KR20220045258A - 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자 - Google Patents

복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 항원 결합 분자에 의해 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법, 1분자의 항원 결합 분자에 의해 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법, 항원의 세포내로의 흡수가 촉진된 항원 결합 분자, 항원으로의 결합 횟수가 증가한 항원 결합 분자, 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시킬 수 있는 항원 결합 분자, 혈장 중 체류성이 개선된 항원 결합 분자, 당해 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물, 및 그들의 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명자들은, 칼슘 의존성을 나타내는 항원 항체 반응을 갖는 항원 결합 분자를 사용함으로써 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하였다.

Description

복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자{Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly}
항체는 혈장 중에서의 안정성이 높고, 부작용도 적은 것으로부터 의약품으로서 주목되고 있다. 그 중에서도 IgG형의 항체 의약은 다수 시판되고 있고, 현재도 수 많은 항체 의약이 개발되고 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 한편, 제2세대의 항체 의약에 적용 가능한 기술로서 다양한 기술이 개발되어 있어, 이펙터 기능, 항원 결합능, 약물동태, 안정성을 향상시키거나, 또는, 면역원성 리스크를 저감시키는 기술 등이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 항체 의약은 일반적으로 투여량이 매우 높기 때문에, 피하 투여 제제의 제작이 곤란한 것, 제조 비용이 비싼 것 등이 과제로서 생각된다. 항체 의약의 투여량을 저감시키는 방법으로서, 항체의 약물동태를 향상시키는 방법과, 항체와 항원의 친화성(affinity)을 향상시키는 방법이 생각된다.
항체의 약물동태를 향상시키는 방법으로서, 정상영역(constant region)의 인공적인 아미노산 치환이 보고되어 있다(비특허문헌 4, 5). 항원 결합능, 항원 중화능을 증강시키는 기술로서, 친화성 성숙 기술(비특허문헌 6)이 보고되어 있어, 가변영역의 CDR 영역 등의 아미노산에 변이를 도입함으로써 항원으로의 결합 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항원 결합능의 증강에 의해 in vitro의 생물활성을 향상시키거나, 또는 투여량을 저감시키는 것이 가능하며, 또한 in vivo에서의 약효를 향상시키는 것도 가능하다(비특허문헌 7).
한편, 항체 1분자당 중화할 수 있는 항원량은 친화성에 의존하여, 친화성을 강하게 함으로써 적은 항체량으로 항원을 중화하는 것이 가능하고, 다양한 방법으로 항체의 친화성을 강하게 하는 것이 가능하다(비특허문헌 6). 또한 항원에 공유 결합적으로 결합하여, 친화성을 무한대로 할 수 있다면 1분자의 항체로 1분자의 항원(2가의 경우는 2항원)을 중화하는 것이 가능하다. 그러나, 지금까지의 방법으로는 1분자의 항체로 1분자의 항원(2가의 경우는 2항원)의 화학양론적인 중화반응이 한계로, 항원량 이하의 항체량으로 항원을 완전히 중화하는 것은 불가능하였다. 즉, 친화성을 강하게 하는 효과에는 한계가 존재하고 있었다(비특허문헌 9). 중화항체의 경우, 그 중화효과를 일정 시간 지속시키기 위해서는, 그 기간에 생체내에서 생산되는 항원량 이상의 항체량이 투여될 필요가 있어, 전술한 항체의 약물동태 향상, 또는, 친화성 성숙 기술만으로는, 필요 항체 투여량의 저감에는 한계가 존재하고 있었다. 그 때문에, 항원량 이하의 항체량으로 항원의 중화효과를 목적 기간 지속하기 위해서는, 하나의 항체로 복수의 항원을 중화할 필요가 있다.
이것을 달성하는 새로운 방법으로서, 최근, 항원에 대해 pH 의존적으로 결합하는 항체가 보고되었다(특허문헌 1). 항원에 대해 혈장 중의 중성 조건하에 있어서는 강하게 결합하고, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 pH 의존적 항원 결합 항체는 엔도솜 내에서 항원으로부터 해리하는 것이 가능하다. pH 의존적 항원 결합 항체는, 항원을 해리한 후에 항체가 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되면 재차 항원에 결합하는 것이 가능하기 때문에, 하나의 항체로 복수의 항원에 반복해서 결합하는 것이 가능해진다.
또한, 항원의 혈장 중 체류성은, FcRn에 결합하여 리사이클되는 항체와 비교하여 매우 짧다. 혈장 중 체류성이 긴 항체가 이러한 혈장 중 체류성이 짧은 항원에 결합하면, 항체 항원 복합체의 혈장 중 체류성은 항체와 동일하게 길어진다. 그 때문에, 항원은 항체와 결합함으로써, 오히려 혈장 중 체류성이 길어져, 혈장 중 항원 농도는 상승한다. 이러한 경우, 항체의 항원에 대한 친화성을 향상시키더라도 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진시키는 것은 불가능하다. 전술한 pH 의존적 항원 결합 항체는, 통상의 항체와 비교하여 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진하는 방법으로서도 유효한 것이 보고되어 있다(특허문헌 1).
이와 같이 pH 의존적 항원 결합 항체는 하나의 항체로 복수의 항원에 결합하여, 통상의 항체와 비교하여 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진할 수 있기 때문에, 통상의 항체에서는 얻을 수 없었던 작용을 갖는다. 그러나, 지금까지 이 pH 의존적 항원 결합 항체의 항원에 반복해서 결합할 수 있는 효과, 및 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진하는 효과를 달성하기 위해서는, 혈장 중과 엔도솜 내의 pH의 차이를 이용하여 항원 항체 반응에 pH 의존성을 부여하는 방법 밖에 알려져 있지 않았다.
또한, 본 발명의 선행기술문헌을 이하에 나타낸다.
WO 2009/125825, ANTIGEN-BINDING MOLECULE CAPABLE OF BINDING TO TWO OR MORE ANTIGEN MOLECULES REPEATEDLY
Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005) Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96. Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review. Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56 Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40 Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries.Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R. Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665 Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications.Curr Opin Biotechnol. 2005 Dec;16(6):631-6. Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9;334(4):1004-13.
본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, 항원 결합 분자에 의해 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법, 1분자의 항원 결합 분자에 의해 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법, 항원의 세포내로의 흡수가 촉진된 항원 결합 분자, 항원으로의 결합 횟수가 증가한 항원 결합 분자, 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시킬 수 있는 항원 결합 분자, 혈장 중 체류성이 개선된 항원 결합 분자, 당해 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물, 및 그들의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 항원 결합 분자(항원 결합능을 갖는 폴리펩티드 등의 분자)에 의한 항원의 세포내로의 흡수(uptake)를 촉진시키는 방법, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법에 대해서 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 본 발명자들은, 혈장 중과 조기 엔도솜 내에 있어서의 칼슘 농도의 차이에 착안하여, 칼슘 의존성을 나타내는 항원 항체 반응을 갖는 항원 결합 분자를 사용함으로써, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시킬 수 있는 것, 항원 결합 분자가 항원에 복수 회 결합함으로써, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시킬 수 있는 것, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시킬 수 있는 것, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선할 수 있는 것을 발견하였다.
즉 본 발명은, 칼슘 의존성을 나타내는 항원 항체 반응을 갖는 항원 결합 분자에 의해, 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법, 1분자의 항원 결합 분자에 의해 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선시키는 방법, 항원의 세포내로의 흡수가 촉진된 항원 결합 분자, 항원으로의 결합 횟수가 증가한 항원 결합 분자, 그의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시킬 수 있는 항원 결합 분자, 혈장 중 체류성이 개선된 항원 결합 분자, 당해 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물, 및 그들의 제조방법 등에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 이하에 관한 것이다.
〔1〕항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로서, 2개의 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 상이하여, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮고, 중성 pH 조건하에 있어서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자.
〔2〕저칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 0.1 μM~30 μM인, 〔1〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔3〕고칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 100 μM~10 mM인, 〔1〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔4〕저칼슘 농도가 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도인, 〔1〕또는〔2〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔5〕고칼슘 농도가 혈장 중의 이온화 칼슘 농도인, 〔1〕또는〔3〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔6〕상기 FcRn 결합 도메인이 Fc 영역인, 〔1〕~〔5〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔7〕또한, 산성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 중성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은, 〔1〕~〔6〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔8〕하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되거나, 또는, 하나 이상의 히스티딘이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔7〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔9〕막항원 또는 가용형 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는, 〔1〕~〔8〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔10〕항원이 IL-6R, IL-6, IgA, 인간 글리피칸 3, 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원인 것을 특징으로 하는, 〔1〕~〔9〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔11〕항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로서, 2개의 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 상이하여, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮고, 항원 결합 도메인에 포함되는 경쇄 또는 중쇄에 인간 항체 유래의 칼슘 결합 모티브가 포함되는 항원 결합 분자.
〔12〕칼슘 결합 모티브가 항원 결합 도메인의 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 포함되는, 〔11〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔13〕칼슘 결합 모티브가 경쇄 CDR1의 Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치 및/또는 32번 위치에 포함되는, 〔12〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔14〕칼슘 결합 모티브가 경쇄 CDR2의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치에 포함되는, 〔12〕또는〔13〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔15〕칼슘 결합 모티브가 경쇄 CDR3의 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치에 포함되는, 〔12〕~〔14〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔16〕항원 결합 분자가 IgA 또는 인간 글리피칸 3 중 어느 하나인, 〔12〕~〔15〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔17〕칼슘 결합 모티브가 항원 결합 도메인의 중쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 포함되는, 〔11〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔18〕칼슘 결합 모티브가 중쇄 CDR3의 Kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치, 96번 위치, 100a번 위치, 및/또는 101번 위치에 포함되는, 〔16〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔19〕항원 결합 분자가 IL-6R 또는 IL-6 중 어느 하나인, 〔17〕또는〔18〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔20〕pH 중성역의 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는, 〔11〕~〔19〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔21〕상기 FcRn 결합 도메인이 Fc 영역인, 〔20〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔22〕상기 Fc 영역의 아미노산 서열 중, EU 넘버링으로 표시되는 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, 및 436 중 어느 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc 영역의 아미노산과 상이한 Fc 영역인, 〔1〕~〔10〕, 〔20〕또는〔21〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔23〕상기 Fc 영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；
237번 위치의 아미노산이 Met,
248번 위치의 아미노산이 Ile,
250번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr,
252번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, 또는 Tyr,
254번 위치의 아미노산이 Thr,
255번 위치의 아미노산이 Glu,
256번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, 또는 Gln,
257번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, 또는 Val,
258번 위치의 아미노산이 His,
265번 위치의 아미노산이 Ala,
286번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Glu,
289번 위치의 아미노산이 His,
297번 위치의 아미노산이 Ala,
303번 위치의 아미노산이 Ala,
305번 위치의 아미노산이 Ala,
307번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr,
308번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, 또는 Thr,
309번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro, 또는 Arg,
311번 위치의 아미노산이 Ala, His, 또는 Ile,
312번 위치의 아미노산이 Ala 또는 His,
314번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg,
315번 위치의 아미노산이 Ala, Asp 또는 His,
317번 위치의 아미노산이 Ala,
332번 위치의 아미노산이 Val,
334번 위치의 아미노산이 Leu,
360번 위치의 아미노산이 His,
376번 위치의 아미노산이 Ala,
380번 위치의 아미노산이 Ala,
382번 위치의 아미노산이 Ala,
384번 위치의 아미노산이 Ala,
385번 위치의 아미노산이 Asp 또는 His,
386번 위치의 아미노산이 Pro,
387번 위치의 아미노산이 Glu,
389번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ser,
424번 위치의 아미노산이 Ala,
428번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, 또는 Tyr,
433번 위치의 아미노산이 Lys,
434번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, His, Ser, Trp, 또는 Tyr, 또는
436번 위치의 아미노산이 His, Ile, Leu, Val,
중 어느 하나 이상의 조합인, 〔22〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔24〕항원 결합 분자가 항체인 것을 특징으로 하는, 〔1〕~〔23〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔25〕이하의 공정(a)~(e)를 포함하는, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, (ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능, (iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및 (iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 제조방법；
(a) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 선택된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) 상기 공정(d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
〔26〕이하의 공정(a)~(e)를 포함하는, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, (ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능, (iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및 (iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 제조방법；
(a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) 상기 공정(d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
〔27〕이하의 공정(a)~(f)를 포함하는, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, (ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능, (iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및 (iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 제조방법；
(a) 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 선택된 항원 결합 분자를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 접촉시키는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(e) 상기 공정(d)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(f) 상기 공정(e)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 생산하는 공정.
〔28〕추가로, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여, 중성 pH 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 부여하거나 또는 높이는 공정을 포함하는, 〔25〕~〔27〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔29〕추가로, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여, 산성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 중성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 저하시키는 공정을 포함하는, 〔25〕~〔27〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔30〕저칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 0.1 μM~30 μM인, 〔25〕~〔27〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔31〕고칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 100 μM~10 mM인, 〔25〕~〔27〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔32〕저칼슘 농도가 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도인, 〔25〕~〔27〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔33〕고칼슘 농도가 혈장 중의 이온화 칼슘 농도인, 〔25〕~〔27〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔34〕항원 결합 분자 중의 아미노산의 개변이, 항원 결합 분자 중의 적어도 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 개변인, 〔29〕에 기재된 제조방법.
〔35〕상기 항원 결합 분자가 결합하는 항원이 IL-6R, IL-6, IgA, 인간 글리피칸 3, 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원인 것을 특징으로 하는, 〔25〕~〔34〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔36〕상기 항원 결합 분자가 항체인 것을 특징으로 하는, 〔25〕~〔35〕중 어느 하나에 기재된 제조방법.
〔37〕〔1〕~〔24〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는 〔25〕~〔36〕중 어느 하나에 기재된 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
〔38〕항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키기 위해 사용되는 의약 조성물인, 〔37〕에 기재된 의약 조성물.
〔39〕혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키기 위해 사용되는 의약 조성물인, 〔37〕에 기재된 의약 조성물.
〔40〕항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로서, 2개의 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 상이하여, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 포함하는, 항원의 세포내로의 흡수, 또는 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키기 위해 사용되는 의약 조성물.
〔41〕저칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 0.1 μM~30 μM인, 〔40〕에 기재된 의약 조성물.
〔42〕고칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 100 μM~10 mM인, 〔40〕에 기재된 의약 조성물.
〔43〕저칼슘 농도가 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도인, 〔40〕또는〔41〕에 기재된 의약 조성물.
〔44〕고칼슘 농도가 혈장 중의 이온화 칼슘 농도인, 〔40〕또는〔42〕에 기재된 의약 조성물.
〔45〕상기 항원 결합 분자에 포함되는 FcRn 결합 도메인이 Fc 영역인,〔40〕~〔44〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔46〕또한, 상기 항원 결합 분자의 산성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 중성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은, 〔40〕~〔45〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔47〕상기 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되거나, 또는, 하나 이상의 히스티딘이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔46〕에 기재된 의약 조성물.
〔48〕상기 항원 결합 분자가 결합하는 항원이 IL-6R, IL-6, IgA, 인간 글리피칸 3, 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원인 것을 특징으로 하는, 〔40〕~〔47〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
〔49〕이하의 공정(a)~(c)를 포함하는, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, (ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능, (iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및 (iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 스크리닝방법；
(a) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
〔50〕이하의 공정(a)~(c)를 포함하는, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, (ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능, (iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및 (iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 스크리닝방법；
(a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
〔51〕이하의 공정(a)~(d)를 포함하는, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, (ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능, (iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및 (iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 스크리닝방법；
(a) 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 선택된 항원 결합 분자를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
〔52〕저칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 0.1 μM~30 μM인, 〔49〕~〔51〕중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법.
〔53〕고칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 100 μM~10 mM인, 〔49〕~〔51〕중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법.
〔54〕저칼슘 농도가 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도인, 〔49〕~〔52〕중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법.
〔55〕고칼슘 농도가 혈장 중의 이온화 칼슘 농도인, 〔49〕~〔51〕또는〔53〕중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법.
〔56〕상기 항원 결합 분자가 결합하는 항원이 IL-6R, IL-6, IgA, 인간 글리피칸 3, 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원인 것을 특징으로 하는, 〔49〕~〔55〕중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법.
〔57〕항원 결합 분자가 항체인 것을 특징으로 하는, 〔49〕~〔56〕중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법.
〔58〕〔1〕~〔24〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는 〔25〕~〔36〕중 어느 하나에 기재된 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 투여함으로써, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법.
〔59〕〔1〕~〔24〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는 〔25〕~〔36〕중 어느 하나에 기재된 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 투여함으로써, 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법.
〔60〕〔1〕~〔24〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는 〔25〕~〔36〕중 어느 하나에 기재된 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 사용함으로써, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법.
〔61〕〔1〕~〔24〕중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 또는 〔25〕~〔36〕중 어느 하나에 기재된 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 사용함으로써, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법.
〔62〕항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로서, 2개의 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 상이하여, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 투여함으로써, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법.
〔63〕항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로서, 2개의 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 상이하여, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 투여함으로써, 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법.
〔64〕항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로서, 2개의 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 상이하여, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 사용함으로써, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법.
〔65〕항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로서, 2개의 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 상이하여, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 사용함으로써, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법.
〔66〕상기 저칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 0.1 μM~30 μM인, 〔62〕~〔65〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔67〕고칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 100 μM~10 mM인, 〔62〕~〔66〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔68〕저칼슘 농도가 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도인, 〔62〕~〔67〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔69〕고칼슘 농도가 혈장 중의 이온화 칼슘 농도인, 〔62〕~〔68〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔70〕상기 항원 결합 분자에 포함되는 FcRn 결합 도메인이 Fc 영역인,〔62〕~〔69〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔71〕또한, 상기 항원 결합 분자의 산성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 중성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은, 〔62〕~〔70〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔72〕상기 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되거나, 또는, 하나 이상의 히스티딘이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔71〕에 기재된 방법.
〔73〕상기 항원 결합 분자가 결합하는 항원이 IL-6R, IL-6, IgA, 인간 글리피칸 3, 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원인 것을 특징으로 하는, 〔62〕~〔72〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔74〕상기 항원 결합 분자가 항체인, 〔62〕~〔73〕중 어느 하나에 기재된 방법.
또한 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 포함하는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 유효성분으로서 함유하는, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수 촉진제, 혈장 중의 항원 농도의 감소 촉진제, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수 증가제, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성 개선제에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자의, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수 촉진제, 혈장 중의 항원 농도의 감소 촉진제, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수 증가제, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성 개선제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 본 발명의 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법, 1분자의 항원 결합 분자에 의해 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법이 제공되었다. 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수가 촉진됨으로써, 항원 결합 분자의 투여에 의해 항원의 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 것이 가능해지는 동시에, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선시키는 것이 가능해지고, 1분자의 항원 결합 분자에 의해 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 것이 가능해져, in vivo에 있어서 통상의 항원 결합 분자보다도 우수한 효과를 발휘시킬 수 있다.
도 1은 pH 의존적 결합 항체가 반복해서 가용형 항원에 결합하는 것을 나타내는 도면이다. (i) 항체가 가용형 항원과 결합하고, (ii) 비특이적으로, 음세포작용(pinocytosis)에 의해 세포내에 내재화되며, (iii) 엔도솜 내에서 항체는 FcRn과 결합하고, 가용형 항원은 항체로부터 해리되며, (iv) 가용형 항원은 리소좀으로 이행하여 분해되고, (v) 가용형 항원이 해리된 항체는 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되며, (vi) 리사이클된 항체는 재차 가용형 항원으로 결합하는 것이 가능해진다.
도 2는 pH 의존적 결합 항체가 반복해서 막형 항원에 결합하는 것을 나타내는 도면이다. (i) 항체가 막형 항원과 결합하고, (ii) 항체와 막형 항원의 복합체의 상태로 세포내에 내재화되며, (iii) 엔도솜 내에서 막형 항원으로부터 해리되고, (iv) 막형 항원은 리소좀으로 이행하여 분해되며, (v) 막형 항원으로부터 해리된 항체는 혈장 중으로 리사이클되고, (vi) 리사이클된 항체는 재차 막형 항원으로 결합하는 것이 가능해진다.
도 3은 pH 의존적 결합 항체의 혈장 중(pH 7.4)과 엔도솜 내(pH 6.0)의 항원으로의 상호작용의 양식을 나타내는 도면이다.
도 4는 칼슘 의존적 결합 항체의 혈장 중(Ca2+ 2 mM)과 엔도솜 내(Ca2+ 3 μM)의 항원으로의 상호작용의 양식을 나타내는 도면이다.
도 5는 pH 및 칼슘 의존적 결합 항체의 혈장 중(pH 7.4, Ca2+ 2 mM)과 엔도솜 내(pH 6.0, Ca2+ 3 μM)의 항원으로의 상호작용의 양식을 나타내는 도면이다.
도 6은 Biacore를 사용한 항인간 IL-6 수용체 항체의 Ca2+ 2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체로의 상호작용을 나타내는 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 7은 H54/L28-IgG1의 Ca2+ 2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체로의 상호작용을 나타내는 Biacore 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 8은 FH4-IgG1의 Ca2+ 2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체로의 상호작용을 나타내는 Biacore 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 9는 6RL#9-IgG1의 Ca2+ 2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체로의 상호작용을 나타내는 Biacore 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 10은 H54/L28-IgG1, FH4-IgG1, 및 6RL#9-IgG1의 정상 마우스 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 11은 H54/L28-IgG1, FH4-IgG1, 및 6RL#9-IgG1의 정상 마우스 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R) 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 12는 H54/L28-N434W, FH4-N434W, 및 6RL#9-N434W의 정상 마우스 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 13은 H54/L28-N434W, FH4-N434W, 및 6RL#9-N434W의 정상 마우스 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R) 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 14는 X선 결정구조 해석으로 결정된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 중쇄 CDR3의 구조를 나타내는 도면이다.
도 15는 Biacore를 사용한 항인간 IL-6 항체의 Ca2+ 1.2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 인간 IL-6으로의 상호작용을 나타내는 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 16은 인간 Vk5-2 서열을 포함하는 항체와, 인간 Vk5-2 서열 중의 당쇄 부가 서열이 개변된 h Vk5-2_L65 서열을 포함하는 항체의 이온 교환 크로마토그램이다. 실선은 인간 Vk5-2 서열을 포함하는 항체(중쇄：CIM_H, 서열번호：48 및 경쇄：hVk5-2, 서열번호：41과 서열번호：28의 융합 분자)의 크로마토그램, 파선은 hVk5-2_L65 서열을 갖는 항체(중쇄：CIM_H(서열번호：48), 경쇄：hVk5-2_L65(서열번호：47))의 크로마토그램을 나타낸다.
도 17은 LfVk1_Ca 서열을 포함하는 항체(중쇄：GC_H, 서열번호：102 및 경쇄：LfVk1_Ca, 서열번호：61)와, LfVk1_Ca 서열 중의 Asp(D) 잔기가 Ala(A) 잔기로 개변된 서열을 포함하는 항체의 5℃ 보존 후(실선) 또는 50℃ 보존 후(점선)의 이온 교환 크로마토그램이다. 각각 5℃ 보존 후의 이온 교환 크로마토그램의 가장 높은 피크를 메인 피크로 하여, 메인 피크로 y축 정규화한 도면이다.
도 18은 LfVk1_Ca 서열을 포함하는 항체(중쇄：GC_H, 서열번호：102 및 경쇄：LfVk1_Ca, 서열번호：61)와, LfVk1_Ca 서열 중의 30번 위치(Kabat 넘버링)의 Asp(D) 잔기가 Ser(S) 잔기로 개변된 LfVk1_Ca6 서열(중쇄：GC_H, 서열번호：102 및 경쇄：LfVk1_Ca6, 서열번호：75)을 포함하는 항체의 5℃ 보존 후(실선) 또는 50℃ 보존 후(점선)의 이온 교환 크로마토그램이다. 각각 5℃ 보존 후의 이온 교환 크로마토그램의 가장 높은 피크를 메인 피크로 하여, 메인 피크로 y축 정규화한 도면이다.
도 19는 Biacore를 사용한 항인간 CD4 항체의 Ca2+ 1.2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 가용형 인간 CD4로의 상호작용을 나타내는 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 20은 항인간 CD4 항체의 정상 마우스 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 21은 가용형 인간 CD4 단독 투여군, TNX355-IgG1 항체 투여군, Q425 항체 투여군 및 Q425L9 항체 투여군의 정상 마우스 혈장 중 가용형 인간 CD4의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 22는 Biacore를 사용한 항인간 IgA 항체의 Ca2+ 1.2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 인간 IgA로의 상호작용을 나타내는 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 23은 GA1-IgG1 항체 투여군, GA2-IgG1 항체 투여군, GA3-IgG1 및 GA2-N434W 항체 투여군의 정상 마우스 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 24는 인간 IgA 단독 투여군, GA1-IgG1 항체 투여군, GA2-IgG1 항체 투여군, GA3-IgG1 항체 투여군 및 GA2-N434W 항체 투여군의 정상 마우스 혈장 중 인간 IgA의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 25는 GA1-IgG1 항체 투여군, GA2-IgG1 항체 투여군, GA3-IgG1 항체 투여군 및 GA2-N434W 항체 투여군의 정상 마우스 혈장 중의 비결합형 인간 IgA의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 26은 다량체 항원에 대해 커다란 면역 복합체를 형성하는 통상 항체의, 항체 1분자당 항원을 소실시키는 효율을 예시하는 도면이다.
도 27은 다량체 항원에 대해 커다란 면역 복합체를 형성하는 천연 IgG1의 정상영역(constant region)을 포함하는 pH/Ca 의존성 항체의, 항체 1분자당 항원을 소실시키는 효율을 예시하는 도면이다.
도 28은 단량체 항원에 존재하는 2개 이상의 에피토프를 인식하여 커다란 면역 복합체를 형성하기에 적절한 multispecific pH/Ca 의존성 항체의, 항체 1분자당 항원을 소실시키는 효율을 예시하는 도면이다.
도 29는 ELISA법을 사용한 항인간 글리피칸 3 항체의 Ca2+ 1.2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 재조합 인간 글리피칸 3으로의 상호작용을 나타내는 도면이다.
도 30은 ELISA법을 사용한 항인간 IgE 항체의 Ca2+ 2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 재조합 인간 IgE로의 상호작용을 나타내는 도면이다.
도 31은 인간 FcRn 형질전환 마우스(transgenic mice)에 있어서의 항체의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 32는 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 33은 정상 마우스에 있어서의 항체의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 34는 정상 마우스에 있어서의 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 35는 정상 마우스에 있어서의 비결합형(unbound) 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 36은 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 37은 Fv4-IgG1-F14를, 저용량(0.01 ㎎/㎏) 또는 1 ㎎/㎏으로 투여한 후의, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 38은 Fv4-IgG1-F14를, 저용량(0.01 ㎎/㎏) 또는 1 ㎎/㎏으로 투여한 후의, 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 39는 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 정상상태(constant)를 유지하고 있는 정상 마우스에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 후의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 40은 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 276)에 대해 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 41은 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 276)에 대해 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 42는 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 친화성과, 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 276)에 대해 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 1일 후의 혈장 중 hsIL-6R 농도의 관계를 나타내는 도면이다.
도 43은 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 친화성과, 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 276)에 대해 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 1일 후의 혈장 중 항체 농도의 관계를 나타내는 도면이다.
도 44는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 276)에 대해 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 항원/항체 몰비(C값)의 추이를 나타내는 도면이다.
도 45는 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 친화성과, 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 276)에 대해 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 1일 후의 항원/항체 몰비(C값)의 관계를 나타내는 도면이다.
도 46은 혈장 중 hsIL-6R 농도가 정상상태를 유지하고 있는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 276)(정상상태 주입 모델)에 대해 Fv4-IgG1-F14를 저용량(0.01 또는 0.2 ㎎/㎏) 또는 1 ㎎/㎏으로 투여한 후의, 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 47은 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 276 및 32)에 대해 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276 및 계통 32에 있어서의 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 48은 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 276 및 계통 32)에 대해 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276 및 계통 32에 있어서의 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 49는 혈장 중 hsIL-6R 농도가 정상상태를 유지하고 있는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 32)(정상상태 주입 모델)에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 후의 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 50은 혈장 중 hsIL-6R 농도가 정상상태를 유지하고 있는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 32)(정상상태 주입 모델)에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 후의 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 51은 혈장 중 hsIL-6R 농도가 정상상태를 유지하고 있는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 32)(정상상태 주입 모델)에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 후의 항원/항체 몰비(C값)의 추이를 나타내는 도면이다.
도 52는 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 친화성과, 혈장 중 hsIL-6R 농도가 정상상태를 유지하고 있는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 32)(정상상태 주입 모델)에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 1일 후의 항원/항체 몰비(C값)의 관계를 나타내는 도면이다.
도 53은 혈장 중 hsIL-6R 농도가 정상상태를 유지하고 있는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 32)(정상상태 주입 모델)에 대해, F11, F39, F48, 및 F264의 Fc 변이체를 갖는 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 후의, 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 54는 혈장 중 hsIL-6R 농도가 정상상태를 유지하고 있는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 32)(정상상태 주입 모델)에 대해, F11, F39, F48, 및 F264의 Fc 변이체를 갖는 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 후의, 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 55는 혈장 중 hsIL-6R 농도가 정상상태를 유지하고 있는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 32)(정상상태 주입 모델)에 대해, F157, F196, 및 F262의 Fc 변이체를 갖는 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 후의, 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 56은 혈장 중 hsIL-6R 농도가 정상상태를 유지하고 있는 인간 FcRn 형질전환 마우스(계통 32)(정상상태 주입 모델)에 대해, F157, F196, 및 F262의 Fc 변이체를 갖는 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 후의, 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타내는 도면이다.
본 발명은 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 항원 결합 분자의 투여에 의한 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법, 및 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성(본 발명에서는 「결합능」으로 기재하는 경우도 있다)이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 사용함으로써, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 항원 결합 분자의 투여에 의한 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법, 및 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법을 제공한다.
아미노산
본 명세서에 있어서, 예를 들면, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, Val/V로 표시되는 바와 같이, 아미노산은 1문자 코드 또는 3문자 코드, 또는 그 양쪽으로 표기되어 있다.
항원
본 명세서에 있어서 「항원」은 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프를 포함하는 한 그 구조는 특정 구조에 한정되지 않는다. 다른 의미로는, 항원은 무기물일 수도 있고 유기물일 수도 있으며, 본 발명이 투여되는 생체에 있어 외래성의, 또는 내재성의 것일 수도 있다. 본 발명의 방법에 의해 약물동태가 개선된 항원 결합 분자가 포함하는 항원 결합 도메인이 결합하는 항원의 예로서는, 예를 들면, 수용체 단백질(막결합형 수용체, 가용형 수용체)이나 세포 표면 마커 등의 막항원, 사이토카인 등의 가용형 항원, 외래성 생물에만 존재하는 에피토프를 포함하는 항원 등을 적합하게 들 수 있다. 항원으로서는 하기와 같은 분자；17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 아드레신(Addressins), 아디포넥틴, ADP 리보실 시클라아제-1, aFGF, AGE, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알레르겐, α1-안티키모트립신, α1-안티트립신, α-시누클레인, α-V/β-1 안타고니스트, 아미닌(aminin), 아밀린, 아밀로이드β, 아밀로이드 면역 글로불린 중쇄 가변영역, 아밀로이드 면역 글로불린 경쇄 가변영역, 안드로겐, ANG, 안지오텐시노겐, 안지오포이에틴 리간드-2, 항Id, 안티트롬빈 III, 탄저, APAF-1, APE, APJ, 아포 A1, 아포혈청아밀로이드 A, 아포-SAA, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민(Artemin), ASPARTIC, 심방성 나트륨 이뇨인자, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 A, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 B, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 C, av/b3 인테그린, Axl, B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-1, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 방어항원, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, β-2-마이크로글로불린, β락타마아제, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, B 림프구 자극인자(BIyS), BMP, BMP-2(BMP-2a), BMP-3(오스테오게닌(Osteogenin)), BMP-4(BMP-2b), BMP-5, BMP-6(Vgr-1), BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BMPR-II(BRK-3), BMP, BOK, 봄베신, 골 유래 신경 영양인자(Bone-derived neurotrophic factor), 소 성장 호르몬, BPDE, BPDE-DNA, BRK-2, BTC, B 림프구 세포 접착분자, C10, C1 저해인자, C1q, C3, C3a, C4, C5, C5a(보체 5a), CA125, CAD-8, 카드헤린-3, 칼시토닌, cAMP, 탄산탈수효소-IX, 암 태아 항원(CEA), 암 관련 항원(carcinoma-associated antigen), 카르디오트로핀-1, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1/I-309, CCL11/에오탁신, CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3-α, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1, CCL24/에오탁신-2, CCL25/TECK, CCL26/에오탁신-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CCL3/M1P-1-α, CCL3Ll/LD-78-β, CCL4/MIP-l-β, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1-γ, CCR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD10, CD105, CD11a, CD11b, CD11c, CD123, CD13, CD137, CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16, CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L, CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD37, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61, CD64, CD66e, CD7, CD70, CD74, CD8, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA, CEACAM5, CFTR, cGMP, CGRP 수용체, CINC, CKb8-1, 클라우딘 18, CLC, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소, 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile) 독소, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 독소, c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, 보체인자 3(C3), 보체인자 D, 코르티코스테로이드 결합 글로불린, 콜로니 자극인자-1 수용체, COX, C-Ret, CRG-2, CRTH2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1/프랙탈카인, CX3CR1, CXCL, CXCL1/Gro-α, CXCL10, CXCL11/I-TAC, CXCL12/SDF-l-α/β, CXCL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15/렁킨(Lungkine), CXCL16, CXCL2/Gro-β CXCL3/Gro-γ, CXCL3, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/Mig, CXCLlO/IP-10, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 시스타틴 C, 사이토케라틴 종양 관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 붕괴 촉진인자, 델타 유사 단백질(Delta-like protein) 리간드 4, des(1-3)-IGF-1(뇌 IGF-1), Dhh, DHICA 옥시다아제, Dickkopf-1, 디곡신, 디펩티딜 펩티다아제 IV, DK1, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EGF 유사 도메인 함유 단백질 7(EGF like domain containing protein 7), 엘라스타아제, 엘라스틴, EMA, EMMPRIN, ENA, ENA-78, 엔도시알린(Endosialin), 엔도텔린 수용체, 엔도톡신, 엔케팔리나제, eNOS, Eot, 에오탁신, 에오탁신-2, 에오탁시니(eotaxini), EpCAM, 에프린 B2/EphB4, Epha2 티로신키나아제 수용체, 상피 증식인자 수용체(EGFR), ErbB2 수용체, ErbB3 티로신키나아제 수용체, ERCC, 에리트로포이에틴(EPO), 에리트로포이에틴 수용체, E-셀렉틴, ET-1, 엑소더스(Exodus)-2, RSV의 F 단백질, F10, F11, F12, F13, F5, F9, 제Ia인자, 제IX인자, 제Xa인자, 제VII인자, 제VIII인자, 제VIIIc인자, Fas, FcαR, Fc 엡실론 RI, FcγIIb, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb, FcRn, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF-2 수용체, FGF-3, FGF-8, 산성 FGF(FGF-acidic), 염기성 FGF(FGF-basic), FGFR, FGFR-3, 피브린, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 섬유아세포 증식인자, 섬유아세포 증식인자-10, 피브로넥틴, FL, FLIP, Flt-3, FLT3 리간드, 엽산 수용체, 난포 자극 호르몬(FSH), 프랙탈카인(CX3C), 유리형 중쇄, 유리형 경쇄, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, G-CSF, G-CSF 수용체, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-15(MIC-1), GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14/CDMP-1), GDF-6(BMP-13/CDMP-2), GDF-7(BMP-12/CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDNF, 겔솔린, GFAP, GF-CSF, GFR-α1, GFR-α2, GFR-α3, GF-β1, gH 외피당단백질, GITR, 글루카곤, 글루카곤 수용체, 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체, Glut 4, 글루타민산 카르복시 펩티다아제 II, 당단백질 호르몬 수용체, 당단백질 llb/llla(GP llb/llla), 글리피칸-3, GM-CSF, GM-CSF 수용체, gp130, gp140, gp72, 과립구-CSF(G-CSF), GRO/MGSA, 성장 호르몬 방출인자, GRO-β, GRO-γ, 피롤리균(H. pylori), 합텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCC 1, HCMV gB 외피당단백질, HCMV UL, 조혈 증식인자(Hemopoietic growth factor)(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, 헤파린 보조인자 II, 간세포 증식인자(hepatic growth factor), 바실러스 안트라시스 방어항원, C형 간염 바이러스 E2 당단백질, E형 간염, 헵시딘, Her1, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HGF, HGFA, 고분자량 흑색종 관련 항원(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA), GP120 등의 HIV 외피 단백질, HIV MIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HMGB-1, HRG, Hrk, HSP47, Hsp90, HSV gD 당단백질, 인간 심근 미오신, 인간 사이토메갈로 바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인간 조직형 플라스미노겐 활성화인자(t-PA), 헌팅틴, HVEM, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IgA, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1, IGF-1 R, IGF-2, IGFBP, IGFR, IL, IL-1, IL-10, IL-10 수용체, IL-11, IL-11 수용체, IL-12, IL-12 수용체, IL-13, IL-13 수용체, IL-15, IL-15 수용체, IL-16, IL-16 수용체, IL-17, IL-17 수용체, IL-18(IGIF), IL-18 수용체, IL-1α, IL-1β, IL-1 수용체, IL-2, IL-2 수용체, IL-20, IL-20 수용체, IL-21, IL-21 수용체, IL-23, IL-23 수용체, IL-2 수용체, IL-3, IL-3 수용체, IL-31, IL-31 수용체, IL-3 수용체, IL-4, IL-4 수용체, IL-5, IL-5 수용체, IL-6, IL-6 수용체, IL-7, IL-7 수용체, IL-8, IL-8 수용체, IL-9, IL-9 수용체, 면역 글로불린 면역 복합체, 면역 글로불린, INF-α, INF-α 수용체, INF-β, INF-β 수용체, INF-γ, INF-γ 수용체, I형 IFN, I형 IFN 수용체, 인플루엔자, 인히빈, 인히빈 α, 인히빈 β, iNOS, 인슐린, 인슐린 A쇄, 인슐린 B쇄, 인슐린 유사 증식신자 1, 인슐린 유사 증식인자 2, 인슐린 유사 증식인자 결합 단백질, 인테그린, 인테그린 α2, 인테그린 α3, 인테그린 α4, 인테그린 α4/β1, 인테그린 α-V/β-3, 인테그린 α-V/β-6, 인테그린 α4/β7, 인테그린 α5/β1, 인테그린 α5/β3, 인테그린 α5/β6, 인테그린 α-δ(αV), 인테그린 α-θ, 인테그린 β1, 인테그린 β2, 인테그린 β3(GPIIb-IIIa), IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, 칼리스타틴, KC, KDR, 케라티노사이트 증식인자(KGF), 케라티노사이트 증식인자-2(KGF-2), KGF, 킬러 면역 글로불린 유사 수용체, kit 리간드(KL), Kit 티로신키나아제, 라미닌 5, LAMP, LAPP(아밀린, 췌도 아밀로이드 폴리펩티드), LAP(TGF-1), 잠복기 관련 펩티드, 잠재형 TGF-1, 잠재형 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LDL, LDL 수용체, LECT2, 레프티, 렙틴, 황체 형성 호르몬(leutinizing hormone)(LH), Lewis-Y 항원, Lewis-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, LFA-3 수용체, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 계면활성제, 림포탁틴, 림포톡신 β 수용체, 리소스핑고지질 수용체, Mac-1, 마크로파지-CSF(M-CSF), MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, 마스핀, MCAM, MCK-2, MCP, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-I(MCAF), M-CSF, MDC, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), 메그신(megsin), Mer, MET 티로신키나아제 수용체 패밀리, 메탈로프로테아제, 막 당단백질 OX2, 메소텔린, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), 미생물 단백질(microbial protein), MIF, MIG, MIP, MIP-1 α, MIP-1 β, MIP-3 α, MIP-3 β, MIP-4, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, 단구 유인 단백질(monocyte attractant protein), 단구 콜로니 저해인자(monocyte colony inhibitory factor), 마우스 고나도트로핀 관련(gonadotropin-associated) 펩티드, MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, 뮤신(Mud), 뮬러리안 억제인자, Mug, MuSK, 미엘린 관련 당단백질, 골수 전구세포 저해인자-1(MPIF-I), NAIP, 나노바디(Nanobody), NAP, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-카드헤린, NCAM, 네프릴리신, 신경세포 접착분자, 뉴로세르핀(neuroserpin), 신경 성장인자(NGF), 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 뉴로트로핀-6, 뉴로필린 1, 뉴르투린, NGF-β, NGFR, NKG20, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, nNOS, NO, Nogo-A, Nogo 수용체, C형 간염 바이러스 유래의 비구조 단백질 3형(NS3), NOS, Npn, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGG1, 온코스타틴 M, OP-2, OPG, OPN, OSM, OSM 수용체, 골 유도인자(osteoinductive factor), 오스테오폰틴, OX40L, OX40R, 산화형 LDL, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PCSK9, PDGF, PDGF 수용체, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-D, PDK-1, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIGF, PIN, PLA2, 태반 증식인자, 태반 알칼리포스파타아제(PLAP), 태반 락토겐, 플라스미노겐 활성화인자 저해인자-1, 혈소판 증식인자(platelet-growth factor), plgR, PLP, 상이한 사이즈의 폴리 글리콜 사슬(poly glycol chain)(예를 들면, PEG-20, PEG-30, PEG40), PP14, 프리칼리크레인, 프리온 단백질, 프로칼시토닌, 프로그램 세포사 단백질 1, 프로인슐린, 프로락틴, 프로단백질 전환효소 PC9, 프로릴랙신(prorelaxin), 전립선 특이적 막항원(PSMA), 프로테인 A, 프로테인 C, 프로테인 D, 프로테인 S, 프로테인 Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1, R51, RAGE, RANK, RANKL, RANTES, 릴랙신, 릴랙신 A쇄, 릴랙신 B쇄, 레닌, 호흡기 다핵체 바이러스(RSV) F, Ret, 레티큘론(reticulon) 4, 류머티즘인자, RLI P76, RPA2, RPK-1, RSK, RSV Fgp, S100, RON-8, SCF/KL, SCGF, 스크렐로스틴(Sclerostin), SDF-1, SDF1 α, SDF1 β, 세린(SERINE), 혈청 아밀로이드 P, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, 시가 유사 독소 II, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, 스핑고신-인산 수용체 1, 포도구균의 리포테이코산, Stat, STEAP, STEAP-II, 줄기세포인자(SCF), 스트렙토키나아제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 신데칸-1, TACE, TACI, TAG-72(종양 관련 당단백질-72), TARC, TB, TCA-3, T세포 수용체 α/β, TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, 테네이신, TERT, 정소 PLAP 유사 알칼리포스파타아제, TfR, TGF, TGF-α, TGF-β, TGF-β 범특이적(TGF-β Pan Specific), TGF-β RII, TGF-β RIIb, TGF-β RIII, TGF-β Rl(ALK-5), TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5, TGF-I, 트롬빈, 트롬보포이에틴(TPO), 흉선 간질성 림포프로테인(Thymic stromal lymphoprotein) 수용체, 흉선 Ck-1, 감상선 자극 호르몬(TSH), 티록신, 티록신 결합 글로불린, Tie, TIMP, TIQ, 조직인자, 조직인자 프로테아제 인히비터, 조직인자 단백질, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNF-α, TNF-β, TNF-β2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2/DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2/TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF/TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF Rl CD120a/p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b/p75-80), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25(DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII/TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35/TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1/APT1/CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68/TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드/TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF/OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드/DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드/LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드/TL6), TNFSF1A(TNF-a 코넥틴(Conectin)/DIF/TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa/TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC/p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34/TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드/APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1 BB 리간드 CD137 리간드), TNF-α, TNF-β, TNIL-I, 독성 대사산물(toxic metabolite), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, TGF-α 및 TGF-β 등의 트랜스포밍 증식인자(TGF), 막관통형 당단백질 NMB, 트랜스티레틴, TRF, Trk, TROP-2, 트로포블라스트 당단백질, TSG, TSLP, 종양 괴사인자(TNF), 종양 관련 항원 CA 125, Lewis Y 관련 당을 나타내는 종양 관련 항원, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 우로키나아제, VAP-1, 혈관 내피 증식인자(VEGF), 바스핀(vaspin), VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-카드헤린, VE-카드헤린-2, VEFGR-1(flt-1), VEFGR-2, VEGF 수용체(VEGFR), VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, 비타민 B12 수용체, 비트로넥틴 수용체, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰 빌레브란트 인자(vWF), WIF-1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, XCL2/SCM-l-β, XCLl/림포택틴, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화 LDL, PCSK9, prekallikrein, RON, TMEM16F, SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B, tau, VAP1, 고분자 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin, sclerostin, fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 조직인자, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, S1P 및 호르몬 및 성장인자를 위한 수용체 중 생체의 체액 중에서 세포에 계류되지 않고 가용형으로 존재하는 분자가 예시될 수 있다.
항원 중에 존재하는 항원 결정기를 의미하는 에피토프는, 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자 중의 항원 결합 도메인이 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 따라서, 예를 들면, 에피토프는 그 구조에 의해 정의될 수 있다. 또한, 당해 에피토프를 인식하는 항원 결합 분자 중의 항원에 대한 결합 활성에 따라서도 당해 에피토프가 정의될 수 있다. 항원이 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에는, 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다. 또한, 에피토프가 당쇄인 경우에는, 특정 당쇄 구조에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다.
직선상 에피토프는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 직선상 에피토프는 전형적으로는, 3개 이상 및 가장 보통으로는 5개 이상, 예를 들면 약 8 내지 약 10개, 6 내지 20개의 아미노산이 고유의 서열에 있어서 포함된다.
입체구조 에피토프는, 직선상 에피토프와는 대조적으로, 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이, 인식된 에피토프의 단일 규정 성분이 아닌 에피토프(예를 들면, 아미노산의 1차 서열이, 반드시 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식되는 것은 아닌 에피토프)이다. 입체구조 에피토프는, 직선상 에피토프에 대해 증대된 수의 아미노산을 포함할 지도 모른다. 입체구조 에피토프의 인식에 관하여, 항체는, 펩티드 또는 단백질의 3차원 구조를 인식한다. 예를 들면, 단백질 분자가 폴딩되어 3차원 구조를 형성하는 경우에는, 입체구조 에피토프를 형성하는 어떤 아미노산 및/또는 폴리펩티드 주쇄는 병렬로 되어, 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 한다. 에피토프의 입체구조를 결정하는 방법에는, 예를 들면 X선 결정학, 2차원 핵자기공명 분광학 및 부위 특이적인 스핀 표지 및 전자 상자성 공명 분광학이 포함되는데, 이들에는 한정되지 않는다. 예를 들면, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996), 제66권, Morris(편)를 참조.
결합 활성
하기에 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자에 의한 에피토프에 대한 결합의 확인방법이 예시되는데, IL-6R 이외의 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자에 의한 에피토프에 대한 결합의 확인방법도 하기의 예시에 준하여 적절히 실시될 수 있다.
예를 들면, IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가, IL-6R 분자 중에 존재하는 선상 에피토프를 인식하는 것은, 예를 들면 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 상기 목적을 위해 IL-6R의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상의 펩티드가 합성된다. 당해 펩티드는, 화학적으로 합성될 수 있다. 또는, IL-6R의 cDNA 중의, 세포외 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 코드하는 영역을 이용하여, 유전자 공학적 수법에 의해 얻어진다. 다음으로, 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드와, IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가된다. 예를 들면, 고정화된 선상 펩티드를 항원으로 하는 ELISA에 의해, 당해 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가될 수 있다. 또는, IL-6R 발현 세포에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합에 있어서의, 선상 펩티드에 의한 저해 레벨을 토대로, 선상 펩티드에 대한 결합 활성이 명확해질 수 있다. 이들 시험에 의해, 선상 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 명확해질 수 있다.
또한, IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 입체구조 에피토프를 인식하는 것은, 다음과 같이 하여 확인될 수 있다. 상기 목적을 위해, IL-6R을 발현하는 세포가 조제된다. IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 IL-6R 발현 세포에 접촉했을 때에 당해 세포에 강하게 결합하는 한편, 당해 항원 결합 분자가 고정화된 IL-6R의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드에 대해 실질적으로 결합하지 않을 때 등을 들 수 있다. 여기서, 실질적으로 결합하지 않는다는 것은, 인간 IL-6R 발현 세포에 대한 결합 활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합 활성을 말한다.
IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면, Antibodies A Laboratory Manual 기재의 방법(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988) 359-420)을 들 수 있다. 즉 IL-6R 발현 세포를 항원으로 하는 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 원리에 의해 평가될 수 있다.
ELISA 포맷에 있어서, IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 결합 활성은, 효소반응에 의해 생성되는 시그날 레벨을 비교함으로써 정량적으로 평가된다. 즉, IL-6R 발현 세포를 고정화한 ELISA 플레이트에 피험 항원 결합 분자를 첨가하여, 세포에 결합한 피험 항원 결합 분자가, 피험 항원 결합 분자를 인식하는 효소 표지 항체를 이용하여 검출된다. 또는 FACS에 있어서는, 피험 항원 결합 분자의 희석계열을 제작하여, IL-6R 발현 세포에 대한 항체 결합 역가(titer)를 결정함으로써, IL-6R 발현 세포에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교될 수 있다.
완충액 등에 현탁한 세포 표면 상에 발현되고 있는 항원에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합은, 플로우 사이토미터에 의해 검출할 수 있다. 플로우 사이토미터로서는, 예를 들면, 다음과 같은 장치가 알려져 있다.
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(모두 BD Biosciences사의 상품명)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(모두 Beckman Coulter사의 상품명)
예를 들면, IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성의 바람직한 측정방법의 일례로서, 다음의 방법을 들 수 있다. 먼저, IL-6R을 발현하는 세포와 반응시킨 피험 항원 결합 분자를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색한다. 피험 항원 결합 분자를 적당히 적합한 완충액으로 희석함으로써, 당해 항원 결합 분자가 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면, 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지 사이 중 어느 하나의 농도로 사용될 수 있다. 다음으로, FACSCalibur(BD사)에 의해 형광강도와 세포수가 측정된다. 당해 세포에 대한 항체의 결합량은, CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻음으로써, 피험 항원 결합 분자의 결합량으로 표시되는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 측정될 수 있다.
IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가, 어떤 항원 결합 분자와 에피토프를 공유하는 것은, 양자의 동일한 에피토프에 대한 경합에 의해 확인될 수 있다. 항원 결합 분자 간의 경합은, 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들면 경합 ELISA 어세이는, 바람직한 교차 블로킹 어세이이다.
구체적으로는, 교차 블로킹 어세이에 있어서는, 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 IL-6R 단백질이, 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 존재하, 또는 비존재하에서 프리인큐베이트된 후에, 피험 항원 결합 분자가 첨가된다. 웰 중의 IL-6R 단백질에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은, 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경합하는 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 경합 항원 결합 분자의 친화성이 커지면 커질수록, 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 단백질을 코트한 웰에 대한 결합 활성은 저하된다.
IL-6R 단백질을 매개로 웰에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은, 사전에 항원 결합 분자를 표지해 둠으로써, 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들면, 비오틴 표지된 항원 결합 분자는, 아비딘페록시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정된다. 페록시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이는, 특히 경합 ELISA 어세이라 불린다. 항원 결합 분자는, 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지될 수 있다. 구체적으로는, 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.
후보의 경합 항원 결합 분자 회합체의 비존재하에서 실시되는 대조 시험에 있어서 얻어지는 결합 활성과 비교하여, 경합 항원 결합 분자가, IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합을 20% 이상, 바람직하게는 20-50% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 블록할 수 있다면, 당해 피험 항원 결합 분자는 경합 항원 결합 분자와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경합하는 항원 결합 분자이다.
IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 구조가 동정되어 있는 경우에는, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은, 당해 에피토프를 구성하는 펩티드에 아미노산 변이를 도입한 펩티드에 대한 양자의 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교함으로써 평가될 수 있다.
이러한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면, 상기의 ELISA 포맷에 있어서 변이를 도입한 선상의 펩티드에 대한 피험 항원 결합 분자 및 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교함으로써 측정될 수 있다. ELISA 이외의 방법으로서는, 칼럼에 결합한 당해 변이 펩티드에 대한 결합 활성을, 당해 칼럼에 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 유하(流下)시킨 후에 용출액 중에 용출되는 항원 결합 분자를 정량함으로써도 측정될 수 있다. 변이 펩티드를 예를 들면 GST와의 융합 펩티드로서 칼럼에 흡착시키는 방법은 공지이다.
또한, 동정된 에피토프가 입체 에피토프인 경우에는, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은, 다음의 방법으로 평가될 수 있다. 먼저, IL-6R을 발현하는 세포와 에피토프에 변이가 도입된 IL-6R을 발현하는 세포가 조제된다. 이들 세포가 PBS 등의 적절한 완충액에 현탁된 세포 현탁액에 대해 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 첨가된다. 이어서, 적당히 완충액으로 세정된 세포 현탁액에 대해, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 인식할 수 있는 FITC 표지된 항체가 첨가된다. 표지 항체에 의해 염색된 세포의 형광강도와 세포수가 FACSCalibur(BD사)에 의해 측정된다. 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 농도는 적합한 완충액에 의해 적당히 희석함으로써 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면, 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지의 사이 중 어느 하나의 농도로 사용된다. 당해 세포에 대한 표지 항체의 결합량은, CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻음으로써, 표지 항체의 결합량으로 표시되는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 측정할 수 있다.
본 방법에 있어서, 예를 들면 「변이 IL-6R 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」다는 것은, 이하의 방법에 의해 판단할 수 있다. 변이 IL-6R을 발현하는 세포에 대해 결합한 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가, 표지 항체로 염색된다. 이어서, 세포의 형광강도가 검출된다. 형광 검출에 플로우 사이토메트리로서 FACSCalibur를 사용한 경우, 얻어진 형광강도는 CELL QUEST Software를 사용하여 해석될 수 있다. 항원 결합 분자 존재하 및 비존재하에서의 Geometric Mean의 값으로부터, 이 비교값(△Geo-Mean)을 하기의 계산식을 토대로 산출함으로써, 항원 결합 분자의 결합에 의한 형광강도의 증가비율을 구할 수 있다.
△Geo-Mean＝Geo-Mean(항원 결합 분자 존재하)/Geo-Mean(항원 결합 분자 비존재하)
해석에 의해 얻어지는 피험 항원 결합 분자의 변이 IL-6R 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 Geometric Mean 비교값(변이 IL-6R 분자 △Geo-Mean값)을, 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 △Geo-Mean 비교값과 비교한다. 이 경우에 있어서, 변이 IL-6R 발현 세포 및 IL-6R 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값을 구할 때 사용하는 피험 항원 결합 분자의 농도는 서로 동일 또는 실질적으로 동일 농도로 조제되는 것이 특히 바람직하다. 사전에 IL-6R 중의 에피토프를 인식하고 있는 것이 확인된 항원 결합 분자가, 대조 항원 결합 분자로서 이용된다.
피험 항원 결합 분자의 변이 IL-6R 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값이, 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값의, 80% 이상, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 30%, 특히 바람직하게는 15%보다 작으면, 「변이 IL-6R 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」 것으로 한다. Geo-Mean값(Geometric Mean)을 구하는 계산식은, CELL QUEST Software User's Guide(BD biosciences사)에 기재되어 있다. 비교값을 비교함으로써 그것이 실질적으로 동일하다고 볼 수 있는 정도라면, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 에피토프는 동일하다고 평가될 수 있다.
항원 결합 도메인
본 명세서에 있어서, 「항원 결합 도메인」은 목적으로 하는 항원에 결합하는 한 어떠한 구조의 도메인도 사용될 수 있다. 그러한 도메인의 예로서, 예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 생체내에 존재하는 세포막 단백인 Avimer에 포함되는 35 아미노산 정도의 A 도메인으로 불리는 모듈(WO2004/044011, WO2005/040229), 세포막에 발현하는 당단백질인 fibronectin 중의 단백질에 결합하는 도메인인 10Fn3 도메인을 포함하는 Adnectin(WO2002/032925), ProteinA의 58 아미노산으로 이루어지는 3개의 헬릭스의 다발(bundle)을 구성하는 IgG 결합 도메인을 scaffold로 하는 Affibody(WO1995/001937), 33 아미노산 잔기를 포함하는 턴과 2개의 역병행 헬릭스 및 루프의 서브유닛이 반복해서 겹쳐 쌓아진 구조를 갖는 안키린 반복(ankyrin repeat：AR)의 분자 표면에 노출되는 영역인 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565), 호중구 겔라티나아제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙방향으로 비틀어진 배럴 구조의 편측을 지지하는 4개의 루프영역인 Anticalin 등(WO2003/029462), 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템으로서 이뮤노 글로불린의 구조를 갖지 않는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))의 류신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈이 반복해서 겹쳐 쌓아진 편자모양의 구조 내부의 병행형 시트 구조의 움푹 들어간 영역(WO2008/016854)을 바람직하게 들 수 있다. 본 발명의 항원 결합 도메인의 적합한 예로서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 포함하는 항원 결합 도메인을 들 수 있다. 이러한 항원 결합 도메인의 예로서는, 「scFv(single chain Fv)」, 「단일 사슬 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」 등을 바람직하게 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인은, 동일 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 동일 에피토프는, 예를 들면, 서열번호：15에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다. 또한, 서열번호：15에 기재된 아미노산 서열의 20번째부터 365번째의 아미노산으로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다. 또는, 본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인은, 서로 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 상이한 에피토프는, 예를 들면, 서열번호：15에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다. 또한, 서열번호：15에 기재된 아미노산 서열의 20번째부터 365번째의 아미노산으로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다.
칼슘 결합 모티브
본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인은, 칼슘 결합 모티브를 포함한다. 칼슘 결합 모티브는, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 한, 항원 결합 도메인의 어느 위치에도 포함될 수 있다. 항원 결합 도메인이 항체의 가변영역인 경우는, 칼슘 결합 모티브는 가변영역의 중쇄에도 포함될 수 있고, 가변영역의 경쇄에도 포함될 수 있다. 또한, 칼슘 결합 모티브는, 중쇄 및 경쇄 양쪽에도 포함될 수 있다. 비한정의 다른 일태양에서는, 칼슘 결합 모티브는, 가변영역의 프레임워크 서열에도 포함될 수 있고, 가변영역의 CDR 서열에도 포함될 수 있다. 또한, 칼슘 결합 모티브는, 프레임워크 서열과 CDR 서열 양쪽에도 포함될 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서, 칼슘 결합 모티브는, 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기를 포함한다. 당해 아미노산 잔기의 예로서, 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산이 바람직하게 사용될 수 있다. 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산의 예로서, 예를 들면 세린(Ser(S)), 트레오닌(Thr(T)), 아스파라긴(Asn(N)), 글루타민(Gln(Q)), 아스파라긴산(Asp(D)), 글루타민산(Glu(E)), 히스티딘(His(H)) 및 티로신(Tyr(Y)) 등을 바람직하게 들 수 있다. 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 성질을 갖는 기존의 항원 결합 도메인에 존재하는 칼슘 결합 모티브가, 본 발명의 칼슘 결합 모티브로서 적당히 사용될 수 있다. 그러한 기존의 항원 결합 도메인의 비한정의 일례로서, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항체의 가변영역에 포함되는 칼슘 결합 모티브가 바람직하게 사용될 수 있다. 그러한 항체의 비한정의 예로서 서열번호：1 및 서열번호：2를 포함하는 IL-6 수용체 항체 및 서열번호：25 및 서열번호：26을 포함하는 IL-6 항체를 들 수 있다. 또한, 복수 개의 칼슘 이온 결합 부위를 가지며, 분자 진화상 공통의 기원으로부터 유래된 것으로 생각되는 트로포닌 C, 칼모듈린, 파브알부민, 미오신 경쇄 등이 알려져 있어, 그의 결합 모티브도 본 발명의 칼슘 결합 모티브로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 도메인이 항체의 가변영역인 경우는, 칼슘 결합 모티브는 가변영역의 중쇄에도 포함될 수 있고, 가변영역의 경쇄에도 포함될 수 있다. 또한, 칼슘 결합 모티브는, 중쇄 및 경쇄 양쪽에도 포함될 수 있다. 비한정의 다른 일태양에서는, 칼슘 결합 모티브는, 가변영역의 프레임워크 서열에도 포함될 수 있고, 가변영역의 CDR 서열에도 포함될 수 있다. 또한, 칼슘 결합 모티브는, 프레임워크 서열과 CDR 서열 양쪽에도 포함될 수 있다. 이들의 칼슘 결합 모티브가 포함되도록 중쇄 또는 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 설계하는 것도 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 비한정의 일태양에서는, 서열번호：41, 서열번호：63, 서열번호：64로 표시되는 인간 항체의 경쇄 가변영역에 포함되는 칼슘 결합 모티브를, 본 발명의 항원 결합 분자의 경쇄 가변영역에 포함되도록 설계하는 것이 가능하다. 그러한 칼슘 결합 모티브로서는, Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및/또는 92번 위치 중 어느 하나 이상의 아미노산이, 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산을 포함하는 칼슘 결합 모티브를 들 수 있다. 그러한 칼슘 결합 모티브의 비한정의 일태양으로서, 서열번호：41, 서열번호：63, 서열번호：64로 표시되는 인간 항체의 경쇄 가변영역의 Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및/또는 92번 위치의 5개의 아미노산으로부터 선택되는 1~4의 아미노산과 동일의 아미노산이, 대응하는 Kabat 넘버링의 아미노산 부위에 포함되는 칼슘 결합 모티브를 바람직하게 들 수 있다. 이 경우에 있어서, 경쇄 가변영역의 Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및/또는 92번 위치의 5개의 아미노산 부위 중, 서열번호：41, 서열번호：63, 서열번호：64로 표시되는 인간 항체의 경쇄 가변영역 중의 대응하는 아미노산 부위에 포함되는 아미노산과 비동일의 아미노산인 아미노산 부위에는, 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산이 포함되는 것이 바람직하다. 또한, 예를 들면, 본 발명의 비한정의 별도의 일태양에서는, 서열번호：1로 표시되는 중쇄 가변영역에 포함되는 칼슘 결합 모티브를, 본 발명의 항원 결합 분자의 중쇄 가변영역에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 그러한 칼슘 결합 모티브로서는, Kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치, 96번 위치 및/또는 100a번 위치의 아미노산이, 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산을 포함하는 칼슘 결합 모티브를 들 수 있다. 또한, 예를 들면, 본 발명의 비한정의 다른 일태양에서는, 서열번호：25로 표시되는 중쇄 가변영역에 포함되는 칼슘 결합 모티브를, 본 발명의 항원 결합 분자의 중쇄 가변영역에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 그러한 칼슘 결합 모티브로서는, Kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치 및/또는 101번 위치의 아미노산이, 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산을 포함하는 칼슘 결합 모티브를 들 수 있다. 이들의 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산으로서, 예를 들면 세린(Ser(S)), 트레오닌(Thr(T)), 아스파라긴(Asn(N)), 글루타민(Gln(Q)), 아스파라긴산(Asp(D)), 글루타민산(Glu(E), 히스티딘(His(H)) 및 티로신(Tyr(Y)) 등을 들 수 있다. 또한 칼슘 이온의 결합을 위해 이들 위치의 아미노산 주쇄의 카르보닐기가 관여하고 있어도 된다. 후술하는 실시예 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 칼슘 결합 모티브에 포함되는 아미노산을 목적하는 항원 결합 도메인에 이식함으로써, 놀랍게도 당해 항원 결합 도메인에 칼슘 이온 결합 활성을 부여하는 것이 가능하였다. 또한, 카드헤린 도메인, 칼모듈린에 포함되는 EF 핸드, Protein kinase C에 포함되는 C2 도메인, 혈액응고 단백질 Factor IX에 포함되는 Gla 도메인, 아시알로글리코프로테인 수용체나 만노오스 결합 수용체에 포함되는 C형 렉틴, LDL 수용체에 포함되는 A 도메인, 아넥신, 트롬보스폰딘 3형 도메인 및 EGF 유사 도메인도 또한 적당히 사용될 수 있다.
특이적
특이적이란, 한쪽 분자가 그 결합상대인 하나 또는 복수의 분자 이외의 분자에 대해서는 전혀 유의한 결합을 나타내지 않는 상태를 말한다. 또한, 항원 결합 도메인이, 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 사용된다. 또한, 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프가 복수의 상이한 항원에 포함되는 경우에는, 당해 항원 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자는 당해 에피토프를 포함하는 다양한 항원과 결합할 수 있다.
항체
본 명세서에 있어서 항체란, 천연의 것이거나 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역 글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연으로 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연 자원이나 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양상청으로부터 단리될 수 있고, 또는 유전자 재조합 등의 수법을 사용함으로써 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역 글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 바람직하게 들 수 있다. 인간의 면역 글로불린으로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 9종류의 클래스(아이소타입)가 알려져 있다. 본 발명의 항체에는, 이들 아이소타입 중 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 포함될 수 있다.
목적하는 결합 활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에 있어서 공지이다. 이하에, IL-6R에 결합하는 항체(항IL-6R 항체)를 제작하는 방법이 예시된다. IL-6R 이외의 항원에 결합하는 항체도 하기의 예시에 준하여 적당히 제작될 수 있다.
항IL-6R 항체는, 공지의 수단을 사용하여 다중클론 또는 단일클론 항체로서 취득될 수 있다. 항IL-6R 항체로서는, 포유동물 유래의 단일클론 항체가 바람직하게 제작될 수 있다. 포유동물 유래의 단일클론 항체에는, 하이브리도마에 의해 생산되는 것, 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주세포에 의해 생산되는 것 등이 포함된다. 본원 발명의 단일클론 항체에는, 「인간화 항체」나 「키메라 항체」가 포함된다.
단일클론 항체 생산 하이브리도마는, 공지기술을 사용함으로써, 예를 들면 이하와 같이 제작될 수 있다. 즉, IL-6R 단백질을 감작 항원으로서 사용하여, 통상의 면역방법에 따라 포유동물이 면역된다. 얻어지는 면역세포가 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합된다. 다음으로, 통상의 스크리닝법에 의해, 단일클론 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 항IL-6R 항체를 생산하는 하이브리도마가 선택될 수 있다.
구체적으로는, 단일클론 항체의 제작은 예를 들면 이하에 나타내는 바와 같이 행해진다. 먼저, 서열번호：16에 그의 뉴클레오티드 서열이 개시된 IL-6R 유전자를 발현함으로써, 항체 취득의 감작 항원으로서 사용되는 서열번호：15로 표시되는 IL-6R 단백질이 취득될 수 있다. 즉, IL-6R을 코드하는 유전자 서열을 공지의 발현 벡터에 삽입함으로써 적당한 숙주세포가 형질전환된다. 당해 숙주세포 중 또는 배양상청 중으로부터 목적하는 인간 IL-6R 단백질이 공지의 방법으로 정제된다. 배양상청 중으로부터 가용형의 IL-6R을 취득하기 위해서는, 예를 들면, Mullberg등(J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968)에 의해 기재되어 있는 바와 같은 가용형 IL-6R인, 서열번호：15로 표시되는 IL-6R 폴리펩티드 서열 중, 1부터 357번째의 아미노산으로 이루어지는 단백질이, 서열번호：15로 표시되는 IL-6R 단백질 대신에 발현된다. 또한, 정제한 천연의 IL-6R 단백질도 또한 동일하게 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
포유동물에 대한 면역에 사용하는 감작 항원으로서 당해 정제 IL-6R 단백질을 사용할 수 있다. IL-6R의 부분 펩티드도 또한 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 이때, 당해 부분 펩티드는 인간 IL-6R의 아미노산 서열로부터 화학합성으로도 취득될 수 있다. 또한, IL-6R 유전자의 일부를 발현 벡터에 삽입하여 발현시킴으로써도 취득될 수 있다. 더 나아가서는 단백질 분해효소를 사용하여 IL-6R 단백질을 분해함으로써도 취득될 수 있으나, 부분 펩티드로서 사용되는 IL-6R 펩티드의 영역 및 크기는 특별한 태양에 한정되지 않는다. 바람직한 영역은 서열번호：15의 아미노산 서열에 있어서 20-357번째의 아미노산에 상당하는 아미노산 서열로부터 임의의 서열이 선택될 수 있다. 감작 항원으로 하는 펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 적어도 5 이상, 예를 들면 6 이상, 또는 7 이상인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 8~50, 바람직하게는 10~30 잔기의 펩티드가 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
또한, IL-6R 단백질의 목적하는 부분 폴리펩티드나 펩티드를 상이한 폴리펩티드와 융합한 융합 단백질이 감작 항원으로서 이용될 수 있다. 감작 항원으로서 사용되는 융합 단백질을 제조하기 위해, 예를 들면, 항체의 Fc 단편이나 펩티드 태그 등이 바람직하게 이용될 수 있다. 융합 단백질을 발현하는 벡터는, 목적하는 2종류 또는 그 이상의 폴리펩티드 단편을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되고, 당해 융합 유전자가 상기와 같이 발현 벡터에 삽입됨으로써 제작될 수 있다. 융합 단백질의 제작방법은 Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab. press)에 기재되어 있다. 감작 항원으로서 사용되는 IL-6R의 취득방법 및 그것을 이용한 면역방법은, WO2003/000883, WO2004/022754, WO2006/006693 등에도 구체적으로 기재되어 있다.
당해 감작 항원으로 면역되는 포유동물로서는, 특정 동물에 한정되는 것은 아니나, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터, 또는 토끼, 원숭이 등이 바람직하게 사용된다.
공지의 방법에 따라 상기 동물이 감작 항원에 의해 면역된다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서, 감작 항원이 포유동물의 복강내 또는 피하에 투여에 의해 투여됨으로써 면역이 실시된다. 구체적으로는, PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당한 희석배율로 희석된 감작 항원이, 목적하는 바에 따라 통상의 애쥬번트, 예를 들면 프로인트 완전 애쥬번트와 혼합되어, 유화된 후에, 그 감작 항원이 포유동물에 4~21일마다 수회 투여된다. 또한, 감작 항원의 면역시에는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩티드가 감작 항원으로서 사용되는 경우에는, 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 등의 담체 단백질과 결합한 그 감작 항원 펩티드를 면역하는 것이 바람직한 경우도 있다.
또한, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는, DNA 면역을 사용하여, 이하와 같이 해서도 제작될 수 있다. DNA 면역이란, 면역동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현될 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA가 투여된 당해 면역동물 중에서, 감작 항원이 당해 면역동물의 생체내에서 발현됨으로써, 면역자극이 부여되는 면역방법이다. 단백질 항원이 면역동물에 투여되는 일반적인 면역방법과 비교하여, DNA 면역에는, 다음과 같은 우위성이 기대된다.
-IL-6R과 같은 막단백질의 구조를 유지하여 면역자극이 부여될 수 있다
-면역항원을 정제할 필요가 없다
DNA 면역에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 얻기 위해, 먼저, IL-6R 단백질을 발현하는 DNA가 면역동물에 투여된다. IL-6R을 코드하는 DNA는, PCR 등의 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다. 얻어진 DNA가 적당한 발현 벡터에 삽입되어, 면역동물에 투여된다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터가 바람직하게 이용될 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법으로서, 일반적으로 사용되고 있는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터가 흡착된 금 입자가, gene gun으로 면역동물 개체의 세포내에 도입됨으로써 DNA 면역이 행해진다. 또한, IL-6R을 인식하는 항체의 제작은 국제공개 WO 2003/104453에 기재된 방법을 사용해도 제작될 수 있다.
이와 같이 포유동물이 면역되고, 혈청 중에 있어서의 IL-6R에 결합하는 항체 역가의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역세포가 채취되어, 세포융합에 제공된다. 바람직한 면역세포로서는, 특히 비장세포가 사용될 수 있다.
상기 면역세포와 융합되는 세포로서, 포유동물의 골수종 세포가 사용된다. 골수종 세포는, 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란, 특정 배양 조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커로는, 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 결손(이하 HGPRT 결손으로 생략한다), 또는 티미딘키나아제 결손(이하 TK 결손으로 생략한다) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성으로 생략한다)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택 배지 중에서 DNA 합성을 행할 수 없어 사멸되지만, 정상의 세포와 융합하면 정상 세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택 배지 중에서도 증식되게 된다.
HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는, 각각 6 티오구아닌, 8 아자구아닌(이하 8AG로 생략한다), 또는 5'브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 이들의 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 흡수하는 정상의 세포는 사멸된다. 한편, 이들의 피리미딘 아날로그를 흡수할 수 없는 이들의 효소를 결손한 세포는, 선택 배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성으로 불리는 선택 마커는, 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포융합에 적합한 각종의 골수종 세포가 공지이다.
이러한 골수종 세포로서, 예를 들면, P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol.(1976)6 (7), 511-519), MPC-11(Cell(1976)8 (3), 405-415), SP2/0(Nature(1978)276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods(1980)35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1(J. Exp. Med.(1978)148 (1), 313-323), R210(Nature(1979)277 (5692), 131-133) 등이 바람직하게 사용될 수 있다.
기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 쾰러와 밀스테인등의 방법(Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준하여, 상기 면역세포와 골수종 세포의 세포융합이 행해진다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양배양액 중에서, 상기 세포융합이 실시될 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 추가로 융합효율을 높이기 위해 목적하는 바에 따라 디메틸설폭시드 등의 보조제가 첨가되어 사용된다.
면역세포와 골수종 세포의 사용비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대해 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면, 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용되고, 추가로, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액이 적합하게 첨가될 수 있다.
세포융합은, 상기 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하여, 사전에 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액(예를 들면 평균 분자량 1000~6000 정도)이 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가된다. 혼합액이 완만하게 혼합됨으로써 목적하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 이어서, 상기에 예로 든 적당한 배양액이 축차 첨가되고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등이 제거될 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간(통상, 이러한 충분한 시간은 수일 내지 수 주간이다) 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시된다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 세포융합에 사용된 골수종이 갖는 선택 마커에 따른 선택 배양액을 이용함으로써 선택될 수 있다. 예를 들면 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종 세포를 세포융합에 사용한 경우, HAT 배양액 중에서, 정상 세포와의 세포융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속된다. 구체적으로는, 일반적으로, 수일 내지 수 주간의 배양에 의해, 목적하는 하이브리도마가 선택될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다.
목적하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이, 공지의 항원 항체 반응에 기초하는 스크리닝방법에 의해 바람직하게 실시될 수 있다. 예를 들면, IL-6R에 결합하는 단일클론 항체는, 세포 표면에 발현된 IL-6R에 결합할 수 있다. 이러한 단일클론 항체는, 예를 들면, FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 스크리닝될 수 있다. FACS는, 형광 항체와 접촉시킨 세포를 레이저광으로 해석하여, 개개의 세포가 발하는 형광을 측정함으로써 세포 표면에 대한 항체의 결합을 측정하는 것을 가능하게 하는 시스템이다.
FACS에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는, 먼저 IL-6R을 발현하는 세포를 조제한다. 스크리닝하기 위한 바람직한 세포는, IL-6R을 강제 발현시킨 포유동물세포이다. 숙주세포로서 사용한 형질전환되어 있지 않은 포유동물세포를 대조로서 사용함으로써, 세포 표면의 IL-6R에 대한 항체의 결합 활성이 선택적으로 검출될 수 있다. 즉, 숙주세포에 결합하지 않고, IL-6R 강제 발현 세포에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택함으로써, IL-6R 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마가 취득될 수 있다.
또는 고정화한 IL-6R 발현 세포에 대한 항체의 결합 활성이 ELISA의 원리를 토대로 평가될 수 있다. 예를 들면, ELISA 플레이트의 웰에 IL-6R 발현 세포가 고정화된다. 하이브리도마의 배양상청을 웰 내의 고정화 세포에 접촉시켜, 고정화 세포에 결합하는 항체가 검출된다. 단일클론 항체가 마우스 유래인 경우, 세포에 결합한 항체는, 항마우스 이뮤노 글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 이들의 스크리닝에 의해 선택된, 항원에 대한 결합능을 갖는 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는, 한계희석법 등에 의해 클로닝될 수 있다.
이와 같이 하여 제작되는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양될 수 있다. 또한, 그 하이브리도마는 액체질소 중에서 장기에 걸쳐 보존될 수 있다.
당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양상청으로부터 목적하는 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고, 그의 복수로부터 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 전자의 방법은, 고순도의 항체를 얻기에 적합한 것이다.
당해 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 클로닝되는 항체 유전자에 의해 코드되는 항체도 바람직하게 이용될 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 적당한 벡터에 삽입하여 숙주에 도입함으로써, 당해 유전자에 의해 코드되는 항체가 발현된다. 항체 유전자의 단리와, 벡터로의 도입, 그리고 숙주세포의 형질전환을 위한 방법은 예를 들면, Vandamme등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur.J. Biochem.(1990)192 (3), 767-775). 하기에 기술하는 바와 같이 재조합 항체의 제조방법도 또한 공지이다.
예를 들면, 항IL-6R 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터, 항IL-6R 항체의 가변영역(V 영역)을 코드하는 cDNA가 취득된다. 그 때문에, 통상, 먼저 하이브리도마로부터 전체 RNA가 추출된다. 세포로부터 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서, 예를 들면 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다.
-구아니딘 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
-AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
추출된 mRNA는, mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등을 사용하여 정제될 수 있다. 또는, QuickPrep mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등과 같이, 세포로부터 직접 전체 mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이러한 키트를 사용하여, 하이브리도마로부터 mRNA가 취득될 수 있다. 얻어진 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체 V 영역을 코드하는 cDNA가 합성될 수 있다. cDNA는 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학 공업사 제조) 등에 의해 합성될 수 있다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 위해, SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech 제조) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002, Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)이 적당히 이용될 수 있다. 또한 이러한 cDNA의 합성과정에 있어서 cDNA의 양말단에 후술하는 적절한 제한효소 사이트가 도입될 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편이 정제되고, 이어서 벡터 DNA와 연결된다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되고, 대장균 등에 도입되어 콜로니가 선택된 후에, 그 콜로니를 형성한 대장균으로부터 목적하는 재조합 벡터가 조제될 수 있다. 그리고, 그 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기서열을 가지고 있는지 여부에 대해서, 공지의 방법, 예를 들면, 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법 등에 의해 확인된다.
가변영역을 코드하는 유전자를 취득하기 위해서는, 가변영역 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 5'-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 먼저 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되고, 5'-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판의 키트가 적당히 사용된다.
얻어진 5'-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR법에 의해 항체 유전자가 증폭된다. 공지의 항체 유전자 서열을 토대로 마우스 항체 유전자 증폭용 프라이머가 디자인될 수 있다. 이들 프라이머는, 이뮤노 글로불린의 서브클래스별로 상이한 염기서열이다. 따라서, 서브클래스는 사전에 Iso Strip 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(로슈 다이어그노스틱스) 등의 시판 키트를 사용하여 결정해 두는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 예를 들면 마우스 IgG를 코드하는 유전자의 취득을 목적으로 할 때는, 중쇄로서 γ1, γ2a, γ2b, γ3, 경쇄로서 κ쇄와 λ쇄를 코드하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머가 이용될 수 있다. IgG의 가변영역 유전자를 증폭하기 위해서는, 일반적으로 3'측의 프라이머에는 가변영역에 가까운 정상영역에 상당하는 부분에 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 한편 5'측의 프라이머에는, 5'RACE cDNA 라이브러리 제작 키트에 부속되는 프라이머가 이용된다.
이렇게 하여 증폭된 PCR 산물을 이용하여, 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 이뮤노 글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 이뮤노 글로불린의, IL-6R에 대한 결합 활성을 지표로 하여, 목적하는 항체가 스크리닝될 수 있다. 예를 들면 IL-6R에 대한 항체의 취득을 목적으로 할 때, 항체의 IL-6R에 대한 결합은, 특이적인 것이 더욱 바람직하다. IL-6R에 결합하는 항체는, 예를 들면 다음과 같이 하여 스크리닝될 수 있다；
(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코드되는 V 영역을 포함하는 항체를 IL-6R 발현 세포에 접촉시키는 공정,
(2) IL-6R 발현 세포와 항체의 결합을 검출하는 공정, 및
(3) IL-6R 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.
항체와 IL-6R 발현 세포의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는, 앞서 기술한 FACS 등의 수법에 의해, 항체와 IL-6R 발현 세포의 결합이 검출될 수 있다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 IL-6R 발현 세포의 고정 표본이 적당히 이용될 수 있다.
결합 활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝방법으로서, 파지 벡터를 이용한 패닝법도 바람직하게 사용된다. 다중클론 항체 발현 세포군으로부터 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스의 라이브러리로서 취득한 경우에는, 파지 벡터를 이용한 스크리닝방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변영역을 코드하는 유전자는, 적당한 링커 서열로 연결함으로써 싱글 체인 Fv(scFv)을 형성할 수 있다. scFv를 코드하는 유전자를 파지 벡터에 삽입함으로써, scFv를 표면에 발현하는 파지가 취득될 수 있다. 이 파지와 목적하는 항원의 접촉 후에, 항원에 결합한 파지를 회수함으로써, 목적의 결합 활성을 갖는 scFv를 코드하는 DNA가 회수될 수 있다. 이 조작을 필요에 따라 반복함으로써, 목적하는 결합 활성을 갖는 scFv가 농축될 수 있다.
목적으로 하는 항IL-6R 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양말단에 삽입한 제한효소 사이트를 인식하는 제한효소에 의해 그 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한효소는, 항체 유전자를 구성하는 염기서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기서열을 인식하여 소화한다. 또한 1 카피의 소화 단편을 벡터에 바른 방향으로 삽입하기 위해서는, 부착 말단을 부여하는 제한효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 소화된 항IL-6R 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써, 항체 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이때, 항체 정상영역(C 영역)을 코드하는 유전자와, 상기 V 영역을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되면, 키메라 항체가 취득된다. 여기서, 키메라 항체란, 정상영역과 가변영역의 유래가 상이한 것을 말한다. 따라서, 마우스-인간 등의 이종(異種) 키메라 항체에 더하여, 인간-인간 동종(同種) 키메라 항체도, 본 발명에 있어서의 키메라 항체에 포함된다. 사전에 정상영역을 갖는 발현 벡터에, 상기 V 영역 유전자를 삽입함으로써, 키메라 항체 발현 벡터가 구축될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 목적하는 항체 정상영역(C 영역)을 코드하는 DNA를 보유한 발현 벡터의 5'측에, 상기 V 영역 유전자를 소화하는 제한효소의 제한효소 인식서열이 적당히 배치될 수 있다. 동일한 조합의 제한효소로 소화된 양자가 인프레임으로 융합됨으로써, 키메라 항체 발현 벡터가 구축된다.
항IL-6R 단일클론 항체를 제조하기 위해, 항체 유전자가 발현 제어영역에 의한 제어하에서 발현되도록 발현 벡터에 삽입된다. 항체를 발현하기 위한 발현 제어영역이란, 예를 들면, 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한, 발현된 항체가 세포외로 분비되도록, 적절한 시그날 서열이 아미노 말단에 부가될 수 있다. 예를 들면, 시그날 서열로서, 아미노산 서열 MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호：113)를 갖는 펩티드가 사용될 수 있는데, 이것 이외에도 적합한 시그날 서열이 부가된다. 발현된 폴리펩티드는 상기 서열의 카르복실 말단 부분에서 절단되고, 절단된 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로서 세포외로 분비될 수 있다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주세포가 형질전환됨으로써, 항IL-6R 항체를 코드하는 DNA를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다.
항체 유전자 발현을 위해, 항체 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA는, 각각 다른 발현 벡터에 삽입된다. H쇄와 L쇄가 삽입된 벡터에 의해, 동일 숙주세포에 동시에 형질전환(co-transfect)됨으로써, H쇄와 L쇄를 구비한 항체 분자가 발현될 수 있다. 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA가 단일의 발현 벡터에 삽입됨으로써 숙주세포가 형질전환될 수 있다(국제공개 WO 1994011523을 참조할 것).
단리된 항체 유전자를 적당한 숙주에 도입함으로써 항체를 제작하기 위한 숙주세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들의 발현계는, 모두 본 발명의 항원 결합 도메인을 단리하는데 응용될 수 있다. 진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우, 동물세포, 식물세포, 또는 진균세포가 적당히 사용될 수 있다. 구체적으로는, 동물세포로서는, 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포,：CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero 등
(2) 양서류세포：아프리카 발톱개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등
또는 식물세포로서는, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는, 캘러스 배양한 세포가 적당히 이용될 수 있다.
또한 진균세포로서는, 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.
-효모：사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces)속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia속
-사상균：아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus)속
또한, 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들면, 세균세포를 사용하는 경우, 대장균(E. coli), 고초균 등의 세균세포가 적당히 이용될 수 있다. 이들 세포 중에, 목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질전환에 의해 도입된다. 형질전환된 세포를 in vitro에서 배양함으로써, 당해 형질전환 세포의 배양물로부터 목적하는 항체가 취득될 수 있다.
재조합 항체의 생산에는, 상기 숙주세포에 더하여, 형질전환 동물도 이용될 수 있다. 즉 목적하는 항체를 코드하는 유전자가 도입된 동물로부터, 당해 항체를 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자는, 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 내부에 인프레임으로 삽입함으로써 융합 유전자로서 구축될 수 있다. 유즙 중에 분비되는 단백질로서, 예를 들면, 염소 β카제인 등을 이용할 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배(胚)로 주입되고, 당해 주입된 배가 암컷의 염소로 도입된다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소(또는 그의 자손)가 생산하는 유즙으로부터는, 목적하는 항체가 유즙 단백질과의 융합 단백질로서 취득될 수 있다. 또한, 형질전환 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 호르몬이 형질전환 염소에 대해 투여될 수 있다(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자가 인간에게 투여되는 경우, 당해 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인으로서, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 유래의 항원 결합 도메인이 적당히 채용될 수 있다. 유전자 재조합형 항체에는, 예를 들면, 인간화(Humanized) 항체 등이 포함된다. 이들 개변 항체는, 공지의 방법을 사용하여 적당히 제조된다.
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인을 제작하기 위해 사용되는 항체의 가변영역은, 통상, 4개의 프레임워크 영역(FR) 사이에 끼인 3개의 상보성 결정영역(complementarity-determining region;CDR)으로 구성되어 있다. CDR은 실질적으로 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은, 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 사이에서도 높은 동일성을 나타내는 것이 많다. 그 때문에, 일반적으로, CDR의 이식에 의해, 어떤 항체의 결합 특이성을, 다른 항체에 이식할 수 있는 것으로 되어 있다.
인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해진다. 구체적으로는, 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서, 예를 들면 Overlap Extension PCR이 공지이다. Overlap Extension PCR에 있어서는, 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에, 이식 대상 마우스 항체의 CDR을 코드하는 염기서열이 부가된다. 프라이머는 4개의 FR의 각각에 대해서 준비된다. 일반적으로, 마우스 CDR의 인간 FR에 대한 이식에 있어서는, 마우스의 FR과 동일성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이, CDR의 기능 유지에 있어서 유리하다고 되어 있다. 즉, 일반적으로, 이식 대상 마우스 CDR에 인접해 있는 FR의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열로 이루어지는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.
또한 연결되는 염기서열은, 서로 인프레임으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머에 의해 인간 FR이 개별적으로 합성된다. 그 결과, 각 FR에 마우스 CDR을 코드하는 DNA가 부가된 산물이 얻어진다. 각 산물의 마우스 CDR을 코드하는 염기서열은, 서로 오버랩되도록 디자인되어 있다. 계속해서, 인간 항체 유전자를 주형으로 하여 합성된 산물의 오버랩된 CDR 부분을 서로 어닐링시켜서 상보가닥 합성반응이 행해진다. 이 반응에 의해, 인간 FR이 마우스 CDR의 서열을 매개로 연결된다.
최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V 영역 유전자는, 그의 5'말단과 3'말단에 어닐링하여 적당한 제한효소 인식서열이 부가된 프라이머에 의해 그의 전장이 증폭된다. 상기와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C 영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써, 인간형 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 당해 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에, 당해 재조합 세포를 배양하고, 당해 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써, 당해 인간화 항체가 당해 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP239400, 국제공개 WO1996/002576호 참조).
상기와 같이 제작된 인간화 항체의 항원에 대한 결합 활성을 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 평가함으로써, CDR을 매개로 연결되었을 때 그 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 인간 항체의 FR을 적합하게 선택할 수 있다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면, 마우스 CDR의 인간 FR에 대한 이식에 사용한 PCR법을 응용하여, FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는, FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이러한 프라이머에 의해 합성된 FR에는, 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원에 대한 결합 활성을 상기 방법으로 측정하여 평가함으로써 목적하는 성질을 갖는 변이 FR 서열이 선택될 수 있다(Cancer Res., (1993) 53, 851-856).
또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역동물로 하여, DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.
또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 V 영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V 영역 서열을 목적하는 인간 항체 C 영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
또한, 항체 유전자를 취득하는 방법으로서 Bernasconi등(Science (2002) 298, 2199-2202) 또는 WO2008/081008에 기재된 바와 같은 B세포 클로닝(각각의 항체의 코드 서열의 동정 및 클로닝, 그의 단리, 및 각각의 항체(특히, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 제작을 위한 발현 벡터 구축을 위한 사용 등)의 수법이, 상기 외에 적당히 사용될 수 있다.
EU 넘버링
본 발명에서 사용되고 있는 방법에 의하면, 항체의 CDR과 FR에 할당되는 아미노산 위치는 Kabat에 따라 규정된다(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987년 및 1991년). 본 명세서에 있어서, 항원 결합 분자가 항체 또는 항원 결합 단편인 경우, 가변영역의 아미노산은 Kabat 넘버링에 따라, 정상영역의 아미노산은 Kabat의 아미노산 위치에 준한 EU 넘버링에 따라 표시된다.
항원의 세포내로의 흡수 또는 세포내로의 흡수의 촉진
본 발명에 있어서 항원 결합 분자에 의한 「항원의 세포내로의 흡수」란, 항원이 엔도사이토시스에 의해 세포내에 흡수되는 것을 의미한다. 또한 본 발명에 있어서 「세포내로의 흡수를 촉진한다」는 것은, 혈장 중에 있어서 항원과 결합한 항원 결합 분자가 세포내에 흡수되는 속도가 촉진되는 것, 및/또는, 흡수된 항원이 혈장 중으로 리사이클되는 양이 감소하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서의 세포내로의 흡수속도의 촉진 정도는, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하시키기 전의 항원 결합 분자와 비교하여, 세포내로의 흡수속도가 촉진되어 있으면 된다. 따라서, 본 발명에 있어서, 항원 결합 분자에 의해 항원의 세포내로의 흡수가 촉진되었는지 여부는, 항원의 세포내로의 흡수속도가 증대되었는지 여부로 판단하는 것이 가능하다. 항원의 세포내로의 흡수속도는, 예를 들면, 인간 FcRn 발현 세포를 포함하는 배양액에 항원 결합 분자와 항원을 첨가하고, 항원의 배양액 중 속도의 감소를 경시적으로 측정하는 것, 또는, 인간 FcRn 발현 세포내에 흡수된 항원의 양을 경시적으로 측정하는 것에 의해 산출할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자의 항원의 세포내로의 흡수속도를 촉진시키는 방법을 이용함으로써, 예를 들면 항원 결합 분자를 투여함으로써, 혈장 중의 항원의 소실속도를 촉진시킬 수 있다. 따라서, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수가 촉진되었는지 여부는, 예를 들면, 혈장 중에 존재하는 항원의 소실속도가 가속되어 있는지 여부, 또는, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도가 저감되어 있는지 여부를 측정함으로써도 확인할 수 있다. 즉 본 발명의 항원 결합 분자의 투여에 의해, 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 것도 가능하다.
1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수
또한, 본 발명에 있어서의 「1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수」란, 1분자의 항원 결합 분자가 분해되어 소실될 때까지의 사이에 항원으로 결합할 수 있는 횟수를 의미한다. 본 발명에 있어서의 「1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시킨다」는 것은, 혈장 중에서 항원이 항원 결합 분자에 결합하고, 항원이 결합된 항원 결합 분자가 세포내에 흡수되어 엔도솜 내에서 항원을 해리한 후에, 항원 결합 분자가 혈장 중으로 되돌아가는 것을 1 사이클로 했을 때, 1분자의 항원 결합 분자가 분해되어 소실될 때까지의 사이에 돌릴 수 있었던 이 사이클의 수를 증가시키는 것이다. 본 발명에 있어서는, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮지 않은 항원 결합 분자, 또는, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하시키기 전의 항원 결합 분자와 비교하여, 사이클 수가 증가되어 있으면 된다. 따라서, 사이클의 수가 증가되었는지 여부는, 전술한 「세포내로의 흡수를 촉진는지」 여부, 또는, 후술하는「혈장 중 체류성이 개선되었는지」 여부에 따라, 판단하는 것이 가능하다.
혈장 중 체류성의 개선
본 발명에 있어서 「혈장 중 체류성의 개선」은, 「약물동태의 향상」, 「약물동태의 개선」, 「우수한 약물동태」, 「혈장 중 체류성의 향상」, 「우수한 혈장 중 체류성」 또는 「혈장 중 체류성을 길게 한다」라고 바꿔 말하는 것이 가능하며, 이들의 어구는 동일 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서 「혈장 중 체류성을 개선한다」는 것은, 항원 결합 분자가 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼, 개 등의 동물에 투여된 후에, 혈장 중으로부터 소실될 때까지(예를 들면, 세포내에서 분해되거나 하여 항원 결합 분자가 혈장 중으로 되돌아가는 것이 불가능한 상태가 될 때까지)의 시간이 길어지는 것 뿐 아니라, 항원 결합 분자가 투여된 후에 분해되어 소실될 때까지의 사이에 항원에 결합 가능한 상태(예를 들면, 항원 결합 분자가 항원에 결합해 있지 않은 상태)에서 혈장 중에 체류하는 시간이 길어지는 것도 포함한다. 즉 항원에 결합해 있지 않은 항원 결합 분자(항원 비결합형 항원 결합 분자)가 분해되어 소실될 때까지의 시간이 길어지는 것을 포함한다.
항원 결합 분자가 혈장 중에 존재하고 있더라도, 그 항원 결합 분자에 이미 항원이 결합해 있는 경우는, 그 항원 결합 분자는 새로운 항원에 결합할 수 없다. 그 때문에 항원 결합 분자가 항원에 결합해 있지 않은 시간이 길어지면, 새로운 항원에 결합할 수 있는 시간이 길어져(새로운 항원에 결합할 수 있는 기회가 많아져), 생체내에서 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있지 않은 시간을 감소시킬 수 있어, 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간을 길게 할 수 있다. 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 가속시킬 수 있으면, 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 농도는 증가되고, 또한, 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간이 길어진다. 즉, 본 발명에 있어서의 「항원 결합 분자의 혈장 중 체류성의 개선」이란, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮지 않은 항원 비결합형 항원 결합 분자, 또는, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하시키기 전의 항원 비결합형 항원 결합 분자와 비교하여, 본 발명의 항원 비결합형 항원 결합 분자 중 어느 하나의 약물동태 파라미터가 개선(혈장 중 반감기의 증가, 평균 혈장 중 체류시간의 증가, 혈장 중 클리어런스의 저하 중 어느 하나)되거나, 또는, 항원 결합 분자 투여 후에 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간이 연장되거나, 또는, 항원 결합 분자에 의한 혈장 중으로부터의 항원의 소실이 가속되는 것을 포함한다.
약물동태 파라미터가 개선되었는지 여부는, 항원 결합 분자 또는 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 반감기, 평균 혈장 중 체류시간, 혈장 중 클리어런스 등 중 어느 하나의 파라미터(파마코키네틱스 연습에 의한 이해(난잔도))를 측정함으로써 판단하는 것이 가능하다. 예를 들면, 항원 결합 분자를 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼, 개, 인간 등에 투여한 경우, 항원 결합 분자 또는 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 농도를 측정하여, 각 파라미터를 산출하고, 혈장 중 반감기가 길어졌거나 또는 평균 혈장 중 체류시간이 길어진 경우 등에는, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성이 개선되었다고 할 수 있다. 이들 파라미터는 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하며, 예를 들면, 약물동태 해석 소프트웨어 WinNonlin(Pharsight)을 사용하여, 부속의 순서에 따라 Noncompartmental 해석을 함으로써 적당히 평가할 수 있다. 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 농도의 측정은 당업자 공지의 방법으로 실시하는 것이 가능하며, 예를 들면, Clin Pharmacol. 2008 Apr;48(4):406-17에 있어서 측정되고 있는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 「혈장 중 체류성을 개선한다」는 것은, 항원 결합 분자 투여 후에 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간이 연장된 것도 포함한다. 항원 결합 분자 투여 후에 항원이 항원 결합 분자에 결합해 있는 시간이 연장되었는지 여부는, 항원 결합 분자 비결합형 항원(유리형 항원)의 혈장 중 농도, 또는 총 항원 농도에 대한 항원 결합 분자 비결합형 항원 농도(유리형 항원 농도)를 측정하여, 당해 농도의 비율이 상승될 때까지의 시간으로 판단하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서 「혈장 중의 항원 농도」의 측정은, 항원 결합 분자 비결합형 항원의 혈장 중 농도, 또는 총 항원 농도에 대한 항원 결합 분자 비결합형 항원 농도의 비율을 당업자 공지의 방법을 사용하여 실시하는 것이 가능하며, 예를 들면, Pharm Res. 2006 Jan;23(1):95-103에 있어서 측정되고 있는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 항원이 어떠한 기능을 생체내에서 나타내는 경우, 항원이 항원의 기능을 중화하는 항원 결합 분자(안타고니스트 분자)와 결합해 있는지 여부는, 그 항원의 기능이 중화되어 있는지 여부로 평가하는 것도 가능하다. 항원의 기능이 중화되어 있는지 여부는, 항원의 기능을 반영하는 어떠한 생체내의 마커를 측정함으로써 평가하는 것이 가능하다. 항원이 항원의 기능을 활성화하는 항원 결합 분자(아고니스트 분자)와 결합해 있는지 여부는, 항원의 기능을 반영하는 어떠한 생체내의 마커를 측정함으로써 평가하는 것이 가능하다.
항원 결합 분자 비결합형 항원의 혈장 중 농도의 측정, 총 항원 농도에 대한 항원 결합 분자 비결합형의 항원 농도의 비율의 측정, 생체내 마커의 측정 등의 측정은 특별히 한정되지 않으나, 항원 결합 분자가 투여된 뒤부터 일정 시간이 경과한 후에 행해지는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 「항원 결합 분자가 투여된 뒤부터 일정 시간이 경과된 후」란, 특별히 한정되지 않고, 투여된 항원 결합 분자의 성질 등에 따라 당업자가 적시 결정하는 것이 가능하여, 예를 들면 항원 결합 분자를 투여한 뒤 1일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 뒤 3일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 뒤 7일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 뒤 14일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 뒤 28일 경과 후 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 인간에 있어서의 혈장 중 체류성이 개선되는 것이 바람직하다. 인간에 있어서의 혈장 중 체류성을 측정하는 것이 곤란한 경우에는, 마우스(예를 들면, 정상 마우스, 인간 항원 발현 형질전환 마우스, 인간 FcRn 발현 형질전환 마우스 등)나 원숭이(예를 들면, 게잡이원숭이 등)에 있어서의 혈장 중 체류성을 토대로, 인간에 있어서의 혈장 중 체류성을 예측할 수 있다.
세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원의 세포내에서의 항원 결합 분자로부터의 해리
또한, 본 발명은, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원의 세포내에서의 항원 결합 분자로부터의 해리를 촉진시키는 방법으로서 이용하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서 항원이 항원 결합 분자로부터 해리되는 개소는 세포내라면 어떠한 개소여도 되나, 바람직하게는 조기 엔도솜 내이다. 본 발명에 있어서, 「세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원의 세포내에서의 항원 결합 분자로부터의 해리」란, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합하여 세포내에 흡수된 항원 모두가 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리될 필요는 없고, 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리되는 항원의 비율이, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮지 않은 항원 결합 분자, 또는, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하시키기 전의 항원 결합 분자와 비교하여, 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리되는 항원의 비율이 보다 높아져 있으면 된다. 또한, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원의 세포내에서의 항원 결합 분자로부터의 해리를 촉진시키는 방법은, 항원과 결합한 항원 결합 분자의 세포내로의 흡수를 촉진시켜, 세포내에서의 항원 결합 분자로부터의 항원의 해리가 촉진되기 쉬워지는 성질을 항원 결합 분자에 부여하는 방법이라고도 할 수 있다.
항원과 결합한 상태에서 세포내에 흡수된 항원 결합 분자의, 항원과 결합해 있지 않은 상태에서의 세포외로의 방출
또한, 본 발명은, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 흡수된 항원 결합 분자의, 항원과 결합해 있지 않은 상태에서의 세포외로의 방출을 촉진시키는 방법으로서 이용하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서, 「항원과 결합한 상태에서 세포내에 흡수된 항원 결합 분자의, 항원과 결합해 있지 않은 상태에서의 세포외로의 방출」이란, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 흡수된 항원 결합 분자 모두가 항원과 결합해 있지 않은 상태에서 세포외로 방출될 필요는 없고, 항원과 결합해 있지 않은 상태에서 세포외로 방출되는 항원 결합 분자의 비율이, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮지 않은 항원 결합 분자, 또는, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하시키기 전과 비교하여, 세포외로 방출되는 항원 결합 분자의 비율이 높아져 있으면 된다. 세포외로 방출된 항원 결합 분자는, 항원 결합 활성을 유지하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 흡수된 항원 결합 분자의 항원과 결합해 있지 않은 상태에서의 세포외로의 방출을 촉진시키는 방법은, 항원과 결합한 항원 결합 분자의 세포내로의 흡수를 촉진시켜, 항원 결합 분자의 항원과 결합해 있지 않은 상태에서의 세포외로의 방출이 촉진되기 쉬워지는 성질을 항원 결합 분자에 부여하는 방법이라고도 할 수 있다.
칼슘 농도의 조건
본 발명에 있어서, 저칼슘 농도 조건하란, 통상, 이온화 칼슘 농도가 0.1 μM~30 μM인 것을 의미한다. 바람직하게는 0.5 μM~10 μM이고, 특히 생체내의 조기 엔도솜 내에서의 이온화 칼슘 농도에 가까운 1 μM~5 μM인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 고칼슘 농도 조건하란, 통상, 이온화 칼슘 농도가 100 μM~10 mM를 의미하고, 바람직하게는 200 μM~5 mM, 특히 생체내의 혈장 중(혈중)에서의 이온화 칼슘 농도에 가까운 0.5 mM~2.5 mM가 바람직하다.
따라서, 본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮다」는 것은, 항원 결합 분자의 이온화 칼슘 농도 0.1 μM~30 μM에서의 항원 결합 활성이, 이온화 칼슘 농도 100 μM~10 mM에서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 바람직하게는, 항원 결합 분자의 이온화 칼슘 농도 0.5 μM~10 μM에서의 항원 결합 활성이, 이온화 칼슘 농도 200 μM~5 mM에서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 특히 바람직하게는, 생체내의 조기 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도에 있어서의 항원 결합 활성이, 생체내의 혈장 중의 이온화 칼슘 농도에 있어서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미하며, 구체적으로는, 항원 결합 분자의 이온화 칼슘 농도 1 μM~5 μM에서의 항원 결합 활성이, 이온화 칼슘 농도 0.5 mM~2.5 mM에서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미한다.
또한 본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮다」는 표현은, 항원 결합 분자의 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 높다고 표현하는 것도 가능하다. 또한 「항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮다」는 표현에는, 항원 결합 분자 중의 아미노산 서열을 개변하거나 함으로써, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하시키거나, 또는, 항원 결합 분자의 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 높게 하는 경우도 포함된다. 즉, 본 발명에 있어서는, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성과 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 비를 크게 하면 된다. 예를 들면, 후술하는 바와 같이, KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값을 크게 한다는 태양을 들 수 있다. 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성과 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 비를 크게 하기 위해서는, 예를 들면, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 낮은 것을 선택하거나, 또는, 항원 결합 분자 중의 아미노산 서열을 개변하거나 함으로써 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 낮게 해도 되고, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 높은 것을 선택하거나, 또는, 항원 결합 분자 중의 아미노산 서열을 개변하거나 함으로써 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 높게 해도 되며, 또는, 그 양쪽이어도 된다.
또한 본 발명에 있어서는, 「저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮다」를「저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능보다도 약하다」로 기재하는 경우도 있고, 또한, 「저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하시킨다」를 「저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 한다」로 기재하는 경우도 있다.
FcRn
면역 글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 Fcγ 수용체와 달리, FcRn, 특히 인간 FcRn은 구조적으로는 주요 조직 부적합성 복합체(MHC) 클래스Ｉ의 폴리펩티드와 구조적으로 유사하여 클래스Ｉ의 MHC 분자와 22~29%의 서열 동일성을 갖는다(Ghetie등，Immunol. Today (1997) 18 (12), 592-598). FcRn은, 가용성 β 또는 경쇄(β2 마이크로글로불린)와 복합체화된 막관통 α 또는 중쇄로 이루어지는 헤테로다이머로서 발현된다. MHC와 같이, FcRn의 α쇄는 3개의 세포외 도메인(α1, α2, α3)으로 이루어지고, 짧은 세포질 도메인은 단백질을 세포 표면에 계류한다. α1 및 α2 도메인이 항체의 Fc 영역 중의 FcRn 결합 도메인과 상호작용한다(Raghavan등(Immunity (1994) 1, 303-315).
FcRn은, 포유동물의 모성 태반 또는 난황낭에서 발현되고, 그것은 모친으로부터 태아로의 IgG의 이동에 관여한다. 이에 더하여 FcRn이 발현하는 설치류 신생아의 소장에서는, FcRn이 섭취된 초유 또는 젖으로부터 모성 IgG의 쇄자연(brush border) 상피를 가로지르는 이동에 관여한다. FcRn은 다수의 종에 걸쳐 다수의 다른 조직, 및 각종 내피세포계에 있어서 발현되고 있다. 그것은 인간 성인 혈관내피, 근육혈관계, 및 간장 동양 모세혈관(hepatic sinusoidal capillaries)에서도 발현된다. FcRn은, IgG에 결합하여, 그것을 혈청에 리사이클함으로써, IgG의 혈장 중 농도를 유지하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되고 있다. FcRn의 IgG 분자로의 결합은, 통상, 엄격하게 pH에 의존적이며, 최적 결합은 7.0 미만의 pH 산성역에 있어서 확인된다.
서열번호：17로 표시된 시그날 서열을 포함하는 폴리펩티드를 전구체로 하는 인간 FcRn은, 생체내에서(서열번호：18에 시그날 서열을 포함하는 그의 폴리펩티드가 기재되어 있는) 인간 β2-마이크로글로불린과의 복합체를 형성한다. β2-마이크로글로불린과 복합체를 형성하고 있는 가용형 인간 FcRn이 통상의 재조합 발현수법을 사용함으로써 제조된다. 이러한 β2-마이크로글로불린과 복합체를 형성하고 있는 가용형 인간 FcRn에 대한 본 발명의 FcRn 결합 도메인의 결합 활성이 평가될 수 있다. 본 발명에 있어서, 특별히 기재가 없는 경우는, 인간 FcRn은 본 발명의 FcRn 결합 도메인에 결합 가능한 형태인 것을 가리키고, 예로서 인간 FcRn과 인간 β2-마이크로글로불린의 복합체를 들 수 있다.
FcRn 결합 도메인
본 발명의 항원 결합 분자는, 항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 갖는다. 인간 FcRn 결합 도메인은, 항원 결합 분자가 산성 pH 및/또는 중성 pH에 있어서 인간 FcRn 결합 활성을 가지고 있으면 특별히 한정되지 않고, 또한, 직접 또는 간접적으로 인간 FcRn에 대해 결합 활성을 갖는 도메인이어도 된다. 그러한 도메인으로서는, 예를 들면, 직접적으로 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 IgG형 면역 글로불린의 Fc 영역, 알부민, 알부민 domain3, 항인간 FcRn 항체, 항인간 FcRn 펩티드, 항인간 FcRn Scaffold 분자 등, 또는 간접적으로 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 IgG나 알부민에 결합하는 분자 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, pH 산성역 및 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 도메인이 바람직하다. 당해 도메인은, 사전에 pH 산성역 및 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn 결합 활성을 가지고 있는 도메인이라면 그대로 사용해도 된다. 당해 도메인이 pH 산성역 및/또는 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn 결합 활성이 없거나 또는 약한 경우에는, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여 인간 FcRn 결합 활성을 얻어도 되나, 인간 FcRn 결합 도메인 중의 아미노산을 개변하여 pH 산성역 및/또는 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 얻는 것이 바람직하다. 또한, 사전에 pH 산성역 및/또는 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn 결합 활성을 가지고 있는 도메인 중의 아미노산을 개변하여, 인간 FcRn 결합 활성을 높여도 된다. 인간 FcRn 결합 도메인의 아미노산 개변은, 아미노산 개변 전과 개변 후의 pH 산성역 및/또는 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 비교함으로써 목적의 개변을 찾아낼 수 있다.
인간 FcRn 결합 도메인은, 직접 인간 FcRn과 결합하는 영역인 것이 바람직하다. 인간 FcRn 결합 영역의 바람직한 예로서, 항체의 Fc 영역을 들 수 있다. 그러나, 알부민이나 IgG 등의 인간 FcRn과의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드에 결합 가능한 영역은, 알부민이나 IgG 등을 매개로 간접적으로 인간 FcRn과 결합하는 것이 가능하다. 그 때문에, 본 발명에 있어서의 인간 FcRn 결합 영역은, 알부민이나 IgG와의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 영역이어도 된다. 특히, 인간 FcRn 결합 도메인은, 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 높은 편이 바람직하고, 사전에 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 높은 인간 FcRn 결합 도메인을 선택해도 되며, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 부여해도 되고, 또는 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 높여도 된다.
인간 FcRn으로의 결합 활성을 측정할 때의 pH 이외의 조건은 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, WO2009/125825에 기재된 바와 같이 MES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 또한, 항원 결합 분자의 인간 FcRn 결합 활성의 측정은 당업자에게 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하며, 예를 들면, Biacore(GE Healthcare) 등을 사용해서 측정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자와 인간 FcRn의 결합 활성의 측정은, 항원 결합 분자 또는 인간 FcRn을 고정화한 칩으로, 각각 인간 FcRn 또는 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흘림으로써 평가하는 것이 가능하다.
여기서, 산성 pH에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성이란, pH 4.0~pH 6.5에서의 인간 FcRn 결합 활성을 의미한다. 바람직하게는 pH 5.5~pH 6.5에서의 인간 FcRn 결합 활성을 의미하고, 특히 바람직하게는, 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH에 가까운 pH 5.8~pH 6.0에서의 인간 FcRn 결합 활성을 의미한다. 또한, 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성이란, pH 6.7~pH 10.0에서의 인간 FcRn 결합 활성을 의미한다. 바람직하게는, pH 7.0~pH 8.0에서의 인간 FcRn 결합 활성을 의미하고, 특히 바람직하게는, 생체내의 혈장 중의 pH에 가까운 pH 7.4에서의 인간 FcRn 결합 활성을 의미한다.
항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 부여하거나, 또는 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 높이는 경우, 예를 들면 인간 FcRn 결합 도메인으로서 IgG형 면역 글로불린의 Fc 영역을 사용하는 경우, 인간 FcRn 결합 도메인의 아미노산을 개변함으로써, 항원 결합 분자에 대해 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 부여하거나, 또는 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 높이는 것이 가능하다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역 글로불린의 Fc 영역으로서는, 예를 들면 인간 천연형 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 Fc 영역을 들 수 있다. 다른 아미노산으로의 개변은, 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 부여되거나 또는 인간 FcRn 결합 활성이 높여지는 한, 어떠한 위치의 아미노산이 개변되어 있어도 된다. 항원 결합 분자가, 인간 FcRn 결합 도메인으로서 인간 IgG1의 Fc 영역을 포함하고 있는 경우, 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합이 인간 천연형 IgG1보다 강해지는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 그러한 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면, EU 넘버링 221번째~225번째, 227번째, 228번째, 230번째, 232번째, 233번째~241번째, 243번째~252번째, 254번째~260번째, 262번째~272번째, 274번째, 276번째, 278번째~289번째, 291번째~312번째, 315번째~320번째, 324번째, 325번째, 327번째~339번째, 341번째, 343번째, 345번째, 360번째, 362번째, 370번째, 375번째~378번째, 380번째, 382번째, 385번째~387번째, 389번째, 396번째, 414번째, 416번째, 423번째, 424번째, 426번째~438번째, 440번째 및 442번째의 위치의 아미노산을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 표 1에 기재된 바와 같은 아미노산의 개변을 들 수 있다. 이들의 개변을 사용함으로써, IgG형 면역 글로불린의 Fc 영역의 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합 활성을 부여하거나, 또는 높이는(강하게 하는) 것이 가능하다. 또한, pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합 활성을 인간 천연형 IgG1과 비교하여 강하게 할 수 있는 개변의 예를 표 2에 나타내었다. 이들 개변 중, 중성 pH에 있어서도 인간 FcRn으로의 결합을 강하게 할 수 있는 개변을 적절히 선택하여, 본 발명에 사용하는 것이 가능하다.
FcRn 결합 도메인의 「아미노산의 개변」 또는 「아미노산 개변」이란, 친FcRn 결합 도메인의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열로 개변하는 것을 포함한다. 친FcRn 결합 도메인의 수식 개변체가 pH 중성역에 있어서 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한, 어느 FcRn 결합 도메인도 친FcRn 결합 도메인으로서 사용될 수 있다. 또한, 이미 개변이 가해진 FcRn 결합 도메인을 친FcRn 결합 도메인으로서 추가적인 개변이 가해진 FcRn 결합 도메인도 본 발명의 FcRn 결합 도메인으로서 바람직하게 사용될 수 있다. 친FcRn 결합 도메인이란, 폴리펩티드 그 자체, 친FcRn 결합 도메인을 포함하는 조성물, 또는 친FcRn 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미할 수 있다. 친FcRn 결합 도메인에는, 항체의 항목에서 개설된 재조합에 의해 생산된 공지의 Fc 영역이 포함될 수 있다. 친FcRn 결합 도메인의 기원은 한정되지 않지만, 비인간 동물의 임의의 생물 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는, 임의의 생물로서는, 마우스, 랫트, 기니피그, 햄스터, 황무지쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 및 비인간 영장류로부터 선택되는 생물을 바람직하게 들 수 있다. 다른 태양에 있어서, 친FcRn 결합 도메인은 또한, 게잡이원숭이, 마모셋, 빨간털원숭이, 침팬지, 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는, 친FcRn 결합 도메인은, 인간 IgG1으로부터 취득될 수 있지만, IgG의 특정 클래스에 한정되는 것도 아니다. 이는, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 영역을 친FcRn 결합 도메인으로서 적절히 사용할 수 있는 것을 의미한다. 마찬가지로, 본 명세서에 있어서, 상기 임의의 생물로부터의 IgG의 임의의 클래스 또는 서브클래스의 Fc 영역을, 바람직하게는 친FcRn 결합 도메인으로서 사용할 수 있는 것을 의미한다. 천연에 존재하는 IgG의 변이체 또는 조작된 유형의 예는, 공지의 문헌(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91, Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470, Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202, WO2009/086320, WO2008/092117, WO2007/041635, 및 WO2006/105338)에 기재되지만 그들에 한정되지 않는다.
개변의 예로서는 하나 이상의 변이, 예를 들면, 친FcRn 결합 도메인의 아미노산과는 상이한 아미노산 잔기로 치환된 변이, 또는 친FcRn 결합 도메인의 아미노산에 대해 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 친FcRn 결합 도메인의 아미노산으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실 등이 포함된다. 바람직하게는, 개변 후의 FcRn 결합 도메인의 아미노산 서열에는, 천연으로 생기지 않는 FcRn 결합 도메인의 적어도 부분을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 변종은 필연적으로 친FcRn 결합 도메인과 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 실시형태에 있어서, 변종은 친FcRn 결합 도메인의 아미노산 서열과 약 75%~100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 보다 바람직하게는 약 80%~100% 미만, 보다 바람직하게는 약 85%~100% 미만의, 보다 바람직하게는 약 90%~100% 미만, 가장 바람직하게는 약 95%~100% 미만의 동일성 또는 유사성의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 비한정의 일태양에 있어서, 친FcRn 결합 도메인 및 본 발명의 개변된 FcRn 결합 도메인 사이에는 하나 이상의 아미노산의 차가 있다. 친FcRn 결합 도메인과 개변 FcRn 결합 도메인의 아미노산의 차이는, 특히 전술한 EU 넘버링으로 특정되는 아미노산 잔기의 위치의 특정된 아미노산의 차이에 따라서도 적합하게 특정 가능하다.
또한, pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 친인간 IgG와 비교하여 강하게 할 수 있는 개변의 예를 표 2에 나타내었다. 이들 개변 중, pH 중성역에 있어서도 인간 FcRn으로의 결합을 강하게 할 수 있는 개변을 적절히 선택하여, 본 발명에 사용하는 것이 가능하다. 또한, Fv4-IgG1에 대해 산성 조건하에서 인간 FcRn으로의 결합을 강하게 할 수 있는 개변의 조합을 표 6-1 및 6-2에 나타내었다. 특히 바람직한 친인간 IgG의 Fc 영역의 개변 아미노산으로서, 예를 들면 EU 넘버링 237번째, 238번째, 239번째, 248번째, 250번째, 252번째, 254번째, 255번째, 256번째, 257번째, 258번째, 265번째, 270번째, 286번째, 289번째, 297번째, 298번째, 303번째, 305번째, 307번째, 308번째, 309번째, 311번째, 312번째, 314번째, 315번째, 317번째, 325번째, 332번째, 334번째, 360번째, 376번째, 380번째, 382번째, 384번째, 385번째, 386번째, 387번째, 389번째, 424번째, 428번째, 433번째, 434번째 및 436번째의 위치의 아미노산을 들 수 있다.
특히 바람직한 개변으로서는, 예를 들면, 친IgG의 Fc 영역의 EU 넘버링
237번째의 Gly를 Met로 치환하는 아미노산 치환,
238번째의 Pro를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
239번째의 Ser을 Lys로 치환하는 아미노산 치환,
248번째의 Lys를 Ile로 치환하는 아미노산 치환,
250번째의 Thr을 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환,
252번째의 Met를 Phe, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환,
254번째의 Ser을 Thr로 치환하는 아미노산 치환,
255번째의 Arg를 Glu로 치환하는 아미노산 치환,
256번째의 Thr을 Asp, Glu, 또는 Gln로 치환하는 아미노산 치환,
257번째의 Pro를 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, 또는 Val로 치환하는 아미노산 치환,
258번째의 Glu를 His로 치환하는 아미노산 치환,
265번째의 Asp를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
270번째의 Asp를 Phe로 치환하는 아미노산 치환,
286번째의 Asn을 Ala 또는 Glu로 치환하는 아미노산 치환,
289번째의 Thr을 His로 치환하는 아미노산 치환,
297번째의 Asn을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
298번째의 Ser을 Gly로 치환하는 아미노산 치환,
303번째의 Val을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
305번째의 Val을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
307번째의 Thr을 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환,
308번째의 Val을 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, 또는 Thr로 치환하는 아미노산 치환,
309번째의 Leu 또는 Val을 Ala, Asp, Glu, Pro, 또는 Arg로 치환하는 아미노산 치환,
311번째의 Gln을 Ala, His, 또는 Ile로 치환하는 아미노산 치환,
312번째의 Asp를 Ala 또는 His로 치환하는 아미노산 치환,
314번째의 Leu를 Lys 또는 Arg로 치환하는 아미노산 치환,
315번째의 Asn을 Ala 또는 His로 치환하는 아미노산 치환,
317번째의 Lys를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
325번째의 Asn을 Gly로 치환하는 아미노산 치환,
332번째의 Ile를 Val로 치환하는 아미노산 치환,
334번째의 Lys를 Leu로 치환하는 아미노산 치환,
360번째의 Lys를 His로 치환하는 아미노산 치환,
376번째의 Asp를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
380번째의 Glu를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
382번째의 Glu를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
384번째의 Asn 또는 Ser을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
385번째의 Gly를 Asp 또는 His로 치환하는 아미노산 치환,
386번째의 Gln을 Pro로 치환하는 아미노산 치환,
387번째의 Pro를 Glu로 치환하는 아미노산 치환,
389번째의 Asn을 Ala 또는 Ser로 치환하는 아미노산 치환,
424번째의 Ser을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
428번째의 Met를 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환,
433번째의 His를 Lys로 치환하는 아미노산 치환,
434번째의 Asn을 Ala, Phe, His, Ser, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환, 및
436번째의 Tyr 또는 Phe를 His로 치환하는 아미노산 치환,
을 들 수 있다.
개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개소만의 아미노산을 개변해도 되고, 2개소 이상의 아미노산을 개변해도 된다. 2개소 이상의 아미노산의 개변의 조합으로서는, 예를 들면 표 3에 기재된 바와 같은 조합을 들 수 있다. 또한, pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 친인간 IgG와 비교하여 강하게 할 수 있는 개변의 조합을 표 4-1~4-5에 나타내었다. 이들 개변 중, pH 중성역에 있어서도 인간 FcRn으로의 결합을 강하게 할 수 있는 개변의 조합을 적절히 선택하여, 본 발명에 사용하는 것이 가능하다. 또한, Fv4-IgG1에 대해 중성 조건하에서 인간 FcRn으로의 결합을 강하게 할 수 있는 개변의 조합을 표 5-1 및 5-2에 나타내었다.
이들의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써, 항원 결합 분자의 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 높일 수 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
[표 4-1]
Figure pat00004
표 4-2는 표 4-1의 계속되는 표이다.
[표 4-2]
Figure pat00005
표 4-3은 표 4-2의 계속되는 표이다.
[표 4-3]
Figure pat00006
표 4-4는 표 4-3의 계속되는 표이다.
[표 4-4]
Figure pat00007
표 4-5는 표 4-4의 계속되는 표이다.
[표 4-5]
Figure pat00008
[표 5-1]
Figure pat00009
표 5-2는 표 5-1의 계속되는 표이다.
[표 5-2]
Figure pat00010
[표 6-1]
Figure pat00011
표 6-2는 표 6-1의 계속되는 표이다.
[표 6-2]
Figure pat00012
이들의 아미노산 개변에 대해서는, 공지의 기술을 이용하여 적절히 실시하는 것이 가능하며, 예를 들면 Drug Metab Dispos. 2007 Jan;35(1):86-94, Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69, J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604, J Biol Chem. 2007;282(3):1709-17, J Immunol. 2002;169(9):5171-80, J Immunol. 2009;182(12):7663-71, Molecular Cell, Vol. 7, 867-877, April, 2001, Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40, Nat Biotechnol. 2005 Oct;23(10):1283-8, Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5;103(49):18709-14, EP2154157, US20070141052, WO2000/042072, WO2002/060919, WO2006/020114, WO2006/031370, WO2010/033279, WO2006/053301, WO2009/086320에 있어서 인간 천연형 IgG1의 Fc 영역의 개변이 행해지고 있다.
The Journal of Immunology, 2009 182: 7663-7671에 의하면, pH 산성역(pH 6.0)에 있어서의 인간 천연형 IgG1의 인간 FcRn 결합 활성은 KD 1.7 μM이고, pH 중성역에 있어서의 인간 천연형 IgG1은 인간 FcRn 결합 활성을 거의 검출하지 못하고 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 항원 결합 분자의 바람직한 태양으로서, pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 20 μM 이하이고, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 인간 천연형 IgG1 이상인 항원 결합 분자를 들 수 있다. 보다 바람직한 태양으로서는, pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 2.0 μM 이하이고, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 40 μM 이하인 항원 결합 분자를 들 수 있다. 더욱 바람직한 태양으로서는, pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 0.5 μM 이하이고, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 15 μM 이하인 항원 결합 분자를 들 수 있다. 즉, 항원 결합 분자의 산성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을, 중성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 저하시키는 것이 바람직하다. 또한, 여기서 나타내는 KD값은, The Journal of Immunology, 2009 182: 7663-7671에 기재된 방법(항원 결합 분자를 칩에 고정하고, 애널라이트로서 인간 FcRn을 흘림)으로 측정했을 때의 값이다.
인간 FcRn 결합 활성의 값으로서, KD(해리상수)를 사용하는 것이 가능한데, 인간 천연형 IgG1의 인간 FcRn 결합 활성은 pH 중성역(pH 7.4)에서는 거의 확인되지 않기 때문에, KD로서 산출하는 것은 곤란하다. pH 7.4에서의 인간 FcRn 결합 활성이 인간 천연형 IgG1보다도 높은지 여부를 판단하는 방법으로서, Biacore에 있어서 동일 농도로 애널라이트를 흘렸을 때의 결합 리스폰스의 크고 작음으로 판단하는 방법을 들 수 있다. 즉, 인간 천연형 IgG1을 고정화한 칩에 인간 FcRn을 pH 7.4에서 흘렸을 때의 리스폰스보다도, 항원 결합 분자를 고정화한 칩에 인간 FcRn을 pH 7.4에서 흘렸을 때의 리스폰스 쪽이 크면, 그 항원 결합 분자의 pH 7.4에서의 인간 FcRn 결합 활성은 인간 천연형 IgG1보다도 높다고 판단할 수 있다.
pH 7.0도 또한 pH 중성역으로서 사용할 수 있다. 중성 pH로서 pH 7.0을 사용함으로써, 인간 FcRn과 FcRn 결합 도메인의 약한 상호작용을 촉진시킬 수 있다. 측정 조건에 있어서 사용되는 온도로서, 결합 친화성을 10℃~50℃의 임의의 온도에서 평가해도 된다. 바람직하게는, 인간 FcRn 결합 도메인과 인간 FcRn의 결합 친화성을 결정하기 위해, 15℃~40℃의 온도를 사용한다. 보다 바람직하게는, 인간 FcRn 결합 도메인과 인간 FcRn의 결합 친화성을 결정하기 위해, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 및 35℃ 중 어느 하나와 같은 20℃부터 35℃까지의 임의의 온도를 동일하게 사용한다. 실시예 5에 기재된 25℃라는 온도는, 본 발명의 태양에 관한 일례이다. 바람직한 태양에 있어서, 인간 FcRn과 FcRn 결합 도메인의 상호작용은, 실시예 5에 기재된 대로 pH 7.0 및 25℃에서 측정될 수 있다. 인간 FcRn에 대한 항원 결합 분자의 결합 친화성은, 실시예 3에 기재된 대로 Biacore에 의해 측정될 수 있다.
보다 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, pH 7.0 및 25℃에서, 천연형 인간 IgG보다 높은 인간 FcRn 결합 활성을 갖는다. 보다 바람직한 태양에 있어서, pH 7.0 및 25℃에서의 인간 FcRn 결합 활성은, 천연형 인간 IgG보다 28배 높거나, 또는 KD 3.2 μM보다 강하다. 보다 바람직한 태양에 있어서, pH 7.0 및 25℃에서의 인간 FcRn 결합 활성은, 천연형 인간 IgG보다 38배 높거나, 또는 KD 2.3 μM보다 강하다.
천연형 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4는, 바람직하게는 인간 FcRn 결합 활성 또는 생체내에 있어서의 결합 활성에 관하여 항원 결합 분자와 비교하는 참조 천연형 인간 IgG 용도를 위한, 천연형 인간 IgG로서 사용된다. 바람직하게는, 목적의 항원 결합 분자와 동일한 항원 결합 도메인 및 인간 FcRn 결합 도메인으로서 천연형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 참조 항원 결합 분자를 적당히 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 천연형 인간 IgG1은, 인간 FcRn 결합 활성 또는 생체내에 있어서의 결합 활성에 관하여 항원 결합 분자와 비교하는 참조 천연형 인간 IgG 용도로 사용된다.
보다 구체적으로는, 본 발명에 기재된 혈장 중의 항원 소실 활성에 대해 장기 효과를 갖는 항원 결합 분자는, pH 7.0 및 25℃에서, 천연형 인간 IgG1보다 28배~440배 높은 범위의 FcRn 결합 활성을 갖거나, 또는 KD가 3.0 μM 내지 0.2 μM의 범위의 FcRn 결합 활성을 갖는다. 혈장 중에서의 항원 소실 활성에 대한 본 발명의 항원 결합 분자의 장기 효과를 평가할 목적으로, 장기간의 혈장 중 항원 농도가, 항원 결합 분자의 투여 2일 후, 4일 후, 7일 후, 14일 후, 28일 후, 56일 후, 또는 84일 후에 혈장 중의 총 항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정함으로써 결정된다. 혈장 중 항원 농도 또는 항원/항원 결합 분자 몰비의 감소가 본 발명에 기재된 항원 결합 분자에 의해 달성되는지 여부는, 앞서 기재한 하나 또는 복수의 임의의 시점에서 감소를 평가함으로써 결정될 수 있다.
더욱이 보다 구체적으로는, 본 발명에 기재된 혈장 중의 항원 소실 활성에 대해 단기 효과를 갖는 항원 결합 분자는, pH 7.0 및 25℃에서, 천연형 인간 IgG보다 440배 높은 인간 FcRn 결합 활성을 갖거나, 또는 KD가 0.2 μM보다 강한 FcRn 결합 활성을 갖는다. 혈장 중의 항원 소실 활성에 대한 본 발명의 항원 결합 분자의 단기 효과를 평가할 목적으로, 단기간의 혈장 중 항원 농도가, 항원 결합 분자의 투여 15분 후, 1시간 후, 2시간 후, 4시간 후, 8시간 후, 12시간 후, 또는 24시간 후에 혈장 중의 총 항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정함으로써 결정된다.
본 발명의 방법은, 표적 항원의 종류에 상관 없는 임의의 항원 결합 분자에 적용 가능하다.
예를 들면, 항원 결합 분자가 막항원에 결합하는 항체의 경우, 생체내에 투여한 항체는 항원에 결합하고, 그 후, 항체는 항원에 결합한 채로 항원과 함께 내재화에 의해 세포내의 엔도솜에 흡수된다. 그 후, 항체는 항원에 결합한 채로 리소좀으로 이행하고, 항체는 항원과 함께 리소좀에 의해 분해된다. 내재화를 매개로 한 혈장 중으로부터의 소실은 항원 의존적인 소실이라 불리고 있고, 대부분의 항체 분자에서 보고되어 있다(Drug Discov Today. 2006 Jan;11(1-2):81-8). 1분자의 IgG 항체가 2가로 항원에 결합한 경우, 1분자의 항체가 2분자의 항원에 결합한 상태로 내재화되어, 그대로 리소좀으로 분해된다. 따라서, 통상의 항체의 경우, 1분자의 IgG 항체가 3분자 이상의 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 예를 들면, 중화 활성을 갖는 1분자의 IgG 항체의 경우, 3분자 이상의 항원을 중화하는 것은 불가능하다.
IgG 분자의 혈장 중 체류성이 비교적 긴(소실이 느린) 것은, IgG 분자의 샐비지 수용체로서 알려져 있는 인간 FcRn이 기능하고 있기 때문이다. 음세포작용에 의해 엔도솜으로 흡수된 IgG 분자는, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 인간 FcRn에 결합한다. 인간 FcRn에 결합할 수 없었던 IgG 분자는 리소좀으로 진행되고, 거기서 분해되는데, 인간 FcRn으로 결합한 IgG 분자는 세포 표면으로 이행되어 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 인간 FcRn으로부터 해리됨으로써 재차 혈장 중으로 되돌아간다.
또한 항원 결합 분자가 가용형 항원에 결합하는 항체의 경우, 생체내에 투여한 항체는 항원에 결합하고, 그 후, 항체는 항원에 결합한 채로 세포내에 흡수된다. 세포내에 흡수된 항체의 대부분은 FcRn에 의해 세포외로 방출되는데, 이때 항원에 결합한 채로 세포외로 방출되기 때문에, 재차, 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 따라서, 막항원에 결합하는 항체와 마찬가지로, 통상의 항체의 경우, 1분자의 IgG 항체가 3분자 이상의 항원에 결합하는 것은 불가능하다.
항원에 대해 혈장 중의 고칼슘 농도 조건하에 있어서는 강하게 결합하여, 엔도솜 내의 저칼슘 농도 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되는 칼슘 농도 의존적 항원 결합 항체는, 엔도솜 내에서 항원으로부터 해리하는 것이 가능하다. 칼슘 농도 의존적 항원 결합 항체는, 항원을 해리한 후에 항체가 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되면 재차 항원에 결합하는 것이 가능하기 때문에, 하나의 항체로 복수의 항원에 반복해서 결합하는 것이 가능해진다. 또한, 항원 결합 분자에 결합한 항원이 엔도솜 내에서 해리됨으로써 혈장 중으로 리사이클되지 않기 때문에, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진하고, 항원 결합 분자의 투여에 의해 항원의 소실을 촉진하며, 혈장 중의 항원 농도를 저하시키는 것이 가능해진다.
항원 결합 분자
본 발명은 항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자로서, 2개의 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 상이하여, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 제공한다.
본 발명에 있어서의 항원 결합 분자는, 대상으로 하는 항원으로의 특이적인 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인을 가지고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 항원 결합 도메인의 바람직한 예로서, 항체의 항원 결합 영역을 가지고 있는 도메인을 들 수 있다. 항체의 항원 결합 영역의 예로서, CDR이나 가변영역을 들 수 있다. 항체의 항원 결합 영역이 CDR인 경우, 전장 항체에 포함되는 6개의 CDR 모두를 포함하고 있어도 되고, 하나 또는 둘 이상의 CDR을 포함하고 있어도 된다. 항체의 결합 영역으로서 CDR을 포함하는 경우, 포함되는 CDR은 아미노산의 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입 등이 행해져 있어도 되고, 또한, CDR의 일부분이어도 된다.
또한 본 발명의 방법이 대상으로 하는 항원 결합 분자로서는, 안타고니스트 활성을 갖는 항원 결합 분자(안타고니스트 항원 결합 분자), 아고니스트 활성을 갖는 항원 결합 분자(아고니스트 항원 결합 분자), 세포 상해 활성을 갖는 분자 등을 들 수 있으나, 바람직한 태양으로서, 안타고니스트 항원 결합 분자, 특히 수용체나 사이토카인 등의 항원을 인식하는 안타고니스트 항원 결합 분자를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 대상이 되는 항원 결합 분자는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 항원 결합 분자여도 된다. 본 발명에서 사용되는 항원 결합 분자는 바람직하게는, 항원 결합 활성(항원 결합 도메인)과 인간 FcRn 결합 도메인을 갖는다. 본 발명에 있어서는, 특히 인간 FcRn과의 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 것이 바람직하다.
항원 결합 도메인과 인간 FcRn 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자의 예로서, 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체의 바람직한 예로서, IgG 항체를 들 수 있다. 항체로서 IgG 항체를 사용하는 경우, 그 종류는 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 아이소타입(서브클래스)의 IgG를 사용하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항원 결합 분자에는 항체의 정상영역이 포함되어 있어도 되고, 정상영역 부분에 아미노산 변이를 도입해도 된다. 도입하는 아미노산 변이는, 예를 들면, Fcγ 수용체로의 결합을 증대 또는 저감시킨 것(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10.) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, IgG2 등의 적절한 정상영역을 선택함으로써, pH 의존적인 결합을 변화시키는 것도 가능하다.
본 발명이 대상으로 하는 항원 결합 분자가 항체인 경우, 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등, 어떠한 동물 유래의 항체여도 된다. 또한, 예를 들면 키메라 항체, 그 중에서도 인간화 항체 등의 아미노산 서열을 치환한 개변 항체여도 된다. 또한, 이종 특이성 항체, 각종 분자를 결합시킨 항체 수식물, 항체 단편을 포함하는 폴리펩티드 등이어도 된다.
「키메라 항체」란, 상이한 동물 유래의 서열을 조합하여 제작되는 항체이다. 키메라 항체의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변(V)영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상(C)영역으로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
「인간화 항체」란, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지는, 인간 이외의 포유동물 유래의 항체, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR로 이식한 것이다. CDR을 동정하기 위한 방법은 공지이다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). 또한, 그의 일반적인 유전자 재조합 수법도 공지이다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조).
이중 특이성 항체는, 상이한 에피토프를 인식하는 가변영역을 동일 항체 분자 내에 갖는 항체를 말한다. 이종 특이성 항체는 2개 이상의 상이한 항원을 인식하는 항체여도 되고, 동일 항원 상의 상이한 2개 이상의 에피토프를 인식하는 항체여도 된다.
또한, 항체 단편을 포함하는 폴리펩티드로서는, 예를 들면, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv(Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36.)domain antibody(dAb)(WO2004/058821, WO2003/002609), scFv-Fc(WO2005/037989), dAb-Fc, Fc 융합 단백질 등을 들 수 있다. Fc 영역을 포함하고 있는 분자는 Fc 영역을 인간 FcRn 결합 도메인으로서 사용할 수 있다. 또한, 이들 분자에 인간 FcRn 결합 도메인을 융합시켜도 된다.
또한, 본 발명을 적용할 수 잇는 항원 결합 분자는, 항체 유사 분자여도 된다. 항체 유사 분자(scaffold 분자, 펩티드 분자)란, 타겟 분자에 결합함으로써 기능을 발휘하는 분자로(Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10, Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469, Protein Science 2006, 15:14-27), 예를 들면, DARPins(WO2002/020565), Affibody(WO1995/001937), Avimer(WO2004/044011, WO2005/040229), Adnectin(WO2002/032925) 등을 들 수 있다. 이들 항체 유사 분자도, 표적 분자에 대해 칼슘 농도 의존적으로 결합하여, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키고, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키며, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선시키고, 하나의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 것이 가능하다.
또한 항원 결합 분자는, 표적에 결합하는 수용체 단백질에 인간 FcRn 결합 도메인이 융합된 단백질이어도 되고, 예를 들면, TNFR-Fc 융합 단백, IL1R-Fc 융합 단백, VEGFR-Fc 융합 단백, CTLA4-Fc 융합 단백 등(Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52, BioDrugs. 2006;20(3):151-60.)을 들 수 있다. 이들 수용체 인간 FcRn 결합 도메인 융합 단백질도 표적 분자에 대해 칼슘 농도 의존적으로 결합하여, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키고, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키며, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선시키고, 하나의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 것이 가능하다.
또한 항원 결합 분자는, 표적에 결합하는데 중화효과를 갖는 인공 리간드 단백질과 인간 FcRn 결합 도메인의 융합 단백질이어도 되고, 예를 들면, 인공 리간드 단백질로서는, 변이 IL-6(EMBO J. 1994 Dec 15;13(24):5863-70.) 등을 들 수 있다. 이들 인공 리간드 융합 단백질도 표적 분자에 대해 칼슘 농도 의존적으로 결합하여, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키고, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키며, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선시키고, 하나의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 항체는 당쇄가 개변되어 있어도 된다. 당쇄가 개변된 항체의 예로서는, 예를 들면, 글리코실화가 수식된 항체(WO99/54342 등), 당쇄에 부가하는 푸코오스가 결손된 항체(WO00/61739, WO02/31140, WO2006/067847, WO2006/067913 등), 바이섹팅 GlcNAc를 갖는 당쇄를 갖는 항체(WO02/79255 등) 등을 들 수 있다.
항원으로의 결합 활성을 측정할 때의 이온화 칼슘 농도 이외의 조건은, 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, HEPES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면, Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자와 항원의 결합 활성의 측정은, 항원이 가용형 항원인 경우는, 항원 결합 분자를 고정화한 칩으로, 항원을 애널라이트로서 흘림으로써 가용형 항원으로의 결합 활성을 평가하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는, 항원을 고정화한 칩으로, 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흘림으로써 막형 항원으로의 결합 활성을 평가하는 것이 가능하다.
본 발명의 항원 결합 분자에 있어서, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 약한 한, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성과 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 비는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 항원에 대한 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 KD(Dissociation constant：해리상수)와 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 KD의 비인 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 40 이상이다. KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한, 400, 1000, 10000 등, 어떠한 값이어도 된다.
항원 결합 활성의 값으로서, 항원이 가용형 항원인 경우는 KD(해리상수)를 사용하는 것이 가능하나, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수)를 사용하는 것이 가능하다. KD(해리상수), 및 겉보기 KD(겉보기 해리상수)는, 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자에 있어서, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성과 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 비를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면, 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)를 사용하는 것도 가능하다. 결합 활성의 비를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 항원에 대한 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 kd(해리속도상수)와 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(저칼슘 농도 조건하)/kd(고칼슘 농도 조건하에 있어서의)의 값은, 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. kd(저칼슘 농도 조건하)/kd(고칼슘 농도 조건하에 있어서의)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술상식에 제작 가능한 한, 50, 100, 200 등, 어떠한 값이어도 된다.
항원 결합 활성의 값으로서, 항원이 가용형 항원인 경우는 kd(해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 kd(Apparent dissociation rate constant：겉보기 해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하다. kd(해리속도상수), 및 겉보기 kd(겉보기 해리속도상수)는, 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다.
또한 본 발명에 있어서, 상이한 칼슘 농도에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 측정할 때는, 칼슘 농도 이외의 조건은 동일하게 하는 것이 바람직하다.
저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 얻기 위해, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하시키는(약하게 하는) 방법(칼슘 농도 의존적인 항원 결합 활성을 부여하는 방법)은 특별히 한정되지 않는다. 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하된(약한) 항원 결합 분자(칼슘 농도 의존적 결합을 나타내는 항원 결합 분자)는, 예를 들면, in vitro에서 제시한 항체 라이브러리로부터 전술한 바와 같은 항원으로의 칼슘 농도 의존적 결합을 지표로 스크리닝을 행함으로써, 직접 취득할 수 있다.
그것 이외의 방법으로서, 이러한 성질을 갖는 항원 결합 분자를 직접 취득하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 동물(마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 인간 면역 글로불린 형질전환 마우스, 인간 면역 글로불린 형질전환 랫트, 인간 면역 글로불린 형질전환 토끼, 라마, 낙타 등)로 항원을 면역하여 얻어진 항체를 항원으로의 칼슘 농도 의존적 결합을 지표로 스크리닝을 행하여, 목적의 성질을 갖는 항체를 직접 취득해도 된다. 또한, 항원 결합 분자 중의 아미노산 서열에 랜덤의 변이를 도입하여, 전술한 방법에 따라, 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 측정하고, 개변 전의 항원 결합 분자와 비교하여, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다, 보다 낮은 것을 선택해도 된다.
전술한 방법 등에 의해 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 저하시키는(약하게 하는)(KD(저칼슘 농도 조건하)/KD(고칼슘 농도 조건하)의 값을 크게 하는) 경우, 특별히 한정되지 않지만, KD(저칼슘 농도 조건하)/KD(고칼슘 농도 조건하)의 값이 원래의 항체와 비교하여 통상, 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상이 되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 칼슘 농도 의존적인 항원 결합 활성을 부여하는 방법은, 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 사용하거나, 또는, 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 부여하거나 또는 높이는 방법과 조합함으로써, 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 기능, 항원 결합 분자의 투여에 의한 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 기능을 증강시키는 것이 가능하다. 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 부여하거나 또는 높이는 방법으로서는, 예를 들면, 전술한 인간 FcRn 결합 도메인의 아미노산을 개변하는 방법을 들 수 있다. 여기서, 「중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성」이란, pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 의미하고, 바람직한 인간 FcRn 결합 활성으로서, pH 7.0~pH 8.0 사이의 인간 FcRn 결합 활성을 들 수 있고, 보다 바람직한 인간 FcRn 결합 활성으로서 pH 7.4에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 들 수 있다.
또한, 추가로, 본 발명의 칼슘 농도 의존적인 항원 결합 활성을 부여하는 방법은, pH 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 사용하거나, 또는, pH 의존적인 항원 결합 활성을 부여하는 방법과 조합시킴으로써, 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 기능, 항원 결합 분자의 투여에 의한 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 기능을 증강시키는 것이 가능하다. pH 의존적인 항원 결합 활성을 부여하는 방법으로서는, 예를 들면, WO2009/125825에 기재된 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 예를 들면, 본 발명의 칼슘 농도 의존적인 항원 결합 분자에, 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합 활성을 중성 pH에 있어서의 항원 결합 활성보다도 저하시키는(약하게 하는) 방법을 조합해서 사용할 수 있다. 여기서, 「산성 pH에 있어서의 항원 결합 활성을 중성 pH에 있어서의 항원 결합 활성보다도 저하시키는(약하게 하는)」이란, 항원 결합 분자의 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합 활성을 pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합 활성보다 약하게 하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 항원 결합 분자의 pH 5.5~pH 6.5에서의 항원 결합 활성을 pH 7.0~pH 8.0에서의 항원 결합 활성보다 약하게 하는 것을 의미하고, 특히 바람직하게는, 항원 결합 분자의 pH 5.8에서의 항원 결합 활성을 pH 7.4에서의 항원 결합 활성보다 약하게 하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서 산성 pH란 통상, pH 4.0~pH 6.5이고, 바람직하게는 pH 5.5~pH 6.5이며, 특히 바람직하게는 pH 5.8이다. 또한, 본 발명에 있어서 중성 pH란 통상, pH 6.7~pH 10.0이고, 바람직하게는, pH 7.0~pH 8.0이며, 특히 바람직하게는 pH 7.4이다.
또한, 항원 결합 분자의 「산성 pH에 있어서의 항원 결합 활성을 중성 pH에 있어서의 항원 결합 활성보다도 저하시키는」이란, 항원 결합 분자의 중성에서의 항원 결합 활성을 산성에서의 pH에 있어서의 항원 결합 활성보다도 높게 한다고 표현하는 것도 가능하다. 즉, 본 발명에 있어서는, 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합 활성과 중성 pH에 있어서의 항원 결합 활성의 차를 크게 하면 된다(예를 들면, 후술하는 바와 같이 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값을 크게 하면 된다). 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합 활성과 중성 pH에 있어서의 항원 결합 활성의 차를 크게 하기 위해서는, 예를 들면, 산성 pH에 있어서의 항원 결합 활성을 낮게 해도 되고, 중성 pH에 있어서의 항원 결합 활성을 높게 해도 되며, 또는, 그 양쪽이어도 된다.
본 발명에 있어서, 산성 pH에 있어서의 항원 결합 활성이 중성 pH에 있어서의 항원 결합 활성보다도 약한 한, 산성 pH에 있어서의 항원 결합 활성과 중성 pH에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 항원에 대한 pH 5.8에서의 KD와 pH 7.4에서의 KD(Dissociation constant：해리상수)의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 40 이상이다. KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한, 400, 1000, 10000 등, 어떠한 값이어도 된다.
또한, 산성 pH에 있어서의 항원 결합 활성과 중성 pH에 있어서의 항원 결합 활성의 차를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면, 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)를 사용하는 것도 가능하다. 결합 활성의 차를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 항원에 대한 pH 5.8에서의 kd(해리속도상수)와 pH 7.4에서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)의 값은, 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술상식에 있어서 제작 가능한 한, 50, 100, 200 등, 어떠한 값이어도 된다.
pH 의존적인 항원 결합 활성을 부여하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 항원 결합 분자 중 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나, 또는 항원 결합 분자 중에 하나 이상의 히스티딘을 삽입함으로써 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합 활성보다 약하게 하는 방법을 들 수 있다. 항체 중의 아미노산을 히스티딘으로 치환함으로써 pH 의존성의 항원 결합 활성을 항체에 부여할 수 있는 것은 이미 알려져 있다(FEBS Letter, 309(1), 85-88, (1992)). 본 발명에서는, 항원 결합 분자에 대해, 히스티딘 변이(치환) 또는 삽입이 도입되는(행해지는) 위치는 특별히 한정되지 않고, 변이 또는 삽입 전과 비교하여 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성이 pH 7.4에 있어서의 항원 결합 활성보다 약해지는(KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 커지는) 한, 어떠한 부위여도 된다. 예를 들면, 항원 결합 분자가 항체인 경우에는, 항체의 가변영역 등을 들 수 있다. 히스티딘 변이 또는 삽입이 도입되는(행해지는) 수는 당업자가 적당히 결정할 수 있고, 1개소만을 히스티딘으로 치환해도 되고, 또는 1개소에만 히스티딘을 삽입해도 되며, 2개소 이상의 복수 개소를 히스티딘으로 치환해도 되고, 또는 2개소 이상의 복수 개소에 히스티딘을 삽입해도 된다. 또한, 히스티딘 변이 이외의 변이(히스티딘 이외의 아미노산으로의 변이)를 동시에 도입해도 된다. 또한, 히스티딘 변이와 히스티딘 삽입을 동시에 행해도 된다. 히스티딘으로의 치환 또는 히스티딘의 삽입은 당업자에게 공지의 알라닌 scanning의 알라닌을 히스티딘으로 치환한 히스티딘 scanning 등의 방법에 의해 랜덤으로 행해도 되고, 히스티딘 변이 또는 삽입이 랜덤으로 도입된 항원 결합 분자 라이브러리 중에서, 변이 전과 비교하여 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 커진 항원 결합 분자를 선택해도 된다.
항원 결합 분자에 대해, 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나, 또는 항원 결합 분자 아미노산에 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 경우, 특별히 한정되지 않지만, 히스티딘 치환 또는 삽입 후의 항원 결합 분자의 pH 7.4에 있어서의 항원 결합 활성이, 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 분자의 pH 7.4에 있어서의 항원 결합 활성과 동등한 것이 바람직하다. 여기서, 히스티딘 치환 또는 삽입 후의 항원 결합 분자의 pH 7.4에 있어서의 항원 결합 활성이, 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 분자의 pH 7.4에 있어서의 항원 결합 활성과 동등하다는 것은, 히스티딘 치환 또는 삽입 후의 항원 결합 분자가, 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 분자가 갖는 항원 결합 활성의 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상을 유지하고 있는 것을 말한다. 히스티딘 치환 또는 삽입에 의해 항원 결합 분자의 항원 결합 활성이 낮아진 경우에는, 항원 결합 분자 중의 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해 항원 결합 활성을 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 활성과 동등하게 해도 된다. 본 발명에 있어서는, 그러한 히스티딘 치환 또는 삽입 후에 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 행함으로써 결합 활성이 동등해진 항원 결합 분자도 포함된다.
또한, 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합 활성보다 약하게 하는 다른 방법으로서, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 비천연형 아미노산으로 치환하는 방법, 또는 항원 결합 분자 중의 아미노산에 비천연형 아미노산을 삽입하는 방법을 들 수 있다. 비천연 아미노산은 인위적으로 pKa를 컨트롤할 수 있는 것이 알려져 있다(Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 34, Chem Soc Rev. 2004 Sep 10;33(7):422-30., Amino Acids. 1999;16(3-4):345-79.). 따라서, 본 발명에 있어서는 전술한 히스티딘 대신에 비천연형 아미노산을 사용하는 것도 가능하다. 또한, 전술한 히스티딘 치환 및/또는 삽입과, 비천연형 아미노산의 치환 및/또는 삽입은, 동시에 행해도 된다. 본 발명에서 사용되는 비천연형 아미노산은 어떠한 비천연형 아미노산이어도 되고, 당업자에 공지의 비천연형 아미노산 등을 사용하는 것이 가능하다.
또한, 항원 결합 분자가 항체 정상영역을 포함하는 물질인 경우, 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합 활성보다 약하게 하는 다른 방법으로서, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역을 개변하는 방법을 들 수 있다. 이러한 항체 정상영역의 개변의 구체예로서는, 예를 들면 WO2009/125825에 기재된 정상영역을 치환하는 방법을 들 수 있다.
또한, 항체 정상영역의 개변방법으로서는, 예를 들면, 정상영역의 아이소타입(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)을 복수 검토하여, pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성이 저하되는(pH 5.8에 있어서의 해리속도를 빠르게 하는) 아이소타입을 선택하는 방법을 들 수 있다. 또한 야생형 아이소타입의 아미노산 서열(야생형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 아미노산 서열)에 아미노산 치환을 도입함으로써, pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성을 저하시키는(pH 5.8에 있어서의 해리속도를 빠르게 하는) 방법을 들 수 있다. 아이소타입(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)에 따라 항체 정상영역의 힌지영역의 서열이 크게 상이하여, 힌지영역의 아미노산 서열의 차이는 항원 결합 활성에 크게 영향을 미치기 때문에, 항원이나 에피토프의 종류에 따라 적절한 아이소타입을 선택함으로써 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성이 저하되는(pH 5.8에 있어서의 해리속도를 빠르게 하는) 아이소타입을 선택하는 것이 가능하다. 또한, 힌지영역의 아미노산 서열의 차이는 항원 결합 활성에 크게 영향을 미치는 것으로부터, 야생형 아이소타입의 아미노산 서열의 아미노산 치환 개소로서는, 힌지영역이 바람직하다고 생각된다.
전술한 방법 등에 의해, 항원 결합 물질의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합 활성보다 약하게 하는(KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값을 크게 하는) 경우, 특별히 한정되지 않지만, KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이, 원래의 항체와 비교하여 통상, 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상이 되어 있는 것이 바람직하다.
항원 결합 분자
또한, 본 발명은 2개의 상이한 칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 상이하여, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 제공한다. 본 발명은 바람직하게는 이온화 칼슘 농도 0.1 μM~30 μM의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 이온화 칼슘 농도 100 μM~10 mM의 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자를 제공한다. 보다 구체적으로는, 생체내의 조기 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도(저칼슘 농도, 예를 들면 1 μM~5 μM)에 있어서의 항원 결합 활성이, 생체내의 혈장 중의 이온화 칼슘 농도(고칼슘 농도, 예를 들면 0.5 mM~2.5 mM)에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자를 들 수 있다.
본 발명의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자는, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에서의 항원 결합 활성보다 낮은 한, 그의 결합 활성의 차는 한정되지 않고, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 조금이라도 낮으면 된다.
본 발명의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 태양으로서, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 KD와 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 KD의 비인 KD(저Ca)/KD(고Ca)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(저Ca)/KD(고Ca)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(저Ca)/KD(고Ca)의 값이 40 이상이다. KD(저Ca)/KD(고Ca)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한, 400, 1000, 10000 등, 어떠한 값이어도 된다.
또한 본 발명의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 다른 바람직한 태양으로서, 항원에 대한 저칼슘 농도 조건하에서의 kd와 고칼슘 농도 조건하에서의 kd의 비인 kd(저Ca)/kd(고Ca)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 kd(저Ca)/kd(고Ca)의 값이 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 kd(저Ca)/kd(고Ca)의 값이 10 이상이고, 더욱 바람직하게는 kd(저Ca)/kd(고Ca)의 값이 30 이상이다. kd(저Ca)/kd(고Ca)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한, 50, 100, 200 등, 어떠한 값이어도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자는, 또한, 전술한 중성 pH 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 가지고 있어도 된다. 당해 중성 pH 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성과, 칼슘 농도 의존적인 항원 결합 활성을 조합함으로써, 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 기능, 항원 결합 분자의 투여에 의한 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 기능을 증강시키는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 항원 결합 분자는, 추가로, 전술한 pH 의존적인 항원 결합 활성, 즉 산성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 중성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮다고 하는 항원 결합 활성을 가지고 있어도 된다. 당해 pH 의존적인 항원 결합 활성과, 칼슘 농도 의존적인 항원 결합 활성을 조합함으로써, 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 기능, 항원 결합 분자의 투여에 의한 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 기능을 증강시키는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 항원 결합 분자는 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은 한, 그 밖에 어떠한 성질을 가지고 있어도 되고, 예를 들면 아고니스트 항원 결합 분자나 안타고니스트 항원 결합 분자 등이어도 된다. 본 발명의 바람직한 항원 결합 분자의 예로서 안타고니스트 항원 결합 분자를 들 수 있다. 안타고니스트 항원 결합 분자는 통상, 리간드(아고니스트)와 수용체의 결합을 저해하여, 수용체를 매개로 한 세포내로의 시그날 전달을 저해하는 항원 결합 분자이다.
또한 pH 의존적인 항원 결합 활성이 부여된 항원 결합 분자는, 하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되거나, 또는 하나 이상의 히스티딘이 삽입되어 있어도 된다.
또한, 본 발명의 항원 결합 분자가 결합하는 항원은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 항원에 결합해도 된다. 예를 들면, 수용체 단백질(막결합형 수용체, 가용형 수용체)이나 세포 표면 마커 등의 막항원, 사이토카인 등의 가용형 항원 등을 들 수 있다. 그 밖의 항원의 구체적인 예로서는, 전술한 바와 같다.
스크리닝방법
본 발명은, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한,
(i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능,
(ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능,
(iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및
(iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능,
으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
구체적으로는, 본 발명은 이하의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다；
(a) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다；
(a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정(a)~(d)를 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다；
(a) 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 선택된 항원 결합 분자를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다；
(a)　항원을 고정한 칼럼에 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정(a)~(d)를 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다；
(a)　항원을 고정한 칼럼에 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 분자를 회수하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 회수된 항원 결합 분자를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정(a)~(d)를 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다；
(a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 취득한 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 항원 결합 활성이, 상기 공정(b)에서 항원 결합 활성보다 약한 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한, 이들 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은, 전술한 스크리닝방법에 있어서, (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 스크리닝방법을 제공한다. (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않지만, 통상 10회 이내이다.
본 발명의 스크리닝방법에 있어서, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은, 이온화 칼슘 농도가 0.1 μM~30 μM 사이의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서, 0.5 μM~10 μM 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서, 생체내의 조기 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 1 μM~5 μM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은, 이온화 칼슘 농도가 100 μM~10 mM 사이의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 200 μM~5 mM 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서, 생체내의 혈장 중에서의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 0.5 mM~2.5 mM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.
항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, 이온화 칼슘 농도 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적당히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은, KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도상수), 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도상수) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정은, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.
고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 한, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성과 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.
본 발명의 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 항원 결합 분자는 어떠한 항원 결합 분자여도 되고, 예를 들면 전술한 항원 결합 분자를 스크리닝하는 것이 가능하다. 예를 들면, 천연의 서열을 갖는 항원 결합 분자를 스크리닝해도 되고, 아미노산 서열이 치환된 항원 결합 분자를 스크리닝해도 된다.
본 발명의 스크리닝방법으로 스크리닝되는 항원 결합 분자는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면, 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지라이브러리 등), 동물로의 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 스크리닝방법에 의해, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능,
(ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능,
(iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및
(iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능,
으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 이들 기능 중 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자를 얻기 위한 스크리닝방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝방법에 의해 얻어지는 이들 항원 결합 분자는, 환자로의 투여량이나 투여빈도를 줄이는 것이 가능하고, 결과로서 총 투여량을 줄이는 것이 가능해지기 때문에, 의약품으로서 특히 우수하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 의약 조성물로서 사용하기 위한 항원 결합 분자의 스크리닝방법으로서 이용하는 것이 가능하다.
항원 결합 분자의 제조방법
본 발명은, 항원 결합 분자의 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다. 또한, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능,
(ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능,
(iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및
(iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능,
으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
구체적으로는, 본 발명은 이하의 공정(a)~(e)를 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다；
(a) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 선택된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) 상기 공정(d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 생산하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정(a)~(e)를 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다；
(a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) 상기 공정(d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 생산하는 공정.
또한, (a)~(d)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않지만, 통상 10회 이내이다.
또한 본 발명은 이하의 공정(a)~(f)를 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다；
(a) 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 선택된 항원 결합 분자를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 접촉시키는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(e) 상기 공정(d)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(f) 상기 공정(e)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 생산하는 공정.
또한, (a)~(e)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(e)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(e)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않지만, 통상 10회 이내이다.
또한, 본 발명은 이하의 공정(a)~(e)를 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다；
(a)　항원을 고정한 칼럼에 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 분자를, 저칼슘 농도 조건하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) 상기 공정(d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 생산하는 공정.
또한, (a)~(d)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않지만, 통상 10회 이내이다.
또한 본 발명은 이하의 공정(a)~(f)를 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다；
(a)　항원을 고정한 칼럼에 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 분자를 회수하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 회수된 항원 결합 분자를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(e) 상기 공정(d)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(f) 상기 공정(e)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 생산하는 공정.
또한, (a)~(e)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(e)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(e)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않지만, 통상 10회 이내이다.
또한 본 발명은 이하의 공정(a)~(f)를 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다；
(a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(c) 상기 공정(b)에서 취득한 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 항원 결합 활성이, 상기 공정(b)에서 항원 결합 활성보다 약한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(e) 상기 공정(d)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(f) 상기 공정(e)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 생산하는 공정.
또한, (a)~(e)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은, 전술한 방법에 있어서, (a)~(e)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(e)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않지만, 통상 10회 이내이다.
본 발명의 제조방법에서 사용되는 항원 결합 분자는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지라이브러리 등), 동물로의 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 라이브러리에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.
전술한 제조방법에 있어서, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은, 이온화 칼슘 농도가 0.1 μM~30 μM 사이의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서, 0.5 μM~10 μM 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서, 생체내의 조기 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 1 μM~5 μM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은, 이온화 칼슘 농도가 100 μM~10 mM 사이의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 200 μM~5 mM 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서, 생체내의 혈장 중에서의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 0.5 mM~2.5 mM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.
항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, 이온화 칼슘 농도 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적당히 결정하는 것이 가능하다.
고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정은, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.
고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 한, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성과 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.
전술한 제조방법에 있어서 항원과 항원 결합 분자의 결합은 어떠한 상태로 행해져도 되고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 고정화된 항원 결합 분자에 항원을 접촉시킴으로써 항원 결합 분자와 항원을 결합시켜도 되고, 고정화된 항원에 항원 결합 분자를 접촉시킴으로써 항원 결합 분자와 항원을 결합시켜도 된다. 또한, 용액 중에서 항원 결합 분자와 항원을 접촉시킴으로써 항원 결합 분자와 항원을 결합시켜도 된다.
또한 본 발명의 제조방법은, 전술한 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 사용하는 것도 가능하고, 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 부여하거나 또는 높이는 방법과 조합하는 것도 가능하다. 본 발명의 제조방법에 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 부여하거나 또는 높이는 방법을 조합하는 경우에는, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여, 중성 pH 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 부여하거나 또는 높이는 공정을 추가로 포함해도 된다. 또한, 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 인간 FcRn 결합 도메인으로서는, 전술한 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 갖는 인간 FcRn 결합 도메인을 바람직한 예로서 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 있어서는, 사전에 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 높은 인간 FcRn 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자를 선택, 및/또는, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여, 중성 pH에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 부여하거나 또는 높이는 공정을 추가로 포함해도 된다.
또한 본 발명의 제조방법은, 전술한 pH 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자에 사용하는 것도 가능하고, pH 의존적인 항원 결합 활성을 부여하는 방법(WO 2009/125825)과 조합시키는 것도 가능하다. 본 발명의 제조방법에 pH 의존적인 항원 결합 활성을 부여하는 방법을 조합하는 경우에는, 사전에 산성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 중성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자를 선택, 및/또는, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여, 산성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 중성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 저하시키는 공정을 추가로 포함해도 된다.
또한, pH 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자로서는, 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되었거나 또는 하나 이상의 히스티딘이 삽입된 항원 결합 분자를 바람직한 예로서 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 있어서는, 항원 결합 분자로서 하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되었거나 또는 하나 이상의 히스티딘이 삽입된 항원 결합 분자를 사용하거나, 또는, 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 공정을 추가로 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 제조방법에 있어서는 히스티딘 대신에 비천연 아미노산을 사용해도 된다. 따라서, 전술한 히스티딘을 비천연 아미노산과 치환하여 본 발명을 이해하는 것도 가능하다.
본 발명의 제조방법에 의해, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때,
(i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능,
(ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능,
(iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및
(iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능,
으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자를 제조하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 제조방법은, 이들 기능 중 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자를 얻기 위한 제조방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 이들 항원 결합 분자는, 환자로의 투여량이나 투여빈도를 줄이는 것이 가능하여, 결과로서 총 투여량을 줄이는 것이 가능해지기 때문에, 의약품으로서 특히 우수하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 제조방법은, 의약 조성물로서 사용하기 위한 항원 결합 분자의 제조방법으로서 이용하는 것이 가능하다.
본 발명의 제조방법에 있어서 얻어진 유전자는, 통상, 적당한 벡터로 담지(삽입)되어, 숙주세포로 도입된다. 그 벡터로서는, 삽입한 핵산을 안정하게 유지하는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 숙주로 대장균을 사용하는 것이라면, 클로닝용 벡터로서는 pBluescript 벡터(Stratagene사 제조) 등이 바람직하나, 시판의 각종 벡터를 이용할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자를 생산할 목적으로 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 시험관 내, 대장균 내, 배양세포 내, 생물개체 내에서 항원 결합 분자를 발현하는 벡터라면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 시험관 내 발현이라면 pBEST 벡터(프로메가사 제조), 대장균이라면 pET 벡터(Invitrogen사 제조), 배양세포라면 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864), 생물개체라면 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)) 등이 바람직하다. 벡터로의 본 발명의 DNA의 삽입은, 통상의 방법에 의해, 예를 들면, 제한효소 사이트를 사용한 리가아제 반응에 의해 행할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11).
상기 숙주세포로서 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 각종의 숙주세포가 사용된다. 항원 결합 분자를 발현시키기 위한 세포로서는, 예를 들면, 세균세포(예：스트렙토코커스, 스타필로코커스, 대장균, 스트렙토미세스, 고초균), 진균세포(예：효모, 아스퍼질러스), 곤충세포(예：드로소필라S2, 스포도프테라SF9), 동물세포(예：CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes 흑색종 세포) 및 식물세포를 예시할 수 있다. 숙주세포로의 벡터 도입은, 예를 들면, 인산칼슘 침전법, 전기펄스 천공법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9), 리포펙션법, 마이크로인젝션법 등의 공지의 방법으로 행하는 것이 가능하다.
숙주세포의 배양은 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 동물세포를 숙주로 한 경우, 배양액으로서, 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 그때, FBS, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용해도 되고, 무혈청 배양에 의해 세포를 배양해도 된다. 배양시의 pH는, 약 6~8로 하는 것이 바람직하다. 배양은 통상, 약 30~40℃에서 약 15~200시간 행하고, 필요에 따라 배지의 교환, 통기, 교반을 더한다.
숙주세포에 있어서 발현된 항원 결합 분자를 소포체의 내강에, 세포 주변강에, 또는 세포외의 환경에 분비시키기 위해, 적당한 분비 시그날을 목적의 폴리펩티드에 삽입할 수 있다. 이들 시그날은 목적의 항원 결합 분자에 대해 내인성이어도 되고, 이종 시그날이어도 된다.
한편, in vivo에서 폴리펩티드를 생산시키는 시스템으로서는, 예를 들면, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 이들 동물 또는 식물에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 폴리펩티드를 생산시켜, 회수한다. 본 발명에 있어서의 「숙주」란, 이들 동물, 식물을 포함한다.
동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). 또한, 포유류동물을 사용하는 경우, 형질전환 동물을 사용할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드를, 염소β 카제인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 폴리펩티드를 코드하는 유전자와의 융합 유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 염소의 배로 주입하고, 이 배를 암컷의 염소로 이식힌다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터, 목적의 항원 결합 분자를 얻을 수 있다. 형질전환 염소로부터 생산되는 항원 결합 분자를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적당히 호르몬을 형질전환 염소에 투여해도 된다(Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702).
또한, 본 발명의 항원 결합 분자를 생산시키는 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 삽입한 바큘로바이러스를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 목적의 항원 결합 분자를 얻을 수 있다.
또한, 식물을 본 발명의 항원 결합 분자 생산에 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다. 담배를 사용하는 경우, 목적으로 하는 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시켜, 본 담뱃잎으로부터 목적하는 항원 결합 분자를 얻을 수 있다(Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-8). 또한, 동일한 박테리아를 부초(Lemna minor)에 감염시켜, 클론화한 후에 부초의 세포로부터 목적하는 항원 결합 분자를 얻을 수 있다(Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1591-1597).
이와 같이 하여 얻어진 항원 결합 분자는, 숙주세포내 또는 세포외(배지, 유즙 등)로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 항원 결합 분자로서 정제할 수 있다. 항원 결합 분자의 분리, 정제는, 통상의 폴리펩티드의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 조금도 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하여 항원 결합 분자를 분리, 정제할 수 있다.
크로마토그래피로서는, 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이들 크로마토그래피는, 역상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용해서 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A를 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia 제조) 등을 들 수 있다.
필요에 따라, 항원 결합 분자의 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백질 수식효소를 작용시킴으로써, 임의로 수식을 가하거나, 부분적으로 펩티드를 제거하는 것도 가능하다. 단백질 수식효소로서는, 예를 들면, 트립신, 키모트립신, 리실 엔도펩티다아제, 프로테인 키나아제, 글루코시다아제 등이 사용된다.
의약 조성물
또한 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자, 본 발명의 스크리닝방법에 의해 단리된 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항원 결합 분자, 본 발명의 스크리닝방법에 의해 단리된 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자는,
(i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능,
(ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능,
(iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및
(iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능,
으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자로서, 항원 결합 분자의 투여빈도를 줄이는 것이 기대되기 때문에 의약 조성물로서 유용하다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 의약 조성물이란, 통상, 질환의 치료 또는 예방, 또는 검사·진단을 위한 약제를 말한다.
본 발명의 의약 조성물은, 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것이 생각된다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은, 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 설정한다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약(예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨)을 포함하는 등장액을 들 수 있다. 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트80(TM), HCO-50 등)를 병용해도 된다.
유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질 및/또는 벤질알코올을 병용해도 된다. 또한, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액 및 초산나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면, 염산프로카인), 안정제(예를 들면, 벤질알코올 및 페놀), 산화 방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전한다.
본 발명의 의약 조성물은, 바람직하게는 비경구 투여에 의해 투여된다. 예를 들면, 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형의 조성물로 할 수 있다. 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
투여방법은 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 선택할 수 있다. 항원 결합 분자를 함유하는 의약 조성물의 투여량은, 예를 들면, 1회 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1000 ㎎의 범위로 설정하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들면, 환자당 0.001~100000 ㎎의 투여량으로 하는 것도 가능하나, 본 발명은 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여방법은, 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변동되나, 당업자라면 그들의 조건을 고려하여 적당한 투여량 및 투여방법을 설정하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 의약 조성물은, 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키기 위해, 또는 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키기 위해 사용되는 의약 조성물일 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 투여함으로써, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법, 또는 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 투여는 in vivo 또는 in vitro의 어느 쪽으로 행해도 된다. 투여 대상으로서는, 예를 들면 비인간 동물(마우스, 원숭이 등), 또는 인간 등을 들 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 사용함으로써, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역 후에 수식(예를 들면, N 말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다)을 받는 경우도 있으나, 그와 같이 아미노산이 번역 후 수식된 경우이더라도 당연히 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함된다.
또한 본 발명은, 적어도 본 발명의 항원 결합 분자를 포함하는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 그 키트에는, 기타, 약학적으로 허용되는 담체, 매체, 사용방법을 기재한 지시서 등을 팩키징해 두는 것도 가능하다.
또한 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 유효성분으로 함유하는, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수 촉진제, 혈장 중의 항원 농도의 감소 촉진제, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수 증가제, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성 개선제에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자의, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수 촉진제, 혈장 중의 항원 농도의 감소 촉진제, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수 증가제, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성 개선제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법, 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법, 1분자의 항원 결합 분자에 의한 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 또는 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자에 관한 것이다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕칼슘 의존적 항원 결합 항체의 항원 소실 가속효과의 콘셉트
(1-1) pH 의존적 결합 항체의 항원 결합 항체에 의한 항원 소실 가속효과
WO 2009/125825에 기재되어 있는 H54/L28-IgG1은 인간화 항IL-6 수용체 항체이고, Fv4-IgG1은, H54/L28-IgG1에 대해 가용형 인간 IL-6 수용체로 pH 의존적으로 결합하는 특성(중성 조건하에 있어서 결합하고, 산성 조건하에 있어서 해리됨)을 부여한 인간화 항IL-6 수용체 항체이다. WO 2009/125825에 기재되어 있는 마우스의 in vivo 시험에 있어서, H54/L28-IgG1과 항원인 가용형 인간 IL-6 수용체의 혼합물을 투여한 군과 비교하여, Fv4-IgG1과 항원인 가용형 인간 IL-6 수용체의 혼합물을 투여한 군에 있어서, 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실을 대폭 가속시킬 수 있는 것이 나타내어졌다.
통상의 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체에 결합한 가용형 인간 IL-6 수용체는, 항체와 함께 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되는 것에 대해, pH 의존적으로 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체는, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항체에 결합한 가용형 인간 IL-6 수용체를 해리한다. 해리된 가용형 인간 IL-6 수용체는 리소좀에 의해 분해되기 때문에, 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실을 대폭 가속하는 것이 가능해지고, 또한 pH 의존적으로 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체는 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되며, 리사이클된 항체는 재차 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합할 수 있어, 이것이 반복됨으로써 하나의 항체 분자가 복수 회 반복해서 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합하는 것이 가능해진다(도 1).
또한, WO 2009/125825에 기재되어 있는 바와 같이, 통상의 인간화 항IL-6 수용체 항체는, 막형 인간 IL-6 수용체에 결합 후, 인간화 항IL-6 수용체 항체와 막형 인간 IL-6 수용체의 복합체의 상태로 내재화되고, 그 후 리소좀으로 분해된다. 그것에 대해, pH 의존적으로 결합하는 인간화 항IL-6 수용체 항체는, 막형 인간 IL-6 수용체에 결합하여 내재화된 후, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 막형 인간 IL-6 수용체로부터 해리됨으로써, 혈장 중으로 리사이클된다. 이와 같이 리사이클된 항체는 재차 막형 인간 IL-6 수용체에 결합할 수 있어, 이것이 반복됨으로써 하나의 항체 분자가 복수 회 반복하여 막형 인간 IL-6 수용체에 결합하는 것이 가능해진다(도 2).
(1-2) 혈장 중 및 엔도솜 중에 있어서의 pH 및 칼슘 농도
도 1 및 도 2에 나타낸 pH 의존적 결합 항체에 의한 작용에 있어서는, 혈장 중과 엔도솜 내의 환경의 차이, 즉 pH의 차이(혈장 중：pH 7.4, 엔도솜 내：pH 6.0)를 이용하여, 혈장 중에서는 항원에 강하게 결합시키고, 엔도솜 내에서는 항원으로부터 해리시키는 것이 중요하다. 혈장 중과 엔도솜 내에서 pH 의존적 결합 항체의 항원으로의 결합능에 이러한 차이를 창출하기 위해서는, 혈장 중과 엔도솜 내의 환경의 차이의 크기가 중요하다. pH의 차이는 즉 수소 이온 농도의 차이이다. 즉, pH 7.4의 혈장 중의 수소 이온 농도는 약 40 nM이고, pH 6.0의 엔도솜 내의 수소 이온 농도는 약 1000 nM이며, 혈장 중과 엔도솜 내에서 인자(수소 이온)의 농도에 약 25배의 차이가 있다.
도 1 및 도 2에 나타낸 작용을 보다 용이하게 달성하기 위해, 또는, 그 작용을 증강하기 위해서는, 혈장 중과 엔도솜 내의 수소 이온 농도의 차이로부터, 농도의 차이가 큰 인자에 의존하는 항체를 사용하면 될 것으로 생각되었다. 혈장 중과 엔도솜 내에서 농도의 차이가 큰 인자를 탐색한 결과, 칼슘이 발견되었다. 혈장 중의 이온화 칼슘 농도는 1.1-1.3 mM 정도이고, 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도는 3 μM 정도로, 혈장 중과 엔도솜 내에서 인자(칼슘)의 농도에 약 400배의 차이가 있어, 그 차는 수소 이온 농도 차(25배)보다도 큰 것이 발견되었다. 즉, 고칼슘 농도 조건하(1.1-1.3 mM)에 있어서 항원에 결합하고, 저칼슘 농도 조건하(3 μM)에 있어서 항원으로부터 해리되는 이온화 칼슘 농도 의존적 결합 항체를 사용함으로써, 도 1 및 도 2에 나타낸 작용을 보다 용이하게 달성할 수 있거나, 또는, 그 작용을 증강시킬 수 있을 것으로 생각되었다.
또한, WO 2009/125825에 있어서, 히스티딘을 도입함으로써, pH 7.4와 pH 6.0에서 성질이 변화하는 pH 의존적 결합 항체를 제작하고 있다. 히스티딘은 혈장 중의 중성 조건하에서는 중성 전하이나, 엔도솜 내의 산성 조건하에서는 양전하를 갖는다. 이 히스티딘의 전하의 변화를 이용하여, 항체와 항원의 상호작용에 pH 의존성을 부여하는 것이 가능하다. 한편으로, 도 3에 나타내는 바와 같이, 히스티딘을 사용하는 경우, 혈장 중에서 항원에 결합하고, 엔도솜 내에서 항원으로부터 해리되기 위해서는, 항체의 히스티딘 잔기는, 항원의 양전하의 아미노산 또는 수소 결합의 도너가 될 수 있는 아미노산과 상호작용하고 있을 필요가 있기 때문에, 목적의 작용을 발휘하기 위한 pH 의존적 결합 항체가 결합하는 항원측의 에피토프는 양전하의 아미노산 또는 수소 결합의 도너가 될 수 있는 아미노산을 가질 필요가 있다.
한편, 도 4에 나타내는 바와 같이, 칼슘 의존적 결합 항체는, 칼슘 이온을 매개로 항원에 결합하는 것으로 생각되기 때문에, 항원측의 에피토프는 칼슘 이온을 킬레이트 가능한 음전하의 아미노산 또는 수소 결합 액셉터가 될 수 있는 아미노산이기 때문에, 히스티딘을 도입하여 제작된 pH 의존적 결합체에서는 타겟으로 할 수 없는 에피토프를 타겟으로 하는 것이 가능하다. 또한, 도 5에 나타내는 바와 같이, 칼슘 의존성과 pH 의존성을 겸비하는 항체를 사용함으로써, 폭넓은 성질을 갖는 에피토프를 타겟으로 하는 것이 가능해질 것으로 생각된다.
〔실시예 2〕파지 디스플레이 기술을 이용한 인간 항체 라이브러리로부터의 Ca 의존적 결합 항체의 취득
(2-1) 나이브(naive) 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제작
인간 PBMC로부터 제작한 polyA RNA나, 시판의 인간 polyA RNA 등을 template로 하여, (Methods Mol Biol. 2002;178:87-100.)에 따라, 인간 항체 서열로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하는 복수의 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다.
(2-2) 비드 패닝에 의한 라이브러리로부터의 Ca 의존적 결합 항체 단편의 취득
구축한 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 최초의 선발은, 항원으로의 결합능을 갖는 항체 단편만을 농축, 또는 Ca 의존적 결합능을 지표로 농축시켰다. Ca 의존적 결합능을 갖는 항체 단편을 농축시키는 경우에는, Ca 이온 존재하에서 항원과 결합시킨 후, EDTA에 의해 Ca 이온을 킬레이트함으로써 파지의 용출을 행하였다. 항원으로서 비오틴 표지한 인간 IL-6 수용체를 사용하였다.
상기와 같이 구축한 파지 디스플레이용 phagemid를 보유한 대장균으로부터 파지 생산을 행하고, 얻어진 배양액을 2.5 M NaCl/10%PEG에 의해 침전시킨 후 TBS로 희석하여 파지 라이브러리액으로 하였다. 파지 라이브러리액에 BSA, CaCl2를 첨가하여, 종농도 4% BSA, 이온화 칼슘 농도 1.2 mM가 되도록 조제하였다. 패닝은 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝 방법을 참고로 하였다(J Immunol Methods. 2008 Mar 20;332(1-2):2-9., J Immunol Methods. 2001 Jan 1;247(1-2):191-203., Biotechnol Prog. 2002 Mar-Apr;18(2):212-20., Mol Cell Proteomics. 2003 Feb;2(2):61-9.). 자기 비드에는 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)를 사용하였다.
구체적으로는, 조제한 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가하고, 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹한 자기 비드를 첨가하고, 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드를 1 mL의 1.2 mM CaCl2/TBS(1.2 mM CaCl2를 포함하는 TBS)로 1회 세정하였다. 그 후, 결합능을 갖는 항체 단편을 농축하는 경우에는, 일반적인 방법으로 용출을 행하고, Ca 의존적 결합능을 갖는 항체 단편을 농축하는 경우에는, 2 mM EDTA/TBS(2%EDTA를 포함하는 TBS)에 비드를 현탁하고, 파지를 회수하였다. 회수한 파지용액에, 대수증식기(OD600 0.4-0.5)가 된 대장균주 TG1 10 mL를 첨가하고, 37℃, 1 hr, 완만하게 교반배양을 행함으로써 감염시켰다. 감염시킨 대장균을, 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 플레이팅하였다. 재차 이 대장균으로부터 배양을 개시하여, 파지의 배양을 행하였다.
2회째 이후의 패닝에서는, Ca 의존적 결합능을 지표로 농축을 행하였다. 구체적으로는, 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가하고, 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹한 자기 비드를 첨가하고, 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드를 1 mL의 1.2 mM CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2, 0.1% Tween-20을 포함하는 TBS)와 1.2 mM CaCl2/TBS로 1회씩 세정하였다. 그 후 0.1 mL의 2 mM EDTA/TBS(2%EDTA를 포함하는 TBS)를 첨가하여 비드를 실온에서 현탁하고, 즉석에서 Magnet Stand를 사용하여 비드를 분리하고, 파지용액을 회수하였다. 회수한 파지용액을, 대수증식기(OD600 0.4-0.5)가 된 대장균주 TG1 10 mL에 첨가, 37℃, 1 hr, 완만하게 교반배양을 행함으로써 감염시켰다. 감염시킨 대장균을 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 플레이팅하였다. 재차 이 대장균으로부터 배양을 개시하고, 상기와 동일하게 파지의 배양을 행하여, 패닝을 2회 반복하였다.
(2-3) 파지 ELISA에 의한 평가
상기 방법에 의해 얻어진 대장균 싱글 콜로니로부터, (Methods Mol Biol. 2002;178:133-145.)에 따라, 파지 함유 배양상청을 회수하였다.
파지 함유 배양상청에 종농도 4%BSA, 칼슘 이온 농도 1.2 mM가 되도록 BSA, CaCl2를 첨가하고, ELISA에 제공하였다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)를 비오틴 표지 항원을 포함하는 PBS 100 μL로 하룻밤 코트하였다. PBST(0.1%Tween20을 포함하는 PBS)로 세정하고, 항원을 제거한 후, 4% BSA-TBS 250 μL로 1시간 이상 블로킹하였다. 4% BSA-TBS를 제거하고, 여기에 조제한 배양상청을 첨가하여 37℃에서 1시간 정치해 파지 제시 항체를 결합시켰다. 1.2 mM CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2, 0.1% Tween20을 포함하는 TBS)로 세정 후, 1.2 mM CaCl2/TBS 또는 1 mM EDTA/TBS를 첨가하고 37℃에서 30분간 정치하여 인큐베이트하였다. 1.2 mM CaCl2/TBST로 세정 후, 4% BSA, 이온화 칼슘 농도 1.2 mM로 한 TBS로 희석한 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Parmacia Biotech)를 1시간 인큐베이트시켰다. 1.2 mM CaCl2/TBST로 세정 후, TMB single solution(ZYMED)으로 검출하고, 황산의 첨가에 의해 반응을 정지한 후, 450 nm의 흡광도를 측정하였다. Ca 의존적 결합능이 있다고 판단한 항체 단편에 대해, 특이적인 프라이머를 사용하여 염기서열 해석을 행하였다.
(2-4) 항체의 발현과 정제
파지 ELISA에 의해, Ca 의존적 결합능이 있다고 판단된 클론에 대해서, 동물세포 발현용 플라스미드로의 도입을 행하였다. 항체의 발현은 이하의 방법을 사용해서 행하였다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)를 FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)로 현탁하고, 1.33×106 개/mL의 세포밀도로 6 well plate의 각 웰로 3 mL씩 파종하여, 리포펙션법에 의해 조제한 플라스미드를 세포로 도입하였다. CO2 인큐베이터(37도, 8%CO2, 90 rpm)에서 4일간 배양을 행하고, 얻어진 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체 농도는, 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 항체 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
〔실시예 3〕취득된 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 Ca 의존적 결합능의 평가
실시예 2에서 취득된 항체 6RL#9-IgG1(중쇄 서열번호：1, 경쇄 서열번호：2), 6RK#12-IgG1(중쇄 서열번호：66, 경쇄 서열번호：67) 및, FH4-IgG1(중쇄 서열번호：3, 경쇄 서열번호：4)을, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 7.4에서 인간 인터류킨 6 수용체(hIL6R) 결합 활성이 평가되었다. 런닝 버퍼로서 3 μM 또는 2 mM CaCl2를 함유하는 0.05% Surfactant P20, 10 mmol/l ACES 150 mmol/l NaCl(pH 7.4 또는 pH 6.0)을 사용해서 측정을 행하였다.
Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 아미노 커플링법으로 재조합형 프로테인 A(Thermo Scientific)를 적당량 고정화한 후, 항체를 결합시켰다. 애널라이트로서 적절한 농도의 hIL-6R을 인젝트하고, 센서칩 상의 항체와 상호작용시켰다. 그 후, 10 mmol/L Glycine-HCl(pH1.5)을 인젝트하고, 센서칩을 재생하였다. 측정은 37℃에서 행하였다. 측정한 결과, 얻어진 센서그램을 도 6에 나타내었다. 이들 결과로부터, 6RL#9-IgG1, 6RK#12-IgG1 및 FH4-IgG1항체는 모두, Ca2+ 농도가 3 μM인 조건하에서는, Ca2+ 농도가 2 mM인 조건하의 경우와 비교하여, hIL6R에 대한 결합이 약한 것이 명확하게 나타내어졌다.
이들 항체 중에서, Ca 의존성을 갖는 항체로서 6RL#9-IgG1(중쇄 서열번호：1, 경쇄 서열번호：2), 및 FH4-IgG1(중쇄 서열번호：3, 경쇄 서열번호：4)을 추가로 반응속도론 해석을 행하였다. Ca 의존성을 갖지 않는 항체로서, WO 2009/125825에 기재되어 있는 H54/L28-IgG1(중쇄 서열번호：5, 경쇄 서열번호：6)을 사용하였다. 고칼슘 이온 농도로서, 2 mM를 사용하고, 저칼슘 이온 농도의 조건으로서 3 μM를 사용하였다. 항원은 인간 IL-6 수용체(IL-6R)를 사용하였다. Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 protein A(Invitrogen)를 적당량 고정화하고, 거기에 목적의 항체를 캡쳐시켰다. 런닝 버퍼에는 10 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20, 2 mmol/L CaCl2, pH 7.4 또는 10 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20, 3 μmol/L CaCl2, pH 7.4의 2종류를 사용하였다. 측정은 모두 37℃에서 실시하고, IL-6R의 희석에도 각각의 버퍼를 사용하였다.
H54L28-IgG1에 관해서는, IL-6R 희석액과 블랭크인 런닝 버퍼를 유속 20 μL/min로 3분간 인젝트하고, 센서칩 상에 캡쳐시킨 항체에 IL-6R을 상호작용시켰다. 그 후 유속 20 μL/min로 10분간 런닝 버퍼를 흘려 IL-6R의 해리를 관찰한 후, 10 mmol/L Glycine-HCl, pH 1.5를 유속 30 μL/min로 30초간 인젝트하고, 센서칩을 재생하였다. 측정에서 얻어진 샌서그램으로부터, 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms), 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 각 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 해리상수 KD(M)를 산출하였다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하였다.
FH4-IgG1, 6RL#9-IgG1에 관해서는, IL-6R 희석액과 블랭크인 런닝 버퍼를 유속 5 μL/min로 15분간 인젝트하고, 센서칩 상에 캡쳐시킨 항체에 IL-6R을 상호작용시켰다. 그 후, 10 mmol/L Glycine-HCl, pH 1.5를 유속 30 μL/min로 30초간 인젝트하고, 센서칩을 재생하였다. 측정에서 얻어진 샌서그램에 대해 steady state affinity model을 사용하여 해리상수 KD(M)를 산출하였다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하였다.
이 방법으로 구한 2 mM CaCl2 존재하에 있어서의 각 항체와 IL-6R의 해리상수 KD를 표 7에 나타낸다. H54/L28-IgG1의 경우는 Ca 농도의 차이에 의한 IL-6R에 대한 결합의 차이는 관찰되지 않았으나, FH4-IgG1, 6RL#9-IgG1의 경우는 저농도의 Ca 조건하에서는 결합이 현저한 감약이 관찰되었다(도 7, 8, 9).
Figure pat00013
H54/L28-IgG1에 대해서는 2 mM Ca 농도 존재하와 동일한 방법으로, Ca 농도가 3 μM인 조건하에서의 KD를 산출할 수 있다. FH4-IgG1, 6RL#9-IgG1에 대해서는 Ca 농도가 3 μM인 경우는, 거의 IL-6R에 대한 결합이 관찰되지 않았기 때문에, 상기의 방법에 의한 KD의 산출은 곤란하나, 하기의 식 1을 사용함으로써 KD를 예측하는 것이 가능하다(Biacore T100 Software Handbook, BR-1006-48, AE 01/2007).
[식 1]
Figure pat00014
상기 식 1 중의 각 항목의 의미를 나타낸다；
Req(RU):정상상태 결합 레벨(Steady state binding levels)
Rmax(RU):애널라이트의 표면 결합능(Analyte binding capacity of the surface)
RI(RU):시료 중의 용적 굴절률 기여(Bulk refractive index contribution in the sample)
C(M):애널라이트 농도(Analyte concentration)
KD(M):평형 해리상수(Equilibrium dissociation constant)
이 식 1을 이용하여, Ca 농도가 3 μmol/L인 경우의 예측되는 각 항체와 IL-6R의 해리상수 KD를 개산한 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure pat00015
상기 표 8 중, Req, Rmax, RI, C는 측정결과를 토대로 가정된 값이다.
이 결과로부터, FH4-IgG1, 6RL#9-IgG1은, 2 mM CaCl2 내지 3 μM CaCl2로 함으로써, IL-6R에 대한 KD가 각각 약 60배, 약 120배 상승(60배, 120배 이상 친화성이 저감)될 것으로 예측되었다. 표 9에 H54/L28-IgG1, FH4-IgG1, 6RL#9-IgG1의 3종류의 항체의 2 mM CaCl2 존재하 및 3 μM CaCl2 존재하에 있어서의 KD값, 및 KD값의 Ca 의존성에 대해서 정리하였다.
Figure pat00016
〔실시예 4〕취득된 항체로의 칼슘 이온 결합 평가
다음으로, 항체로의 칼슘 이온의 결합의 평가를 행하기 위해, 시차주사형 열량측정(DSC)에 의한 열변성 중간온도(Tm값)의 평가를 행하였다(MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal 제조). 열변성 중간온도(Tm값)는 안정성의 지표로, 칼슘 이온이 결합하여 단백질이 안정화되면, 열변성 중간온도(Tm값)는 칼슘 이온이 결합해 있지 않은 경우에 비해 높아지는(J Bio Chem. 2008 Sep 12 ; Vol.283 ; No. 37:pp 25140 - 25149) 것을 이용하여, 항체로의 칼슘 이온의 결합의 평가를 행하였다. 정제한 항체를 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 또는 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl2, pH 7.4의 용액에 대해 투석(EasySEP, TOMY)을 행하였다. 단백질 용액을 투석에 사용한 용액으로 0.1 ㎎/mL로 조제하고, 20℃부터 115℃까지 240℃/hr의 승온속도로 DSC 측정을 행하였다. 얻어진 DSC의 변성 곡선을 토대로 각 항체의 Fab 도메인의 열변성 중간온도(Tm값)를 산출하여 표 10에 나타내었다.
Figure pat00017
표 10의 결과로부터 칼슘 의존적 결합능을 나타내는 FH4 및 6RL#9는 칼슘 이온의 농도에 따라 Fab의 Tm값이 변동되고, 칼슘 의존적 결합능을 나타내지 않는 H54/L28은 Tm값이 변동되지 않는 것이 나타내어졌다. FH4 및 6RL#9에서 나타내어진 Fab의 Tm값의 변동은, 이들 항체에 칼슘 이온이 결합하여, Fab 부분이 안정화된 것을 나타내고 있다. 이것에 의해, FH4 및 6RL#9는 칼슘 이온이 결합하고, 한편으로 H54/L28은 칼슘 이온이 결합해 있지 않은 것이 나타내어졌다.
〔실시예 5〕정상 마우스를 사용한 Ca 의존성 결합 항체의 항원의 혈장 중 체류성에 대한 영향 평가
(5-1) 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험
정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 hsIL-6R(가용형 인간 IL-6 수용체：참고예 1에서 제작)을 단독 투여 또는 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 체내동태를 평가하였다. hsIL-6R 용액(5 ㎍/mL), 또는, hsIL-6R과 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액을 꼬리 정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여하였다. 항인간 IL-6 수용체 항체로서는, 전술한 H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1, FH4-IgG1을 사용하였다.
혼합용액 중의 hsIL-6R 농도는 모두 5 ㎍/mL이나, 항인간 IL-6 수용체 항체 농도는 항체마다 상이하여, H54/L28-IgG1은 0.1 ㎎/mL, 6RL#9-IgG1 및 FH4-IgG1은 10 ㎎/mL, 이때, hsIL-6R에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, hsIL-6R은 대부분이 항체에 결합해 있는 것으로 생각된다. 투여 후 15분간, 7시간, 1일간, 2일간, 4일간, 7일간, 14일간, 21일간, 28일간에서 채혈을 행하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다.
(5-2) ELISA법에 의한 정상 마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체 농도 측정
마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체 농도는 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 Anti-Human IgG 고상화 플레이트를 제작하였다. 혈장 중 농도로서 0.64, 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ㎍/mL의 검량선 시료와 100배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하고, Anti-Human IgG 고상화 플레이트에 분주하여 25℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후 Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody(R&D)를 25℃에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 25℃에서 0.5시간 반응시켜, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색반응을 행하고, 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)로 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1, FH4-IgG1의 혈장 중 항체 농도 추이를 도 10에 나타내었다.
(5-3) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 hsIL-6R 농도 측정
마우스의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 전기화학 발광법으로 측정하였다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조정한 hsIL-6R 검량선 시료 및 50배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하여, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 토실리주마브(중쇄 서열번호：13, 경쇄 서열번호：14) 용액을 혼합하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그때의 Assay buffer에는 10 mM EDTA가 포함되어 있어, 샘플 중의 Free Ca 농도를 저하시켜, 샘플 중의 거의 모든 hsIL-6R이 6RL#9-IgG1 또는 FH4-IgG1로부터 해리되어, 첨가한 토실리주마브과 결합한 상태로 하는 것을 목적으로 하였다. 그 후, MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하였다. 추가로 25℃에서 1시간 반응시키고 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)를 분주하고, 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정을 행하였다. hSIL-6R 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 도 11에 나타내었다.
그 결과, hsIL-6R 단독은 매우 빠른 소실을 나타낸 것에 대해, hsIL-6R과 Ca 의존적인 결합이 없는 통상의 항체인 H54/L28-IgG1을 동시에 투여한 경우는, hsIL-6R의 소실을 대폭으로 느리게 하였다. 그에 대해, hsIL-6R과 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 갖는 6RL#9-IgG1 또는 FH4-IgG1을 동시에 투여한 경우는, hsIL-6R의 소실을 대폭으로 가속하였다. H54/L28-IgG1을 동시에 투여한 경우와 비교하여, 6RL#9-IgG1 및 FH4-IgG1을 동시에 투여한 경우는, Day1에 있어서의 혈장 중의 hsIL-6R 농도를 각각 39배 및 2배 저감할 수 있었다. 이것으로부터 칼슘 의존적 결합 항체가 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 가속 가능한 것이 확인되었다.
〔실시예 6〕Ca 의존적 항원 결합 항체의 항원 소실 가속효과의 향상 검토(항체 제작)
(6-1) IgG 항체의 FcRn으로의 결합에 관하여
IgG 항체는 FcRn에 결합함으로써 긴 혈장 중 체류성을 갖는다. IgG와 FcRn의 결합은 산성 조건하(pH 6.0)에 있어서만 확인되고, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서는 거의 결합은 확인되지 않는다. IgG 항체는 비특이적으로 세포에 흡수되는데, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내의 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가, 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 FcRn으로부터 해리된다. IgG의 Fc 영역에 변이를 도입하고, 산성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 상실시키면, 엔도솜 내로부터 혈장 중으로 리사이클되지 않게 되기 때문에, 항체의 혈장 중 체류성은 현저히 손상된다.
IgG 항체의 혈장 중 체류성을 개선시키는 방법으로서, 산성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 향상시키는 방법이 보고되어 있다. IgG 항체의 Fc 영역에 아미노산 치환을 도입하여, 산성 조건하의 FcRn으로의 결합을 향상시킴으로써, 엔도솜 내로부터 혈장 중으로 리사이클 효율이 상승되어, 그 결과, 혈장 중 체류성이 개선된다. 아미노산 치환을 도입할 때 중요한 것은, 중성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 높이지 않는 것이다. 중성 조건하에 있어서 FcRn에 결합해 버리면, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가도, 중성 조건하의 혈장 중에 있어서 IgG 항체가 FcRn으로부터 해리되지 않으면 IgG 항체가 혈장 중으로 리사이클되지 않기 때문에, 반대로 혈장 중 체류성은 손상되게 된다.
예를 들면, J Immunol. 2002;169(9):5171-80.에 기재되어 있는 바와 같이, IgG1에 대해 아미노산 치환을 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 마우스 FcRn에 대한 결합이 확인되어지게 된 항체를 마우스에 투여한 경우, 항체의 혈장 중 체류성이 악화되는 것이 보고되어 있다. 또한, J Immunol. 2009;182(12):7663-71.이나 J Biol Chem. 2007 Jan 19;282(3):1709-17.이나 J Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80.에 기재되어 있는 바와 같이, IgG1에 대해 아미노산 치환을 도입함으로써 산성 조건하(pH 6.0)에 있어서의 인간 FcRn의 결합이 향상되는데, 동시에 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 확인되어지게 된 항체를 게잡이원숭이에게 투여한 경우, 항체의 혈장 중 체류성이 개선되는 일은 없어, 혈장 중 체류성에 변화가 확인되지 않은 것이 보고되어 있다. 그 때문에, 항체의 기능을 향상시키는 항체 공학 기술에 있어서는, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 증가시키지 않고 산성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증가시킴으로써 항체의 혈장 중 체류성을 개선시키는 것에만 주력되고 있어, 지금까지 IgG 항체의 Fc 영역에 아미노산 치환을 도입하여, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 증가시키는 것의 이점은 보고되어 있지 않다.
Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체는, 가용형의 항원의 소실을 가속시켜, 하나의 항체 분자가 복수 회 반복해서 가용형의 항원에 결합하는 효과를 갖는 것으로부터, 매우 유용하다. 이 항원 소실 가속효과를 추가로 향상시키는 방법으로서, FcRn으로의 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 결합을 증강시키는 방법을 검증하였다.
(6-2) 중성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 갖는 Ca 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체의 조제
칼슘 의존적 항원 결합능을 갖는 FH4-IgG1과 6RL#9-IgG1, 및 대조로서 칼슘 의존적 항원 결합능을 갖지 않는 H54/L28-IgG1에 대해, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증가시키는 아미노산 변이를 도입하였다. 아미노산 변이의 도입은 PCR을 사용한 당업자 공지의 방법을 사용해서 행하였다. 구체적으로는 IgG1의 중쇄 정상영역에 대해, IgG1의 중쇄 정상영역에 대해, EU 넘버링에 있어서의 434번째를 Asn으로부터 Trp로 치환한 FH4-N434W(중쇄 서열번호：7, 경쇄 서열번호：8)와 6RL#9-N434W(중쇄 서열번호：9, 경쇄 서열번호：10)와 H54/L28-N434W(중쇄 서열번호：11, 경쇄 서열번호：12)를 제작하였다. 아미노산 치환의 도입방법으로서는, QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여, 첨부 설명서에 기재된 방법으로 변이체를 제작하고, 얻어진 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여, 목적의 발현 벡터를 제작하였다. 항체의 발현, 정제, 농도 측정은 실시예 2에 기재된 방법으로 실시하였다.
〔실시예 7〕정상 마우스를 사용한 Ca 의존성 결합 항체의 소실 가속효과의 평가
(7-1) 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험
정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 hsIL-6R(가용형 인간 IL-6 수용체：참고예 1에서 제작)을 단독 투여 또는 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 체내동태를 평가하였다. hsIL-6R 용액(5 ㎍/mL), 또는, hsIL-6R과 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액을 꼬리 정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여하였다. 항인간 IL-6 수용체 항체로서는, 전술한 H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, FH4-N434W을 사용하였다.
혼합용액 중의 hsIL-6R 농도는 모두 5 ㎍/mL이지만, 항인간 IL-6 수용체 항체 농도는 항체마다 상이하여, H54/L28-N434W는 0.042 ㎎/mL, 6RL#9-N434W는 0.55 ㎎/mL, FH4-N434W는 1 ㎎/mL로 하였다. 이때, hsIL-6R에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, hsIL-6R은 대부분이 항체에 결합해 있는 것으로 생각된다. 투여 후 15분간, 7시간, 1일간, 2일간, 4일간, 7일간, 14일간, 21일간, 28일간에서 채혈을 행하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다.
(7-2) ELISA법에 의한 정상 마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체 농도 측정
마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체 농도는 실시예 6과 동일한 ELISA법으로 측정하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, FH4-N434W의 혈장 중 항체 농도 추이를 도 12에 나타내었다.
(7-3) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 hsIL-6R 농도 측정
마우스의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 전기화학 발광법으로 측정하였다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조정한 hsIL-6R 검량선 시료 및 50배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하여, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody(R&D)를 혼합하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그때의 Assay buffer에는 10 mM EDTA가 포함되어 있어, 샘플 중의 Free Ca 농도를 저하시켜, 샘플 중의 거의 모든 hsIL-6R이 6RL#9-N434W 또는 FH4-N434W로부터 해리되어, 프리체로서 존재하는 상태로 하는 것을 목적으로 하였다. 그 후, MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하였다. 추가로 25℃에서 1시간 반응시켜 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)를 분주하고, 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정을 행하였다. hsIL-6R 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥 내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 도 13에 나타내었다.
결과, pH 7.4에 있어서의 FcRn으로의 결합을 증강시켰으나, hsIL-6R과 Ca 의존적인 결합이 없는 통상의 항체인 H54/L28-N434W를 동시에 투여한 경우는, hsIL-6R 단독으로 투여한 경우와 비교하여, hsIL-6R의 소실을 대폭으로 느리게 하였다. 그것에 대해, hsIL-6R과 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 가지며, 또한 pH 7.4에 있어서의 FcRn으로의 결합을 증강시킨 항체인 6RL#9-N434W 또는 FH4-N434W를 동시에 투여한 경우는, hsIL-6R 단독으로 투여한 경우보다도 hsIL-6R의 소실을 가속시켰다. hsIL-6R을 단독으로 투여한 경우와 비교하여, 6RL#9-N434W 및 FH4-N434W를 동시에 투여한 경우는, Day1에 있어서의 혈장 중의 hsIL-6R 농도를 각각 3배 및 8배 저감시킬 수 있었다. 이것으로부터, 칼슘 의존적 결합 항체에 대해, pH 7.4에 있어서의 FcRn으로의 결합능을 증강시킴으로써, 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 추가로 가속 가능한 것이 확인되었다.
hsIL-6R과 Ca 의존적인 결합이 없는 통상의 항체인 H54/L28-IgG1과 비교하여, hsIL-6R과 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 갖는 항체인 6RL#9-IgG1 또는 FH4-IgG1은, hsIL-6R의 소실을 증대시키는 효과가 확인되고, hsIL-6R과 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 가지며, 또한, pH 7.4에 있어서의 FcRn으로의 결합을 증강시킨 항체인 6RL#9-N434W 또는 FH4-N434W는, hsIL-6R의 소실을 hsIL-6R 단독보다도 가속시킬 수 있는 것이 확인되었다. 이들 데이터는, 도 1에 나타낸 바와 같이 pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체와 마찬가지로, Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체가 엔도솜 내에서 항원을 해리하는 것을 시사하고 있다. 실시예 1에 기재한 바와 같이, pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체의 경우는 표적으로 할 수 있는 에피토프가 한정되어 버리나(도 3), 본 검토에서 발견된 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체를 사용함으로써(도 4, 5), 엔도솜 의존적으로 항원을 해리할 수 있는 항체가 표적으로 할 수 있는 에피토프를 보다 폭넓게 할 수 있을 것으로 생각되었다.
〔실시예 8〕6RL#9 항체의 칼슘 이온 결합 부위의 X선결정 구조 해석에 의한 동정
(8-1) X선결정 구조 해석
실시예 4에 나타내어진 바와 같이, 6RL#9 항체는 칼슘 이온과 결합하는 것이 열변성 온도 Tm값의 측정으로부터 시사되었다. 그러나, 6RL#9 항체의 어느 부위가 칼슘 이온과 결합해 있는지 예상할 수 없었기 때문에, X선결정 구조 해석의 수법을 사용함으로써, 칼슘 이온이 상호작용하는 6RL#9 항체의 서열 중의 잔기가 특정되었다.
(8-2) 6RL#9 항체의 발현 및 정제
X선결정 구조 해석에 사용하기 위해 발현시킨 6RL#9 항체가 정제되었다. 구체적으로는, 6RL#9 항체의 중쇄(서열번호：1)와 경쇄(서열번호：2)를 각각 발현시킬 수 있도록 조제된 동물 발현용 플라스미드가 동물세포에 일과적으로 도입되었다. 최종 세포밀도 1×106 세포/mL가 되도록 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)로 현탁된 800 mL의 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에, 리포펙션법에 의해 조제된 플라스미드가 도입되었다. 플라스미드가 도입된 세포는 CO2 인큐베이터(37℃, 8%CO2, 90 rpm) 중에서 5일간 배양되었다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용한 당업자 공지의 방법에 따라, 상기와 같이 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용하여 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(8-3) 6RL#9 항체로부터의 Fab 프래그먼트의 정제
분자량 분획 사이즈 10000MWCO의 한외여과막을 사용하여 6RL#9 항체가 21 ㎎/mL까지 농축되었다. L-Cystein 4 mM, EDTA 5 mM, 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)을 사용하여 5 ㎎/mL에 의해 희석된 2.5 mL의 당해 항체의 시료가 조제되었다. 0.125 ㎎의 Papain(Roche Applied Science)을 첨가하여 교반된 당해 시료가 35℃에서 2시간 정치되었다. 정치 후, 프로테아제 인히비터 칵테일 미니, EDTA 프리(Roche Applied Science) 1정을 녹인 10 mL의 25 mM MES 완충액(pH 6)을 추가로 당해 시료에 첨가하고, 얼음 속에 정치함으로써, Papain에 의한 프로테아제 반응이 정지되었다. 다음으로, 당해 시료가, 하류에 1 mL 사이즈의 ProteinA 담체 칼럼 HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)가 직렬로 연결된 25 mM MES 완충액 pH 6으로 평형화된 1 mL 사이즈의 양이온 교환 칼럼 HiTrap SP HP(GE Healthcare)에 첨가되었다. 동 완충액 중 NaCl 농도를 300 mM까지 직선적으로 올려 용출을 행함으로써 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 정제 분획이 얻어졌다. 다음으로, 얻어진 정제 분획이 5000MWCO의 한외여과막에 의해 0.8 mL 정도까지 농축되었다. 50 mM NaCl을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 8)으로 평형화된 겔여과 칼럼 Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)에 농축액이 첨가되었다. 결정화용 정제 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트가 동 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용출되었다. 또한, 상기의 모든 칼럼조작은 6~7.5℃의 저온하에서 실시되었다.
(8-4) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정화
사전에 일반적인 조건 설정으로 6RL#9 Fab 프래그먼트의 종결정이 얻어졌다. 다음으로 5 mM가 되도록 CaCl2가 첨가된 정제 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트가 5000MWCO의 한외여과막을 사용하여 12 ㎎/mL로 농축되었다. 다음으로, 행잉 드롭 증기 확산법으로, 상기와 같이 농축된 시료의 결정화가 실시되었다. 리저버 용액(reservoir solution)으로서 20-29%의 PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)이 사용되었다. 커버글래스 상에서 0.8 ㎕의 리저버 용액 및 0.8 ㎕의 상기 농축시료의 혼합액에 대해, 29% PEG4000 및 5 mM CaCl2를 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5) 중에서 파쇄된 상기 종결정이 100-10000배로 희석된 희석계열의 용액 0.2 ㎕를 첨가함으로써 결정화 드롭이 조제되었다. 당해 결정화 드롭을 20℃에 2일 내지 3일 정치함으로써 얻어진 얇은 판상 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다.
(8-5) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정화
정제 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트가 5000MWCO의 한외여과막을 사용하여 15 ㎎/㎖로 농축되었다. 다음으로, 행잉 드롭 증기 확산법으로, 상기와 같이 농축된 시료의 결정화가 실시되었다. 리저버 용액으로서 18-25%의 PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)이 사용되었다. 커버글래스 상에서 0.8 ㎕의 리저버 용액 및 0.8 ㎕의 상기 농축시료의 혼합액에 대해, 25% PEG4000을 포함하는 100 mM　HEPES 완충액(pH 7.5) 중에서 파쇄된 Ca 존재하에서 얻어진 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 결정이 100-10000배로 희석된 희석계열의 용액 0.2 ㎕를 첨가함으로써 결정화 드롭이 조제되었다. 당해 결정화 드롭을 20℃에 2일 내지 3일 정치함으로써 얻어진 얇은 판상 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다.
(8-6) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 측정
35% PEG4000 및 5 mM CaCl2를 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)의 용액에 침지된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서 얻어진 단결정 하나를, 미소한 나일론 루프가 부착된 핀을 사용하여 외액째로 떠냄으로써, 당해 단결정이 액체질소 중에서 동결되었다. 고에너지 가속기 연구기구의 방사광 시설 포톤 팩토리의 빔라인 BL-17A를 사용하여, 상기 동결 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다. 또한, 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 동결 결정을 둠으로써 동결상태가 유지되었다. 빔라인에 비치된 CCD 디텍터 Quantum315r(ADSC)을 사용하여, 결정을 1°씩 회전시키면서 토탈 180매의 회절 화상이 수집되었다. 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여, 및 회절 데이터의 처리가 프로그램 Xia2(CCP4 Software Suite), XDS Package(Walfgang Kabsch) 및 Scala(CCP4 Software Suite)에 의해 행해졌다. 최종적으로 분해능 2.2Å까지의 회절강도 데이터가 얻어졌다. 본 결정은 공간군 P212121에 속하고, 격자상수 a＝45.47Å, b＝79.86Å, c＝116.25Å, α＝90°, β＝90°, γ＝90°였다.
(8-7) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 측정
35% PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)의 용액에 침지된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서 얻어진 단결정 하나를, 미소한 나일론 루프가 부착된 핀을 사용하여 외액째로 떠냄으로써, 당해 단결정이 액체질소 중에서 동결되었다. 고에너지 가속기 연구기구의 방사광 시설 포톤 팩토리의 빔라인 BL-17A를 사용하여, 상기 동결 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다. 또한, 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 동결 결정을 둠으로써 동결상태가 유지되었다. 빔라인에 비치된 CCD 디텍터 Quantum210r(ADSC)을 사용하여, 결정을 1°씩 회전시키면서 토탈 180매의 회절 화상이 수집되었다. 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여, 및 회절 데이터의 처리가 프로그램 Xia2(CCP4 Software Suite), XDS Package(Walfgang Kabsch) 및 Scala(CCP4 Software Suite)에 의해 행해졌다. 최종적으로 분해능 2.3Å까지의 회절강도 데이터가 얻어졌다. 본 결정은 공간군 P212121에 속하고, 격자상수 a＝45.40Å, b＝79.63Å, c＝116.07Å, α＝90°, β＝90°, γ＝90°로, Ca 존재하의 결정과 동형이었다.
(8-8) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 구조해석
프로그램 Phaser(CCP4 Software Suite)를 사용한 분자 치환법에 의해, 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 구조가 결정되었다. 얻어진 결정격자의 크기와 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 분자량으로부터, 비대칭 단위 중의 분자 수가 1개라고 예상되었다. 1차 서열 상의 상동성을 토대로 PDB code: 1ZA6의 구조좌표로부터 취출된 A쇄 112-220번 및 B쇄 116-218번의 아미노산 잔기 부분이, CL 및 CH1 영역의 탐색용 모델 분자가 되었다. 다음으로 PDB code: 1ZA6의 구조좌표로부터 취출된 B쇄 1-115번의 아미노산 잔기 부분이, VH 영역의 탐색용 모델 분자가 되었다. 마지막으로 PDB code 2A9M의 구조좌표로부터 취출된 경쇄 3-147번의 아미노산 잔기가, VL 영역의 탐색용 모델 분자가 되었다. 이 순번에 따라 각 탐색용 모델 분자의 결정 격자 내에서의 방향과 위치를 회전 함수 및 병진 함수로부터 결정함으로써, 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 초기 구조 모델이 얻어졌다. 당해 초기 구조 모델에 대해 VH, VL, CH1, CL의 각 도메인을 움직이는 강체 정밀화를 행함으로써, 25-3.0Å의 반사 데이터에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 46.9%, Free R값은 48.6%가 되었다. 또한 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 위상을 사용하여 계산된 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 참조하면서 모델 수정을 반복하여 프로그램 Coot(Paul Emsley) 상에서 행함으로써 모델의 정밀화가 행해졌다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 토대로 Ca 이온 및 물분자를 모델에 삽입함으로써, 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용하여 정밀화가 행해졌다. 분해능 25-2.2Å의 21020개의 반사 데이터를 사용함으로써, 최종적으로 3440 원자의 모델에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 20.0%, Free R값은 27.9%가 되었다.
(8-9) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 측정
6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정의 구조는, 동형인 Ca 존재하 결정의 구조를 사용해서 결정되었다. 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 구조좌표로부터 물분자와 Ca 이온 분자가 제외되고, VH, VL, CH1, CL의 각 도메인을 움직이는 강체 정밀화가 행해졌다. 25-3.0Å의 반사 데이터에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 30.3%, Free R값은 31.7%가 되었다. 또한 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 위상을 사용하여 계산된 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 참조하면서 모델을 수정을 반복하여 프로그램 Coot(Paul Emsley) 상에서 행함으로써 모델의 정밀화가 행해졌다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 토대로 물분자를 모델에 삽입함으로써, 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용하여 정밀화가 행해졌다. 분해능 25-2.3Å의 18357개의 반사 데이터를 사용함으로써, 최종적으로 3351 원자의 모델에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 20.9%, Free R값은 27.7%가 되었다.
(8-10) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재 또는 비존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 비교
6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정 및 Ca 비존재하에서의 결정의 구조를 비교하자, 중쇄 CDR3에 커다란 변화가 보였다. X선 결정구조 해석으로 결정된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 중쇄 CDR3의 구조를 도 14에 나타내었다. 구체적으로는, Ca 존재하에서의 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 결정에서는, 중쇄 CDR3 루프 부분의 중심 부분에 칼슘 이온이 존재하고 있었다. 칼슘 이온은, 중쇄 CDR3의 95번 위치, 96번 위치 및 100a번 위치(Kabat 넘버링)와 상호작용하고 있는 것으로 생각되었다. Ca 존재하에서는, 항원과의 결합에 중요한 중쇄 CDR3 루프가 칼슘과 결합함으로써 안정화되어, 항원과의 결합에 최적인 구조로 되어 있는 것이 생각되었다. 항체의 중쇄 CDR3에 칼슘이 결합하는 예는 지금까지 보고되어 있지 않아, 항체의 중쇄 CDR3에 칼슘이 결합한 구조는 신규한 구조이다. 중쇄 CDR3는 항원과의 결합에 가장 중요한 것이 알려져 있어, 중쇄 CDR3의 구조 유지에 칼슘 이온이 필요해져 있는 본 실시예에서 발견된 모티브는, 항원으로의 결합에 칼슘 이온이 중요한 역할을 하고 있다고 생각된다. 즉, 본 모티브를 갖는 항체는 칼슘 이온 의존적으로 항원에 대한 결합을 가질 가능성이 매우 높은 것으로 생각되어, 예를 들면 본 모티브를 갖는 합성 라이브러리를 제작할 수 있다면, 그러한 라이브러리로부터 효율적으로 칼슘 의존적 결합 항체를 취득하는 것이 가능하다고 생각되었다.
〔실시예 9〕파지 디스플레이 기술을 이용한 인간 항체 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 IL-6에 결합하는 항체의 취득
(9-1) 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제작
인간 PBMC로부터 제작한 폴리A RNA나, 시판되고 있는 인간 폴리A RNA 등을 주형으로 하여 당업자에게 공지의 방법에 따라, 서로 상이한 인간 항체 서열의 Fab 도메인을 제시하는 복수의 파지로 이루어지는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.
(9-2) 비드 패닝에 의한 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체 단편의 취득
구축된 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 최초의 선발은, 항원(IL-6)으로의 결합능을 갖는 항체 단편만의 농축에 의해 실시되었다. 항원으로서 비오틴 표지된 IL-6이 사용되었다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행해졌다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10%PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로, 파지 라이브러리액에 종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl2가 첨가되었다. 패닝방법으로서, 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝 방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). 자기 비드로서, NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.
구체적으로는, 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써, 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1.2 mM CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2를 포함하는 TBST)로 3회 세정된 후, 1 mL의 1.2 mM CaCl2/TBS(1.2 mM CaCl2를 포함하는 TBS)로 추가로 2회 세정되었다. 그 후, 0.5 mL의 1 ㎎/mL의 트립신이 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉석에서 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고, 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이, 대수증식기(OD600이 0.4-0.5)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써, 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은, 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로, 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써, 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 이후의 패닝에서는, Ca 의존적 결합능을 지표로 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써, 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl2/TBST와 1.2 mM CaCl2/TBS로 세정되었다. 그 후 0.1 mL의 2 mM EDTA/TBS가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 즉석에서 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고, 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써, Fab를 제시하지 않는 파지의 pIII 단백질(헬퍼파지 유래의 pIII 단백질)이 절단되어, Fab를 제시하지 않는 파지의 대장균에 대한 감염능을 상실시켰다. 트립신 처리된 파지용액으로부터 회수된 파지가, 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써, 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로, 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다. Ca 의존적 결합능을 지표로 하는 패닝이 3회 반복되었다.
(9-3) 파지 ELISA에 의한 평가
상기 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터, 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라, 파지 함유 배양상청이 회수되었다. 종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl2가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 이하의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 PBS로 하룻밤 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 4%BSA-TBS로 블로킹되었다. 4%BSA-TBS가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써, 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 1.2 mM CaCl2/TBST로 세정된 각 웰에, 1.2 mM CaCl2/TBS 또는 1 mM EDTA/TBS가 첨가되고, 당해 플레이트는 37℃에서 30분간 정치하고 인큐베이트되었다. 1.2 mM CaCl2/TBST로 세정된 후에, 종농도 4%의 BSA 및 1.2 mM의 이온화 칼슘 농도로 한 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 각 웰에 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 1.2 mM CaCl2/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이, 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
단리된 96 클론을 사용하여 파지 ELISA를 행함으로써, IL-6에 대한 Ca 의존적인 결합능을 갖는 6KC4-1#85 항체, 6LC4-1#15 항체 및 6LC4-2#16 항체가 얻어졌다. 상기의 파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단되는 항체 단편을 주형으로 하여 특이적인 프라이머에 의해 증폭된 유전자의 염기서열 해석이 행해졌다. 6KC4-1#85 항체의 중쇄 가변영역의 서열을 서열번호：25에, 및 경쇄 가변영역의 서열을 서열번호：26에 기재하였다. 6KC4-1#85 항체의 중쇄 가변영역(서열번호：25)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 IgG1 유래 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드(서열번호：65)와 연결된 DNA 단편이, 동물세포 발현용 벡터에 삽입되어, 서열번호：27로 표시되는 중쇄를 발현하는 벡터가 구축되었다. 6KC4-1#85 항체의 경쇄 가변영역(서열번호：26)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 천연형 Kappa쇄의 정상영역(서열번호：28)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 서열번호：29로 표시된 서열을 코드하는 DNA 단편이, 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 동일한 방법으로, 6LC4-1#15 항체(중쇄 서열번호 68, 경쇄 서열번호 69) 및 6LC4-2#16 항체(중쇄 서열번호 70, 경쇄 서열번호 71)가 세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다.
(9-4) 항체의 발현과 정제
파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단된 클론이, 동물세포 발현용 플라스미드로 도입되었다. 항체의 발현은 이하의 방법을 사용하여 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되어, 1.33×106 세포/mL의 세포밀도로 6웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는, 리포펙션법에 의해 세포로 도입되었다. CO2 인큐베이터(37도, 8%CO2, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해져다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법을 사용해서, 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써, 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(9-5) 칼슘 의존적 항IL6 항체의 결합 평가
취득된 항체를, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 7.4에서 인간 인터류킨 6(hIL6) 결합 활성(해리상수 KD(M))에 관하여 평가하였다. 런닝 버퍼로서 3 μM 또는 1.2 mM　CaCl2를 함유하는 0.05% Tween20, 10 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl(pH 7.4)을 사용해서 측정을 행하였다.
Sensor chip CM5(GE Healthcare) 상에 아미노 커플링법으로 재조합형 프로테인 A/G(Thermo Scientific)를 적당량 고정화한 후, 항체를 결합시켰다. 애널라이트로서 적절한 농도의 hIL6(인간 인터류킨 6, 가마쿠라 테크노사이언스)을 인젝트하고, 센서칩 상의 항체와 상호작용시켰다. 그 후, 10 mmol/L Glycine-HCl(pH 1.5)을 인젝트하고, 센서칩을 재생하였다. 측정은 37℃에서 행하였다. 측정 결과, 얻어진 센서그램을 도 15에 나타내었다. 이들 결과로부터, 6LC4-1#15-IgG1 및 6LC4-2#16-IgG1, 6KC4-1#85-IgG1 항체는 Ca2+ 농도가 3 μM인 조건하에서는, Ca2+ 농도가 1.2 mM인 조건하의 경우와 비교하여, hIL6에 대한 결합이 약한 것이 명확하게 나타내어졌다. 상기 결과는, 칼슘 의존적인 항원 결합이라는 성질이 실시예 3에 나타난 IL-6R 뿐 아니라 IL-6에서도 나타난 것으로부터, 다른 항원에 대해서도 적용 가능한 것을 나타내고 있다.
〔실시예 10〕6KC4-1#85 항체의 칼슘 이온 결합 평가
(10-1) 6KC4-1#85 항체의 칼슘 이온 결합 평가
인간 항체 라이브러리로부터 취득된 칼슘 의존적 항원 결합 항체 6KC4-1#85 항체가 칼슘과 결합하는지 평가되었다. 이온화 칼슘 농도가 상이한 조건으로, 측정되는 Tm값이 변동되는지 여부가 실시예 4에 기재된 방법으로 평가되었다.
6KC4-1#85 항체의 Fab 도메인의 Tm값을 표 11에 나타내었다. 표 11에 나타내어져 있는 바와 같이, 6KC4-1#85 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 칼슘 이온의 농도에 따라 변동되고 있는 것으로부터, 6KC4-1#85 항체가 칼슘과 결합하는 것이 명확해졌다.
Figure pat00018
(10-2) 6KC4-1#85 항체의 칼슘 이온 결합 부위의 동정
실시예 10의 (10-1)에서 6KC4-1#85 항체는 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌으나, 6KC4-1#85는 후술되는 hVk5-2 서열과 같은 칼슘 결합 모티브를 갖지 않는다. 이에, 칼슘 이온이 6KC4-1#85 항체의 어느 잔기와 칼슘 이온이 결합해 있는지 동정하기 위해, 6KC4-1#85 항체의 CDR에 존재하는 Asp(D) 잔기를 칼슘 이온의 결합 또는 킬레이트에 관여할 수 없는 Ala(A) 잔기로 치환한 개변 중쇄(6_H1-11(서열번호：30), 6_H1-12(서열번호：31), 6_H1-13(서열번호：32), 6_H1-14(서열번호：33), 6_H1-15(서열번호：34)) 및 개변 경쇄(6_L1-5(서열번호：35) 및 6_L1-6(서열번호：36))가 제작되었다. 개변 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 동물세포의 배양액으로부터, 개변 항체가 실시예 2에 기재된 방법에 따라 정제되었다. 정제된 개변 항체의 칼슘 결합이, 실시예 4에 기재된 방법에 따라 측정되었다. 측정된 결과를 표 12에 나타내었다.
Figure pat00019
표 12에 나타내어져 있는 바와 같이, 6KC4-1#85 항체의 중쇄 CDR3의 95번 위치 또는 101번 위치(Kabat 넘버링)를 Ala 잔기로 치환함으로써 6KC4-1#85 항체의 칼슘 결합능이 상실되는 것으로부터, 이 잔기가 칼슘과의 결합에 중요하다고 생각된다. 6KC4-1#85 항체의 개변 항체의 칼슘 결합성으로부터 명확해진 6KC4-1#85 항체의 중쇄 CDR3의 루프 부착 밑둥 부근에 존재하는 칼슘 결합 모티브도, 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 항원 결합 도메인에 있어서의 칼슘 결합 모티브로서 사용될 수 있는 것이 명확해졌다. 본 모티브는 실시예 8에서 발견된 모티브와 마찬가지로 중쇄 CDR3의 칼슘 결합 모티브인 것으로부터, 동일하게 예를 들면 본 모티브를 갖는 합성 라이브러리를 제작할 수 있다면, 그러한 라이브러리로부터 효율적으로 칼슘 의존적 결합 항체를 취득하는 것이 가능하다고 생각되었다.
〔실시예 11〕 칼슘 이온에 결합하는 인간 생식세포 계열 서열의 탐색
(11-1) 인간 생식세포 계열 서열의 취득
인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체에서 칼슘 이온이 결합하는 것은 지금까지 보고되어 있지 않다. 이에, 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부를 판정하기 위해, Human Fetal Spreen Poly RNA(Clontech)로부터 조제된 cDNA를 주형으로 하여 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체의 생식세포 계열의 서열이 클로닝되었다. 클로닝된 DNA 단편은 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열을 당업자 공지의 방법으로 결정하고, 그 서열번호를 표 13에 나타내었다. 서열번호：37(Vk1), 서열번호：38(Vk2), 서열번호：39(Vk3), 서열번호：40(Vk4) 및 서열번호：41(Vk5)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 천연형 Kappa쇄의 정상영역(서열번호：28)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이, 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 또한, 서열번호：42(Vk1), 서열번호：43(Vk2), 서열번호：44(Vk3), 서열번호：45(Vk4) 및 서열번호：46(Vk5)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 IgG1의 C 말단 2 아미노산이 결실된 폴리펩티드(서열번호：65)를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이, 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다.
Figure pat00020
(11-2) 항체의 발현과 정제
취득된 5종류의 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 DNA 단편이 삽입된 동물세포 발현 벡터가 동물세포로 도입되었다. 항체의 발현은 이하의 방법을 사용해서 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되어, 1.33×106 세포/mL의 세포밀도로 6 웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는, 리포펙션법에 의해 세포로 도입되었다. CO2 인큐베이터(37도, 8%CO2, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법을 사용해서, 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써, 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(11-3) 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가
정제된 항체의 칼슘 이온 결합 활성이 평가되었다. 정제된 항체가 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2(pH 7.4) 또는 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl2(pH 7.4)의 용액을 외액으로 하는 투석(EasySEP, TOMY) 처리에 제공되었다. 투석에 사용된 용액을 사용하여 대략 0.1 ㎎/mL로 조제된 항체용액을 피험물질로 하여, 20℃~115℃까지 240℃/hr의 승온속도로 DSC 측정이 행해졌다. 얻어진 DSC의 변성곡선을 토대로 산출된 각 항체의 Fab 도메인의 열변성 중간온도(Tm값)를 표 14에 나타내었다.
Figure pat00021
그 결과, hVk1, hVk2, hVk3, hVk4 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은, 당해 Fab 도메인을 포함하는 용액 중의 칼슘 이온의 농도에 상관없이 변동되지 않았다. 한편으로, hVk5 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은, 당해 Fab 도메인을 포함하는 항체 용액 중의 칼슘 이온의 농도에 따라 변동된 것으로부터, hVk5 서열이 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 12〕인간 Vk5(hVk5) 서열의 평가
(12-1) hVk5 서열
Kabat 데이터 베이스 중에는, hVk5 서열로서 hVk5-2 서열만이 등록되어 있다. 이하에서는, hVk5와 hVk5-2는 동일한 정의로 취급된다.
(12-2) 당쇄 비부가형 hVk5-2 서열의 구축, 발현 및 정제
hVk5-2 서열은 20번 위치(Kabat 넘버링)의 아미노산에 N형 당쇄가 부가되는 서열을 갖는다. 단백질에 부가하는 당쇄에는 이질 성분(heterogeneity)이 존재하기 때문에, 물질의 균일성의 관점에서 당쇄는 부가되지 않는 편이 바람직하다. 이에, 20번 위치(Kabat 넘버링)의 Asn(N) 잔기가 Thr(T) 잔기로 치환된 개변체 hVk5-2_L65(서열번호：47)가 제작되었다. 아미노산의 치환은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하는 당업자 공지의 방법으로 행해졌다. 개변체 hVk5-2_L65를 코드하는 DNA가 동물 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체 hVk5-2_L65의 DNA가 삽입된 동물 발현용 벡터는, 중쇄로서 CIM_H(서열번호：48)가 발현되도록 삽입된 동물 발현용의 벡터와, 실시예 2에서 기재한 방법으로 함께 동물세포 중에 도입되었다. 도입된 동물세포 중에서 발현된 hVk5-2_L65 및 CIM_H를 포함하는 항체가, 실시예 2에서 기재한 방법으로 정제되었다.
(12-3) 당쇄 비부가형 hVk5-2 서열을 포함하는 항체의 물성 평가
취득된 개변 서열 hVk5-2_L65를 포함하는 항체가, 개변에 제공된 원래의 hVk5-2 서열을 포함하는 항체보다도, 그 이질성(heterogeneity)이 감소되어 있는지 여부가, 이온 교환 크로마토그래피를 사용해서 분석되었다. 이온 교환 크로마토그래피의 방법을 표 15에 나타내었다. 분석 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 당쇄 부가 부위가 개변된 hVk5-2_L65는, 원래의 hVk5-2 서열보다도 이질성(heterogeneity)이 감소되어 있는 것이 나타내어졌다.
Figure pat00022
다음으로, 이질성(heterogeneity)이 감소된 hVk5-2_L65 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가, 실시예 4에 기재된 방법을 사용해서 평가되었다. 그 결과, 표 16에 나타낸 바와 같이, 당쇄 부가 부위가 개변된 hVk5-2_L65를 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값도, 항체용액 중의 칼슘 이온의 농도 변화에 따라 변동되었다. 즉, 당쇄 부가 부위가 개변된 hVk5-2_L65를 포함하는 항체의 Fab 도메인에 칼슘 이온이 결합하는 것이 나타내어졌다.
Figure pat00023
〔실시예 13〕hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 항체 분자에 대한 칼슘 이온의 결합 활성의 평가
(13-1) hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 개변 항체의 제작, 발현 및 정제
hVk5-2_L65 서열은 인간 Vk5-2 서열의 프레임워크에 존재하는 당쇄 부가 부위의 아미노산이 개변된 서열이다. 실시예 12에서 당쇄 부가 부위를 개변해도 칼슘 이온이 결합하는 것이 나타내어졌으나, 프레임워크 서열은 생식세포 계열의 서열인 것이 면역원성의 관점에서 일반적으로는 바람직하다. 이에, 항체의 프레임워크 서열을, 당해 항체에 대한 칼슘 이온의 결합 활성을 유지하면서, 당쇄가 부가되지 않는 생식세포 계열 서열의 프레임워크 서열로 치환하는 것이 가능한지 여부가 검토되었다.
화학 합성된 hVk5-2 서열의 프레임워크 서열이 hVk1, hVk2, hVk3 및 hVk4 서열로 개변된 서열(각각 CaVk1(서열번호：49), CaVk2(서열번호：50), CaVk3(서열번호：51), CaVk4(서열번호：52)를 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 천연형 Kappa쇄의 정상영역(서열번호：28)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이, 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다. 상기와 같이 제작된 각 플라스미드는, CIM_H(서열번호：48)를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 플라스미드와 함께 실시예 2에서 기재된 방법으로 동물세포에 도입되었다. 상기와 같이 도입된 동물세포의 배양액으로부터, 발현된 목적하는 항체 분자가 정제되었다.
(13-2) hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 개변 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가
hVk5-2 서열 이외의 생식세포 계열 서열(hVk1, hVk2, hVk3, hVk4)의 프레임워크 서열 및 hVK5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 개변 항체에, 칼슘 이온이 결합하는지 여부가 실시예 4에 기재된 방법으로 평가되었다. 평가된 결과를 표 17에 나타내었다. 각 개변 항체의 Fab 도메인의 Tm값은, 항체용액 중의 칼슘 이온 농도의 변화에 따라 변동되는 것이 나타내어졌다. 따라서, hVk5-2 서열의 프레임워크 서열 이외의 프레임워크 서열을 포함하는 항체도 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다. 즉, hVk5-2 서열의 CDR 서열이 갖는 모티브가 칼슘 이온과의 결합에 중요한 것이 나타내어져, 프레임워크 서열은 임의의 프레임워크여도 되는 것이 확인되었다.
Figure pat00024
또한, hVk5-2 서열 이외의 생식세포 계열 서열(hVk1, hVk2, hVk3, hVk4)의 프레임워크 서열 및 hVK5-2 서열의 CDR 서열을 포함하도록 개변된 각 항체의 Fab 도메인의 열안정성의 지표인 열변성 온도(Tm값)는, 개변에 제공된 원래의 hVk5-2 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값보다도 증가하는 것이 명확해졌다. 이 결과로부터, hVk1, hVk2, hVk3, hVk4의 프레임워크 서열 및 hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 항체는 칼슘 이온과 결합하는 성질을 가질 뿐 아니라, 열안정성의 관점에서도 우수한 분자인 것이 발견되었다.
〔실시예 14〕인간 생식세포 계열 hVk5-2 서열에 존재하는 칼슘 이온 결합 부위의 동정
(14-1) hVk5-2 서열의 CDR 서열 중의 변이 부위의 설계
실시예 13에 기재되어 있는 바와 같이, hVk5-2 서열의 CDR 부분이 다른 생식세포 계열의 프레임워크 서열에 도입된 경쇄를 포함하는 항체도 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다. 이 결과로부터 hVk5-2에 존재하는 칼슘 이온 결합 부위는 CDR 중에 존재하는 것이 시사되었다. 칼슘 이온과 결합하는, 즉, 칼슘 이온을 킬레이트하는 아미노산으로서, 음전하의 아미노산 또는 수소 결합의 액셉터가 될 수 있는 아미노산을 들 수 있다. 거기서, hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에 존재하는 Asp(D) 잔기 또는 Glu(E) 잔기가 Ala(A) 잔기로 치환된 변이 hVk5-2 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 평가되었다.
(14-2) hVk5-2 서열의 Ala 치환체의 제작 및 항체의 발현 및 정제
hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에 존재하는 Asp 및/또는 Glu 잔기가 Ala 잔기로 개변된 경쇄를 포함하는 항체 분자가 제작되었다. 실시예 12에서 기재되는 바와 같이, 당쇄가 부가되지 않는 개변체 hVk5-2_L65는 칼슘 이온 결합을 유지하고 있었던 것으로부터, 칼슘 이온 결합성이라는 관점에서는 hVk5-2 서열과 동등하다고 생각된다. 본 실시예에서는 hVk5-2_L65를 템플레이트 서열로 하여 아미노산 치환이 행해졌다. 제작된 개변체를 표 18에 나타내었다. 아미노산의 치환은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene), PCR 또는 In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA) 등의 당업자 공지의 방법에 의해 행해져, 아미노산이 치환된 개변 경쇄의 발현 벡터가 구축되었다.
Figure pat00025
얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정되었다. 제작된 개변 경쇄의 발현 벡터를 중쇄 CIM_H(서열번호：48)의 발현 벡터와 함께, 인간 태아 신장 암세포 유래 HEK293H주(Invitrogen), 또는 FreeStyle293세포(Invitrogen)에 일과성으로 도입함으로써, 항체를 발현시켰다. 얻어진 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로, 항체가 정제되었다. 정제된 항체용액의 280 nm에서의 흡광도가, 분광광도계를 사용하여 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써, 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(14-3) hVk5-2 서열의 Ala 치환체를 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성 평가
얻어진 정제 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 판정되었다. 구체적으로는, 정제된 항체가 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2(pH 7.5) 또는 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl(pH 7.5)의 용액(표 19에서는 칼슘 이온 농도 0 μM로 표기)을 외액으로 하는 투석(EasySEP, TOMY) 처리에 제공되었다. 투석에 사용된 용액을 사용하여 대략 0.1 ㎎/mL로 조제된 항체용액을 피험물질로 하여, 20℃부터 115℃까지 240℃/hr의 승온속도로 DSC 측정이 행해졌다. 얻어진 DSC의 변성곡선을 토대로 산출된 각 항체의 Fab 도메인의 열변성 중간온도(Tm값)가 표 19에 나타내어져 있다. hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에 존재하는 Asp 또는 Glu 잔기를 칼슘 이온의 결합 또는 킬레이트에 관여할 수 없는 Ala 잔기로 치환함으로써, 항체용액의 칼슘 이온 농도의 변화에 따라 그 Fab 도메인의 Tm값이 변동되지 않는 항체가 존재하였다. Ala 치환에 의해 Tm값이 변동되지 않는 치환 부위(32번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링))는 칼슘 이온과 항체의 결합에 특히 중요한 것이 나타내어졌다.
Figure pat00026
〔실시예 15〕 칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 hVk1 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가
(15-1) 칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 hVk1 서열의 제작 및 항체의 발현 및 정제
실시예 14에서 기재된 Ala 치환체의 칼슘의 결합 활성의 결과로부터, hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에서 Asp나 Glu 잔기가 칼슘 결합에 중요한 것이 나타내어졌다. 이에, 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기만을 다른 생식세포 계열의 가변영역 서열에 도입해도 칼슘 이온과 결합할 수 있는지 여부가 평가되었다. 구체적으로는, 인간 생식세포계 서열인 hVk1 서열의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기가 hVk5-2 서열의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기로 치환된 개변체 LfVk1_Ca(서열번호：61)가 제작되었다. 즉, hVk5-2 서열 중의 이들의 5 잔기만이 도입된 hVk1 서열을 포함하는 항체가 칼슘과 결합할 수 있는지 여부가 판정되었다. 개변체의 제작은 실시예 2와 동일하게 행해졌다. 얻어진 경쇄 개변체 LfVk1_Ca 및 경쇄 hVk1 서열을 포함하는 LfVk1(서열번호：62)을, 중쇄 CIM_H(서열번호：48)와 함께 발현시켰다. 항체의 발현 및 정제는 실시예 14와 동일한 방법으로 실시되었다.
(15-2) 칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 인간 hVk1 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가
상기와 같이 얻어진 정제 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 실시예 4에 기재된 방법으로 판정되었다. 그 결과를 표 20에 나타내었다. hVk1 서열을 갖는 LfVk1을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 항체용액 중의 칼슘의 농도 변화에 따라서는 변동되지 않는 한편으로, LfVk1_Ca를 포함하는 항체 서열의 Tm값은, 항체용액 중의 칼슘의 농도 변화에 따라 1℃ 이상 변화된 것으로부터, LfVk1_Ca를 포함하는 항체가 칼슘과 결합하는 것이 나타내어졌다. 상기의 결과로부터, 칼슘 이온의 결합에는, hVk5-2의 CDR 서열이 모두 필요하지 않고, LfVk1_Ca 서열을 구축할 때 도입된 잔기만으로도 충분한 것이 나타내어졌다.
Figure pat00027
(15-3) 분해 억제형 LfVk1_Ca 서열의 구축, 발현 및 정제
실시예 15의 (15-2)에서 인간 생식세포계 서열인 hVk1 서열의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기가 hVk5-2 서열의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기로 치환된 개변체 LfVk1-Ca(서열번호：61)가 제작되어, 칼슘 이온이 결합하는 것이 나타내어졌다. 이에, LfVk1_Ca 서열을 포함하는 Ca 의존성 항체(Ca 결합 항체)를 생각할 수 있으나, 신규 서열인 LfVk1_Ca 서열의 의약품으로서의 보존 안정성은 불명확한 것으로부터, 그의 의약품으로서의 응용 가능성은 불명확하다. 이에, LfVk1_Ca의 열가속시험에 의해 안정성을 평가하였다. LfVk1_Ca를 L쇄에 갖는 항체를 20 mM Histidine-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0의 용액에 하룻밤 4℃의 조건에서 투석하였다. 투석된 항체는 0.5 ㎎/mL로 조제되어, 5℃ 또는 50℃에서 3일간 보존되었다. 보존 후의 각 항체를 실시예 12에 기재된 방법으로 이온 교환 크로마토그래피가 행해졌다. 그 결과, 도 17에 나타내는 바와 같이, LfVk1_Ca는 50℃에서 3일간 보존으로 현저히 분해되는 것이 확인되었다. LfVk1_Ca 서열은, 30번 위치, 31번 위치 및 32번 위치(Kabat 넘버링)에 Asp가 존재하여, 산성 조건하에서 분해하는 것이 보고되어 있는 Asp-Asp 서열이 CDR1 서열 중에 존재하기 때문에(J. Pharm. Biomed. Anal. (2008) 47(1), 23-30), 30번 위치, 31번 위치 및 32번 위치(Kabat 넘버링)가 분해 개소일 가능성이 생각되었다. 이에, LfVk1_Ca의 분해를 회피하기 위해, 분해될 가능성이 있는 3개소의 Asp(D) 잔기가 Ala(A) 잔기로 치환된 개변체 LfVk1_Ca1(서열번호：72), LfVk1_Ca2(서열번호：73) 및 LfVk1_Ca3(서열번호：74)가 제작되었다. 아미노산의 치환은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하는 당업자 공지의 방법으로 행해졌다. 개변체를 코드하는 DNA가 동물 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 DNA가 삽입된 동물 발현용 벡터는, 중쇄로서 G CH(서열번호：102)가 발현되도록 삽입된 동물 발현용 벡터와, 실시예 14에서 기재한 방법으로 함께 동물세포 중에 도입되었다. 도입된 동물세포 중에서 발현된 항체가, 실시예 14에서 기재한 방법으로 정제되었다.
(15-4) 분해 억제형 LfVk1_Ca 서열을 포함하는 항체의 안정성 평가
실시예 15의 (15-3)에서 취득된 항체가, 개변에 제공된 원래의 LfVk1_Ca 서열을 포함하는 항체보다도, pH 6.0 용액 중에서의 분해가 억제되어 있는지 여부가 열가속 후의 각 항체의 이질성(heterogeneity)의 비교에 의해 평가되었다. 전술한 것과 마찬가지로 항체는 5℃ 또는 50℃에서 3일간 보존되었다. 보존 후의 각 항체를 실시예 12에 기재된 방법으로 이온 교환 크로마토그래피가 행해졌다. 분석의 결과, 도 17에 나타내어지는 바와 같이 30번째(Kabat 넘버링) 부위가 개변된 LfVk1_Ca1은, 원래의 LfVk1_Ca 서열보다도 이질성(heterogeneity)이 적어, 열가속에 의한 분해가 현저히 억제되어 있는 것이 나타내어졌다. 즉, LfVk1_Ca 서열 중의 30번 위치에 존재하는 Asp(D) 잔기가 분해되는 것이 나타내어지고, 그리고 Asp 잔기의 분해는 아미노산 개변에 의해 회피할 수 있는 것이 나타내어졌다.
(15-5) 경쇄 30번 위치 Asp 잔기 분해 억제형 LfVk1_Ca 서열의 제작 및 항체의 발현 및 정제
실시예 15의 (15-4)에서 기재된 Ala 치환체의 분해 억제 결과로부터, LfVk1_Ca 서열의 CDR 서열 중에서 30번 위치(Kabat 넘버링)의 Asp(D) 잔기가 산성 조건에서 분해되어, 30번 위치(Kabat 넘버링)를 다른 아미노산((15-4)에서는, Ala(A) 잔기로 치환됨)으로 치환함으로써 억제할 수 있는 것이 나타내어졌다. 이에, 30번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기를 칼슘 이온을 킬레이트할 수 있는 잔기의 하나인 Ser(S) 잔기로 치환한 서열(LfVk1_Ca6라 부른다. 서열번호：75)로 하더라도, 칼슘 결합능을 유지하면서, 분해가 억제되는지 여부가 평가되었다. 개변체의 제작은 실시예 14와 동일하게 행해졌다. 얻어진 경쇄 개변체 LfVk1_Ca6 및 경쇄 LfVk1_Ca 서열을, 중쇄 GC_H(서열번호：102)와 함께 발현시켰다. 항체의 발현 및 정제는 실시예 14와 동일한 방법으로 실시되었다.
(15-6) 경쇄 30번 위치 Asp 잔기 분해 억제형 LfVk1_Ca 서열의 평가
상기와 같이 얻어진 정제 항체의 산성 조건하에 있어서의 보존 안정성이 실시예 15의 (15-4)에 기재된 방법으로 판정되었다. 그 결과, 도 18에 나타내는 바와 같이, LfVk1_Ca6 서열을 포함하는 항체는, 원래의 LfVk1_Ca 서열을 포함하는 항체보다도 분해가 억제되어 있는 것이 나타내어졌다.
또한, LfVk1_Ca 서열을 포함하는 항체 및 LfVk1_Ca6 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 실시예 15에 기재된 방법으로 판정되었다. 그 결과를 표 21에 나타낸다. LfVk1_Ca 서열을 포함하는 항체 및 분해 억제형인 LfVk1_Ca6 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은, 각각 항체용액 중의 칼슘의 농도 변화에 따라 1℃ 이상 변화되었다.
Figure pat00028
이상의 결과로부터, 안정성을 고려할 때, 30번 위치는 Asp 이외의 칼슘 이온과 상호작용이 가능한 아미노산(Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, His, Tyr 등)으로서, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 서열 모두 또는 일부가 hVk5-2의 아미노산, 또는, 칼슘과 상호작용 가능한 아미노산(Asp, Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, His, Tyr 등)인 것이, 항체로의 칼슘 이온의 결합에 중요한 것이 나타내어졌다. 예를 들면 이러한 모티브를 갖는 합성 라이브러리를 제작할 수 있다면, 그러한 라이브러리로부터 효율적으로 칼슘 의존적 결합 항체를 취득하는 것이 가능하다고 생각되었다.
〔실시예 16〕NMR에 의한 칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 인간 hVk1 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가
(16-1) 항체의 발현과 정제
NMR 측정에 사용하기 위해 발현시킨 LfVk1_Ca를 포함하는 항체와 LfVk1을 포함하는 항체가 정제되었다. 구체적으로는, LfVk1_Ca를 포함하는 항체는 중쇄(서열번호：13)와 경쇄(서열번호：61)를 각각 발현시킬 수 있도록 조제된 동물 발현용 플라스미드가 동물세포에 일과적으로 도입되었다. 또한, LfVk1을 포함하는 항체는 중쇄(서열번호：13)와 경쇄(서열번호：62)를 각각 발현시킬 수 있도록 조제된 동물 발현용 플라스미드가 동물세포에 일과적으로 도입되었다. 최종 세포밀도 1×106 세포/mL가 되도록 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)로 현탁된 100 mL의 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)의 세포 현탁액에, 표지 아미노산이 첨가되었다. 구체적으로는, Asp/Glu/Gln/Asn 표지체에 대해서는 L-Aspartic acid-13C4,15N(10 ㎎), L-Glutamic acid-13C5,15N(2.5 ㎎), L-Glutamine-13C5,15N2(60 ㎎), L-Asparagine-13C4,15N2·H2O(2.5 ㎎), β-chloro-L-alanine(6 ㎎)을 10 mL의 물에 현탁한 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과한 액을 첨가하였다. Leu 표지체에 대해서는, L-Leucine-15N(30 ㎎), β-chloro-L-alanine(6 ㎎)을 10 mL의 물에 현탁한 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과한 액을 첨가하였다. 리포펙션법에 의해 조제된 플라스미드가 세포에 도입되었다. 플라스미드가 도입된 세포는 CO2 인큐베이터(37℃, 8%CO2, 90 rpm) 중에서 5일간 배양되었다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용한 당업자 공지의 방법에 따라, 상기와 같이 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용하여 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(16-2) Fab 프래그먼트의 조제
분자량 분획 사이즈 30,000MWCO의 한외여과막을 사용하여, 각종 항체가 8.2-11.8 ㎎/mL까지 농축되었다. L-Cystein 1 mM, EDTA 2 mM, 50 mM 초산/125 mM 트리스 완충액(pH 6.8)을 사용하여 8 ㎎/mL로 희석된 당해 항체의 시료가 조제되었다. 각 항체에 대해 1/240 양의 Papain(Roche Applied Science)을 첨가하여 교반된 당해 시료가 37℃에서 1시간 정치되었다. 정치 후, 각각 하류에 1 mL 사이즈의 ProteinA 담체 칼럼 HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)가 직렬로 연결된 50 mM 초산/125 mM 트리스 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 Gly-Gly-Tyr-Arg(Sigma) 펩티드를 결합한 1 mL 사이즈의 HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)에 첨가되었다. 상류의 Gly-Gly-Tyr-Arg 펩티드에 의해 활성화 Papain을 제거하는 동시에, 하류의 ProteinA 담체 칼럼으로 Fc 프래그먼트 및 미소화 항체를 제거함으로써 Fab 프래그먼트의 정제 분획이 얻어졌다. Fab 분획에 포함되는 불활성 Papain이 활성화되는 것을 방지하기 위해, Fab 분획에는 시스테인 프로테아제 저해제 E64(Sigma)를 10 μM 첨가하였다. 또한, 상기 모든 칼럼 조작은 20~25℃의 실온하에서 실시되었다.
(16-3) LfVk1_Ca 항체 및 LfVk1 항체의 Fab 프래그먼트의 NMR 시료 조제
항체용액을 MWCO 5000의 한외여과기 Vivaspin(Sartorius)을 사용하여 0.5 mL까지 원심에 의해 농축하였다. 다음으로 상기 한외여과기에 디아필트레이션 컵(diafiltration cup)을 설치하여, NMR용 완충액：5 mM d-BisTris, 20 mM NaCl, 0.001 %(w/v) NaN3, 5 %(v/v) 2H2O, pH 7.0(NaOH, HCl을 사용하여 pH를 조제)으로 완충액 치환(다이아 필트레이션 컵에 상기 완충액을 5 mL 더하여 0.5 mL까지 원심 농축하는 것을 3회 반복)을 행하여, 마지막으로 0.25 mL까지 농축하였다. 마지막으로, NMR 완충액으로 한외여과기를 씻어, 농축액과 합하여 항체용액을 LfVk1_Ca 항체에 대해서는 420 μL, LfVk1 항체에 대해서는 270 μL로 하였다. 이 단계에서 재차, pH를 확인하고, 필요에 따라 NaOH, HCl에 의해 pH 7.0으로 조정하였다. UV 측정기 Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 280 nm에 있어서의 흡광도를 측정하고, 280 nm에 있어서의 몰 흡광계수를 70000 M-1·㎝-1로 하여 Fab 프래그먼트를 정량하였다. Leu 표지 LfVk1_Ca 항체, Leu 표지 LfVk1 항체는 0.12 mM, Asp, Glu, Asn, Gln 표지 LfVk1_Ca 항체, Asp, Glu, Asn, Gln 표지 LfVk1 항체는 0.24 mM가 되었다. 이들 시료 중, LfVk1_Ca 항체에 대해서는, 직경 5 ㎜의 NMR 시료관(shigemi)에, LfVk1 항체에 대해서는 직경 5 ㎜의 수용액용 대칭형 마이크로 시료관(shigemi)에 파스퇴르 피펫을 사용해서 충전하였다. LfVk1_Ca 항체의 Ca2+ 적정 실험에 있어서는, 항체용액에 항체에 대해, Ca2+가 1, 2, 5, 10, 20몰 등량이 되도록, CaCl2 용액을 순차, 첨가하였다. 첨가에 사용한 CaCl2 용액에는 NMR 버퍼에 용해한 10, 20, 50, 100 mM CaCl2 용액을 준비하였다. 시린지 부분을 기존의 제품으로부터 연장한 특주 마이크로시린지(ITO)에 의해, 첨가 용량이 3-10 μL의 범위가 되도록, CaCl2 용액의 필요량을 직접, NMR 시료관에 충전된 항체용액에 첨가하고, 시료관을 볼텍스 믹서에 의해 교반 후, 수동 원심기(Shimadzu)에 의해 원심분리하였다.
(16-4) LfVk1_Ca 항체 및 LfVk1_Ca 항체의 Fab 프래그먼트의 아미드기 시그날을 관측하기 위한 NMR 측정
NMR 측정에는, TCI CryoProbe를 설치한 NMR 분광기 DRX750(Bruker Biospin)를 사용하였다. 설정온도를 307K(GasFlow 535 L/h)로 하였다. 아미드기 시그날을 관측하기 위한 NMR 측정에는 1H-15N HSQC를 사용하였다. 측정법으로서는, 15N 전개기에 α탄소와 카르보니 탄소의 동시 13C 디커플링, 및 용매수 시그날 소거를 위한 3-9-19 펄스 트레인을 수반하는 1H-15N FHSQC를 사용하여, 그것을 제어하는 펄스 프로그램에는, 메이커(Bruker Biospin)에 의해 표준으로서 준비되어 있는 것을 사용하였다. NMR의 측정조건은 이하와 같이 하였다. 스펙트럼 폭:12019 Hz(f2), 1976 Hz(f1), 데이터 포인트 수: 2048(f2), 128(f1). 데이터 처리에는 Topspin 3.0(Bruker Biospin)을 사용하였다. 데이터 처리조건은 이하와 같이 하였다. f2, f1 모두, 윈도우 함수로서 shifted Sine(QSINE)을 곱하고, 2배의 데이터 포인트 수가 되도록 제로화(zero filling)를 행한 후에, 푸리에 변환을 행하였다. 시그날의 화학 시프트는 NMR 해석 소프트웨어 Sparky(UCSF)를 사용해서 산출하였다.
(16-5) 주쇄 아미드기의 NMR 시그날의 귀속
지금까지 토실리주마브(중쇄 서열번호：13, 경쇄 서열번호：14)의 Fab 프래그먼트의 주쇄 아미드기의 NMR 시그날 중, 80%가 귀속되었다(데이터 미공개). LfVk1_Ca 항체의 Fab 프래그먼트의 아미노산 서열은, 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3의 일부, 및 경쇄 73, 83번의 아미노산 잔기를 제외하고, 토실리주마브과 Fab 프래그먼트의 아미노산 서열과 동일하다. 양 항체에서 아미노산 서열이 동일한 부분에 대해서는, 그 NMR 시그날이 동일한 화학 시프트를 갖거나, 또는 그들이 가깝기 때문에, 토실리주마브의 귀속정보를 이행하는 것이 가능하였다. Leu 표지 시료에 대해서는, 경쇄 11, (33), (46), (47), (54), (78), 125, 135, 136, 154, 175, 179, 181, 201, 중쇄 18, 46, 64, 71, 81, 83, 114, 144, 147, 165, 176, 181, 184, 195가 귀속을 이행하는 것이 가능하였다. 상기, 괄호가 붙어 있지 않은 번호는 토실리주마브과 동일한 화학 시프트이기 때문에, 귀속이 이행 가능했던 잔기번호, 괄호가 붙은 번호는, 토실리주마브과 가까운 화학 시프트를 가지고 있고, 그것 이외에 가까운 화학 시프트를 갖는 시그날이 없기 때문에, 귀속이 가능했던 잔기번호였다. 한편, Asp, Glu, Asn, Gln 표지 시료에 대해서는, LfVk1_Ca 항체와 LfVk1 항체의 스펙트럼을 비교하여, 4개의 시그날이 LfVk1_Ca에서 새롭게 관측되고 있었다. 이는, 이 양 항체 사이에서 Asp, Glu, Asn, Gln 잔기 중, Ca2+ 결합 모티브로서 도입한 서열이 상이한 경쇄 Asp30, 31, 32, 92, Glu50의 5 잔기 중 어느 4 잔기 유래라고 분류할 수 있었다.
(16-6) Ca 2+ 의 LfVk1_Ca 항체 상의 결합 부위의 동정
LfVk1_Ca 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca2+ 미첨가 상태와, 20몰 등량 첨가의 1H-15N HSQC 스펙트럼을 비교하여, 화학 시프트가 변화되어 있는 시그날을 추출하였다. 그 결과, Leu 표지 시료로부터는, 경쇄 Leu33이 결합에 관여하고 있고, 그 이외의 Leu 잔기는 결합에 관여하고 있지 않은 것을 알 수 있었다. 또한, Asp, Glu, Asn, Gln 표지 시료로부터는, 경쇄 Asp30, 31, 32, 92, Glu50의 5 잔기 중 어느 4 잔기가 결합에 관여하고, 그 이외의 Asp, Glu, Asn, Gln 잔기 중 1 잔기를 제외한 모두가 결합에 관여하고 있지 않은 것이 명확해졌다. 이상의 사실로부터, Ca2+ 결합 모티브로서 도입된 아미노산 서열 중, 적어도 경쇄 CDR1, 이에 더하여 경쇄 CDR2, CDR3의 양쪽 또는 어느 하나의 아미노산이 Ca2+ 결합에 관여하고 있다고 동정되었다. 이 사실은 실시예 15에 있어서 확인된 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링) 중 4개가 hVk5-2 서열의 아미노산인 것이 칼슘 이온의 결합에 중요했던 결과와 일치하고 있다.
(16-7) 적정 실험에 있어서의 Ca 2+ 해리상수의 산출
Ca2+ 농도가 LfVk1_Ca 항체의 Fab 프래그먼트에 대해, 0, 1, 2, 5, 10, 20 몰 등량일 때의 1H-15N HSQC 스펙트럼을 이용하였다. 결합 부위로서 동정된 경쇄 Leu33의 시그날의 1H 또는 15N 화학 시프트를 세로축에, 상기 Ca2+의 몰 등량을 가로축에 플로팅하고, 그래프 작성 소프트웨어 Gnuplot을 이용하여 이하의 식 2로 나타내어지는 함수의 피팅을 행하였다.
〔식 2〕
Figure pat00029
식 2로 표시되는 함수에 있어서, s, t는 각각 Ca2+ 비결합시의 화학 시프트[ppm], Ca2+ 포화 결합시의 추정 화학 시프트[ppm], a는 항체 Fab 프래그먼트 농도[M], Kd는 해리상수, x는 항체 Fab 프래그먼트에 대해 첨가한 Ca2+의 몰 등량을 나타내고 있다. 피팅시에는, s, t, Kd를 피팅 파라미터로 하였다. 그 결과, 1H 화학 시프트로부터는 Kd=7.1×10-5[M], 15N 화학 시프트로부터는 Kd=5.9×10-5[M]으로 추산되었다.
〔실시예 17〕hVk5-2 변이체 서열(variant sequence)의 칼슘 결합 평가
Vk5-2(서열번호：41) 외에 Vk5-2로 분류되는 Vk5-2 변이체 1(서열번호：63) 및 Vk5-2 변이체 2(서열번호：64)가 얻어졌다. 이들 변이체에 대해서도 칼슘 결합 평가가 행해졌다. Vk5-2, Vk5-2 변이체 1 및 Vk5-2 변이체 2의 DNA 단편이 각각 동물세포용 발현 벡터에 삽입되었다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정되었다. Vk5-2, Vk5-2 변이체 1 및 Vk5-2 변이체 2의 DNA 단편이 각각 삽입된 동물세포용 발현 벡터는, 중쇄로서 CIM_H(서열번호：48)가 발현되도록 삽입된 동물 발현용 벡터와, 실시예 13에서 기재된 방법으로 함께 동물세포 중에 도입되어, 항체가 정제되었다. 정제된 항체의 칼슘 이온 결합 활성이 평가되었다. 정제된 항체가 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2(pH 7.5) 또는 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl(pH 7.5)의 용액(표 22에서는 칼슘 이온 농도 0 mM로 표기)을 외액으로 하는 투석(EasySEP, TOMY) 처리에 제공되었다. 투석에 사용된 용액을 사용하여 대략 0.1 ㎎/mL로 조제된 항체용액을 피험물질로 하여, 20℃부터 115℃까지 240℃/hr의 승온속도로 DSC 측정이 행해졌다. 얻어진 DSC의 변성곡선을 토대로 산출된 각 항체의 Fab 도메인의 열변성 중간온도(Tm값)가 표 22에 나타내어져 있다.
Figure pat00030
그 결과, Vk5-2, Vk5-2 변이체 1 및 Vk5-2 변이체 2의 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은, 당해 Fab 도메인을 포함하는 항체용액 중의 칼슘 이온의 농도에 따라 변동된 것으로부터, Vk5-2로 분류되는 서열을 갖는 항체는 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 18〕칼슘 의존적으로 인간 CD4에 결합하는 항체
(18-1) 가용형 인간 CD4의 조제
가용형 인간 CD4는 이하와 같이 조제되었다. 막관통 영역을 결손한 인간 CD4의 아미노산 서열에 Myc 태그를 부가한 서열(서열번호：76)을 코드하는 DNA 서열이 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 재조합 인간 CD4의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다.
(18-2) 가용형 인간 CD4에 결합하는 항체의 발현과 정제
TNX355-IgG1(중쇄 서열번호：77, 경쇄 서열번호：78) 및 Q425(중쇄 서열번호：79, 경쇄 서열번호：80)는 항인간 CD4 항체이다. 또한 Q425L9(중쇄 서열번호：81, 경쇄 서열번호：82)는 Q425의 L쇄 개변체이다. TNX355-IgG1(중쇄 서열번호：77, 경쇄 서열번호：78), Q425(중쇄 서열번호：79, 경쇄 서열번호：80) 및 Q425L9(중쇄 서열번호：81, 경쇄 서열번호：82)의 아미노산을 코드하는 DNA 서열이, 동물세포 발현용 플라스미드로 도입되었다. 항체의 발현은 이하의 방법을 사용해서 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되어, 1.33×106 세포/mL의 세포밀도로 6 웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는, 리포펙션법에 의해 세포로 도입되었다. CO2 인큐베이터(37℃, 8%CO2, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법을 사용해서, 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써, 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(18-3) 취득된 항체의 인간 CD4에 대한 칼슘 의존적 결합능 평가
취득된 항체의 가용형 인간 CD4에 대한 칼슘 의존적 결합능이 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용해서 평가되었다. 고칼슘 이온 농도로서 1.2 mM를 사용하고, 저칼슘 이온 농도의 조건으로서 3 μM를 사용하였다. 항원은 가용형 인간 CD4(18-1에서 조제)를 사용하였다. Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 protein G(Invitrogen)를 적당량 고정화하고, 거기에 목적의 항체를 캡쳐시켰다. 런닝 버퍼에는 1.2 mmol/L CaCl2 또는 3 μmol/L CaCl2를 포함하는 10 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20, 1.2 mmol/L CaCl2, pH 7.4 또는 pH 6.0을 사용하였다. 측정은 모두 37℃에서 실시하고, 인간 CD4의 희석에도 각각의 버퍼를 사용하였다. 항체의 센서그램을 도 19에 나타내었다. 도 19에 나타낸 바와 같이 TNX355-IgG1 항체는 런닝 버퍼의 조건이 변화되어도 센서그램의 형상은 변화되지 않은 것으로부터, TNX355-IgG1은 인간 CD4에 대해 칼슘 의존적으로 결합 활성을 나타내지 않는 통상의 항체인 것이 확인되었다. 한편으로, Q425 항체 및 Q425L9 항체는 모두 칼슘 이온 농도가 3 μM(저칼슘 이온 농도)일 때의 항원 결합량은 칼슘 이온 농도가 1.2 mM(고칼슘 이온 농도)일 때의 항원 결합량보다도 적어, Ca 의존적 결합능이 나타내어졌다. 특히 Q425L9 항체는, 칼슘 이온 농도가 3 μM가 되면, 200 nM의 애널라이트(가용성 인간 CD4)에서 측정한 경우에도 전혀 결합상을 관측할 수 없었다. 즉, Q425 항체 및 Q425L9 항체는 인간 CD4에 대해 칼슘 의존적으로 결합 활성을 나타내는 칼슘 의존적 결합인 것이 확인되었다.
〔실시예 19〕정상 마우스를 사용한 Ca 의존성 결합 항체의 항원의 혈장 중 체류성으로의 영향 평가
(19-1) 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험
실시예 18에서 조제된 Q425 및 Q425L9는 칼슘 의존적으로 가용형 인간 CD4에 결합하는 항체였다. 그러나, 지금까지 칼슘 의존적으로 항원과 결합하는 성질을 갖는 항체와 항원을 동시에 투여한 경우에, 칼슘 의존적으로 항원과 결합하는 성질이 없는 항체와 항원을 동시에 투여한 경우보다도 항원의 소실을 가속시키는 성질을 가지고 있는 것은 실시예 5 및 실시예 6에서 나타낸 바와 같이 IL6R에서 명확해져 있으나, 다른 항원에서도 항원의 소실을 가속시키는 성질을 가지고 있는지는 명확하지 않다.
이에, 정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 가용형 인간 CD4(실시예 18에서 조제)를 단독 투여 또는 가용형 인간 CD4 및 항인간 CD4 항체를 동시 투여한 후의 가용형 인간 CD4 및 항인간 CD4 항체의 체내동태를 평가하였다. 가용형 인간 CD4 용액(50 ㎍/mL), 또는, 가용형 인간 CD4 및 항인간 CD4 항체의 혼합용액을 꼬리 정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여하였다. 항인간 CD4 항체로서는, 전술한 TNX355-IgG1, Q425-IgG1, Q425L9-IgG1을 사용하였다.
혼합용액 중의 가용형 인간 CD4 농도는 모두 50 ㎍/mL이지만, 항인간 CD4 항체 농도는 항체마다 상이하여, TNX355-IgG1은 0.264 ㎎/mL, Q425-IgG1은 0.197 ㎎/mL, 및 Q425L9-IgG1은 2.594 ㎎/mL, 이때, 가용형 인간 CD4에 대해 항인간 CD4 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, 가용형 인간 CD4는 대부분이 항체에 결합하고 있다고 생각된다. 투여 후 가용형 인간 CD4를 단독 투여한 군은, 2분간, 5분간, 15분간, 30분간, 1시간, 2시간에서 채혈을 행하였다. 가용형 인간 CD4 및 칼슘 의존적 항원 결합능이 없는 TNX355-IgG1을 동시 투여한 군은, 투여 후 5분간, 2시간, 7시간, 1일간, 3일간, 7일간, 14일간, 28일간에서 채혈을 행하였다. 가용형 인간 CD4 및 칼슘 의존적 항원 결합능을 갖는 Q425-IgG1 및 Q425L9-IgG1을 동시 투여한 군은, 투여 후 5분간, 30분간, 2시간, 7시간, 1일간, 3일간, 8일간, 14일간, 28일간에서 채혈을 행하였다. 채혈한 혈액은 바로 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다.
(19-2) ELISA법에 의한 정상 마우스 혈장 중의 항인간 CD4 항체 농도 측정
마우스 혈장 중의 항인간 CD4 항체 농도는 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 Anti-Human IgG 고상화 플레이트를 제작하였다. 혈장 중 농도로서 0.64, 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ㎍/mL의 검량선 시료와 100배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하여, Anti-Human IgG 고상화 플레이트에 분주하여 25℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후 Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody(R&D)를 25℃에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 25℃에서 0.5시간 반응시켜, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색반응을 행하고, 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)으로 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다.
이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 TNX355-IgG1, Q425-IgG1 및 Q425L9-IgG1의 혈장 중 항체 농도 추이를 도 20에 나타내었다.
(19-3) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 가용형 인간 CD4 농도 측정
마우스의 혈장 중 가용형 인간 CD4 농도는 ELISA법으로 측정하였다.
sCD4 단독 투여군·Q425, Q425_L9와 동시 투여한 군에 대해서는, TNX를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 TNX 고상화 플레이트를 제작하였다. 혈장 중 농도로서 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156 ㎍/mL의 검량선 시료와 100배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 10 mM EDTA가 들어 있는 Buffer로 조제하여, TNX 고상화 플레이트에 분주하여 25℃에서 3시간 인큐베이션하였다. 그 후 Anti-c-myc-HRP(Miltenyi Biotech)를 25℃에서 1시간 반응시켜, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색반응을 행하고, 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)으로 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다.
TNX와 동시 투여한 군에 대해서는, Q425를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 Q425 고상화 플레이트를 제작하였다. 혈장 중 농도로서 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 ㎍/mL의 검량선 시료와 100배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 2 mM Ca2+가 들어 있는 Buffer로 조제하고, TNX 고상화 플레이트에 분주하여 25℃에서 3시간 인큐베이션하였다. 그 후 Anti-c-myc-HRP(Miltenyi Biotech)를 25℃에서 1시간 반응시켜, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색반응을 행하고, 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)으로 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다.
이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 가용형 인간 CD4 농도 추이를 도 21에 나타내었다.
결과, 가용형 인간 CD4 단독은 매우 빠른 소실을 나타낸 것에 대해, 가용형 인간 CD4와 Ca 의존적인 결합이 없는 통상의 항체인 TNX355-IgG1을 동시에 투여한 경우는, 가용형 인간 CD4의 소실을 대폭으로 느리게 하였다. 그것에 대해, 가용형 인간 CD4와 Ca 의존적인 결합을 갖는 Q425-IgG1 또는 Q425L9-IgG1을 동시에 투여한 경우는, 가용형 인간 CD4의 소실을 대폭으로 가속하였다. TNX355-IgG1을 동시에 투여한 경우와 비교하여, Q425-IgG1 또는 Q425L9-IgG1을 동시에 투여한 경우는, 가용형 인간 CD4의 소실을 촉진하는 것이 가능하였다. 이것으로부터 칼슘 의존적 결합 항체가 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 달성할 수 있는 것이 IL-6R 뿐 아니라 인간 CD4에 있어서도 확인되었다.
〔실시예 20〕칼슘 의존적으로 인간 IgA에 결합하는 항체
(20-1) 인간 IgA(hIgA)의 조제
항원인 인간 IgA의 재조합 인간 IgA(이하 hIgA)는 이하와 같이 조제하였다. H(WT)-IgA1(서열번호：83)과 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 hIgA를 발현시켜서, 당업자 공지의 방법으로 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 사용해서 정제하였다.
(20-2) 인간 IgA에 결합하는 항체의 발현과 정제
GA1-IgG1(중쇄 서열번호：84, 경쇄 서열번호：85), GA2-IgG1(중쇄 서열번호：86, 경쇄 서열번호：87), GA3-IgG1(중쇄 서열번호：88, 경쇄 서열번호：89) 및 GA4-IgG1(중쇄 서열번호：90, 경쇄 서열번호：91)은 인간 IgA에 결합하는 항체이다. 또한, 실시예 6 및 실시예 7과 동일하게, 혈장 중으로부터의 항원(hIgA)의 소실을 더욱 증대시키기 위해, GA2-IgG1에 대해 마우스 FcRn에 대한 pH 7.4에 있어서의 결합을 증강시키기 위해 N434W의 아미노산 치환을 도입한 GA2-N434W(중쇄 서열번호：92, 경쇄 서열번호：87)를 제작하였다. GA1-IgG1(중쇄 서열번호：84, 경쇄 서열번호：85), GA2-IgG1(중쇄 서열번호：86, 경쇄 서열번호：87), GA3-IgG1(중쇄 서열번호：88, 경쇄 서열번호：89), GA4-IgG1(중쇄 서열번호：90, 경쇄 서열번호：91) 및 GA2-N434W(중쇄 서열번호：92, 경쇄 서열번호：87)를 코드하는 DNA 서열이 동물 발현용 플라스미드에 당업자 공지의 방법으로 삽입되었다. 항체의 발현은 이하의 방법을 사용해서 행하였다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)를 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)로 현탁하여, 1.33×106 개/mL의 세포밀도로 6 웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종하고, 리포펙션법에 의해 조제한 플라스미드를 세포로 도입하였다. CO2 인큐베이터(37℃, 8%CO2, 90 rpm)로 4일간 배양을 행하고, 얻어진 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체 농도는, 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용하여 항체 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
(20-3) 취득된 항체의 인간 IgA에 대한 Ca 의존적 결합능 평가
취득된 항체를, Biacore T200(GE Healthcare)을 사용하여 인간 IgA 결합 활성(해리상수 KD(M))에 관하여 평가하였다. 런닝 버퍼로서 3 μM 또는 1.2 mM　CaCl2를 함유하는 0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl(pH 7.4 및 pH 5.8), 0.1 μM 또는 10 mM　CaCl2를 함유하는 0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH 8.0을 사용해서 측정을 행하였다.
Sensor chip CM5(GE Healthcare) 상에 아미노 커플링법으로 재조합형 프로테인 A/G(Thermo Scientific)를 적당량 고정화한 후, 항체를 결합시켰다. 애널라이트로서 적절한 농도의 hIgA((20-1)에 기재)를 인젝트하고, 센서칩 상의 항체와 상호작용시켰다. 그 후, 10 mmol/L Glycine-HCl, pH 1.5를 인젝트하고, 센서칩을 재생하였다. 측정을 37℃에서 행하였다. 측정결과를 Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여, 커브 피팅에 의한 해석 및 평형치 해석에 의해, 해리상수 KD(M)를 산출하였다. 그 결과를 표 23에 나타낸다. 또한, 얻어진 센서그램을 도 22에 나타내었다. GA2-IgG1, GA3-IgG1, GA4-IgG1은 Ca2+ 농도가 1.2 mM에 있어서는 인간 IgA에 강하게 결합하지만, Ca2+ 농도가 3 μM에 있어서는 인간 IgA에 약하게 결합하는 것이 명확하게 나타내어졌다.
Figure pat00031
〔실시예 21〕정상 마우스를 사용한 Ca 의존성 인간 IgA 결합 항체의 항원의 혈장 중 체류성으로의 영향 평가
(21-1) 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험
정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 인간 IgA(인간 IgA：실시예 20에서 제작)를 단독 투여 또는 인간 IgA 및 항인간 IgA 항체를 동시 투여한 후의 인간 IgA 및 항인간 IgA 항체의 체내동태를 평가하였다. 인간 IgA 용액(80 ㎍/mL), 또는, 인간 IgA 및 항인간 IgA 항체의 혼합용액을 꼬리 정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여하였다. 항인간 IgA 항체로서는, 전술한 GA1-IgG1, GA2-IgG1, GA3-IgG1 및 GA2-N434W를 사용하였다.
혼합용액 중의 인간 IgA 농도는 모두 80 ㎍/mL이지만, 항인간 IgA 항체 농도는 각 항체의 hIgA로의 친화성에 따라 항체마다 상이하여, GA1-IgG1은 100 ㎎/mL, GA2-IgG1은 28.9 ㎎/mL, GA3-IgG1은 53.8 ㎎/mL, GA2-N434W는 1 ㎎/mL로 하였다. 이때, 인간 IgA에 대해 항인간 IgA 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, 인간 IgA는 대부분이 항체에 결합해 있는 것으로 생각된다. 투여 후 5분간, 7시간, 1일간, 2일간, 3일간, 7일간에서 채혈을 행하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다.
(21-2) ELISA법에 의한 정상 마우스 혈장 중의 항인간 IgA 항체 농도 측정
마우스 혈장 중의 항인간 IgA 항체 농도는 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 Anti-Human IgG 고상화 플레이트를 제작하였다. 혈장 중 농도로서 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.01563, 0.07813 ㎍/mL의 검량선 시료와 100배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하여, Anti-Human IgG 고상화 플레이트에 분주하고 25℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후 Goat Anti-Human IgG(γ chain specific) Biotin(BIOT) Conjugate(Southern Biotechnology Associats Inc.)를 25℃에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 25℃에서 1시간 반응시켜, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색반응을 행하고, 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)으로 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 GA1-IgG1, GA2-IgG1, GA3-IgG1 및 GA2-N434W의 혈장 중 항체 농도 추이를 도 23에 나타내었다.
(21-3) ELISA법에 의한 혈장 중 인간 IgA 농도 측정
마우스의 혈장 중 인간 IgA 농도는 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 Goat anti-Human IgA Antibody(BETHYL)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 Anti-Human IgA 고상화 플레이트를 제작하였다. 혈장 중 농도로서 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 ㎍/mL로 조정한 인간 IgA 검량선 시료 및 100배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하여, 이들 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL에 500 ng/mL의 hsIL-6R을 200 μL 첨가하여, 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후 Anti-Human IgA 고상화 플레이트에 분주하고 추가로 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후 Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody(R&D)를 실온에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 실온에서 1시간 반응시켜, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색반응을 행하고, 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)으로 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 인간 IgA 농도 추이를 도 24에 나타내었다.
결과, 인간 IgA 단독의 소실에 대해, 인간 IgA와 Ca 의존적인 결합이 약한(의존성 정도가 작은) 항체인 GA1-IgG1을 동시에 투여한 경우는, 인간 IgA의 소실을 느리게 하였다. 그것에 대해, 인간 IgA와 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 갖는 GA2-IgG1을 동시에 투여한 경우는, 인간 IgA의 소실을 대폭으로 가속하였다. 도 23에 나타내어진 혈장 중 항체 농도, 도 24에 나타내어진 혈장 중 인간 IgA 농도 및 표 23에 나타내어진 각 항체의 KD값으로부터, 혈장 중에 존재하는 비결합형의 인간 IgA 농도를 구하였다. 그 결과를 도 25에 나타내었다. 도 25에 나타내어진 바와 같이 GA1-IgG1 투여군의 비결합형의 항원(인간 IgA)의 농도와 비교하여, GA2-IgG1 또는 GA3-IgG1 투여군의 비결합형의 항원(인간 IgA)의 농도는 낮은 것으로부터, 칼슘 의존적 결합 항체를 항원의 소실을 가속함으로써, 비결합형의 항원(인간 IgA)을 저하시킬 수 있는 것이 나타내어졌다. 또한, pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시킨 GA2-N434W는 항원의 소실을 GA2-IgG1보다도 빠르게 하여, 투여 7시간 후에는 검출한계 이하가 되었다.
이상으로부터 칼슘 의존적 결합 항체가, pH 또는 칼슘 의존적으로 결합하지 않는 통상의 항체와 비교하여, 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 가속 가능한 것이 확인되어, 이 현상은 실시예 5에서 나타내어진 인간 IL6R이나 실시예 19에서 나타내어진 인간 CD4 뿐 아니라 인간 IgA에서도 일어나는 것이 명확해졌다. 또한, 실시예 6 및 실시예 7의 인간 IL6R과 마찬가지로, 칼슘 의존적 결합 항체에 대해 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시킴으로써 추가로 항원의 소실을 가속시킬 수 있는 것이 인간 IgA에 있어서도 확인되었다.
참고 실시예 31에 나타내는 바와 같이, pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 Fv4-IgG1은, 비pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 H54/L28-IgG1과 비교하여 인간 IL-6 수용체의 소실을 가속시키는 것이 가능하였지만, 인간 IL-6 수용체 단독보다 소실을 가속화시키는 것은 불가능하였다. 인간 IL-6 수용체 단독보다 소실을 가속시키기 위해서는, 중성 영역에 있어서의 FcRn으로의 결합을 증강시킨 Fv4-IgG1-v1 또는 Fv4-IgG1-v2를 사용할 필요가 있다.
한편, 놀랍게도, Ca 의존적으로 인간 IgA에 결합하는 GA2-IgG1은, 중성 영역에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증강시키지 않은 천연형 IgG1의 정상영역을 포함함에도 불구하고, 인간 IgA의 소실을 인간 IgA 단독보다 가속시키는 것이 발견되었다. 이러한 것이 GA2-IgG1에 있어서 일어나는 이유로서 이하의 메커니즘이 생각되었다.
인간 IL-6 수용체의 단량체 항원의 경우, 2가의 항체에 대해 항원이 2개 결합하여, 항원 항체 3분자로 이루어지는 항원 항체 복합체를 형성한다. 한편, 인간 IgA가 이량체 항원이고, 항체도 2가인 것으로부터, 양자의 항원 항체 복합체는, 항원 항체 4분자 이상으로 이루어지는 항원 항체 복합체(면역 복합체)를 형성하는 것으로 생각된다.
다량체 항원에 대한 천연 IgG1형 통상 항체가 커다란 면역 복합체를 형성하는 경우, 그 면역 복합체는 FcgR, FcRn, 보체 수용체 등에 대해 다가의 Fc 영역을 매개로 avidity로 결합하는 것이 가능하기 때문에, 이들의 수용체를 발현하는 세포에 흡수되는 것에 대해, pH/Ca 의존성을 갖지 않는 단량체 항원에 대한 통상 항체는, 천연 IgG1형의 수용체에 대한 친화성이 충분하지 않기 때문에 세포에 흡수되는 효율이 낮다. 본래 FcRn은 세포내에 흡수된 항체를 엔도솜으로부터 혈장 중으로 리사이클하는 역할을 가지고 있는데, 이러한 FcRn에 대해 다가로 결합 가능한 커다란 면역 복합체는, FcRn을 매개로 엔도솜으로부터 리소좀으로 이행하여 분해되는 것이 알려져 있다. 즉, 도 26에 나타내는 바와 같이, 다량체 항원에 대해 커다란 면역 복합체를 형성하는 통상 항체는, 그 항원의 소실을 가속시키는 것은 가능하나, 엔도솜 내에서도 항원이 항체로부터 해리되는 경우가 없는 것으로부터, 항원과 동시에 항체도 소실되어 버리기 때문에, 항체 1분자당 항원을 소실시키는 효율은 나쁘다. 즉, pH/Ca 의존성을 갖지 않는 단량체 항원에 대한 통상 항체는 항원의 소실을 가속시키는 것은 가능하나, 그 효율은 나쁘다고 생각된다.
이에 대해, 다량체 항원에 대한 천연형 IgG1의 정상영역을 포함하는 pH/Ca 의존성 항체가 커다란 면역 복합체를 형성하는 경우는, 도 27에 나타내는 바와 같이, 그 면역 복합체는 FcgR, FcRn, 보체 수용체 등에 대해 다가의 Fc 영역을 매개로 avidity로 결합하고, 이들 수용체를 발현하는 세포에 흡수된다. 그 후, 엔도솜 내에서 항원이 pH/Ca 의존성 항체로부터 해리됨으로써, 면역 복합체의 형성이 해소된다. 항원은 FcRn에 결합하는 것이 불가능하기 때문에, 리소좀으로 이행하여 분해되는 것에 대해, 항체는 면역 복합체를 형성하고 있지 않기 때문에 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되는 것으로 생각된다.
즉, 다량체 항원에 대한 천연 IgG1형의 정상영역을 포함하는 pH/Ca 의존성 항체가 커다란 면역 복합체를 형성하고, avidity로 FcgR, FcRn, 보체 수용체 등에 결합하는 것이 가능하면, 항원의 소실만을 선택적으로 대폭 가속시키는 것이 가능하다고 생각된다. 그러한 것이 인간 IgA에 대한 GA2-IgG1에 있어서도 일어나고 있다고 생각되었다. 참고 실시예 31에 나타내는 바와 같은 천연형 IgG1에 대해 아미노산 치환으로 중성 영역에 있어서의 FcRn의 결합을 증강시키는 방법을 사용하지 않고, 다량체 항원의 소실을 대폭으로 가속시키는 방법으로서 유용하다고 생각되었다.
이러한 작용을 발휘하기 위해서는, 항원 항체가 커다란 면역 복합체를 형성하여, IgG1에서도 avidity로 FcgR/FcRn에 강하게 결합할 필요가 있다고 생각된다. 항원이 이량체 이상의 항원이라면, 커다란 면역 복합체를 형성하고, avidity로 전술한 수용체에 결합하는 pH/Ca 의존성 항체를 스크리닝하는 것이 가능하다면, 아미노산 치환하지 않고 천연형 IgG1의 정상영역을 사용함으로써 효율적으로 항원의 소실을 가속시키는 것이 가능하다. 또한, 일반적으로는 항원과 항체가 커다란 면역 복합체를 형성하기 위해서는, 항원이 다량체 항원(예를 들면 IgA, IgE 등의 immunoglobulin이나 TNF, CD154 등의 TNF 슈퍼패밀리)일 필요가 있다고 생각되나, 단량체 항원이더라도 그 단량체 항원에 존재하는 2개 이상의 에피토프를 인식하는 적절한 2종류 이상의 pH/Ca 의존성 항체의 혼합물을 사용하는 것으로도 커다란 면역 복합체를 형성하는 것이 가능하다고 생각된다. 또한, 단량체 항원에 존재하는 2개 이상의 에피토프를 인식하는 적절한 multispecific pH/Ca 의존성 항체(예를 들면, 도 28에 나타내는 바와 같은 에피토프 A를 인식하는 우완(右腕)과 에피토프 B를 인식하는 좌완(左腕)을 포함하는 천연형 IgG의 정상영역을 포함하는 bispecific 항체)를 사용하는 것으로도 커다란 면역 복합체를 형성하는 것이 가능하다고 생각된다. 즉, 단량체 항원에 대해서도, 적절한 pH/Ca 의존성 항체를 스크리닝할 수 있다면, 천연형 IgG1의 정상영역을 포함하는 항체의 혼합물이나 multispecific 천연형 IgG1의 정상영역을 포함하는 항체를 사용함으로써, 그 아미노산이 치환된 변이형 IgG1을 사용하지 않고 효율적으로 항원의 소실을 가속시키는 것도 가능하다고 생각된다.
〔실시예 22〕칼슘 의존적으로 인간 글리피칸 3에 결합하는 항체
(22-1) 인간 글리피칸 3(GPC3)의 조제
항원으로서 사용하는 재조합 인간 글리피칸 3(이하 GPC3)를 이하와 같이 조제하였다. 인간 글리피칸 3의 막관통 영역을 포함하지 않는 아미노산 서열에 6 잔기의 히스티딘이 연결된 서열(서열번호：93)을 발현하는 플라스미드가 정상적(定常的)으로 도입되어 있는 CHO 세포를 배양하고, 배양상청을 회수하였다. 얻어진 배양상청을, 이온 교환 크로마토그래피 정제 후, His 태그를 사용한 친화성 정제 및 겔 여과 크로마토그래피 정제를 행하여, GPC3를 얻었다.
(22-2) 인간 GPC3에 결합하는 항체의 발현과 정제
항인간 글리피칸 3 항체인, CSCM-01_005(중쇄 서열：94, 경쇄 서열：95), CSCM-01_009(중쇄 서열：96, 경쇄 서열：97), CSCM-01_015(중쇄 서열：98, 경쇄 서열：99), CSCM-01_023(중쇄 서열：100, 경쇄 서열：101) 및 GC-IgG1(중쇄 서열：102, 경쇄 서열：103)이 각각 동물 발현용 플라스미드로 삽입되었다. 항체의 발현은 이하의 방법을 사용해서 행하였다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)를 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)로 현탁하여, 1.33×106 개/mL의 세포밀도로 6 웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종하고, 리포펙션법에 의해 조제한 플라스미드를 세포로 도입하였다. CO2 인큐베이터(37℃, 8%CO2, 90 rpm)에서 4일간 배양을 행하고, 얻어진 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체 농도는, 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용하여 항체 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423). 또한, GC-IgG1 항체에 대해서는, GC-IgG1 항체가 정상적으로 발현하는 CHO 세포 배양상청으로부터 동일한 방법으로 항체를 정제하여, 농도를 산출하였다.
(22-3) 취득된 항체의 인간 GPC3에 대한 Ca 의존적 결합능 평가
취득된 항체가 이하의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 PBS로 하룻밤 코트되었다. 해당 플레이트의 각 웰을 ACES buffer(10 mM ACES, 150 mM NaCl, 100 mM CaCl2, 0.05% Tween20, pH 7.4)로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 2%BSA를 포함하는 ACES Buffer 250 μL로 1시간 이상 블로킹되었다. 2%BSA를 포함하는 ACES Buffer가 제거된 각 웰에, 사전에 10 ㎍/mL로부터 4배씩 희석을 행한 정제 IgG 각 100 μL가 첨가된 당해 플레이트를 1시간 정치함으로써, IgG를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. ACES Buffer로 세정된 각 웰에, 「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH 7.4」, 「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl2, pH 7.4」, 「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH 5.8」또는「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl2, pH 5.8」이 첨가되고, 당해 플레이트는 37℃에서 30분간 정치하여 인큐베이트되었다. ACES Buffer로 세정된 후에, 2%BSA를 포함하는 ACES Buffer에 의해 희석된 HRP 결합 항인간 IgG 항체(BIOSOURCE)가 각 웰에 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. ACES Buffer로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이, 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
측정된 결과를 도 29에 나타내었다. GC-IgG1에서는 칼슘 이온의 농도에 상관없이 흡광도가 동일한 것에 대해, CSCM-01_005, CSCM-01_009, CSCM-01_015 및 CSCM-01_023은 1.2 mM 칼슘 이온 농도(고칼슘 이온 농도)에 있어서의 흡광도와 비교하여, 3 μM 칼슘 이온 농도(저칼슘 이온 농도)에 있어서의 흡광도는, 현저하게 낮은 결과로 되었다. 이 결과로부터, CSCM-01_005, CSCM-01_009, CSCM-01_015 및 CSCM-01_023은 칼슘 이온의 농도에 따라 항원과의 결합이 변화되는 성질을 갖는 것이 나타내어져, 인간 글리피칸 3에 대해서도 칼슘 의존적 항체를 취득할 수 있는 것이 나타내어졌다. 이들의 칼슘 의존적 항인간 글리피칸 3 항체는, 통상의 항인간 글리피칸 3 항체와 비교하여, 전술한 실시예에 있어서의 인간 IL-6R, 인간 CD4, 인간 IgA와 마찬가지로, 인간 글리피칸 3의 소실을 가속시킬 수 있다고 생각되었다. 또한 이들의 칼슘 의존적 항인간 항글리피칸 3 항체에 대해, pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증강시킴으로써, 추가로 인간 글리피칸 3의 소실을 가속시킬 수 있다고 생각되었다.
〔실시예 23〕칼슘 의존적으로 IgE에 결합하는 항체
(23-1) 비오틴화 인간 IgE의 조제
항원인 인간 IgE는 이하와 같이 조제되었다. IgE-H(서열번호：104, C 말단에 비오틴 부가 서열이 연결되어 있다) 및 L(WT)(서열번호：14)을 코드하는 DNA 서열을 삽입한 동물세포 발현 벡터를 제작하고, 당해 발현 벡터 및 FreeStyle293(Invitrogen)을 사용하여 배양상청 중에 비오틴 부가 서열이 C 말단에 결합한 전장의 인간 IgE 단백질을 발현시켰다. 얻어진 배양상청으로부터 이온 교환 크로마토그래피, 아비딘을 사용한 친화성 정제, 추가로 겔 여과 크로마토그래피 정제를 행하여, 비오틴화 인간 IgE를 얻었다.
(23-2) 인간 IgE에 결합하는 항체의 발현과 정제
GEB0100(중쇄 서열번호：105, 경쇄 서열번호：106), GEB0220(중쇄 서열번호：107, 경쇄 서열번호：108), GEB0230(중쇄 서열번호：109, 경쇄 서열번호：110) 및 Xolair(중쇄 서열번호：111, 경쇄 서열번호：112)는 인간 IgE에 결합하는 항체이다. GEB0100(중쇄 서열번호：105, 경쇄 서열번호：106), GEB0220(중쇄 서열번호：107, 경쇄 서열번호：108), GEB0230(중쇄 서열번호：109, 경쇄 서열번호：110) 및 Xolair(일반명 Omalizumab)(중쇄 서열번호：111, 경쇄 서열번호：112)가 각각 동물 발현용 플라스미드에 당업자 공지의 방법으로 삽입되었다. 항체의 발현은 이하의 방법을 사용해서 행하였다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)로 리포펙션법에 의해 조제한 플라스미드를 세포로 도입하였다. CO2 인큐베이터(37℃, 8%CO2, 90 rpm)에서 4~7일간 배양을 행하고, 얻어진 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체 농도는, 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용하여 항체 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
(23-3) 취득된 항체의 인간 IgE에 대한 Ca 의존적 결합능의 평가
취득된 항체의 인간 IgE에 대한 Ca 의존적 결합능의 평가는 ELISA법을 사용해서 행해졌다. 구체적으로는, NUNC 이뮤노 384 웰 플레이트 맥시소프(Thermo fisher scientific사 제조 464718)에 1 ㎍/mL의 Goat anti-rabbit IgG-Fc polyclonal antibody(Bethyl laboratory사 제조 A120-111A) 또는 1 ㎍/mL의 Goat anti-human IgG-Fc polyclonal antibody(ICN biomedicals사 제조 55071)를 40 μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 용액을 제거하고, 20%로 희석한 Blocking One 시약(나칼라이 테스크사 제조 03953-95)을 50 μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 용액을 제거하고, 1.2 mM의 염화칼슘을 포함하는 트리스 완충용액으로 희석한 정제 항체를 40 μL 첨가하였다. 4℃에서 하룻밤 인큐베이트한 후, 1.2 mM의 염화칼슘과 0.05%(w/v)의 Tween-20을 포함하는 트리스 완충용액 80 μL로 3회 세정하고, 1.2 mM의 염화칼슘을 포함하는 트리스 완충용액으로 500 ng/mL로 희석한 비오틴화 인간 IgE((23-1)에서 제작)를 40 μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 1.2 mM의 염화칼슘과 0.05%(w/v)의 Tween-20을 포함하는 트리스 완충용액 80 μL로 3회 세정하고, 2 mM의 염화칼슘을 포함하는 ACES 완충용액(pH 7.4) 또는 3 μM의 염화칼슘을 포함하는 ACES 완충용액(pH 7.4)을 80 μL 첨가하여, 바로 용액을 제거한 후, 재차 2 mM의 염화칼슘을 포함하는 ACES 완충용액(pH 7.4) 또는 3 μM의 염화칼슘을 포함하는 ACES 완충용액(pH 7.4)을 80 μL 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 1.2 mM의 염화칼슘과 0.05%(w/v)의 Tween-20을 포함하는 트리스 완충용액 80 μL로 3회 세정하고, 1.2 mM의 염화칼슘을 포함하는 트리스 완충용액으로 25 ng/mL로 희석한 HRP 표지 스트렙토아비딘(Thermo fisher scientific사 제조 21132)을 40 μL 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 1.2 mM의 염화칼슘과 0.05%(w/v)의 Tween-20을 포함하는 트리스 완충용액 80 μL로 3회 세정하고, 발색기질(KPL사 제조 50-66-06: ABTS peroxidase substrate system 1 component)을 40 μL 첨가한다. 실온에서 15분 또는 30분 인큐베이트한 후, 405 nm의 흡광도를 측정하였다(Molecular devices사 제조 SpectraMax Plus384).
측정결과를 도 30에 나타내었다. Xolair의 경우는 칼슘 이온의 농도에 상관없이 흡광도가 동일한 것에 대해, GEB0100, GEB0220 및 GEB0230은 2 mM 칼슘 이온 농도(고칼슘 이온 농도)에 있어서의 흡광도와 비교하여, 3 μM 칼슘 이온 농도(저칼슘 이온 농도)에 있어서의 흡광도는, 현저하게 낮은 결과로 되었다. 이 결과로부터, GEB0100, GEB0220 및 GEB0230은 칼슘 이온의 농도에 따라 항원과의 결합이 변화되는 성질을 갖는 것이 나타내어졌다. 상기 현상은, 인간 IgE에 대해서도 칼슘 의존적 항체가 취득 가능한 것을 나타내고 있다. 이들 칼슘 의존적 항인간 IgE 항체는, Xolair 등의 통상의 항인간 IgE 항체와 비교하여, 전술한 실시예에 있어서의 인간 IL-6R, 인간 CD4, 인간 IgA와 마찬가지로, 인간 IgE의 소실을 가속시키는 것이 가능하다고 생각된다. 또한 이들의 칼슘 의존적 항인간 IgE 항체에 대해, pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증강시킴으로써, 추가로 인간 IgE의 소실을 가속시킬 수 있다고 생각되었다.
〔참고예 1〕가용형 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)의 조제
항원인 인간 IL-6 수용체의 재조합 인간 IL-6 수용체는 이하와 같이 조제하였다. J. Immunol. 152, 4958-4968(1994)에서 보고되어 있는 N 말단측 1번째부터 357번째의 아미노산 서열로 이루어지는 가용형 인간 IL-6 수용체(이하, hsIL-6R)의 CHO 정상 발현주를 당업자 공지의 방법으로 구축하고, 배양하여, hsIL-6R을 발현시켰다. 얻어진 배양상청으로부터, Blue Sepharose 6 FF 칼럼크로마토그래피, 겔 여과 칼럼크로마토그래피의 2공정에 으해 hsIL-6R을 정제하였다. 최종 공정에 있어서 메인 피크로서 용출된 분획을 최종 정제품으로 하였다.
〔참고예 2〕인간 FcRn의 조제
FcRn은 FcRn과 β2-마이크로글로불린의 복합체이다. 공표되어 있는 인간 FcRn 유전자 서열을 토대로 올리고 DNA 프라이머를 조제하였다(J Exp Med. 1994 Dec 1; 180(6): 2377-81). 유전자 전체를 코드하는 DNA 단편은, 조제한 프라이머 및 주형으로서 인간 cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)를 사용하여 PCR에 의해 조제하였다. 얻어진 DNA 단편을 주형으로서 사용하고, 시그날 영역(Met1~Leu290)을 함유하는 세포외 도메인을 코드하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하여, 포유동물세포 발현 벡터에 삽입하였다. 마찬가지로, 공표되어 있는 인간 β2-마이크로글로불린 유전자 서열(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002))을 토대로 올리고 DNA 프라이머를 조제하였다. 유전자 전체를 코드하는 DNA 단편은, 조제한 프라이머 및 주형으로서 인간 cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)를 사용하여 PCR에 의해 조제하였다. 얻어진 DNA 단편을 주형으로서 사용하고, 시그날 영역(Met1~Met119)을 함유하는 단백질 전체를 코드하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하여, 포유동물세포 발현 벡터에 삽입하였다.
가용형 인간 FcRn을 이하의 순서로 발현시켰다. 인간 FcRn(서열번호：17) 및 β2-마이크로글로불린(서열번호：18)을 발현시키기 위해 구축한 플라스미드를, PEI(Polyscience)를 사용한 리포펙션법에 의해, 인간 태아 신장암 유래 세포주 HEK293H(Invitrogen)의 세포에 도입하였다. 얻어진 배양상청을 회수하고, IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 정제한 후에 HiTrap Q HP(GE Healthcare)(J Immunol. 2002 Nov 1; 169(9): 5171-80)를 사용함으로써 FcRn을 추가로 정제하였다.
〔참고예 3〕pH 의존적 항원 결합 항체의 항원 소실 가속효과의 향상 검토(in vivo 시험)
(3-1) 중성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 갖는 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체의 조제
VH3-IgG1(서열번호：19)과 VL3-CK(서열번호：20)를 포함하는 Fv4-IgG1에 대해, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증가시키는 변이를 도입하였다. 구체적으로는 IgG1의 중쇄 정상영역에 대해, EU 넘버링에 있어서의 252번째를 Met로부터 Tyr로, 254번째를 Ser로부터 Thr로, 256번째를 Thr로부터 Glu로 치환한 VH3-IgG1-v1(서열번호：21), 및 IgG1의 중쇄 정상영역에 대해, EU 넘버링에 있어서의 434번째를 Asn으로부터 Trp로 치환한 VH3-IgG1-v2(서열번호：22)를 조제하였다. 아미노산 치환의 도입은, QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene) 또는 In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)를 사용하여, 첨부 설명서 기재의 방법으로 변이체를 제작하고, 얻어진 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여, 목적의 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다.
H54(서열번호：5)와 L28(서열번호：6)을 포함하는 H54/L28-IgG1, VH3-IgG1(서열번호：19)과 VL3-CK(서열번호：20)를 포함하는 Fv4-IgG1, VH3-IgG1-v1(서열번호：21)과 VL3-CK(서열번호：20)를 포함하는 Fv4-IgG1-v1, 및 VH3-IgG1-v2(서열번호：22)와 VL3-CK(서열번호：20)를 포함하는 Fv4-IgG1-v2의 발현 및 정제는, 이하의 방법을 사용해서 행해졌다. 제조원이 제공하는 프로토콜에 기재된 바와 같이 FreestyleHEK293(Invitrogen)에 의해, 또는 HEK293H주(Invitrogen)에 의해 항체를 발현시켰다. 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen)를, 10% 소태아 혈청(Invitrogen)을 포함하는 DMEM배지(Invitrogen)로 현탁하고, 5~6×105 개/mL의 세포밀도로 접착세포용 디쉬(직경 10 ㎝, CORNING)의 각 디쉬로 10 mL씩 파종하여 CO2 인큐베이터(37℃, 5%CO2) 내에서 만 하루 배양한 후에, 배지를 흡인 제거하고, CHO-S-SFM-II(Invitrogen)배지 6.9 mL를 첨가하였다. 조제한 플라스미드를 lipofection법에 의해 세포로 도입하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 원심분리(약 2000 g, 5분간, 실온)하여 세포를 제거하고, 추가로 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(등록상표)-GV(Millipore)를 통과시켜 멸균하여 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청에 rProtein A Sepharose(상표) Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 정제하였다. 정제 항체 농도는, 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 값으로부터 Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423에 기재된 방법으로 산출된 흡광계수를 이용하여 항체 농도를 산출하였다. 당업자 공지의 방법으로 발현시켜서 정제하였다.
(3-2) 인간 FcRn 형질전환 마우스 및 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험
인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 계통 276 +/+ 마우스, Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010;602:93-104.) 및 정상 마우스(C57BL/6J 마우스, Charles River Japan)에 hsIL-6R(가용형 인간 IL-6 수용체：참고예 1에서 조제)을 단독 투여 또는 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 생체내에 있어서의 동태를 평가하였다. hsIL-6R 용액(5 ㎍/mL) 또는 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액(각각 5 ㎍/mL, 0.1 ㎎/mL)을 꼬리 정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여하였다. 이때, hsIL-6R에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, hsIL-6R은 거의 모두 항체에 결합해 있는 것으로 생각된다. 투여 15분 후, 7시간 후, 1일 후, 2일 후, 3일 후, 4일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후, 28일 후에 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다. 항인간 IL-6 수용체 항체로서는, 인간 FcRn 형질전환 마우스에는 전술한 H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, 및 Fv4-IgG1-v2, 정상 마우스에는 전술한 H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-v1, 및 Fv4-IgG1-v2를 사용하였다.
(3-3) 혈장 중 항인간 IL-6 수용체 항체 농도의 ELISA법에 의한 측정
마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체 농도는 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 항인간 IgG(γ쇄 특이적)F(ab')2 항체 단편(Sigma)을 Nunc-ImmunoPlate, MaxiSorp(Nalge Nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 항인간 IgG 고상화 플레이트를 조제하였다. 혈장 중 농도로서 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ㎍/mL의 검량선 시료와 100배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하여, 이들 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL에 20 ng/mL의 hsIL-6R을 200 μL 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후 항인간 IgG 고상화 플레이트에 분주하고 추가로 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후 비오틴화 항인간 IL-6R 항체(R&D)를 실온에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 실온에서 1시간 반응시켜, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색반응을 행하고, 1N 황산(Showa Chemical)으로 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 항체 농도 추이를 도 31에, 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 항체 농도 추이를 도 33에 나타내었다.
(3-4) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 hsIL-6R 농도 측정
마우스의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 전기화학 발광법으로 측정하였다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 및 31.25 pg/mL의 농도로 조정한 hsIL-6R 검량선 시료 및 50배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하였다. 시료를, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 단일클론 항인간 IL-6R 항체(R&D), 비오틴화 항인간 IL-6R 항체(R&D), 및 WT-IgG1 용액과 혼합하여, 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그때의 항인간 IL-6 수용체 항체로서, H(WT)(서열번호：13)와 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 WT-IgG1의 종농도는 시료에 포함되는 항인간 IL-6 수용체 항체 농도보다 과잉의 333 ㎍/mL이고, 시료 중의 거의 모든 hsIL-6R을 WT-IgG1과 결합한 상태로 하는 것을 목적으로 하였다. 그 후, MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하였다. 추가로 실온에서 1시간 반응시켜 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)를 분주하고, 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정을 행하였다. IL-6R 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 도 32에, 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 도 34에 나타내었다.
(3-5) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 유리 hsIL-6R 농도 측정
가용형 인간 IL-6 수용체가 혈장 중에 있어서 어느 정도 중화되어 있는지를 평가하기 위해, 마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체에 의해 결합(중화)되어 있지 않은 가용형 인간 IL-6 수용체 농도(유리 hsIL-6R 농도)를 전기화학 발광법으로 측정하였다. 10000, 5000, 2500, 1250, 625, 312.5, 또는 156.25 pg/mL로 조정한 hsIL-6R 검량선 시료 및 마우스의 혈장 시료 12 μL를, 0.22 ㎛의 필터 컵(Millipore)에 있어서 건조시킨 적량의 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare) 수지에 첨가함으로써 혈장 중에 존재하는 모든 IgG형 항체(마우스 IgG, 항인간 IL-6 수용체 항체 및 항인간 IL-6 수용체 항체-가용형 인간 IL-6 수용체 복합체)를 프로테인 A에 흡착시켰다. 그 후, 고속 원심기로 스핀 다운하고, 패스용액을 회수하였다. 패스용액에는 프로테인 A에 결합한 항인간 IL-6 수용체 항체-가용형 인간 IL-6 수용체 복합체는 포함되지 않기 때문에, 패스용액 중의 hsIL-6R 농도를 측정함으로써, 혈장 중의 유리 hsIL-6R 농도를 측정 가능하다. 다음으로 패스용액을, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 단일클론 항인간 IL-6R 항체(R&D) 및 비오틴화 항인간 IL-6R 항체(R&D)와 혼합하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후, MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하였다. 추가로 실온에서 1시간 반응시켜 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)를 분주하고, 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정을 행하였다. hsIL-6R 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 유리 hsIL-6R 농도 추이를 도 35에 나타내었다.
(3-6) pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합의 효과
H54/L28-IgG1과 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합을 갖는 Fv4-IgG1의 in vivo 시험의 결과를 비교하였다. 도 31 및 도 33에 나타낸 바와 같이, 양자의 항체 혈장 중 체류성은 거의 동등하였으나, 도 32 및 도 34에 나타내는 바와 같이, pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합을 갖는 Fv4-IgG1과 동시에 투여한 hsIL-6R 쪽이, H54/L28-IgG1과 동시에 투여한 hsIL-6R과 비교하여, hsIL-6R의 소실이 빨라져 있는 것이 확인되었다. 이 경향은 인간 FcRn 형질전환 마우스와 정상 마우스 양쪽에서 확인되고, pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합능을 부여함으로써 4일 후의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 각각 약 17배 및 약 34배 저감할 수 있는 것이 발견되었다.
(3-7) 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn으로의 결합의 효과
천연형 인간 IgG1은 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 인간 FcRn에 거의 결합하지 않는(친화성이 매우 약한) 것이 보고되어 있다. 천연형 인간 IgG1에 대해 EU 넘버링에 있어서의 434번째를 Asn으로부터 Trp로 치환함으로써, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 증가하는 것이 보고되어 있다(J Immunol. 2009;182(12):7663-71.). Fv4-IgG1, 및 Fv4-IgG1에 대해 이 아미노산 치환을 도입한 Fv4-IgG1-v2의 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 in vivo 시험의 결과를 비교하였다. 도 31에 나타낸 바와 같이, 양자의 항체 혈장 중 체류성은 거의 동등하였으나, 도 32에 나타내는 바와 같이, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 증가한 Fv4-IgG1-v2와 동시에 투여한 hsIL-6R 쪽이, Fv4-IgG1과 동시에 투여한 hsIL-6R과 비교하여, hsIL-6R의 소실이 빨라져 있는 것이 확인되었다. 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 부여함으로써 4일 후의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 약 4배 저감할 수 있는 것이 발견되었다.
인간 FcRn과 마우스 FcRn의 상동성(homology)으로부터 EU 넘버링에 있어서의 434번째의 Asn으로부터 Trp로의 치환은, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 마우스 FcRn으로의 결합도 증가시킨다고 생각된다. 또한, EU 넘버링에 있어서의 252번째를 Met로부터 Tyr로, 254번째를 Ser로부터 Thr로, 256번째를 Thr로부터 Glu로 치환함으로써, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합이 증가하는 것이 보고되어 있다(J Immunol. 2002;169(9):5171-80.). Fv4-IgG1, 및 Fv4-IgG1에 대해 이들 아미노산 치환을 각각 도입한 Fv4-IgG1-v1과 Fv4-IgG1-v2의 정상 마우스에 있어서의 in vivo 시험의 결과를 비교하였다. 도 33에 나타낸 바와 같이, Fv4-IgG1과 비교하여, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 마우스 FcRn으로의 결합도 증가시킨 Fv4-IgG1-v1과 Fv4-IgG1-v2의 혈장 중 체류성은 약간 저하되었다(1일 후의 혈장 중 항체 농도가 각각 약 1.5배 및 약 1.9배 저하).
도 34에 나타내는 바와 같이, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합이 증가한 Fv4-IgG1-v1 또는 Fv4-IgG1-v2와 동시에 투여한 hsIL-6R 쪽이, Fv4-IgG1과 동시에 투여한 hsIL-6R과 비교하여, hsIL-6R의 소실이 현저히 빨라져 있는 것이 확인되었다. 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합을 부여함으로써, Fv4-IgG1-v1과 Fv4-IgG1-v2는 1일 후의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 각각 약 32배 및 약 80배 저감할 수 있는 것이 발견되었다. 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합을 부여함으로써, 전술한 바와 같이 항체의 혈장 중 농도도 약간 저하되었으나, 그것을 대폭으로 윗도는 혈장 중 hsIL-6R 농도 저감효과를 나타내는 것이 발견되었다. 또한 hsIL-6R 단독의 투여군과 비교해도, Fv4-IgG1-v1 또는 Fv4-IgG1-v2와 동시에 투여한 hsIL-6R 쪽이 hsIL-6R의 소실이 빨라져 있는 것이 발견되었다. 도 34에 나타내는 바와 같이, hsIL-6R 단독과 비교하여, Fv4-IgG1-v1 또는 Fv4-IgG1-v2와 동시에 hsIL-6R을 투여함으로써 1일 후의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 각각 약 4배 및 약 11배 저감할 수 있는 것이 발견되었다. 이는 즉, pH 의존적으로 가용형 IL-6 수용체에 결합하고, 또한 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 마우스 FcRn에 대한 결합을 부여한 항체의 투여에 의해, 가용형 IL-6 수용체의 소실을 항체에 의해 가속시킬 수 있는 것을 의미한다. 즉, 이러한 항체를 생체내에 투여함으로써, 생체내에서 혈장 중의 항원 농도를 저감하는 것이 가능해진다.
도 35에 나타내는 바와 같이, H54/L28-IgG1은 투여 7일 후까지 유리 hsIL-6R 농도가 검출되었으나, Fv4-IgG1은 투여 후 1일 이후에는 유리 hsIL-6R이 검출되지 않고, Fv4-IgG1-v1 또는 Fv4-IgG1-v2는 투여 후 7시간 이후에는 유리 hsIL-6R이 검출되지 않았다. 즉, hsIL-6R에 대해 pH 의존적 결합을 갖는 Fv4-IgG1은, H54/L28-IgG1과 비교하여 낮은 유리 hsIL-6R 농도를 나타낸 것으로부터, hsIL-6R에 대해 pH 의존적 결합을 부여함으로써 높은 hsIL-6R의 중화효과를 발휘하고, 또한 Fv4-IgG1에 대해 pH 7.4에 있어서 FcRn으로의 결합을 증가시킨 Fv4-IgG1-v1 및 Fv4-IgG1-v2는, 더욱 낮은 유리 hsIL-6R 농도를 나타낸 것으로부터, pH 7.4에 있어서 FcRn으로의 결합을 증가시킴으로써 더욱 높은 hsIL-6R의 중화효과를 발휘하는 것이 가능한 것이 확인되었다.
H54/L28-IgG1과 같은 통상의 중화항체는, 항체를 투여하면 결합하는 항원의 클리어런스를 저하시켜, 항원은 보다 혈장 중에 오래 체류한다. 항체 투여에 의해 그 작용을 중화하고자 하는 항원의 혈장 중 체류성이 길어지는 것은 바람직하지 않다. 항원에 대한 결합에 pH 의존성(중성 조건하에서 결합하고, 산성 조건하에서 해리됨)을 부여함으로써, 항원의 혈장 중 체류성을 짧게 하는 것이 가능하다. 금번, 추가로 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 부여함으로써, 항원의 혈장 중 체류성을 더욱 짧게 할 수 있었다. 또한, pH 의존적으로 항원에 결합하여 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 부여한 항체를 투여함으로써, 항원 단독의 클리어런스보다도 클리어런스를 증대시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 지금까지 항체 투여에 의해 항원 단독의 클리어런스보다도 클리어런스를 증대시키는 방법은 알려져 있지 않아, 본 검토에서 발견된 방법은, 항체 투여에 의해 혈장 중으로부터 항원을 소실시키는 방법으로서 매우 유용하다. 또한, 본 검토에 의해 비로소 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증가시키는 것의 이점이 발견되었다. 또한, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증가시키는 다른 아미노산 치환을 갖는 Fv4-IgG1-v1과 Fv4-IgG1-v2의 양쪽에 있어서 동일한 효과가 확인된 것으로부터, 아미노산 치환의 종류에 상관없이, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 증가시키는 아미노산 치환이라면, 항원의 소실을 가속시키는 효과가 있다고 생각된다. 즉, J Biol Chem. 2007;282(3):1709-17에 보고되어 있는 EU 넘버링 257번째의 Pro를 Ile로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 311번째의 Gln을 Ile로 치환하는 아미노산 치환, J Immunol. 2009;182(12):7663-71.에 보고되어 있는 EU 넘버링 434번째의 Asn을 Ala, Tyr 또는 Trp로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 252번째의 Met를 Tyr로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 307번째의 Thr을 Gln로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 308번째의 Val을 Pro로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 250번째의 Thr을 Gln으로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 428번째의 Met를 Leu로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 380번째의 Glu를 Ala로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 378번째의 Ala를 Val로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 436번째의 Tyr을 Ile로 치환하는 아미노산 치환, J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24에 보고되어 있는 EU 넘버링 252번째의 Met를 Tyr로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 254번째의 Ser을 Thr로 치환하는 아미노산 치환, EU 넘버링 256번째의 Thr을 Glu로 치환하는 아미노산 치환, Nat Biotechnol. 2005 Oct;23(10):1283-8.에 보고되어 있는 433번째의 His를 Lys로 치환하는 아미노산 치환, 434번째의 Asn을 Phe로 치환하는 아미노산 치환, 436번째의 Tyr을 His로 치환하는 아미노산 치환 등, 및 이들 아미노산 치환의 조합을 사용함으로써, 투여로 혈장 중으로부터 항원을 소실시키는 항체 분자를 제작 가능하다고 생각된다.
〔참고예 4〕인간 FcRn으로의 결합 활성의 평가
Biacore를 사용한 항체와 FcRn의 상호작용을 평가하는 측정계로서, J Immunol. 2009;182(12):7663-71.에 기재된 센서칩으로 항체를 고정화하여 인간 FcRn을 애널라이트로 하는 시스템이 보고되어 있다. 이 목적을 위해, 인간 FcRn을 참고예 2에 기재된 바와 같이 조제하였다. 본 계를 사용하여, Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-v1 및 Fv4-IgG1-v2의 pH 6.0 및 pH 7.4에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합 활성(해리상수 KD)의 평가를 행하였다. 피험물질인 항체는, Series S 센서칩 CM5에 직접 고정화하여 시험에 제공하였다. 센서칩으로의 항체의 고정화는, 런닝 버퍼로서 50 mmol/L 인산나트륨/150 mmol/L NaCl, 0.05%(v/v%) Surfactant P20 pH 6.0을 사용하고, 아민 커플링 키트를 사용하여 메이커의 매뉴얼에 따라 고정화량 500RU를 목표로 실시하였다.
런닝 버퍼로서, 50 mmol/L 인산나트륨/150 mmol/L NaCl, 0.05% Surfactant P20 pH 6.0, 또는 50 mmol/L 인산나트륨/150 mmol/L NaCl, 0.05% Surfactant P20 pH 7.4를 사용하고, 제작한 센서칩을 사용하여 측정을 실시하였다. 측정은 모두 25℃에서 행하였다. 인간 FcRn 희석액과 런닝 버퍼(참조 용액으로서)를 유속 5 μL/min로 10분간 인젝트하고, 센서칩 상의 항체에 인간 FcRn을 상호작용시켰다. 그 후 유속 5 μL/min로 1분간 런닝 버퍼를 흘려 FcRn의 해리를 관찰한 후, 20 mmol/L Tris-HCl/150 mmol/L NaCl, pH 8.1을 유속 30 μL/min로 15초간 인젝트를 2회 반복하여 센서칩을 재생하였다.
측정결과의 해석은 Biacore T100 Evaluation Software(Ver. 2.0.1)로 행하였다. 적어도 6개의 상이한 농도의 FcRn의 측정결과로부터 정상상태 친화성법(steady-state affinity method)에 의해 해석하여 해리상수(KD)를 산출하였다. Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-v1 및 Fv4-IgG1-v2의 pH 6.0 및 pH 7.4에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합 활성(해리상수 KD)의 결과를 이하의 표 24에 나타내었다.
Figure pat00032
Fv4-IgG1의 pH 7.4에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합은 매우 약하여, KD값을 산출할 수는 없었다(NA). 그것에 대해, Fv4-IgG1-v1과 Fv4-IgG1-v2는 pH 7.4에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합이 확인되고, KD값은 각각 36.55 μM와 11.03 μM로 산출되었다. 또한, pH 6.0에 있어서의 인간 FcRn으로의 KD값은 각각 1.99 μM와 0.32 μM와 0.11 μM로 산출되었다. 도 31에 나타낸 바와 같이, 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서, Fv4-IgG1과 비교하여, Fv4-IgG1-v2로 함으로써 hsIL-6R의 소실이 가속된 것으로부터, 인간 IgG1을 개변하여 최저 pH 7.4에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 11.03 μM보다도 강하게 함으로써, 항원의 소실을 가속시킬 수 있다고 생각된다. 또한, J Immunol. 2002;169(9):5171-80.에 나타내어져 있는 바와 같이 인간 IgG1은 마우스 FcRn에 대해 인간 FcRn보다도 10배 정도 강하게 결합하는 것으로부터, Fv4-IgG1-v1과 Fv4-IgG1-v2에 있어서도 pH 7.4에 있어서의 마우스 FcRn으로의 결합은 인간 FcR에 대한 결합보다도 10배 정도 강할 것으로 예상된다. 도 34에 나타낸 정상 마우스에 있어서의 Fv4-IgG1-v1과 Fv4-IgG1-v2의 hsIL-6R의 소실 가속은, 도 32에 나타낸 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 Fv4-IgG1-v2의 hsIL-6R의 소실 가속보다도 큰 것으로부터, pH 7.4에 있어서의 FcRn으로의 결합의 강도에 따라, hsIL-6R의 소실 가속이 커질 것으로 생각된다.
〔참고예 5〕중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시킨 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체의 조제
(5-1) Fv4-IgG1의 중쇄 정상영역 개변체의 제작
인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의, pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체의 항원 소실효과를 추가로 증대시키기 위해, Fv4-IgG1에 대해, 중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시키기 위한 다양한 개변을 도입하였다. 구체적으로는, 표 25-1 및 25-2에 기재된 아미노산 개변을 Fv4-IgG1의 중쇄 정상영역에 도입함으로써, 각종 변이체를 제작하였다(변이 개소의 아미노산 번호는 EU 넘버링에 따름). 또한, 아미노산 치환의 도입은 참고예 3에 기재된 당업자 공지의 방법에 따라 실시하였다.
[표 25-1]
Figure pat00033
표 25-2는 표 25-1의 계속되는 표이다.
[표 25-2]
Figure pat00034
조제한 중쇄와 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 변이체를, 참고예 3에 기재된 당업자 공지의 방법으로 발현시켜서 정제하였다.
(5-2) 인간 FcRn에 대한 결합 평가
Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여, 인간 FcRn과 항체의 속도론적 해석을 행하였다. 이 목적을 위해, 인간 FcRn을 참고예 2에 기재한 바와 같이 조제하였다. 센서칩 CM4(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 프로테인 L(ACTIGEN)을 적당량 고정화하고, 거기에 목적의 항체를 포착시켰다. 다음으로, FcRn 희석액과 런닝 버퍼(참조 용액으로서)를 인젝트하고, 센서칩 상에 포착시킨 항체에 인간 FcRn을 상호작용시켰다. 런닝 버퍼에는 50 mmol/L 인산나트륨, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20, pH 7.0을 사용하고, FcRn의 희석에도 각각의 버퍼를 사용하였다. 칩의 재생에는 10 mmol/L 글리신-HCl, pH 1.5를 사용하였다. 측정은 모두 25℃에서 실시하였다. 측정으로 얻어진 센서그램으로부터, 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms), 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 각 항체의 인간 FcRn에 대한 KD(M)를 산출하였다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하였다.
Biacore에 의한 중성 조건하(pH 7.0)에서의 인간 FcRn으로의 결합 평가의 결과를, 표 6-1 및 6-2에 기재하였다. 여기서, 천연형 IgG1은 결합이 매우 약하여, KD는 산출 불가능하였기 때문에, 표 6-1에 ND로 표기하였다.
〔참고예 6〕중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시킨 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체의 in vivo 시험
참고예 4에서 조제한 중성 조건하에서의 인간 FcRn으로의 결합능을 부여한 중쇄를 사용해서, 중성 조건하에서의 인간 FcRn으로의 결합능을 갖는 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체를 제작하여, 생체내에서의 항원 소실효과의 검증을 행하였다. 구체적으로는,
VH3-IgG1과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1,
VH3-IgG1-v2와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-v2,
VH3-IgG1-F14와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F14,
VH3-IgG1-F20과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F20,
VH3-IgG1-F21과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F21,
VH3-IgG1-F25와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F25,
VH3-IgG1-F29와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F29,
VH3-IgG1-F35와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F35,
VH3-IgG1-F48과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F48,
VH3-IgG1-F93과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F93,
VH3-IgG1-F94와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F94
를, 참고예 3에 기재된 당업자 공지의 방법으로 발현시켜서 정제하였다.
조제한 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체에 대해서, 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 계통 276 +/+ 마우스, Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010;602:93-104.)를 사용한 in vivo 시험을, 참고예 3의 방법과 동일하게 실시하였다.
얻어진 정맥내 투여 후의 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 도 36에 나타내었다. 시험의 결과, 중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시킨 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체는 모두, 중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합능을 거의 갖지 않는 Fv4-IgG1과 비교하여, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 낮게 추이하는 것이 나타내어졌다. 그 중에서도, 특히 현저한 효과를 나타낸 것으로서 예를 들면, Fv4-IgG1-F14와 동시에 투여된 가용형 인간 IL-6 수용체의 1일 후의 혈장 중 농도는, Fv4-IgG1과 동시에 투여된 그것과 비교하여, 약 54배 저하되는 것이 나타내어졌다. 또한, Fv4-IgG1-F21과 동시에 투여된 가용형 인간 IL-6 수용체의 7시간 후의 혈장 중 농도는, Fv4-IgG1과 동시에 투여된 그것과 비교하여, 약 24배 저하되는 것이 나타내어졌다. 더 나아가서는, Fv4-IgG1-F25와 동시에 투여된 가용형 인간 IL-6 수용체의 7시간 후의 혈장 중 농도는, 검출한계(1.56 ng/mL) 이하로, Fv4-IgG1과 동시에 투여된 그것과 비교하여, 200배 이상 현저한 항원 농도의 저하가 가능하다고 생각되었다. 이들 사실로부터, 항원 소실효과를 증강시키는 것으로 목적으로 하여, pH 의존적 항원 결합 항체에 대해 중성 조건하에서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시키는 것은 매우 유효한 것이 나타내어졌다. 또한, 항원 소실효과를 증강시키기 위해 도입되는, 중성 조건하에서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시키는 아미노산 개변의 종류는 표 6-1, 표 6-2에 기재된 개변을 포함하여 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개변을 도입해도, 생체내에 있어서 항원 소실효과를 증강시키는 것이 가능하다고 생각된다.
또한, Fv4-IgG1-F14, Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F25, Fv4-IgG1-F48의 4종의 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체와 동시에 투여한 가용형 인간 IL-6 수용체는, 가용형 인간 IL-6 수용체의 단독 투여군과 비고해도, 보다 낮은 혈장 중 농도 추이를 나타내었다. 이러한 pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체를, 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 일정 농도를 유지하고 있는 상태(정상상태)에 있는 생체내에 투여함으로써, 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 정상상태에 있어서의 혈장 중 농도보다도, 보다 낮게 유지하는 것이 가능하다. 즉, 이러한 항체를 생체내에 투여함으로써, 생체내에서 혈장 중의 항원 농도를 저감시키는 것이 가능해진다.
〔참고예 7〕사용량(0.01 ㎎/㎏)에 있어서의 Fv4-IgG1-F14의 유효성의 검증
참고예 6에서 조제한 Fv4-IgG1-F14를 사용해서, 저용량(0.01 ㎎/㎏)에 있어서의 in vivo 시험을 참고예 6의 방법과 동일하게 행하여, 참고예 6에서 얻어진 Fv4-IgG1 및 Fv4-IgG1-F14의 1 ㎎/㎏ 투여시의 결과와 비교하였다(결과를 도 37 및 38에 나타내었다).
그 결과, Fv4-IgG1-F14의 0.01 ㎎/㎏ 투여군의 혈장 중 항체 농도는, 1 ㎎/㎏ 투여군과 비교하여 100배 정도 낮음에도 불구하고(도 38), 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이는 거의 동등한 것이 나타내어졌다(도 37). 또한, Fv4-IgG1-F14의 0.01 ㎎/㎏ 투여군의 7시간 후의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는, Fv4-IgG1의 1 ㎎/㎏ 투여군의 그것과 비교하여, 약 3배 저하시키는 것이 나타내어졌다. 또한, Fv4-IgG1-F14는, 어느 용량으로의 투여군에 있어서도, 가용형 인간 IL-6 수용체 단독 투여군과 비교하여, 보다 낮은 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내었다(도 37).
이 사실로부터, Fv4-IgG1에 대해 중성 조건하에서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시킨 Fv4-IgG1-F14는, Fv4-IgG1의 100분의 1의 투여량이더라도, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 효과적으로 저하시키는 것이 나타내어졌다. 즉, pH 의존적 항원 결합 항체에 대해, 중성 조건하에서의 FcRn으로의 결합능을 증강시킴으로써, 보다 낮은 투여량이더라도 효과적으로 항원을 소실시키는 것이 가능해질 것으로 생각된다.
〔참고예 8〕정상 마우스를 사용한 정상상태 모델에 의한 in vivo 시험
(8-1) 중성 조건하에 있어서의 마우스 FcRn으로의 결합 평가
참고예 5에서 조제한,
VH3-IgG1(서열번호：19)과 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 VH3/L(WT)-IgG1,
VH3-IgG1-v2(서열번호：22)와 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 VH3/L(WT)-IgG1-v2,
VH3-IgG1-F20(서열번호：23)과 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 VH3/L(WT)-IgG1-F20,
에 대해서, 이하의 방법에 의해 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 마우스 FcRn으로의 결합 평가를 실시하였다.
Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여, 마우스 FcRn과 항체의 속도론적 해석을 행하였다. 센서칩 CM4(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 프로테인 L(ACTIGEN)을 적당량 고정화하고, 거기에 목적의 항체를 포착시켰다. 다음으로, FcRn 희석액과 런닝 버퍼(참조 용액으로서)를 인젝트하고, 센서칩 상에 포착시킨 항체에 마우스 FcRn을 상호작용시켰다. 런닝 버퍼에는 50 mmol/L 인산나트륨, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20, pH 7.4를 사용하고, FcRn의 희석에도 각각의 버퍼를 사용하였다. 칩의 재생에는 10 mmol/L 글리신-HCl, pH 1.5를 사용하였다. 측정은 모두 25℃에서 실시하였다. 측정으로 얻어진 센서그램으로부터, 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms), 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 각 항체의 마우스 FcRn에 대한 KD(M)를 산출하였다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하였다.
결과를 표 26(pH 7.4에 있어서의 마우스 FcRn 친화성)에 나타내었다. 여기서, 정상영역이, 천연형 IgG1인 VH3/L(WT)-IgG1(표 26에 있어서의 IgG1)은, 마우스 FcRn에 대한 결합이 매우 약하여, KD는 산출 불가능하였기 때문에, 표 26에는 ND로 표기하였다. 측정 결과, 중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증강시킨 이들의 개변체는, 마우스 FcRn에 대해서도 마찬가지로, 중성 조건하에 있어서의 결합이 증강되어 있는 것이 나타내어졌다.
Figure pat00035
(8-2) 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 정상상태로 한 정상 마우스에 있어서의 in vivo 시험
실시예 3 및 참고예 5에서 조제한, H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-v2 및 Fv4-IgG1-F20을 사용하여, 하기의 방법으로 in vivo 시험을 행하였다.
정상 마우스(C57BL/6J 마우스, Charles River Japan)의 배부(背部) 피하에, 가용형 인간 IL-6 수용체를 충전한 주입 펌프(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet)를 메워넣음으로써, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 정상상태로 유지되는 동물 모델을 제작하였다. 그 동물 모델에 대해, 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여하고, 투여 후의 가용형 인간 IL-6 수용체의 생체내에 있어서의 동태를 평가하였다. 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 중화항체의 생산을 억제하기 위해, 단일클론 항마우스 CD4 항체(R&D)를 꼬리 정맥에 20 ㎎/㎏으로 단회 투여하였다. 그 후, 92.8 ㎍/mL의 가용형 인간 IL-6 수용체를 충전한 주입 펌프를 마우스 배부 피하에 메워넣었다. 주입 펌프 메워넣기 3일 후에, 항인간 IL-6 수용체 항체를 꼬리 정맥에 1 ㎎/㎏으로 단회 투여하였다. 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 15분 후, 7시간 후, 1일 후, 2일 후, 3일 후, 4일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후, 28일 후에 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 어세이를 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다.
(8-3) 혈장 중 항인간 IL-6 수용체 항체 농도의 ELISA법에 의한 측정
참고예 3과 동일한 방법으로 실시하였다.
(8-4) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 hsIL-6R 농도 측정
실시예 5와 동일한 방법으로 실시하였다.
도 39에 나타낸 바와 같이, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 약 40 ng/mL에 있어서 정상상태를 유지하고 있는 정상 마우스(hsIL-6R군)에 대해, 가용형 인간 IL-6 수용체의 중화항체인 H54/L28-IgG1을 투여하자, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 650 ng/mL(투여 전의 15배)까지 상승하였다. 한편으로, H54/L28-IgG1에 pH 의존적 항원 결합능을 부여한 Fv4-IgG1의 투여군에 있어서는, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 70 ng/mL 정도를 유지하고 있었다. 이 사실로부터, 통상의 중화항체인 H54/L28-IgG1의 투여에 의해 유발되는 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도의 상승은, pH 의존적 결합능을 부여함으로써, 10분의 1 정도로까지 억제할 수 있는 것이 나타내어졌다.
또한, pH 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체에 대해, 중성 조건하에서의 FcRn으로의 결합을 증강시키는 개변을 도입한 Fv-IgG1-v2 및 Fv-IgG1-F20의 투여에 의해, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 정상상태의 10분의 1 이하로까지 저하된 상태를 유지하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 여기서, Fv-IgG1-v2는, 투여로부터 14일 후에 있어서의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 약 2 ng/mL로, 투여 전의 20분의 1로까지 저하시키는 것이 가능하였다. 또한, Fv-IgG1-F20은, 투여로부터 7시간 후, 1일 후, 2일 후, 4일 후의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는, 검출한계(1.56 ng/mL) 이하로, 투여 전의 25분의 1 이하로까지 저하시키고 있는 것이 나타내어졌다.
이상의 사실로부터, 혈장 중의 항원 농도가 정상상태를 유지하고 있는 동물 모델에 대해, pH 의존적 항원 결합능과 중성 조건하에서의 FcRn으로의 결합능을 겸비하는 항체를 투여함으로써, 혈장 중의 항원의 소실속도를 증가시켜, 혈장 중 항원 농도를 현저히 저하시키는 가능한 것이 나타내어졌다.
통상의 항체는, H54/L28-IgG1과 같이, 표적 항원에 대해 결합함으로써만 그 작용을 중화할 수 있고, 더욱 나쁘게도 혈장 중의 항원 농도의 상승이 일어나 버린다. 한편, pH 의존적 항원 결합능과 중성 조건하에서의 FcRn으로의 결합능을 겸비하는 항체는, 표적 항원을 중화할 뿐 아니라, 혈장 중의 표적 항원의 농도를 저하시키는 것이 가능한 것이 발견되었다. 항원을 혈장 중으로부터 제거함으로써, 중화 이상의 높은 효과를 갖는 것을 기대할 수 있다. 또한, 중화만으로는 불충분한 표적 항원에 대해서도, 효과를 나타내는 것이 가능해질 것으로 생각된다.
〔참고예 9〕항원 소실을 증강시키는데 필요한 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성 역치의 동정, 및 항원 소실과 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성의 관계
(9-1) in vivo 시험을 위한 항체 조제
pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 증가된 VH3-IgG1(서열번호：19)과 VL3-CK(서열번호：20)를 포함하는 Fv4-IgG1의 Fc 변이체를 제작하였다. 구체적으로는, VH3-M73(서열번호：24) 및 VH3-IgG1-v1(서열번호：21)을 조제하였다. 아미노산 치환의 도입은 참고예 3에 기재된 당업자 공지의 방법에 따라 실시하였다.
H54(서열번호：5)와 L28(서열번호：6)을 포함하는 H54/L28-IgG1, VH3-IgG1(서열번호：19)과 VL3-CK(서열번호：20)를 포함하는 Fv4-IgG1, VH3-M73(서열번호：24)과 VL3-CK(서열번호：20)를 포함하는 Fv4-M73, VH3-IgG1-v1(서열번호：21)과 VL3-CK(서열번호：20)를 포함하는 Fv4-IgG1-v1, 및 VH3-IgG1-v2(서열번호：22)와 VL3-CK(서열번호：20)를 포함하는 Fv4-IgG1-v2를, 참고예 3에 기재된 당업자 공지의 방법으로 발현시켜서 정제하였다.
(9-2) pH 중성 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성의 평가
VH3-IgG1(서열번호：19)과 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 VH3/L(WT)-IgG1, VH3-M73(서열번호：24)과 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 VH3/L(WT)-M73, VH3-IgG1-v1(서열번호：21)과 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 VH3/L(WT)-IgG1-v1, 및 VH3-IgG1-v2(서열번호：22)와 L(WT)(서열번호：14)을 포함하는 VH3/L(WT)-IgG1-v2는, 그 모두를 참고예 3에 기재된 바와 같이 조제하여, 중성 pH(pH 7.0)에 있어서의 인간 FcRn 결합에 관하여 평가하였다.
인간 FcRn에 대한 VH3/L(WT)-IgG1-v1 및 VH3/L(WT)-IgG1-v2의 결합 활성을, 참고예 5에 기재된 방법을 사용해서 측정하였다. 인간 FcRn에 대한 VH3/L(WT)-IgG1 및 VH3/L(WT)-M73의 결합 활성이 낮기 때문에, 실시예 5에 기재된 방법으로는 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 측정할 수 없어, 이들 항체를 이하에 기재하는 방법으로 평가하였다. 항체와 인간 FcRn의 결합의 동태를 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용해서 해석하였다. 센서칩 CM4(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 적당량의 프로테인 L(ACTIGEN)을 고정화하고, 칩에 목적의 항체를 포착시켰다. 다음으로, 희석한 FcRn 용액과 런닝 버퍼(참조 용액으로서)를 인젝트하고, 센서칩 상에 포착시킨 항체에 인간 FcRn을 상호작용시켰다. 런닝 버퍼로서, 50 mmol/l 인산나트륨, 150 mmol/l NaCl, 0.05%(w/v) Tween 20, pH 7.0을 사용하였다. FcRn을 각 버퍼를 사용해서 희석하였다. 칩을 10 mmol/l 글리신-HCl(pH 1.5)을 사용해서 재생하였다. 측정은 25℃에서 행하였다.
각 항체의 KD(M)를, 센서그램의 결합 및 해리상을 동시에 적합시켜서, 실행 중의 조(組)에 있어서의 모든 곡선을 일괄 적합시키는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여 센서그램 데이터로부터 도출하였다. 센서그램을, Biacore T100 Evaluation Software에 의해 제공된 1：1 결합 모델인 「랭뮤어 결합」 모델에 적합시켰다. 결합 상호작용의 몇 가지에 대해서는, 평형에 기초하는 어프로치를 이용하여, 애널라이트 농도의 대수(log)에 대해 평형 결합 리스폰스인 Req를 플로팅하여, 비선형 회귀 분석에 의해 KD를 도출하였다.
중성 조건하(pH 7.0)에 있어서의 인간 FcRn 결합에 대한 Biacore에 의한 결과를 표 27에 나타낸다.
Figure pat00036
(9-3) 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276을 사용한 동시 투여 모델에 있어서의 항체의 항원 소실효과의 in vivo 시험
동시 투여 모델을 사용한 항체의 in vivo 시험을 참고예 3에 기재한 바와 같이 행하였다. 본 시험에 있어서 사용한 항인간 IL-6 수용체 항체는, 앞서 기재한 H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, Fv4-M73, Fv4-IgG1-v1, 및 Fv4-IgG1-v2이다. 이 시험에 있어서 사용한 마우스는 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 계통 276 +/+ 마우스, Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104)이다.
도 40에 나타내는 바와 같이, H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, Fv4-M73, Fv4-IgG1-v1, 및 Fv4-IgG1-v2의 약물동태는 동등하여, 이들 항체는 시험 간 유사한 혈장 중 농도를 유지하였다.
혈장 중 hsIL-6 농도 추이를 도 41에 나타내었다. Fv4-IgG1과 함께 투여한 hsIL-6R과 비교하여, Fv4-IgG1-v2와 함께 투여한 hsIL-6R은, 클리어런스의 증대를 나타내었으나, Fv4-M73 및 Fv4-IgG1-v1과 함께 투여한 hsIL-6R은 클리어런스의 저하를 나타내었다. M73, v1 및 v2의 모든 Fc 변이체가, 인간 FcRn에 대해 pH 중성 조건하(pH 7.0)에 있어서 결합 친화성이 증대되어 있는데, hsIL-6R 클리어런스의 증대를 나타낸 것은 Fv4-IgG1-v2 뿐이고, Fv4-M73 및 Fv4-IgG1-v1은 증대를 나타내지 않았다. 이는, 항원의 클리어런스를 증대시키기 위해서는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성이 KD 3.2 μM이거나 또는 천연형 인간 IgG1(인간 FcRn에 대한 결합 친화성은 KD 88 μM)보다 28배 높은 IgG1-v1과 비교하여, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성이, 그것보다 적어도 높을 필요가 있는 것을 나타내고 있다.
도 42는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 친화성과, hsIL-6R 및 Fc 변이체를 동시 투여한 1일 후의 혈장 중 hsIL-6R 농도의 관계를 나타낸다. 본 실시예 및 참고예 6에 기재된 Fc 변이체(Fv4-IgG1, Fv4-M73, Fv4-IgG1-v1, Fv4-IgG1-v2, Fv4-IgG1-F14, Fv4-IgG1-F20, Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F25, Fv4-IgG1-F29, Fv4-IgG1-F35, Fv4-IgG1-F48, Fv4-IgG1-F93, 및 Fv4-IgG1-F94)를 플로팅하고 있다. pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성을 증대시키면, 항원의 클리어런스를 반영하는 혈장 중 hsIL-6R 농도는, 처음에 증가한 후, 급격하게 저하되었다. 이는, 천연형 인간 IgG1과 비교하여 항원 클리어런스를 증대시키기 위해서는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성이, 바람직하게는 KD 2.3 μM(도 42의 곡선에 적용시켜 얻은 값)보다 강할 필요가 있는 것을 나타내고 있다. 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성이 KD 88 μM~KD 2.3 μM인 경우, 오히려 항원 클리어런스는 저하되는 것으로 생각된다(보다 높은 hsIL-6R 농도). 바꿔말하면, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성은, 항원의 소실을 증강시키기 위해서는, 바람직하게는 천연형 인간 IgG1보다 38배 높을 필요가 있고, 그렇지 않으면 항원 클리어런스는 저하될 것으로 생각된다.
도 43은, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 친화성과, hsIL-6R 및 Fc 변이체를 동시 투여한 1일 후의 혈장 중 항체 농도의 관계를 나타낸다. 본 실시예 및 참고예 6에 기재된 Fc 변이체(Fv4-IgG1, Fv4-M73, Fv4-IgG1-v1, Fv4-IgG1-v2, Fv4-IgG1-F14, Fv4-IgG1-F20, Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F25, Fv4-IgG1-F29, Fv4-IgG1-F35, Fv4-IgG1-F48, Fv4-IgG1-F93, 및 Fv4-IgG1-F94)를 플로팅하고 있다. pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성을 증대시키면, 항체의 약물동태(클리어런스)를 반영하는 혈장 중 항체 농도는 처음에 유지되지만, 그 후 급격하게 저하된다. 이는, 천연형 인간 IgG1(인간 FcRn에 대한 결합 친화성은 KD 88 μM)과 유사한 항체의 약물동태를 유지하기 위해서는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 친화성이, KD 0.2 μM(도 43의 곡선에 적용하여 얻은 ??)보다 약할 필요가 있는 것을 나타내고 있다. 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성이 KD 0.2 μM보다 강한 경우, 항체의 클리어런스는 증대되었다(즉, 혈장으로부터의 보다 급속한 항체의 소실). 바꿔말하면, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성은, 천연형 인간 IgG1과 유사한 항체 약물동태를 나타내기 위해서는, 천연형 인간 IgG1과 비교하여 440배 이내의 높이로 할 필요가 있고, 그렇지 않으면 혈장으로부터의 항체의 급속한 소실이 발생할 것으로 생각된다.
도 42 및 43의 양쪽을 고려할 때, 천연형 인간 IgG1과 유사한 항체 약물동태를 유지하면서 IgG1과 비교하여 항원 클리어런스를 증대시키기(즉, 혈장 중 항원 농도를 감소시키기) 위해서는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성이, 2.3 μM~0.2 μM일 필요가 있거나, 또는 바꿔말하면 pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성이, 천연형 인간 IgG1보다 38배~440배 높은 범위일 필요가 있다. 장기간의 항체 소실 활성을 갖는 IgG1과 유사한 약물동태인 그러한 항체는, 장기간 작용성에 의해, 만성 질환 등의 보다 긴 투여 간격을 필요로 하는 항체 치료에 있어서 유익해질 것으로 생각된다.
한편, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성을 KD 0.2 μM보다 강하게 증대시킴으로써, 또는 바꿔말하면 천연형 인간 IgG1과 비교하여 pH 7.0에서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성을 440배보다 높게 증대시킴으로써, 항체는 천연형 인간 IgG1보다 신속하게 혈장으로부터 소실되지만, 항원 클리어런스를 단기간에 상당한 정도의 것으로 증강시킬 것으로 생각된다. 항원 농도의 급속하고 커다란 감소를 유도할 수 있는 그러한 항체는, 그 즉효성에 의해, 질환 관련 항원을 혈장 중으로부터 제거할 필요가 있는 급성 질환 등의 항체 치료에 있어서 유익해질 것으로 생각된다.
항체 1분자당 혈장으로부터 소실되는 항원의 양은, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성이 증대된 항체 Fc 변이체를 투여함으로써 항원 소실효율을 평가하는 경우에 중요한 요인이 된다. 항체 1분자당 항원 소실효율을 평가하기 위해, 본 실시예 및 참고예 6에 기재된 in vivo 시험의 각 시점에서 이하의 계산을 행하였다.
A값：각 시점에서의 항원의 몰 농도
B값：각 시점에서의 항체의 몰 농도
C값：항체 몰 농도당 항원 몰 농도(항원/항체 몰비)
C＝A/B
각 항체에 대한 C값(항원/항체 몰비)의 추이를 도 44에 기재하였다. C값이 보다 작은 것은, 항체 1분자당 항원 소실효율이 보다 높은 것을 나타내는데, C값이 보다 큰 것은, 항체 1분자당 항원 소실효율이 보다 낮은 것을 나타낸다. IgG1과 비교하여 C값이 보다 작으면, Fc 변이체에 의해 보다 높은 항원 소실효율이 얻어진 것을 나타내는데, IgG1과 비교하여 C값이 보다 크면, Fc 변이체가 항원 소실효율에 관하여 부정적인 효과를 갖는 것을 나타낸다. Fv4-M73 및 Fv4-IgG1-v1을 제외한 모든 Fc 변이체가, Fv4-IgG1과 비교하여 항원 소실효율의 증대를 나타내었다. Fv4-M73 및 Fv4-IgG1-v1은, 항원 소실효율에 해 부정적인 영향을 나타내고, 이는 도 42와 일치하였다.
도 45는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 친화성과, hsIL-6R 및 Fc 변이체를 동시 투여한 1일 후의 C값(항원/항체 몰비)의 관계를 나타낸다. 본 실시예 및 참고예 6에 기재된 Fc 변이체(Fv4-IgG1, Fv4-M73, Fv4-IgG1-v1, Fv4-IgG1-v2, Fv4-IgG1-F14, Fv4-IgG1-F20, Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F25, Fv4-IgG1-F29, Fv4-IgG1-F35, Fv4-IgG1-F48, Fv4-IgG1-F93, 및 Fv4-IgG1-F94)를 플로팅하고 있다. 이는, 천연형 인간 IgG1과 비교하여 보다 높은 항원 소실효율을 달성하기 위해서는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 친화성이 KD 3.0 μM(도 45의 곡선에 적용하여 얻은 값)보다 강할 필요가 있는 것을 나타내고 있다. 바꿔말하면, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성은, 천연형 인간 IgG1과 비교하여 보다 높은 항원 소실효율을 달성하기 위해서는, 천연형 인간 IgG1보다 적어도 29배 높을 필요가 있다.
결론으로서는, FcRn에 대해 pH 7.0에서 KD 3.0 μM~0.2 μM의 결합 친화성을 갖는 항체 변이체의 군, 또는 바꿔말하면 FcRn에 대해 pH 7.0에서 천연형 인간 IgG1 보다 29배~440배 높은 범위의 결합 친화성을 갖는 항체 변이체의 군은, IgG1과 유사한 항체 약물동태를 갖지만, 증대된 혈장 중 항체 소실능을 갖는다. 따라서, 그러한 항체는, IgG1과 비교하여 증대된 항원 소실효율을 나타낸다. IgG1과 유사한 약물동태에 의해, 혈장으로부터 항원을 장기간 소실시키는 것이 가능하여(장기간 작용성의 항원 소실), 이로 인해 긴 투여 간격이 가능해져, 이는 만성 질환에 관한 항체 치료 물질에 있어서 바람직하다고 생각된다. FcRn에 대해 pH 7.0에서 KD 0.2 μM 보다 강한 결합 친화성을 갖는 항체 변이체의 군, 또는 바꿔말하면 FcRn에 대해 pH 7.0에서 천연형 인간 IgG1 보다 440배 높은 결합 친화성을 갖는 항체 변이체의 군은, 급속한 항체 클리어런스(단기간의 항체 소실)를 갖는다. 그럼에도 불구하고, 그러한 항체는 항원의 더욱이 보다 급속한 클리어런스를 가능하게 하는 것으로부터(즉효성의 항원 소실), 따라서, 그러한 항체는 또한, IgG1과 비교하여 증대된 항원 소실효율을 나타낸다. 참고예 8에 나타내는 바와 같이, 정상 마우스에 있어서의 Fv4-IgG1-F20은, 혈장으로부터의 항원의 대폭적인 소실을 매우 단기간에 유도하는데, 항원 소실효과는 지속되지 않는다. 그러한 프로파일은, 질환 관련 항원을 매우 단기간에 신속하고 대폭적으로 혈장으로부터 고갈시킬 필요가 있는 급성 질환의 경우에 바람직할 것으로 생각된다.
〔참고예 10〕인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276을 사용한 정상상태 주입 모델에 의한 Fv4-IgG1-F14의 in vivo 시험
인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276을 사용한 하기의 정상상태 주입 모델에 의한 Fv4-IgG1-F14의 in vivo 시험을 행하였다. 시험군은 대조군(항체 없음), 1 ㎎/㎏의 용량에서의 Fv4-IgG1, 및 1 ㎎/㎏, 0.2 ㎎/㎏, 및 0.01 ㎎/㎏의 용량에서의 Fv4-IgG1-F14으로 이루어진다.
인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 계통 276 +/+ 마우스 (B6.mFcRn-/- hFCRN Tg276 B6.Cg-Fcgrt＜tm1Dcr＞ Tg(FCGRT)276Dcr(Jackson #4919)), Jackson Laboratories; Methods Mol Biol.(2010) 602: 93-104)의 배부 피하에, 가용형 인간 IL-6 수용체를 충전한 주입 펌프(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL 2004；alzet)를 메워 넣음으로써, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 일정하게 유지되는 모델 동물을 제작하였다. 모델 동물에 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여하고, 투여 후의 가용형 인간 IL-6 수용체의 생체내에 있어서의 동태를 평가하였다. 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 중화항체의 생산을 억제하기 위해, 주입 펌프를 메워 넣기 전과, 항체를 꼬리 정맥에 투여한 14일 후에, 단일클론 항마우스 CD4 항체(R&D)를 20 ㎎/㎏으로 투여하였다. 다음으로, 92.8 ㎍/㎖의 가용형 인간 IL-6 수용체를 충전한 주입 펌프를 마우스의 배부 피하에 메워 넣었다. 주입 펌프 메워 넣기 3일 후에, 항인간 IL-6 수용체 항체(H54/L28-IgG1 및 H54/L28-IgG1-F14)를 꼬리 정맥에 1 ㎎/㎏으로 단회 투여하였다. 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 15분 후, 7시간 후, 1일 후, 2일 후, 3일 후, 4일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후, 및 28일 후에 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다.
마우스 혈장 중의 hsIL-6R 농도는 전기화학 발광으로 측정하였다. 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, 및 31.25 pg/㎖의 농도로 조정한 hsIL-6R 검량선 시료 및 50배 이상 희석한 마우스 혈장 시료를 조제하였다. 시료를, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 단일클론 항인간 IL-6R 항체(R&D), 비오틴화 항인간 IL-6R 항체(R&D), 및 WT-IgG1 용액과 혼합하여, 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. 항인간 IL-6 수용체 항체로서, 토실리주마브(중쇄 서열번호：13, 경쇄 서열번호：14)을 포함하는 WT-IgG1의 종농도는, 시료에 포함되는 항인간 IL-6 수용체 항체 농도 보다 과잉의 333 ㎍/㎖이고, 시료 중의 거의 모든 hsIL-6R 분자를 WT-IgG1과 결합한 상태로 하는 것을 목적으로 하였다. 그 후, 시료를 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하고, 실온에서 1시간 반응시켜서 세정을 행하였다. Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)를 분주하고, 바로 Sector PR 400 Reader(Meso Scale Discovery)로 측정을 행하였다. hsIL-6R 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다.
도 46은, 항체 투여 후의 혈장 중 hsIL-6R 농도의 시간 프로파일을 나타낸다. 항체를 투여하지 않은 베이스 라인의 hsIL-6R 레벨과 비교하여, 1 ㎎/㎏ Fv4-IgG1의 투여에 의해, 혈장 중 hsIL-6R 농도가 수 배 증가하였다. 한편, 1 ㎎/㎏의 Fv4-IgG1-F14의 투여에 의해, Fv4-IgG1군 및 베이스 라인군과 비교한 경우에 혈장 중 농도의 유의한 감소가 발생하였다. 2일째에, 혈장 중 hsIL-6R 농도는 검출되지 않고(혈장 중 hsIL-6R 농도의 정량 한계는 이 측정계에 있어서 1.56 ng/mL이다), 이는 14일째까지 지속되었다.
H54/L28-IgG1-F14는, H54/L28-IgG1과 비교하여 혈장 중 hsIL-6R 농도의 감소를 나타내었으나, 감소의 정도는 작았다. 감소의 정도는, hsIL-6R에 대한 pH 의존적 결합 특성을 Fv4 가변영역에 갖는 경우에서는 상당히 컸다. 이는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성을 증대시키는 것은 혈장 중 항원 농도를 감소시키기 위해 유효한 것이, pH 의존적 항원 결합과 pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성의 증대를 조합하면, 항원 소실이 유의하게 증대되는 것을 나타내고 있다.
보다 저용량의 Fv4-IgG1-F14를 사용한 시험은, 1 ㎎/㎏의 1/100인 0.01 ㎎/㎏에서 조차도, 혈장 중 항원 농도를 베이스 라인 보다도 감소시켜서, 분자가 혈장으로부터 항원을 고갈시키는 효율이 유의한 것을 나타내고 있다.
〔참고예 11〕동시 투여 모델에 있어서의 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276 및 계통 32의 비교
지금까지의 in vivo 시험은, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276(Jackson Laboratories)을 사용해서 행하고 있었다. 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276과 상이한 형질전환 계통인 계통 32의 차를 비교하기 위해, 본 발명자들은, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 계통 32 +/+ 마우스 (B6.mFcRn-/- hFCRN Tg32; B6.Cg-Fcgrt＜tm1Dcr＞ Tg(FCGRT)32Dcr)(Jackson #4915)), Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104)를 사용하여 H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, 및 Fv4-IgG1-v2의 동시 투여 시험을 행하였다. 시험 방법은, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32를 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276 대신에 사용한 것 이외는, 참고예 3의 시험 방법과 동일하였다.
도 47은, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276 및 계통 32의 양쪽에 있어서의 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타낸다. H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, 및 Fv4-IgG1-v2는, 유사한 혈장 중 hsIL-6R 농도-시간 프로파일을 나타내었다. 어느 마우스에 있어서도, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성을 증대시키자, 혈장으로부터의 항원 소실이 같은 정도로 증강되었다(Fv4-IgG1과 Fv4-IgG1-v2를 비교).
도 48은, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 276 및 계통 32의 양쪽에 있어서의 혈장 중 항체 농도 추이를 나타낸다. H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, 및 Fv4-IgG1-v2는, 유사한 혈장 중 항체 농도-시간 프로파일을 나타내었다.
결론으로서는, 계통 276과 계통 32 사이에 유의차는 관찰되지 않고, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성을 증대시키는 Fc 변이체는, 혈장 중 항원 농도의 소실의 증강에 관하여, 인간 FcRn을 발현하는 2개의 상이한 형질전환 마우스 계통에 있어서 유효하다.
〔참고예 12〕중성 pH에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성이 증대된 다양한 항체 Fc 변이체의 제작
(12-1) Fc 변이체의 제작
항원 소실 프로파일을 더욱 개선하기 위해, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성을 증대시키는 것을 목적으로 하여, 다양한 변이를 Fv4-IgG1에 도입하였다. 구체적으로는, 표 15에 나타내어지는 아미노산 변이를 Fv4-IgG1의 중쇄 정상영역에 도입하여 Fc 변이체를 제작하였다(변이부위의 아미노산 번호는, EU 넘버링에 따라 기재한다). 아미노산 치환의 도입은 참고예 3에 기재된 당업자 공지의 방법에 따라 실시하였다.
조제된 중쇄와 L(WT)(서열번호：14)을 각각 포함하는 추가적인 변이체(IgG1-F100~IgG1-F1052)를, 참고예 3에 기재된 당업자 공지의 방법으로 발현시켜서 정제하였다.
(12-2) 인간 FcRn 결합의 평가
항체와 인간 FcRn의 결합의 동태를, IgG1-v1, IgG1-v2, 및 IgG1-F2~IgG1-F1052에 대해서서는 참고예 5에 기재한 바와 같이, 또는 IgG1 및 M73에 대해서는 참고예 9에 기재한 바와 같이 해석하였다. 중성 조건하(pH 7.0)에 있어서의 인간 FcRn 결합에 대한 Biacore에 의한 결과를 표 28-1~28-21에 나타낸다.
[표 28-1]
Figure pat00037
표 28-2는, 표 28-1의 계속되는 표이다.
[표 28-2]
Figure pat00038
표 28-3은, 표 28-2의 계속되는 표이다.
[표 28-3]
Figure pat00039
표 28-4는, 표 28-3의 계속되는 표이다.
[표 28-4]
Figure pat00040
표 28-5는, 표 28-4의 계속되는 표이다.
[표 28-5]
Figure pat00041
표 28-6은, 표 28-5의 계속되는 표이다.
[표 28-6]
Figure pat00042
표 28-7은, 표 28-6의 계속되는 표이다.
[표 28-7]
Figure pat00043
표 28-8은, 표 28-7의 계속되는 표이다.
[표 28-8]
Figure pat00044
표 28-9는, 표 28-8의 계속되는 표이다.
[표 28-9]
Figure pat00045
표 28-10은, 표 28-9의 계속되는 표이다.
[표 28-10]
Figure pat00046
표 28-11은, 표 28-10의 계속되는 표이다.
[표 28-11]
Figure pat00047
표 28-12는, 표 28-11의 계속되는 표이다.
[표 28-12]
Figure pat00048
표 28-13은, 표 28-12의 계속되는 표이다.
[표 28-13]
Figure pat00049
표 28-14는, 표 28-13의 계속되는 표이다.
[표 28-14]
Figure pat00050
표 28-15는, 표 28-14의 계속되는 표이다.
[표 28-15]
Figure pat00051
표 28-16은, 표 28-15의 계속되는 표이다.
[표 28-16]
Figure pat00052
표 28-17은, 표 28-16의 계속되는 표이다.
[표 28-17]
Figure pat00053
표 28-18은, 표 28-17의 계속되는 표이다.
[표 28-18]
Figure pat00054
표 28-19는, 표 28-18의 계속되는 표이다.
[표 28-19]
Figure pat00055
표 28-20은, 표 28-19의 계속되는 표이다.
[표 28-20]
Figure pat00056
표 28-21은, 표 28-20의 계속되는 표이다.
[표 28-21]
Figure pat00057
〔참고예 13〕인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32를 사용한 정상상태 주입 모델에 의한 다양한 Fc 변이체 항체의 in vivo 시험
참고예 12에 있어서 제작한 Fc 변이체를, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32를 사용한 정상상태 주입 모델에 있어서 혈장 중 항원 소실능에 관하여 시험하였다. 정상상태 주입 모델 in vivo 시험은, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32를 계통 276 대신에 사용하고, 단일클론 항마우스 CD4 항체를 2회(주입 펌프를 메워 넣기 전과, 항체를 투여한 14일 후) 또는 3회(주입 펌프를 메워 넣기 전과, 항체를 투여한 10일 후 및 20일 후) 투여한 것 이외는, 실시예 1에 기재한 바와 같이 행하였다.
표 28-1~28-21에 기재된 Fc 변이체로부터 선택한, 이하에 기재된 항체 Fc 변이체를, 참고예 3에 기재된 당업자 공지의 방법으로 발현시켜서 정제하였다：
VH3-IgG1과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1；
VH3-IgG1-F11과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F11；
VH3-IgG1-F14와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F14；
VH3-IgG1-F39와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F39；
VH3-IgG1-F48과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F48；
VH3-IgG1-F140과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F140；
VH3-IgG1-F157과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F157；
VH3-IgG1-F194와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F194；
VH3-IgG1-F196과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F196；
VH3-IgG1-F198과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F198；
VH3-IgG1-F262와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F262；
VH3-IgG1-F264와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F264；
VH3-IgG1-F393과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F393；
VH3-IgG1-F434와 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F424； 및
VH3-IgG1-F447과 VL3-CK를 포함하는 Fv4-IgG1-F447.
이들 항체를, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32에 1 ㎎/㎏의 용량으로 투여하였다.
도 49는, 마우스에 있어서의 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타낸다. Fv4-IgG1과 비교하여, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성이 증대된 Fc 변이체는 모두, 혈장 중 hsIL-6R 농도의 감소를 나타내고, 이로 인해 혈장으로부터의 항원의 소실을 증대시켰다. 항원 농도 감소의 정도 및 지속은 Fc 변이체 간에 상이했지만, 모든 변이체가 일치하여 IgG1과 비교하여 혈장 중 hsIL-6R 농도를 감소시켰다. 이는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성이 증대됨으로써, 혈장으로부터의 항원의 소실이 일반적으로 증대되는 것을 나타내고 있다. 도 50은, 마우스에 있어서의 혈장 중 항체 농도 추이를 나타낸다. 항체의 약물동태는 Fc 변이체 간에 상이하였다.
참고예 9에 기재한 바와 같이, 항체 1분자당 혈장으로부터 소실되는 항원의 양은, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 친화성이 증대된 항체 Fc 변이체를 투여함으로써 항원 소실효율을 평가하는 경우에 중요한 요인이 된다. 이로 인해, 각 항체에 대한 C값(항원/항체 몰비)의 추이를 도 51에 기재하였다. 도 52는, pH 7.0에 있어서의 인간 FcRn에 대한 Fc 변이체의 결합 친화성과, 항체 투여 1일 후의 C값(항원/항체 몰비)의 관계를 나타낸다. 이는, 이 시험에 있어서 시험한 모든 항체 Fc 변이체가 Fv4-IgG1과 비교하여 작은 C값을 갖는 것을 나타내고 있다. 본 시험에 있어서 시험한 모든 Fc 변이체가, 인간 FcRn에 대해 pH 7.0에서 KD 3.0 μM보다 강한 결합 친화성을 갖는 것으로부터, 그들은 천연형 인간 IgG1과 비교하여 높은 항원 소실효율을 달성하였다. 이는 참고예 9에서 얻어진 결과와 일치하였다(도 42).
도 53은, 본 시험에 있어서 시험한 Fc 변이체에 있어서, F11, F39, F48, 및 F264의 Fc 변이체를 갖는 항체가, IgG1과 유사한 약물동태를 나타낸 것을 나타낸다. 이 시험은 인간 FcRn 형질전환 마우스를 사용해서 행해지고 있는 것으로부터, 이들의 Fc 변이체는 인간에 있어서도 IgG1과 유사한 긴 반감기를 가질 것으로 예상된다. 도 54는, 천연형 인간 IgG1과 유사한 약물동태를 갖는 항체(F11, F39, F48, 및 F264)를 투여한 마우스에 있어서의 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타낸다. 이들 변이체는, IgG1과 비교하여 혈장 중 hsIL-6R 농도를 약 10배 저감시켰다. 또한, 이들 항체는, 베이스 라인 hsIL-6R 농도(항체 없음의 농도) 보다 아래까지 hsIL-6R 농도를 감소시켰다. 따라서, 이들 항체는, 혈장으로부터의 항원의 장기 소실을 가능하게 하여, 이로 인해, 만성 질환을 위한 항체 치료에 있어서 바람직한 긴 투여 간격을 가능하게 할 것으로 생각된다.
도 55 및 56은 각각, IgG1, 및 Fc 변이체 F157, F196, 및 F262에 대한 혈장 중 항체 농도 및 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타낸다. 놀랍게도, F157 및 F262의 항체 약물동태는, 천연형 IgG1과 비교하여 유의하게 빠른 혈장으로부터의 클리어런스를 나타내었으나, F157 및 F262는 혈장으로부터의 대폭적이고 지속적인 hsIL-6R 소실을 나타내었다. 구체적으로는, F157에서의 혈장 중 hsIL-6R 농도는, 1일째부터 28일째(14일째를 제외)까지 검출한계(1.56 ng/㎖) 보다 아래이고, F262에서의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 14일째부터 28일째까지 검출한계(1.56 ng/㎖) 보다 아래였다. 한편, F157과 비교하여 항체의 클리어런스가 보다 느린 F196에 관해서는, 항원 농도는 14일째에서 증가하기 시작하여, 28일째에 베이스 라인으로 되돌아갔다. 본 시험에 있어서 시험한 Fc 변이체 중에서, F157 및 F262는, 혈장 중 hsIL-6R 농도를 28일째의 시점에서 1.56 ㎎/㎖ 보다 아래로 감소시킬 수 있었던 유일한 Fc 변이체였다.
항체는 천연형 인간 IgG1과 비교하여 매우 급속하게 혈장으로부터 소실된 것으로부터, F157 및 F262에 있어서 그러한 지속적인 장기효과가 얻어진 것은, 항체의 약물동태로부터는 예상외의 것이다. 특히, F157에서의 혈장 중 항체 농도는, 21일째에서는 검출되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 혈장 중 hsIL-6R 농도는, 21일째 및 28일째의 시점에서 검출한계의 1.56 ng/㎖ 보다 낮은 레벨까지 계속해서 감소되었다. 본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 이 예상외의 결과는, 항체가 FcRn 결합형으로서 혈관 내피세포 표면에 존재하기 때문이라고 생각된다. 이들 항체는 혈장 중에서 저농도를 나타내었지만, 이들 항체는 여전히 FcRn 결합형(혈장 중 항체 농도로서 측정 불가능)으로서 혈관 컴파트먼트에 존재하고 있다. 이들의 FcRn 결합 항체는 여전히 혈장 중의 항원에 결합하여, 항원/항체 복합체가 FcRn에 의해 흡수된 후, 항원은 엔도솜 내에서 유리되어 리소좀에 의해 분해되는데, 항체는 FcRn 결합형으로서 세포 표면에 되돌려져 리사이클된다. 이와 같이, 이들의 FcRn 결합 항체는 항원의 소실에 기여한다. 이것에 의해, 항체 농도가 혈장 중에서 낮아진 후 조차도 이들 항체가 항원 소실능을 유지하고 있는 이유가 설명된다.
본 발명에 의해, 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 방법, 1분자의 항원 결합 분자에 의해 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 방법, 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 방법, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법이 제공되었다. 항원 결합 분자에 의한 항원의 세포내로의 흡수가 촉진됨으로써, 항원 결합 분자의 투여에 의해 항원의 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 것이 가능해지는 동시에, 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성을 개선시키는 것이 가능해져, 1분자의 항원 결합 분자에 의해 항원으로의 결합 횟수를 증가시키는 것이 가능해져, in vivo에 있어서 통상의 항원 결합 분자 보다도 우수한 효과를 발휘시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTIGEN-BINDING MOLECULES THAT REPEATEDLY BIND TO MULTIPLE ANTIGEN MOLECULES <130> C1-A1009Y1P <150> JP 2010-266121 <151> 2010-11-30 <150> JP 2011-217886 <151> 2011-09-30 <160> 113 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Pro Gly Gly Gly Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro 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Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Asp Ala Phe 100 105 110 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 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115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 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an artificially synthesized sequence <400> 110 Ala Ile Glu Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Thr Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asp Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Gly Ser Asp 85 90 95 Val Asp Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 111 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 111 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 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Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 113 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 113 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser

Claims (12)

  1. 이하의 공정(a)~(e)를 포함하는, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, (ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능, (iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및 (iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 제조방법；
    (a) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
    (b) 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
    (c) 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
    (d) 상기 공정(c)에서 선택된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
    (e) 상기 공정(d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
  2. 이하의 공정(a)~(e)를 포함하는, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, (ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능, (iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및 (iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 제조방법；
    (a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
    (b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,
    (c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
    (d) 상기 공정(c)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
    (e) 상기 공정(d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
  3. 이하의 공정(a)~(f)를 포함하는, (i) 항원의 세포내로의 흡수를 촉진시키는 기능, (ii) 항원에 2회 이상 결합하는 기능, (iii) 혈장 중의 항원 농도의 감소를 촉진시키는 기능, 및 (iv) 우수한 혈장 중 체류성 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 항원 결합 분자의 제조방법；
    (a) 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
    (b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
    (c) 상기 공정(b)에서 선택된 항원 결합 분자를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 접촉시키는 공정,
    (d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
    (e) 상기 공정(d)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
    (f) 상기 공정(e)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 생산하는 공정.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여, 중성 pH 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 부여하거나 또는 높이는 공정을 포함하는 제조방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여, 산성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성을 중성 pH 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다도 저하시키는 공정을 포함하는 제조방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    저칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 0.1 μM~30 μM인 제조방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    고칼슘 농도가 이온화 칼슘 농도 100 μM~10 mM인 제조방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    저칼슘 농도가 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도인 제조방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    고칼슘 농도가 혈장 중의 이온화 칼슘 농도인 제조방법.
  10. 제5항에 있어서,
    항원 결합 분자 중의 아미노산의 개변이, 항원 결합 분자 중의 적어도 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 개변인 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 분자가 결합하는 항원이 IL-6R, IL-6, IgA, 인간 글리피칸 3, 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 분자가 항체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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