぼみを
有するプレート（ウエル）を用いることが有利である。

前記吸着体を用い、これにＰ’ＡＩ　　・１含有混合物
を接触せしめると、該吸着体に固定化したＭＣＡとＰＡ
Ｉ　　・１とが結合して、結果的にＰＡＩ　　・１が該
吸着体に結合する。かくすることによりＦＡＩ　　・１
を分離、除去することが可能である。

また前記の如くしてＰＡＩ　　・１を吸着体に結合させ
、できれば残余の混合物を洗浄して除去する。

次いで吸着体に結合しなＰＡＩ　　・１を酸性条件（０
．２Ｍグリシン塩酸）で離脱し、これを取得することに
よってＰＡＩ　　・１単離することができる。

かくして前記ＭＣＡを結合させた吸着体の使用により、
ＰＡＩ　　・１を含有する混合物からのＰＡＩ　　・１
の除去、該混合物からのＦＡＩ　　・１の分離及び精製
、該混合物中のＦＡＩ　　・１の含有量の測定などが極
めて簡単な操作で達成される。

Ｈ．　　ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体含有液からのヒ
トＰＡＩ１の分離 まず前記ＰＡＩ　　・１に対するＭＣＡを不溶性担休に
固定化または結合させて吸着体を得る。その際使用され
る不溶性担体としては、モノクローナル抗体を用いた測
定試薬または測定用キットの基材として一殻的使用され
るものであればよい。例えば材質としてセファロース、
ポリアクリルアミド、セルロース、デキストラン、また
はマレイン酸ボリマー或いはこれらの混合物が好ましく
用いられる。これら不活性担体の形態としては、粉末状
、粒状、ペレット状、ビーズ状、フイルム状、繊維状な
ど種々の形態であることができる。また一最に血漿、ま
たはその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹状
のくぼみのプレート（ウエル）を用いることが有利であ
る。

前記吸着体を用い、これにＦＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合
体含有混合物を、接触せしめると、該吸着体に固定化し
たＭＣＡとＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体とが結合して
、結果的にＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体が該吸着体に
結合する。かくすることによりＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ
複合体を分離・除去することが可能である。また前記の
如くしてＦＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体を吸着体に結合
させ、できれば残余の混合物を洗浄して除去する。次い
で吸着体に結合しなＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体を酸
性条件（０．２Ｍグリシン塩酸）で離脱し、これを取得
することによってＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体を単離
することができる。

かくして前記ＭＣＡを吸着させた吸着体の使用により、
ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体を含有する混合物からの
ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の除去、該混合物からの
ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の分離及び精製、該混合
物中のＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体量の含有量の測定
などが極めて簡単な操作で達成される。

（寄託） ＰＡＩ　　・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３
は、それを産土するハイブリドーマが、ブダペスト条約
に基づく国際寄託機関である微工研（Ｆｅ　ｒｍｅｎｔ
ａ−ｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
）に１９８８年１１月２２日にＦＥＲＮ　ｐ−１０４０
５として寄託され、その後１９８９年３月２日に国際寄
託に変更された＜ＣＩＵ際寄託；Ｎｏ．ＢＰ−２３１７
＞。

ＰＡＩ　　・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−４
は、それを産土するハイブリドーマが、上記微工研に１
９８８年１１月２２日にＰＥＲＭ　ｐ−１０４０６とし
て寄託され、その後１９８９年３月２日に国際寄託に変
更されたく国際寄託Ｎｏ．　ＢＰ−２３１８）。

ｔＰＡに対するモノクローナル抗体ＪＴＡ−１は、それ
を産生ずるハイブリドーマが、上記微工研に１９８８年
１１月２２日ＦＥＲＭ　ｐ−１０３９９として寄託され
、その後、１９８９年３月２日に国際寄託に変更された
く国際寄託Ｎｏ．　ＢＰ−２３１６）。

上記以外のＦＡＩ　・１−ＭＣＡを産土するハイブリド
ーマは、それぞれＪＴＩ−１　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４
０３＞，　ＪＴＩ−２（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４０４１，
　ＪＴＩ−５　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４０７）として、
また抗ｔＰＡ−ＭＣＡを産生するハイブリドーマはそれ
ぞれＪＴＡ−２　（ＰＥＲＭ　Ｐ−１０４００１，　Ｊ
ＴＡ−３　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４０１），　ＪＴＡ−
４　（ＦＥＢＭ　Ｐ−１０４０２１として微工研に１９
８８年１１月２２日に寄託されている。

以下実施例を掲げて本発明を詳述するが、本発明はこれ
らに限定されるわけではない。

ｅ．実施例 実施例１　−　（１） （抗原の単離・精製） 抗原に用いるＰＡＩ・１はｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ　Ｊ．
　Ａ．らの方法［ｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ　Ｊ．Ａ．　ｅ
ｔ　ａｔ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２５９
．　１４９１４−１４９２１　（１９８４）参照］を応
用し、ヒト血管壁内皮細胞の培養上清から単離・精製し
た。

すなわち、ウシ血清を含まないヒト血管内皮細胞培養上
清をＣＨ　Ａ．　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ吸着体に接触させ
、上清中のＰＡＩ　　・１を含む両分を吸着させた。吸
着体を洗浄後、Ｉ　Ｍ　ａ−Ｍｅｔｈｙｌｍａｎｎｏｓ
ｉｄｅを含むバッファーで吸着画分を溶出した。この溶
出画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳
動法を用いて分子量分画を行ない、ＰＡＩ　　・１に相
当する分子量部分のゲルを切り出し、このゲル断片より
タンパク質を抽出して抗原とした。

実施例１　−　＋２１ （ＭＣＡの取得） 実施例１　−　（１）の方法で精製したＰＡＩ　　・１
を雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（４周齢〉２匹に対して１４
日間隔で４回免疫しな。初回の免疫はＰＢＳに溶解した
。５０μｇのＦＡＩ　　・１を等量のフロイントの完全
アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　
ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合し、そのエマルジョンを、一
匹あたり５０μｇとなるように腹腔内に投与した、２回
目、３回目は、同じ＜５０μｇのＰＡＩ−１をフロイン
トの不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’Ｓｉｍｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）混合し、同じく腹腔内
に投与しな。最終免疫は１０μｇのＰＡＩ　　・１をＰ
ＢＳ溶液のまま、マウス尾静脈から追加投与した。最終
免疫の３日後に免疫したマウスの牌臓細胞を細胞融合に
用いた。

免疫したマウスの＃臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（Ｐ３Ｕ１１を約２＝１〜約１５：１の割合で混合し、
５０％ポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ）
を融合促進剤としてＫ６ｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの
方法に従い細胞融合を行なった。融合後の細胞は、Ｉ　
ＸＩＯ’　ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞濃度となるように１０
％ＦＣＳ　−−ＲＰ１１Ｉ−１６４０培地に懸濁し、９
６ｗｅ　Ｉ　Ｉ　ｓマイクロプレート（Ｃｏｓｔｅｒ）
に１ウエｌレ当り１００　μ（Ｊずつ分注した。

融合細胞は、Ｃ　Ｏ　２インキュベーター（５％ＣＯ２
　．３７℃｝中で培養し、ヒボキサンチン、アミノブテ
リン；チミジンを含む培地（ＩＩＡＴ培地）で培地交換
を行ない、ＨＡＴ培地中で増殖させて、牌臓細胞と、骨
髄腫細胞からなるハイブリドーマのスクリーニングを行
なった。

ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ＰＡＩ・１を
コーティングしたマイクロタイタープレートを用いＥＬ
ＩＳＡ法により検出した。第２抗体には、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（以降ＨＲＰと略す）標識ウサギ抗マウ
スＩｇＧ抗体を用いた。

融合細胞をまいた合計５７０のウエルのうち５１１のウ
エルにコロニーの形成が認められる。このうち抗体産生
陽性ウエルは下記表１に示すように８ウエルであった。

これらの抗体産生陽性ウェルについて限界希釈法による
クローニングを２回繰り返して行ない５個のクローンを
得た。このクローンから産土されるＭＣＡをそれぞれＪ
ＴＩ−１，　ＪＴＩ−２ＪＴＩ−３，　ＪＴＩ−４，　
ＪＴｌ５とする。得られたクローンは９０％ＦＣＳ　−
１０％ＤＭＳＯ中に懸濁させ液体窒素中保存した。各ク
ローンの産土するＭＣＡは、クローンをＢａｌｂ／Ｃマ
ウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロテインＡ　−
　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂカラムを用いて精製した
。

表　１　（細胞融合） 牌１１”ｌｌｉ細胞［ｃｅｌ　Ｉ／　ｍｌ　］　　　９
．　Ｏ　Ｘ　１０７骨髄腫細胞［ｃｅｌｌ／ｍｌ］　　
ｌｊ　ＸＩＯ７牌臓細胞 比　　　　　　６．９ 骨髄腫細胞 細胞数［ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ］　　　１．５８Ｘ１０５
ｗｅｌｌ数　　　　　　　　５７０ コロニーを形成した陽性ｓｅｌｌ数 ５１１　（８９．６％） 抗体産生陽性ｗｅｌｌ数　　　　８（１、５７％）ドデ
シル硫酸ナトリウム（以後ＳＤＳと略す）で活性化した
ＰＡＩ　　・１へのＭＣＡ結合能を、抗原固定化エンザ
イムイムノアッセイ法を用いて検定した。

ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ＰＡＩ　　・１溶液に、終濃度０
．１％となるようにＳＤＳを加え、３７℃で１時間保温
した。その後終濃度１％となるようにトライトンＸ−１
００を加え、水冷上で１時間静置した。この操作でＳＤ
Ｓ活性化ＰＡＩ　　・１が得られた。

このＳＤＳ活性化ＰＡＩ　　・１を抗原とし、また比較
のなめにＰＡＩ　　−　１−ｔＰＡ複合体、ｑｕｉｓｃ
ｅｎｔ　ＰＡＩ　−　１も抗原とし、エンザイムイムノ
アッセイを行なった。

各々の抗原を１μｇ／ｍｌのタンパク濃度に調製しポリ
スチレンプラスチックウエルに１夜４℃で、これをコー
ティングした。表２に示すように抗原との結合能を検定
した。ウエルを洗浄し、ＢＳＡでブロックし、３７゜Ｃ
で２時間、５μｇ／ｍｌのタンパク濃度に調製した５種
のＭＣＡとともに保温しな。

洗浄後、ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスとともに保温した。

洗浄後、ウエルに残存しているベルオキシダーゼ活性を
定量し、結合能を検定した。５種のＭＣＡとともにＰＡ
Ｉ　　・１−ｔＰＡ複合体、ｑｕｉｓｃｅｎｔ　ＰＡＩ
・１　，　ＳＤＳ活性化ＰＡＩ　　・１に結合能を示し
たが、ＪＴＩ−１はｑｕｌｓｃｅｎｔ　ＰＡＩ　・１へ
の結合がより強く、ＪＴｌ２はＳＤＳ活性化ＰＡＩ　　
・１への結合がより強かった。ＪＴＩ−３，　−４はと
もに３種の抗原に強く結合した。ＪＴＩ−５はＰＡＩ　
　・１−ｔＰＡ複合体に結合しな。

ＰＡＩ　　・１またはＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の
各々３００ｎｇを、ＳＤＳスラブゲル電気泳動し、この
後電気的にニトロセルロースメンブレン上にタンパクを
転移した。このニトロセルロースメンブレンをＢＳＡで
ブロックし、洗浄後、室温で２時間１０μｇ／ｍｌのタ
ンパク濃度になるように調製したＪＴＩ−１〜５それぞ
れの溶液中で保温した。洗浄後ＨＲＰ標識ウサギ抗マウ
ス抗体とともに保温した。洗浄後、ニトロセルロース上
に、抗原と結合して残存しているＩＩＲＰ標識抗体のべ
ルオキシダーゼ活性を検出した。結果を表２に示した。

ＪＴｉ２〜４は、ＰＡＩ　　・１単独、ＰＡＩ　　・１
−ｔＰＡ複合体ともに結合能を示した。

（解離定数） Ｃｏｍｐｌｅｘ ４．４Ｘ　Ｏ−’Ｍ １．０３Ｘ　Ｏ−８Ｍ ５．ＯＸ　Ｏ−８Ｍ ２．８Ｘ　Ｏ−８Ｍ ＩＸ　Ｏ−’Ｍ＜ 表３　Ｋｄ ｑＰＡＩ・Ｉ ＪＴ　−１　　　　９．Ｉ　　Ｘ　　Ｏ−９ＭＪＴ　−
２　　　　４．７　　Ｘ　　Ｏ−９ＭＪＴ　−３　　　
　２．１　　Ｘ　　Ｏ−９ＭＪＴ−４　　　　９。２　
　Ｘ　　Ｏ−’ＭＪＴｉ５　　　　１　Ｘ　Ｏ−５Ｍ＜ ｑＰＡＩ　；　ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ＰＡＩ　　−　１
Ｃｏｍｐｌｅｘ　；　ＰＡＩ　　−　１−ｔＰＡ複合体
また、抗原固定化法で、ＭＣＡの抗原への結合能を分析
した結果、表３に示した解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔ
ｉｏｎ　Ｃｏｎｓｔａｎｔ，以後Ｋｄと略す）を得た。

（　ＪＴＩ−２のイムノブロッテイングでの結合能》Ｐ
ＡＩ　　・１またはＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の各
々３００ｎｇを、ＳＤＳスラブゲル電気泳動し、この後
電気的にニトロセルロースメンブレン上にタンパクを転
移した。このニトロセルロースメンブレンをＢＳＡでブ
ロックし、洗浄後、室温で２時間１０μｇ　／　ｍｌの
タンパク濃度になるよう調製した。ＪＴＩ−２溶液中で
保温した。洗浄後ＨＲＰ標識ウサギ抗マウス抗体ととも
に保温した。洗浄後、ニトロセルロース上に、抗原と結
合して残存しているＨＲＰ標識抗体のべルオキシダーゼ
活性を検出した。結果を図１に示した。ＪＴＩ−２は、
ＰＡＩ　　・１単独、ＰＡＩ　　・１一ｔＰＡ複合体と
もに結合能を示した。

実施例２ （抗ｔＰＡ　−　ＭＣＡの作成） Ｒｉｊｋｅｎ　Ｄ．Ｃ．らの方法［Ｒｉｊｋｅｎ　Ｄ．
Ｃ．　ｅｔ　ａｔＪ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２
５６．　７０３５−７０４１　（１９８１）　］を応用
し、ヒトメラノーマ細胞の培養上清から単離・精製した
ｔＰＡを高原として用い、実施例１と同様にして下記の
ような抗ｔＰＡ　−　ＭＣＡ産土ハイブリドーマ及び抗
ｔＰＡ−ＭＣＡを作成した。

得られたＭＣＡをそれぞれＪＴＡ−１，　ＪＴＡ−２，
　ＪＴＡ−３，ＪＴＡ−４とする。ｔＰＡとＭＣＡとの
エンザイムイムノアッセイ法での結合能及びイムノブ口
ッテイングでの結合能は実施例１と同様に行なった。結
果は表４及び表５に示しな。

表５Ｋｄ（解離定数）　ＸＩＯ−９Ｍ 一本鎖ｔＰＡ　　二本鎖ｔＰＡ　　ＣｏｍｐｌｅｘＪＴ
Ａ−１　　　　　　７．４　　　　　　　３。４３６Ｊ
ＴＡ−２　　　　　　３．７　　　　　　　１．５　　
　　　　２４ＪＴＡ−３　　　　　　９．８　　　　　
　　６．７　　　　　　６．７ＪＴＡ−４　　　　　　
６．４　　　　　・　　９．２　　　　　　０．７実施
例３ （種々の抗体の組合せの検討１） ＦＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体量を測定する系を作製す
るために、種々の抗体の組合せでの二抗体サンドイツ千
法を検討した。まず一次抗体を抗ＰＡＩ　　・ＩＭＣＡ
とし、二次抗体を抗ｔＰＡ−ＭＣＡとした組合せを検討
した。

ＪＴＩ−１，　−２，−３或いは−４を、１０μｇ／ｍ
ｌのタンパク濃度の溶液とし、これを各々ポリスチレン
プラスチックウエルに４℃１夜静置してコーティングし
た。ウエルを洗浄し、ＵＳＡでブロックした後、それぞ
れ０，　１０，　２０，　４０ｎｇ　／　ｍｌのタンパ
ク濃度になるよう調製したＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合
体と３７℃、３時間保温しな。洗浄後、ＨＲＰ標識した
ＪＴＡ−１を２μｇ　／　ｍｌのタンパク濃度になるよ
うに調製した溶液と３７℃、３時間医温しな。洗浄後ウ
エルに残存するベルオキシダーゼ活性を定量し、サンド
イッチ法での抗原結合能を検定した。その結果を図２に
示した。

このことにより、最も高い結合能を示したものは、一次
抗体にＪＴｉ３或いはＪＴｌ４を用いたものであった。

実施例４ （種々の抗体の組合せの検討２） 一次抗体を抗ｔＰ人　・ＭＣＡとし、二次抗体を抗ＦＡ
Ｉ　　・１　・ＭＣＡとして検討しな。

ＪＴＡ−１，　−２，　−３或いは−４を１０μｇ／ｔ
ｎｌのタンパク濃度の溶液とし、これを各々ボリスチレ
ンプラスチックウエルに４℃１夜静置してコーティング
した。ウエルを洗浄し、ＢＳＡでブロックした後、それ
ぞれ０，　１０．　２０．　４０ｎｇ　／ｍｌのタンパ
ク濃度になるよう調製したＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合
体と３７゜Ｃ、３時間保温した。洗浄後、ＨＲＰ標識し
たＪＴｉｌ，　−２−３或いは−４を２μｇ／ｍｌのタ
ンパク濃度になるように調製した溶液と３７℃、３時間
保温した。洗浄後ウエルに残存するベルオキシダーゼ活
性を定量し、サンドイッチ法での抗原結合能を検定した
。

その結果を図３に示した。

このことにより、最も高い結合能を示したものは、一次
抗体にＪＴＡ−１　、二次抗体にＪＴｌ４を用いたもの
であった。

実施例５ （一次抗体としてＪＴＡ−１　、二次抗体としてＪＴｉ
４を用いたサンドイッチ法へ、遊ｉｌ！ｔｔＰＡが及ぼ
す影響） 実施例４で得た組合せにおいて、ＰＡＩ　　・１−ｔＰ
Ａ複合体を定量する場合、同時に遊離のｔＰＡが存在し
たときに複合体の定量値が妨害をうけるか否かを検討し
た。

ＪＴＡ−１を１０μｇ　／　ｍｌのタンパク濃度溶液と
し、これを各々ポリスチレンプラスチックウエルに４℃
１夜静置してコーティングした。ウエルを洗浄し、ＢＳ
Ａでブロツクした後、ＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体１
００ｇ／ｍｌの溶液に、遊離ｔＰＡを各々０，　５０，
　１００，１，　０００　ｎｇ／　ｍｌの終濃度となる
ように加えたものと、３７℃、３時間保温した。洗浄後
、ＨＲＰ標識したＪＴＩ−４を２μｇ／ｍｌのタンパク
濃度となるように調製した溶液と３７℃３時間保温した
。洗浄後ウエルに残存しているベルオキシダーゼ活性を
定量し、遊離ｔＰＡによる妨害の程度を検定した。その
結果を図４に示した。

このことより、このサンドイッチ系では遊離ｔＰＡ濃度
が、ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体濃度の１０倍程度あ
ると、ＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体測定値への妨害を
うけることがわかった。

実施例６ （一次抗体としてＪＴＩ−３或いは−４、二次抗体とし
てＪＴＡ−１を用いたサンドイッチ系へ、遊離ＰＡＩ１
が及ぼす影響》 実施例３で得た組合せにおいて、ｔＰＡ　−　ＰＡＩ　
　・１複合体を定量する場合、同時に遊離のＰＡＩ　・
１が存在したときに複合体の定量値が妨害をうけるか否
かを検討した。

ＪＴＩ−３或いは−４を１０μｇ　／　ｍｌのタンパク
濃度溶液とし、これを各々ポリスチレンプラスチックウ
エルに４℃１夜静１してコーティングした。ウエルを洗
浄し、ＢＳＡでブロツクした後、ＰＡＩ　　・１一ｔＰ
Ａ複合体１０ｎｇ／ｍｌの溶液に、遊離ＰＡＩ・１を各
々０，　１００，　２００，　３００，　４００，　５
００ｎｇ／ｍｌの濃度となるように加えた溶液と、３７
℃、３時間保温した。

洗浄後、ＨＲＰ標識したＪＴＡ−１を２　μｇ　／　ｍ
ｌのタンパク濃度となるように調製した溶液と３７℃３
時間保温した。洗浄後ウエルに残存しているベルオキシ
ダーゼ活性を定量し、遊離ＦＡＩ　　・１による妨害の
程度を検定した。その結果を図５に示した。

このことより、ＪＴＩ−３を一次抗体としたこのサンド
イッチ系では遊ＭＰＡＩ　　・ｌが、ＰＡＩ　　・１−
ｔＰＡ複合体の１０倍程度存在するだけで大きく妨害を
受けることがわかった。また、ＪＴＩ−４を一次抗体と
した場合も、遊離ＰＡＩ　　・１がＰＡＩ　　・ｌ−ｔ
ＰＡ複合体の数１０倍程度存在すると妨害を受けること
がわかった。

実施例７ （固相担体をビーズとし、一次抗体としてＪＴＩ−４、
二次抗体としてＪＴＡ−１を用いたサンドイッチ系へ、
遊＠ＰＡＩ　　・１が及ぼす影響） 実施例６において、比較的良好な結果を示した一次抗体
をＪＴＩ−４　、二次抗体をＪＴＡ−１とした組合せに
おいて、一次抗体の量を増加させるため、ポリスチレン
プラスチックウエルのかわりにポリスチレンビーズを用
いた系を検討した。

ＪＴｉ４を５０μｇ／ｍｌのタンパク濃度溶液とし、こ
の中にポリスチレンビーズを入れ、４℃１夜靜置してコ
ーティングした。洗浄した後、各々のビーズをプラスチ
ックチューブに１個ずついれ、ＢＳＡでブロックした。

洗浄後ＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体１３。２ｎｇ／ｍ
ｌの溶液に遊離ＰＡＩ−１を各々０，　５００，１００
０ｎｇ／ｍｌの終濃度になるように加えた溶液と４゜Ｃ
、１夜静置した。洗浄ごＨＲＰ標識したＪＴＡ−１を２
μｇ／ｍｌのタンパク濃度となるように調製した溶液と
３７℃３時間保温した。洗浄後ビーズに残存しているベ
ルオキシダーゼ活性を定量し、遊離ＰＡＩ　　・１によ
る妨害の程度を検定した。その結果を図６に示した。

このことより、一次抗体をコーティングする濃度を５０
μｇ　／　ｍｌとし、固相担体をポリスチレンビーズと
した系では遊ＭＰＡＩ　　・１の妨害を受けないことが
わかった。

実施例８ （ＰＡＩ　　・１単独とＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体
との全ＦＡＩ・１抗原量の測定） ＪＴＴ−３をタンパク濃度５０μｇ／ｍｌでポリスチレ
ンプラスチックウエル上に４℃で１夜静置し、コーティ
ングした。次に１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液（以
後ＴＢＳと略す）を加え、３７℃で２時間静置した後０
．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリス塩酸緩衝液（以
後ＴＢＳ−Ｔｗと略す）で４回洗浄した。次にＰＡＩ　
　・１或いはＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体を、タンパ
ク濃度１０．　２０或いは４０１ｇ／ｍｌになるように
ＴＢＳ−Ｔｗで希釈した溶液を加え３７℃で２時間靜置
した。ＴＢＳＴｗで４回洗浄後、ベルオキシダーゼで標
識したＪＴＩ−４を、ＴＢＳ−Ｔｗで２　μｇ　／　ｍ
ｌになるように希釈した溶液を加え、３７℃で２時間静
置した。ＴＢＳ−Ｔｗで４回洗浄後、ベルオキシダーゼ
基質溶液を加え室温で反応後、波長４９５ｎｍで吸光度
を測定した。

結果を図７−１に示す。この図より、ＰＡＩ　　・１単
独でのタンパク濃度或いはＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合
体のタンパク濃度と吸光度の関係は、同様の直線関係に
なることが示された。以上のことから、この測定系では
、ＰＡＩ　　・１単独とＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体
をあわせた全ＰＡＩ　　・１抗原量を測定しうろことが
示された。

（一次抗体：　ＪＴＩ−３　，二次抗休ＪＴｌ４の組合
せと一次抗体：　ＪＴＩ−４　、二次抗体ＪＴｉ３の組
合せとの比較） 上記実験と同様な要領で、ＪＴＩ−３をボリスチレンプ
ラスチックウエルにコーティングし、一次抗体として使
用し、ベルオキシダーゼで標識したＪＴｌ４を二次抗体
として使用した場合と、ＪＴｉ４を一次抗体とし、ＪＴ
Ｉ−３を二次抗体とした場合との比較を行なった。この
際ＰＡＩ　　・１とＰＡＩ　　・１一ｔＰＡ複合体との
間で抗体の結合に違いがあるか否かをみるために検体中
のＰＡＩ　　・１とＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体の混
合比を下記のように変化させた。

ＰＡＩ　　・Ｉ　　ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体Ａ　
　　１００％　　　　　θ％ ８　　　　７０％　　　　　３０％ Ｃ　　　　５０％　　　　　５０％ Ｄ　　　　３０％　　　　　７０％ Ｅ　　　Ｏ％　　　　１００％ 結果を図７−２、図７−３に示す。図７−２と図７−３
を比較してわかるように、一次抗体ＪＴｉ４、二次抗体
ＪＴＩ−３の組合せのほうが測定感度がよい。また複合
体を形成しているＰＡＩ　　・１と単独のＦＡＩ　　・
１との測定値の差がな＜ＰＡＩ　　・１の量を適確に測
定している。

実施例９ （抗ＰＡＩ　　・１　・ＭＣＡによる、試験管内でのＰ
ＡＩ１−ｔＰＡ複合体形成抑制〉 Ｑｕｉｓｃｅｎｔ　ＰＡＩ　−　１を、ＳＤＳを用いて
活性化し、ＳＤＳ活性化ＰＡＩ　　・１を得た。このＳ
ＤＳ活性化ＰＡＩ−　１　１００ｎｇにＪＴＩ−１ｙ　
−２，　−３，　−４，？ウスＩｇＧ或いはウサギ抗Ｐ
ＡＩ　　・１ボリクローナル抗体をモル比にして１０倍
または１００倍加え３７゜Ｃで１時間ｉｉ１ｌ’ｉｉ！
ｔＬた。次に１２５１標識化ｔＰＡを０．１ｎｇ　　（
ＩＸＩＯ４ｃｐｍｌ加え、３７℃で３０分間静置した。

このものをＳＤＳスラブゲル電気泳動し、ゲルを乾燥後
オートラジオグラフィーを行なった。ここで検出された
ｔＰＡ単独或いはＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体に相当
する放射活性を測定し、ｔＰＡ単独とＰＡＩ　　・ｌ−
ｔＰＡ複合体の放射活性の比を百分率表示で表６に示し
な。表に示されたように、抗ＰＡＩ　　・１ボリクロー
ナル抗体をＰＡＩ　　・１の１００倍モル量加えた場合
、ほぼ完全に複合体形成が抑制された。またＪＴｌ３を
１０倍量或いは１００倍量加えた場合も、強く複合体形
成が抑制された。またＪＴＩ−２も複合体形成を抑制す
る傾向を示した。以上のことより少くともＪＴＩ−３は
試験管内でのＦＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体形成を抑制
することが示された。

表６　試験管内でのＦＡＩ　・１−ｔＰＡ複合体形成抑
制 抗体　　　ｔＰＡ なし　　　　　　　　　　　４１％ マウスＩｇＧ　　　１００倍　　　　４０ＪＴＩ−１　
　　　　　１０倍　　　　３６１００倍　　　　３９ ＪＴ［−２　　　　　　１０倍　　　　４６１００倍　
　　　５１ ＪＴＩ−３　　　　　１０倍　　　　８１１００倍　　
　　９２ ＪＴｌ４　　　　　　１０倍　　　　３９１００倍　　
　　３３ ポリクローナル　抗体　１００倍　　　　　　　１００
Ｃｏｍｐｌｅｘ；　ＰＡＩ　・１−ｔＰＡ複合体実施例
１０ （抗ＰＡＩ　　・１　・ＭＣＡによる、ＰＡＩ　　・１
のｔＰＡ依存性プラスミノーゲン活性化阻害の抑制）Ｑ
ｕｉｓｃｅｎｔ　ＰＡＩ　・１を、ＳＤＳを用いて活性
化し、ＳＤＳ活性化ＰＡＩ　　・１を得た。このＳＤＳ
活性化ＰＡＩ・１　２０ｎｇに、ＪＴＩ−１，　−２，
　−３，　−４或いはウサギ抗ＰＡＩ　　・１ポリクロ
ーナル抗体をモル比にして１０倍または１００倍加え、
３７℃で１時間静置した。次にｔＰＡを０．　２５ｎｇ
加え、３７℃で３０分間静置した。次にプラスミノーゲ
ン２２μｇ、プラスミンの合成発色基質であるＳ−２２
５１を０．１５ｍＭになるように加え、３７℃で３時間
靜置した後、波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。なお
、ここで用いたＳＤＳ活性化ＰＡＩ　　・１の量は、ｔ
ＰＡ活性の９０％を阻害する量だった。結果を表７に示
した。表７は残存するｔＰＡ活性が、ＳＤＳ活性化ＰＡ
Ｉ　　・１を含まない場合の何％に当るかを表示した。

表に示されたように抗ＰＡ！　　・１ボリクローナル抗
体をＰＡＩ　・ｌの１００倍モル量加えた場合、ｔＰＡ
活性はほぼ完全に回復した。またＪＴＩ−３を１００倍
モル量加えた場合も約５０％ｔＰＡ活性が回復した。以
上のことよりＪＴＩ−３はＳＤＳ活性化ＰＡＩ　　・１
によるｔＰＡ依存性プラスミノーゲン活性化阻害を抑制
することが示された。

＊ 表７　抗ＰＡ！　　・１によるＰＡＩ　　・１のｔＰＡ
依存性プラスミノーゲン活性化阻害の抑制抗　体　　　
　残存ｔＰＡ活性本 なし　　　　　　　　　　　５．９％ マウスＩｇＧ　　　１００倍　　　　５．９ＪＴＩ−１
　　　　　１０倍　　　７。１１００倍　　　４．７ ＪＴＩ−２　　　　　１０倍　　　５．４１００倍　　
　４．８ ＪＴＩ−３　　　　　１０倍　　　１１．９１００倍　
　　４８。９ ＪＴＩ−４　　　　　１０倍　　　５．９１００倍　　
　７．１ ポリクローナル　抗体　　１０倍　　　　　　　５。９
１００倍　　　９５．２ ｔＰＡ単独で活性測定した場合を１００％とした。

実施例１１ （抗ＰＡＩ　　・１　・ＭＣＡによる、血管壁内皮細胞
上でのＰＡＩ　・１−ｔＰＡ複合体形成の抑制）血管壁
内皮細胞を、直径３　５ｍｍの細胞培養皿上にコンフル
エントになるよう培養した。細胞を無血清１９９培地で
洗浄後２ｍｌの無血清１９９培地、終濃度１００ｎｇ　
／ｍｌのｔＰＡ及び終濃度１０，ｃｚｇ　／ｍｌのＪＴ
Ｉ−１，　−２．　−３，　−４，マウスＩｇＧ或いは
ウサギ抗ＰＡＩ１ポリクローナル抗体を加え３７℃で３
時間静置し、上滑を回収した。この上清をＳＤＳスラブ
ゲル電気泳動を行なった後フィブリンオートグラフィー
で分析した。結果を図８に示した。図８において記号１
〜５はそれぞれ以下の場合を示す。

１　；　ＪＴＩ−１を加えた場合、２　．　ＪＴＩ−３
を加えた場合、３；ポリクローナル抗体を加えた場合、
４；ＪＴＩ−４を加えた場合、５；実験に用いたｔＰＡ
。

図８より、ウサギ抗ＰＡ！　　・１ポリクローナル抗体
を加えた場合、ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体形成は完
全に抑制されたことがわかる。またＪＴＩ−１，　ＪＴ
Ｉ−３を加えた場合もＰＡＩ　　・ｌ−ｔＰＡ複合体形
成の抑制がみられな。以上のことから、ＪＴＩＩ　　Ｊ
Ｔｉ３は血管壁内皮細胞が作る活性形ＫＰＡＩ・１によ
るＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体形成を抑制することが
わかった。

実施例１２ （　ＪＴＩ−３による線溶促進効果） ＪＴＩ−３による線溶促進効果を解析するなめに、１２
５Ｉ　−Ｆｉｂｒｉｎ　ｐｌａｔｅ法を用いて以下の実
験を行なった。

（１）一定量のｔＰＡ　（０．　００２５０／　ｍｌ　
）に、このｔＰＡ活性をほとんど阻害する量のＳＤＳ活
性化ＰＡＩ　　・１（６ｎｇ／ｍｌ＞と、桂々の濃度の
ＪＴＩ−３　（ＰＡＩ　−　１とＪＴｌ３のモル比にし
て１：１から１　：　１，０００までの量）を同時に加
えた。３７゜Ｃで２０分間保温した後、　１２５Ｉ　−
Ｆｉｂｒｉｎをｃｏａｔｉｎｇ　Ｌた２４ｗｅｌｌボリ
スチレンプレートにいれ、同時にｐｌａｓｍｉｎｏｇｅ
ｎを加えた。３７℃で２時間保温した後、上清中の１２
５■一放射活性及びプレートに残存している１２５■一
放射活性の両方を測定し、この二者の比からＦｉｂｒｉ
ｎ溶解度（％ｌｙｓｉｓ）を求めな。図９ではｓｉｍｕ
ｌｔａｎｅｏｕ！ｌｌｙと表示した。

（２）　ＳＤＳ活性化ＰＡＩ　　・１　　（６ｎｇ／ｍ
＋）にＪＴｉ３（ＰＡＩ・１とＪＴＩ−３の、モル比に
して１：］．から１　：　１，０００までの量）を加え
、３７℃で３０分間保温した。ここに一定量のｔＰＡ　
（０．　００２５ｔｌ／　ｍｌ　＞を加え、さらに３７
℃で２０分間保温しな。

このものを　１２５Ｉ　一Ｆｉｂｒｉｎをｃｏａｔｉｎ
ｇ　Ｌた２４ｗｅｌｌボリスチレンプレートにいれ、同
時にｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎを加えた。３７゜Ｃで２時
間保温した後、上清中の１２５■一放射活性及びプレー
トに残存している１２５■一放射活性の両方を測定し、
この二者の比からＦｉｂｒｉｎ溶解度（％ｌｙｓｉｓ）
を求めた。図９ではｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙと表示し
な。

この実験より、ｔＰＡ活性をほぼ完全に阻害する量のＰ
ＡＩ　　・１が存在している場合でも、ＪＴＩ−３を加
えることによりＪＴＩ−３の濃度依存的にＰＡＩ　　・
１によるｔＰＡ活性阻害が抑制されてゆき、最終的にＪ
ＴＩ−３がＰＡＩ　　・１の５００倍量程度存在すると
、ＰＡＩ　　・１によるｔＰＡ活性阻害が大部分抑制さ
れることがわかった。

実施例１３ （正常人、患者検体測定） ＰＡＩ　　−　１−ｔＰＡ　Ｃｏｍｐｌｅｘ測定系を用
い、正常人及び各種疾患患者のＰｌａｓｍａ中ＰＡＩ　
　−　１−ｔＰＡ　ｃｏｍｐｌｅｘ濃度を測定しな（図
１０）。正常人２１例においては約９ｎｇ／ｍｌを最高
値として、平均値５．３　ｎｇ／ｍｌであった。これに
対し血栓症患者５例においては約１４ｎｇ／ｍｌを最高
値として平均値計５ｎｇ／ｍｌとなり正常人とはあきら
かな差がみられた。このことにより、ＰＡＩ　　・１−
ｔＰＡ　Ｃｏｍｐｌｅｘを測定することが血栓症の診断
・治療に役立つことが示された。また他の疾患患者にお
いても２０ｎｇ／ｍｌをこえるような値もみられ、血栓
症以外の患者の診断・治療に役立つ可能性も示された。

実施例１４ （ヒト血管壁内皮細胞ＰＡＩ　　・１の精製）ヒト血管
壁内皮細胞培養上清ＬＱに、ｐＨ７．　０に調製した飽
和硫安１ρを、１時間かけ水冷攪拌しなから加えた。す
べての硫安溶液を加えおえたのち、２時間攪拌をする。

この溶液を１０．　ＯＯＯＸ　Ｇ、３０分間４℃で遠心
分離し、沈澱を分離しな。

この沈澱を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−　１１ＣＩ　ｐＨ７
．４　−０．１５ＭＮａＣＩ−０．０１％Ｔｗｅｅｎ　
８０　（以後Ｔｗ　８０と略す〉に１ｍＭ　Ｂｅｎｚａ
ｍｉｄｉｎｅ緩［ｉ液１００　ｍｌに溶解し同Ｍ．Ｗｒ
液に対して４℃で透析した。

透析を終えた試料を、前記抗ＰＡＩ　　・１　・ＭＣＡ
ＪＴｉｌを、ｌｍｇ／ｍｌ・抗体の濃度で結合させた抗
体一担体結合体１０ｍ１と混合、攪拌し４℃、１８時間
の反応を終えた抗体一担体結合体を集め、これを１００
　ｍｌの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−　ＨＣＩ−１．ＯＭ　
　Ｎａｉｌ−０．０１％Ｔｗ　８０　−　１　ｍＭ　Ｂ
ｅｎｚａｍｉｄｉｎ　ｇｆｉ液で洗浄し、さらに２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　−　ＨＣＩ−０．１５Ｍ　Ｎａｉｌ　Ｏ
．０１％Ｔｗ８０１　ｍＭ　Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ緩
％液１００ｍｌで洗浄する。

ＰＡＩ　　・１を吸着している抗体・担体結合体から０
．２Ｍグリシン・塩酸ｐＨ２．５−０、Ｏｊ％Ｔｗ　８
０Ｍｔｉｉ液を用いてＰＡＩ　　・１を溶出しな。

カラムからの溶出液は３ｍｌずつ分画した。また溶出後
各分画はＩＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ９．０を加えてｐＨ７．
　４に調製しな。

得られた試料に存在するＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体
を除くために抗ｔＰＡポリクローナル抗体を不溶化した
担体と４℃、１８時間攪拌しその上清を得た。

上記の実施例において、ＦＡＩ　　・１の精製を確認の
ためのＳＤＳ電気泳動を行ない、タンパク染色と抗ＰＡ
Ｉ　・１　・ｉｌｃＡ　ＪＴＩ−２及びＨＲＰ像識化ウ
サギ抗マウスＩｇＧを用いたイムノブロッティングの結
果を図１１に示した。

図１１において記号Ａ〜Ｆはそれぞれ以下の銀染色を示
す。

Ａ；培養上清、Ｂ；抗体力ラム素通り、Ｃ；分画１、Ｄ
；分画２、Ｅ；分画３、Ｆ；分画４。またＧはイムノブ
ロッティング発色を示す。

上記の実験において、ＪＴＩ−１をｌｍｇ／ｍｌ・抗体
の濃度で結合させた抗体一担体結合体のかわりにＪＴＩ
−３をｌｍｇ／ｍｌ・抗体の濃度で結合させた抗休一担
体結合体を用いる以外は同じ要領で実験を行なったとこ
ろ同様の結果が得られた。

実施例１５ （ＦＡＩ　　−　１−ｔＰＡ　Ｃ：ｏｍｐｌｅｘの精製
）ヒト血管壁内皮細胞を単層培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ
ｃｕｌｔｕｒｅ）　Ｌ、無血清１９９培地で洗浄した。

ここに無血清１９９培地、終濃度１，ｉｚｇ／ｍｌのタ
ンパク量のｔＰＡ及び終濃度３％のＬＫＢ社製ウルトロ
セラＧを加え一夜培養した。上清を回収し、タイパク分
解酵素阻害剤を加え、ＪＴＩ−３を固定化したセファロ
ース４Ｂ樹脂と４℃一夜保温した。樹脂を洗浄後、結合
した物買を０．２Ｍグリシン・塩酸ｐｆｌ２、５の酸性
条件で溶出しな。溶出された両分を中和後、さらに抗ｔ
ＰＡポリクローナル抗体を固定化したセファロース４Ｂ
樹脂と４℃、一夜保温した。樹脂を洗浄後０．　２Ｍグ
リシン・塩酸で溶出し中和した。得られた両分の銀染色
像を図１２に示しな。

この図より、単一のＰＡＩ　　−　１−ｔＰＡ　Ｃｏｍ
ｐｌｅｘが得られているのがわかった。また、抗ｔＰＡ
ポリクローナル抗体のかわりにＪＴＡ−１を用いても同
様の結果が得られた。

図１２において記号Ａ〜Ｅはそれぞれ以下の銀染色を示
す。

Ａ；培養上清、Ｂ　；　ＪＴＩ−３　カラム素通り、Ｃ
；抗ｔＰＡ抗体力ラム溶出画分１、Ｄ；画分２、Ｅ；画
分３。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１　−　（２＞におけるＪＴＩ−２のＰＡ
Ｉ１　、ＰＡＩ　　・１−ｔＰＡ複合体への結合能を示
すイムノブロツティング結果である。 図２は実施例３における各抗体のＰＡＩ　　・１−ｔＰ
Ａ複合体への結合能を示すものである。 図３は実施例４における抗体の組合せにおける抗体結合
能を示したものである。 図４は実施例５の遊離ｔＰＡの測定系へ及ぼす影響を示
したものである。 図５は実施例６における測定系への遊離ＰＡＩ１の及ぼ
す影響を示したものである。 図６は実施例７における、固相担体をビーズとした場合
の測定系への遊離ＰＡＩ　・１の影響を示したものであ
る。 図７は実施例８の全ＰＡＩ　　・１抗原量の測定結果を
示したものである。 図８は実施例１１の抗ＰＡＩ　　．１　　．　ＩＪＣ：
ＡのＰＡＩ１−ｔＰＡ複合体形成の抑制能を示したもの
である。 図９は実施例１２のＪＴＩ−３による線溶促進効果を示
したものである。 図１０は実施例１３における正常人及び各種疾患患者の
Ｐｌａｓｍａ中のＰＡＩ　　−　１−ｔＰＡ　Ｃｏｍｐ
ｌｅｘ濃度の測定結果を示す。 図１１は実施例１４のＰＡＩ　　・１の精製結果を示す
。 図１２は実施例１５のＰＡＩ　　−　１−ｔＰＡ　Ｃｏ
ｍｐｌｅｘの精製結果を示す。 酬 又 ＦＡＩ・ −ｔＰＡ禅壱４儂劇 （　ｎｇ／ｍｌ　） ろ−１ ＰＡＬ・Ｉ−ＩＰＡ鐘右律４底 （ｎｇ／ｍｔ） ＰＡＩ・＋−ｔｐＡ＠インイ４ヨラ鳴Ｊアー（ｎｇ／ｍ
ｌ） ｌ！′ｌｌ＋ ノβ，｛墳１ｔピ八ｔ良　（ｎｇ／ｍｌ）閏 ろ ＦＡ　’７−１　＄　ｌ’Ｍ｛Ｎ＠ｌ＝Ｊ’ｌ’ｉ犠歴
燻８Ｌ（１荀） 酪１２− ハ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ 藺ｑ−Ｚ Ｐ八１１の５１＝Ｌびヤ一） Ｍ８ ｒ！２′１ｑ一ろ ，ず｛九伴２　ブ千工一苧 二；一，ハ１冫，イコｊ：；Ｊ’ＴＩ二−｛ゴ｝ＰＡＬ
・１の遭んー　（ハ々一叉） ＋￥Ｈ１ Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアクティベータ
   ーインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクテ
   ィベーター複合体を、不溶性固体担体に結合した第１抗
   体及び標識化された第２抗体を使用して免疫学的に測定
   するための試薬系であって、一方の抗体がヒトプラスミ
   ノーゲンアクティベーターインヒビター・１に対するモ
   ノクローナル抗体ＪＴＩ−３またはＪＴＩ−４或いはこ
   れらと同等の断片であり、他方の抗体がヒト組織プラス
   ミノーゲンアクティベーターに対するモノクローナル抗
   体ＪＴＡ−１またはそれと同等の断片であることを特徴
   とする免疫学的測定試薬系。 ２、第１抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベーター
   インヒビター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−
   ３またはＪＴＩ−４或いはこれらと同等の断片であり、
   第２抗体がヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター
   に対するモノクローナル抗体ＪＴＡ−１またはそれと同
   等の断片である請求項１による免疫学的測定試薬系。 ３、該ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１に対するモノクローナル抗体が、モノクローナ
   ル抗体ＪＴＩ−４である請求項１または２による免疫学
   的測定試薬系。 ４、（ｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体、（ｉｉ
   ）標識化された第２抗体、 （ｉｉｉ）溶解剤、 （ｉｖ）洗浄剤及び （ｖ）酵素で標識化された抗体を使用する場合には、酵
   素活性を測定するための基質及び 反応停止剤 を組合せてなるヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアク
   ティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノー
   ゲンアクティベーター複合体を測定するためのキットで
   あって、前記一方の抗体がヒトプラスミノーゲンアクテ
   ィベーターインヒビター・１に対するモノクローナル抗
   体ＪＴＩ−３またはＪＴＩ−４或いはこれらと同等の断
   片であり、他方の抗体がヒト組織プラスミノーゲンアク
   ティベーターに対するモノクローナル抗体ＪＴＡ−１ま
   たはそれと同等の断片であることを特徴とする免疫学的
   測定キット。 ５、第１抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベーター
   インヒビター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−
   ３またはＪＴＩ−４或いはこれらと同等の断片であり、
   第２抗体がヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター
   に対するモノクローナル抗体ＪＴＡ−１またはそれと同
   等の断片である請求項４による免疫学的測定キット。 ６、（ｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体にヒト検
   体を接触させ、洗浄後、次いで標識化 された第２抗体を接触させるか、或いは （ｉｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体、標識化さ
   れた第２抗体及びヒト検体を同一系 に存在せしめる、 ことによりヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアクティ
   ベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲン
   アクティベーター複合体を免疫学的に測定する方法であ
   って、前記一方の抗体がヒトプラスミノーゲンアクティ
   ベーターインヒビター・１に対するモノクローナル抗体
   ＪＴＩ−３またはＪＴＩ−４或いはこれらと同等の断片
   であり、他方の抗体がヒト組織プラスミノーゲンアクテ
   ィベーターに対するモノクローナル抗体ＪＴＡ−１また
   はそれと同等の断片であることを特徴とする前記免疫学
   的測定方法。 ７、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビタ
   ー・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３。 ８、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビタ
   ー・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３を産生す
   るハイブリドーマＪＴＩ−３。 ９、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビタ
   ー・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−４。 １０、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−４を産生
   するハイブリドーマＪＴＩ−４。 １１、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターに対
   するモノクローナル抗体ＪＴＡ−１。 １２、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターに対
   するモノクローナル抗体ＪＴＡ−１を産生するハイブリ
   ドーマＪＴＡ−１。 １３、ヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアクティベー
   ターインヒビター・１及びヒトプラスミノーゲンアクテ
   ィベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲ
   ンアクティベーター複合体を、不溶性固体担体に結合し
   た第１抗体及び標識化された第２抗体を使用して免疫学
   的に測定するための試薬系であって、一方の抗体がヒト
   プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１に
   対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３またはそれと同等
   の断片であり、他方の抗体がヒトプラスミノーゲンアク
   ティベーターインヒビター・１に対するモノクローナル
   抗体ＪＴＩ−４またはそれと同等の断片であることを特
   徴とする免疫学的測定試薬系。 １４、第１抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベータ
   ーインヒビター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ
   −４またはそれと同等の断片であり、標識化された第２
   抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３または
   それと同等の断片である請求項１３による免疫学的測定
   試薬系。 １５、（ｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体、（ｉ
   ｉ）標識化した第２抗体、 （ｉｉｉ）溶解剤、 （ｉｖ）洗浄剤及び （ｖ）酵素で標識化された抗体を使用する場合には、酵
   素活性を測定するための基質及 び反応停止剤、 を組合せてなるヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアク
   ティベーターインヒビター・１及びヒトプラスミノーゲ
   ンアクティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラス
   ミノーゲンアクティベーター複合体を測定するためのキ
   ットであって、前記一方の抗体がヒトプラスミノーゲン
   アクティベーターインヒビター・１に対するモノクロー
   ナル抗体ＪＴＩ−３またはそれと同等の断片であり、他
   方の抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベーターイン
   ヒビター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−４ま
   たはそれと同等の断片であることを特徴とする免疫学的
   測定キット。 １６、第１抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベータ
   ーインヒビター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ
   −４またはそれと同等の断片であり、標識化された第２
   抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３または
   それと同等の断片である請求項１５による免疫学的測定
   キット。 １７、（ｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体にヒト
   検体を接触させ、洗浄後、次いで標識 化された第２抗体を接触させるか、或いは （ｉｉ）不溶性固体担体に結合した第１抗体、標識化さ
   れた第２抗体及びヒト検体を同一 系に存在せしめる、 ことにより、ヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアクテ
   ィベーターインヒビター・１及びヒトプラスミノーゲン
   アクティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミ
   ノーゲンアクティベーター複合体を免疫学的に測定する
   方法であって、前記一方の抗体がヒトプラスミノーゲン
   アクティベーターインヒビター・１に対するモノクロー
   ナル抗体ＪＴＩ−３またはそれと同等の断片であり、他
   方の抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベーターイン
   ヒビター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−４ま
   たはそれと同等の断片であることを特徴とする前記免疫
   学的測定方法。 １８、第１抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベータ
   ーインヒビター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ
   −４またはそれと同等の断片であり、標識化された第２
   抗体がヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３または
   それと同等の断片である請求項１７による前記免疫学的
   測定方法。 １９、不溶性固体担体にヒトプラスミノーゲンアクティ
   ベーターインヒビター・１に対するモノクローナル抗体
   ＪＴＩ−３またはＪＴＩ−４或いはこれらと同等の断片
   を結合させた免疫吸着体。 ２０、該不溶性固体担体が、プラスチック容器、プラス
   チックビーズ、ラテックスビーズ、ガラスビーズまたは
   金属粒子である請求項１９による免疫吸着体。 ２１、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１及びヒトプラスミノーゲンアクティベーターイ
   ンヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベ
   ーター複合体を含む原料混合物を、 （１）請求項１９による免疫吸着体と接触せしめて、該
   吸着体にヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒ
   ビター・１及びヒトプラスミノーゲンアクティベーター
   インヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクテイ
   ベーター複合体を選択的に結合せしめ、 （２）得られた結合吸着体を前記混合物から分離し、 （３）結合吸着体に溶出液を接触させて、ヒトプラスミ
   ノーゲンアクティベーターインヒビター・１及びヒトプ
   ラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１−ヒ
   ト組織プラスミノーゲンアクティベーター複合体を該溶
   出液中に溶出させ、 （４）かくしてヒトプラスミノーゲンアクティベーター
   インヒビター・１及びヒトプラスミノーゲンアクティベ
   ーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンア
   クティベーター複合体を含有する混合溶液を得、 （５）該混合溶液を、ヒト組織プラスミノーゲンアクテ
   ィベーターに対する抗体またはそれと同等の断片を不溶
   性固体担体に結合させた免疫吸着体と接触せしめて、ヒ
   トプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１
   −ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター複合体を
   選択的に該吸着体に結合せしめ、 （６）得られた前記複合体の結合吸着体を、前記混合溶
   液から分離し、 （７）分離された前記複合体の結合吸着体に、溶出液を
   接触させて、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターイ
   ンヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベ
   ーター複合体を該溶出液中へ溶出させ、 （８）得られた溶出液から、ヒトプラスミノーゲンアク
   ティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノー
   ゲンアクティベーター複合体を回収する、 （９）また必要ならば、前記（６）の工程で分離された
   混合溶液からヒトプラスミノーゲンアクティベーターイ
   ンヒビター・１を回収する、ことを特徴とする前記原料
   混合物から、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターイ
   ンヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベ
   ーター複合体またはそれとヒトプラスミノーゲンアクテ
   ィベーターインヒビター・１の分離回収方法。 ２２、請求項２１における工程（６）から分離された混
   合溶液からヒトプラスミノーゲンアクティベーターイン
   ヒビター・１を回収する請求項２１の原料混合物からの
   ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・
   １の分離回収方法。 ２３、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター及び
   ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・
   １−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター複合体
   を含む原料混合物を、（１）ヒト組織プラスミノーゲン
   アクティベーターに対する抗体またはそれと同等の断片
   を不溶性固体担体に結合させた免疫吸着体と接触せしめ
   て、該吸着体にヒト組織プラスミノーゲンアクティベー
   ター及びヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒ
   ビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベータ
   ー複合体を選択的に結合せしめ、 （２）得られた結合吸着体を前記混合物から分離し、 （３）該結合吸着体に溶出液を接触させて、ヒト組織プ
   ラスミノーゲンアクティベーター及びヒトプラスミノー
   ゲンアクティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラ
   スミノーゲンアクティベーター複合体を該溶出液中に溶
   出させ、 （４）かくしてヒト組織プラスミノーゲンアクティベー
   ター及びヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒ
   ビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベータ
   ー複合体を含有する混合溶液を得、 （５）該混合溶液を、請求項１９による免疫吸着体と接
   触せしめて該吸着体にヒトプラスミノーゲンアクティベ
   ーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンア
   クティベーター複合体を選択的に結合せしめ、 （６）得られた前記複合体の結合吸着体を前記混合溶液
   から分離し、 （７）分離された前記複合体の結合吸着体に、溶出液を
   接触させて、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターイ
   ンヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベ
   ーター複合体を該溶出液中へ溶出させ、 （８）得られる溶出液から、ヒトプラスミノーゲンアク
   ティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノー
   ゲンアクティベーター複合体を回収する、 （９）また必要ならば、前記（６）の工程で分離された
   混合溶液からヒト組織プラスミノーゲンアクティベータ
   ーを回収する、 ことを特徴とする前記原料混合液から、ヒトプラスミノ
   ーゲンアクティベーターインヒビター・１−ヒト組織プ
   ラスミノーゲンアクティベーター複合体またはそれとヒ
   ト組織プラスミノーゲンアクティベーターの分離回収方
   法。 ２４、請求項２３における工程（６）から分離された混
   合溶液からヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター
   を回収する請求項２３の原料混合物からのヒト組織プラ
   スミノーゲンアクティベーターの分離回収方法。 ２５、ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１に対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３または
   それと同等の断片を有効成分として含む血栓溶解促進剤
   。 ２６、ヒト検体中のヒトプラスミノーゲンアクティベー
   ターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアク
   ティベーター複合体を請求項６の方法に従って測定し、
   その含有量の値により血栓症の病状を診断する方法。 ２７、ヒト検体中の （ｉ）ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター
   複合体を請求項６の方法に従って測定し、一方 （ｉｉ）ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒ
   ビター・１及びヒトプラスミノーゲンアクティベーター
   インヒビター・１−ヒト組織プラスミノーゲンアクティ
   ベーター複合体を請求項１７の方法に従って測定し、 上記（ｉ）及び（ｉｉ）の結果により、血栓症の病状を
   診断する方法。